v​ ​Introducción.

Cromatografía ​es un proceso de separación que depende de la diferente distribución

de los componentes de una mezcla entre una fase móvil y una fase estacionaria, la
fase estacionaria debe ser en la forma de una columna empaquetada (cromatografía
en columna) a través de esta fase móvil es permitido el flujo, o en la forma de una
capa fina adherida a un material que lo soporte (cromatografía en capa fina), por la
cual la fase móvil asciende por acción capilar.

La fase estacionaria puede ser un líquido o sólido y la fase móvil puede ser liquido o
gas. Las combinaciones posibles dan pie a las principales técnicas en su uso
general.

El uso de la cromatografía es conveniente cuando uno se enfrenta con una mezcla

totalmente desconocida, donde es mejor llevar a cabo una cruda y rápida
separación cromatográfica, con una porción pequeña de la mezcla, usando la
información y la experiencia ganada en la ejecución se prueba para llevar una
separación más eficiente en el resto del material. La cromatografía en capa fina
sirve como excelente guía en las condiciones para la cromatografía en columna.

Cromatografía de partición. La fase estacionaria es una pequeña capa de líquido

adsorbida en la superficie en la esencia de un soporte inerte. La fase móvil puede
ser un líquido o un gas. En cualquier sistema de separación dependerá mayormente
de la partición entre las dos fases a pesar de que el proceso de separación puede
ser complicado por la incursión de los efectos de adsorción involucrando el soporte
inerte y los compuestos con los que se experimentará en la cromatografía de
separación. La cromatografía de papel es un importante ejemplo de la cromatografía
de partición en el cual el papel filtro sirve como un soporte de la fase líquida e
inmóvil.

Cromatografía de adsorción. La fase móvil es usualmente un líquido y la fase

estacionaria as a adsorbente sólido finalmente dividido. La separación depende de
la adsorción selectiva de los componentes de la mezcla en la superficie del sólido.
La separación basada cromatografía del proceso gas-sólido están limitadas por la
aplicación de mezclas orgánicas.

Objetivos.

·​ Se extraerá el pigmento de la espinaca, con la técnica adecuada.

​

· Se separará el pigmento de la espinaca por las técnicas de cromatografía en

​

capa fina y de cromatografía en columna.

Hipótesis:

· ​Una vez identificado la mezcla de composición conocida con un Rf que separe a

los componentes podremos ocuparlo para la cromatografía en columna para la
correcta separación de los componentes orgánicos de la espinaca.

Una vez llevadas las pruebas a cabo con los diferentes disolventes se identificará el
más polar y el menos polar que serían los adecuados para poder generar una
mezcla de composición conocida.

Si se identifica el disolvente más polar y el menos polar con mejor separación del
pigmento extraído, se hace una mezcla de estos disolventes y se utiliza para su
separación utilizando la cromatografía en columna se identificará la separación del
pigmento que se extrajo.

Si se identifica un solvente polar y otro poco polar miscibles entre sí, donde se haya
separado mejor el pigmento extraído, posteriormente se prepara una mezcla con
estos dos disolventes a una cierta concentración y la utilizamos en la cromatografía
en columna el extracto tendrá una separación óptima y correcta.

v​ ​Parte experimental.

Ø​ ​Materiales.

§​ ​Mortero

§​ ​Embudo de separación

§​ ​Embudo de tallo corto

§​ ​Frascos medianos de vidrio

§​ ​Pipetas graduadas de 5ml

§​ ​Bureta de 25ml

§​ ​Probeta

§​ ​Matraz de bola de 100ml

§​ ​Soporte universal

§​ ​Pinzas de doble presión

§​ ​Soporte universal

§​ ​Portaobjetos

§​ ​Tubos de ensayo

§​ ​Gradilla

§​ ​Capilares

§​ ​Termómetro

§​ ​Mufla

§​ ​Propipeta

§​ ​Alambre

§​ ​Algodón

§​ ​Aro de metal

Ø​ ​Reactivos.

§​ ​Silica gel para columna (SiO2​ )​

§​ ​Silica gel para capa fina (SiO​2)​

§​ ​Acetato de etilo (​C​4​H​8​O​2​)

​ ​6​H​14​)
§​ ​Hexano ( C

§​ ​Etanol (​C​2​H​5​OH)

​ H​3​OH)
§​ ​Metanol (C

​ ​3​H​6​O)
§​ ​Acetona (C
 §​ ​Sal (NaCl)

§​ ​Eter de petróleo (​C​6​H​6 )​

§​ ​Tolueno (​C​7​H​8

​ HCl​3​)
§​ ​Cloroformo (C

§​ ​Benceno (​C​6​H​6​ )

§​ ​Cloruro de metileno (​CH​2​Cl​2​)

Metodología.

Extracción del pigmento.

Se colocó 20 gr. de espinaca en un mortero y se macero hasta tener una

pasta homogénea, se le agregó metanol y se esperó 20 minutos, posteriormente el
contenido se colocó un embudo de separación con ayuda de un embudo de tallo
corto y un algodón para llevar a cabo una filtración, una vez filtrado dentro del
embudo de separación se le agregó 30ml de éter de petróleo y se tapó, se procedió
a agitar sosteniendo con fuerza el tapón, se voltea el embudo de separación
dejando que resbalará la mezcla de los componentes en las paredes del embudo,
se abrió la manija del embudo dejando escapar el CO​2 producido por la agitación,
este proceso se repitió hasta que ya no liberará gas, se colocaba el embudo sobre
un anillo de metal y se esperaba a que se fueran visibles las fases de separaciones
de los componentes, separando de esta manera el componente orgánico. El lavado
se realizó cuatro veces.

El pigmento como estaba demasiado diluido se recolectó en un frasco, tapado con

papel aluminio agujereado y se dejó que se evaporara, posteriormente agregamos
5ml de éter de petróleo para que estuviera más concentrado.

Preparado de la sílica.

En un frasco de vidrio pequeño se agregó 30 gr de silica gel para columna,

posteriormente se le agregó acetato de etilo poco a poco hasta formar una
suspensión, se agitó para obtener la consistencia que se deseaba.
Preparación y activación de las placas.

Se juntan dos portaobjetos, se sumergieron en la suspensión previamente

agitada y se sacaban rápidamente de la mezcla, dejando un centímetro de las
placas limpia, posteriormente se separaban y se les quitaba el exceso de los
costados, antes de volver a sumergir el siguiente par de placas se agitaba
vigorosamente para que no se separará la suspensión. Cada 6 placas o 3 pares de
placas se agregó más acetato de etilo y en caso de que se volviera menos espesa
se agregaba silica gel para capa fina.

Para la activación de las placas se ponía a calentar la mufla a 100°C y se

metían las placas por 15 minutos para eliminar la humedad.

Preparación de los capilares

Se tomó un capilar se sujetaron de los extremos y posteriormente y se

calentaba con una fuente directa de calor en el centro,ya una vez que se tenía una
separación de aproximadamente 4-5cm, se estira los extremos y se separa, de esta
manera los puntos de aplicación serían del tamaño adecuado. Formando una pipeta
pequeña.

Preparación de las cámaras de elusión.

Primera muestra​. Se prepararon 9 frascos con diferentes diluyentes, cada frasco

contenía 5ml de su respectivo disolvente y papel filtro dentro del frasco, estos
disolventes estaban ordenados por orden de polaridad.

Segunda muestra. Se prepararon 9 frascos con acetato de etilo y hexano en

diferentes concentraciones. En este caso los papeles filtros se metieron hasta
después de agregar la solución.

Tercera muestra. Se prepararon 10 frascos con 5ml de una mezcla de 100ml

acetato de etilo (40ml) y hexano (60ml). En este caso los papeles filtros se metieron
hasta después de agregar la solución.

Cromatografía en capa fina.

Se activaron las placas, después con ayuda de un capilar se marcaron dos

puntos y se punteo en repetidas ocasiones hasta obtener un punto pequeño pero
visible punto verde (a un centímetro de distancia de la base) se preparó la ​primera
muestra de las cámaras con los ​disolventes posteriormente se sumergió en el frasco
con 5 ml del disolvente más polar hasta que el disolvente estuviera a 1mm del borde
superior de la sílica. Se repitió este proceso para todos los disolventes en el orden
de polaridad establecido.

Cromatografía en columna.

Primero se montó un equipo que consistía de un soporte universal con pinzas

de doble presión que sostenían una bureta (25ml) con un vaso recolector debajo de
esta. Se procedió a meter un pedazo de algodón con ayuda de un alambre hasta el
fondo de la columna, luego se le agregó a la bureta de 12.5ml de éter de petróleo.
En un matraz de bola de 250ml se agregaron 20g de silica gel para columna y
alrededor de 10 ml de éter de petróleo agitando vigorosamente y vaciando
rápidamente en la bureta con la ayuda de un embudo de tallo corto, una vez vaciado
el contenido del matraz, se abría la bureta y se dejaba vaciar la parte transparente
(éter de petróleo). Se procedió a agregar 2cm de sal procurando que la capa
quedará totalmente horizontal. Una vez realizado esto se le agregó el pigmento
recolectado, y se le adicionó 10ml de la mezcla de composición conocida (Hexano:
3 y acetato de etilo :2) se abrió la bureta permitiendo un goteo lento de 6 segundos
entre cada gota y una vez observado el pigmento en la parte baja se empezó a
recolectar en tubos de ensayo muestras de 1 ml, se recolectaron 20 tubos de
ensayo. Se volvieron a preparar las cámaras de elusión y con la mezcla de
composición conocida y se prepararon y activaron 20 placas, donde fueron
punteadas con dos puntos, el primero con la muestra recolectada en los tubos de
ensayo y el segundo con el pigmento original, dichas placas se metieron a las
cámaras de elusión y se observaron y anotaron resultados.

Resultados.
Cuestionario.

1-¿A qué grupo de compuestos pertenecen los pigmentos?

Carotenoides coloración amarilla

Xantofilas coloración amarillo-anaranjado

Clorofila a y b color verde

Ficobilinas color azul y roja

2-¿A qué se deben que estos compuestos sean coloridos?

Clorofila es un pigmento que da el color verde a los vegetales, absorbe la luz necesaria para
realizar la fotosíntesis, por lo que absorbe la luz roja, violeta y azul y refleja la verde.

Carotenoides: son los responsables de la gran mayoría de los colores amarillos,

anaranjados y rojos presentes en los alimentos vegetales.

3.-Explique la diferencia entre cromatografía de adsorción y partición.

La cromatografía de adsorción se maneja en la fases líquido-sólido o sólido-gas (pero esta

limitada a mezclas orgánicas) y la cromatografía de partición se maneja en las fases líquido-
líquido ó sólido-gas.

4.-¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la cromatografía en capa fina en

comparación con la cromatografía en columna?

La cromatografía en capa fina es llevado a cabo de forma rápida y requiere de menos

muestra, es una excelente herramienta de análisis y es usada frecuentemente para
determinar la combinación óptima de los disolventes y adsorbentes que se pueden utilizar
para la cromatografía en columna. Pero la desventaja es que está limitada a los compuestos
que tengan un punto de ebullición aproximado de 150°C.

5.-Explique la diferencia que existe entre el adsorbente utilizado en cromatografía en

capa fina y el de columna. Hacer una lista en orden creciente de actividad.

En el adsorbente en cromatografía en columna se debe ocupar uno que no se disuelva en la

asociada fase líquida, ya que esta se maneja con un equilibrio entre la adsorción y la
solubilidad. Los más comunes utilizados son silica gel S iO₂⋅xH₂O y aluminia Al₂O₃⋅xH₂O .

El adsorbente utilizado en capa fina es alumina G (oxido de aluminio) y sílica gel G (acido
silico). La G es la designación que significa yeso (sulfato de calcio). Este se une muy bien
con el adsorbente y a el plato que se usa de soporte. Solo se utiliza aglutinante cuando el
adsorbente usado es alrededor de 10-13% de el peso de G.
6.-Hacer una lista de capacidad de adsorción de los grupos funcionales de los
compuestos orgánicos

7.-Hacer una lista de eluyentes usados en cromatografía en columna y capa delgada

en orden creciente de polaridad
·​ ​ ter de petróleo
​É
·​ H​ exano
·​ T ​ olueno
·​ B ​ enceno
·​ C ​ loruro de metileno
·​ C ​ loroformo
·​ A ​ cetato de etilo
·​ A ​ cetona
·​ E ​ tanol
·​ M ​ etanol

8.-¿Cómo se prepara el capilar para aplicar la muestra en la cromatografía?

Se tomó un capilar se sujetaron de los extremos y posteriormente y se calentaba

con una fuente directa de calor en el centro, estirando los extremos y separándolos,
de esta manera los puntos de aplicación serían del tamaño adecuado.
9.-¿Por qué es necesario que la cámara de elución esté saturada de los vapores del
eluyente?

Los vapores fuerzan a la separación de los componentes. Por eso es importante mantenerla
cerrada las cámaras de elusión.

10.-Explicar cada uno de los siguientes términos

Elución simple: Donde un solo disolvente asa por la columna durante toda la separación.
Esta sirve para compuestos con polaridad similar.

Elución fraccionada: Una serie de incremento de polaridad en disolventes es usada para

eluir la mezcla de la columna. Se usa un componente poco polar, y después se agrega
disolvente o mezcla de estos que tengan más polaridad. En esta es esencial aumentar
gradualmente la polaridad para que las bandas no eluyen.

Eluyente : Es un disolvente orgánico que se utiliza en la cromatografía para la extracción de

un compuesto para separar otra fase.

Eluante: Es el soluto o el material que se va a separar

Adsorbente: ​Un adsorbente es un sólido que tiene la capacidad de retener sobre su superficie
un componente presente en corrientes líquidas o gaseosas.

Adsorción: Proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapados en la superficie,
de otra sustancia o material.

Afinidad por el adsorbente: La sustancia cede a la capacidad de capilaridad del adsorbente

y eluye a través de él.

11.- ¿Cómo se clasifica la cromatografía en función de su fase estacionaria?

En cromatografía de adsorción la fase estacionaria es un adsorbente sólido finamente

dividido y en cromatografía de partición donde la fase estacionaria es un solvente líquido.

12.- ¿Cuál es la función de la fase móvil y cómo se lleva a cabo la separación?

Depende de si es cromatografia de adsorcion o cromatografía de partición su estado, ya sea

sólido o líquido/gas, su función es separar los componentes de una mezcla para que
puedan ser identificados o recolectados. Esta separación de los consiste en la polaridad de
los componentes que componen la mezcla.

13.- ¿Cómo se prepara la papilla para la c.c.f?

En un frasco de vidrio pequeño se agregó 30 gr de sílica gel para columna,

posteriormente se le agregó acetato de etilo poco a poco hasta formar una
suspensión, se agitó para obtener la consistencia que se deseaba.
14.- ¿Cuándo es conveniente activar una placa, como se activa?

Para la activación de las placas se ponía a calentar la mufla a 100°C y se

metían las placas por 15 minutos para eliminar la humedad. Es conveniente para
lograr un alto grado de reproducibilidad y eliminar la humedad que contengan, ya
que esto ayuda a la descomposición de los productos orgánicos.

15.- ¿Qué espesor debe tener la fase estacionaria en la c.c.f?

250 micras

16.- Al comparar el Rf de dos compuestos se encontró que eran igual, podría

pensarse que se trata del mismo compuesto?

Sí, debido a la afinidad que tienen los componentes de la muestra eluyente empleado,
puede haber la posibilidad de que sea el mismo compuesto.

17.- ¿Existirá alguna relación entre la cantidad de adsorbente y las dimensiones de la

columna?

Como regla general la cantidad de adsorbente debe ser de 25 a 30 veces, el peso, la

cantidad de material, que va a ser separada además la columna debe tener una relación
altura-diámetro aproximado de 8:1.Algunos ejemplos típicos de este tipo se mostrarán en la
siguiente tabla:

La dificultad de la separación es también un factor a considerar en el tamaño y la longitud

de la columna que se va a ocupar y también en la cantidad de adsorbente que se va a
necesitar. Estos compuestos requieren columnas largas y más adsorbente, lo que es
contrario a los compuestos de fácil separación.

18.- ¿Cómo debe ser la polaridad de un eluyente al empacar una columna?

Debe tener una polaridad baja.

19.- ¿Cuál es el orden de polaridad en que salen los compuestos de una

cromatografía en columna?

Del menos polar al más polar.

20.- ¿A qué se le llama frente del eluyente?

Se podría ver como la frontera que separa las bandas en la cromatografía en columna, es
importante que estos se mantengan de manera horizontal.

21.- ¿Cómo se controla la salida de los componentes en una cromatografía en

columna?

Mientras los componentes de la mezcla son separados se comienzan a formar bandas en

movimiento, estas bandas contienen un solo componente. Si se eligieron bien los
parámetros de la columna las bandas se van a separar unas de otras dejando espacios
entre el solvente puro y el componente separado. Mientras esa banda pasa a la parte baja
de la columna puede ser recolectada antes de que llegue la otra banda .

22.- ¿Por qué no debe dejarse secar la columna cromatográfica?

Porque se necesita mantener un equilibrio entre la afinidad del adsorbente y el solvente.

23.- ¿Por qué es importante que las muestras a separar por cromatografía vayan lo
más secas posible?

Por que el contener un compuesto polar podría dificultar la separación de los componentes
que formen parte de la mezcla.

24.- Al cargar una columna se recomienda que la muestra lleve la mínima cantidad de
disolvente ¿Por qué?

Porque el disolvente afecta el desplazamiento del compuesto.

25.- ¿Qué pH presenta la alúmina?

Básico pH 10: Utilizado para compuestos ácidos

Neutro pH 7: Es utilizado para ácidos y bases débiles,

Ácido pH 4: Utilizado para compuestos básicos.

26.- ¿Por qué cuando se utiliza la alúmina como adsorbente no se recomienda usar
acetona como eluyente?

Por que la medida en que cualquier solvente dado puede lavar un compuesto adsorbente de
aluminia depende casi directamente de la polaridad relativa de los solventes. Y la acetona al
ser un componente polar se une a la aluminia fuertemente, en cambio los compuestos no
polares tienen fuerzas débiles, así que no se adhieren fuertemente a la aluminia.

27.- ¿Cuáles son los pasos a seguir para la preparación de las placas preparativas?

Primero se recomienda limpiar con alcohol, para eliminar la grasa que puedan contener,
dejándolas secar. Una vez secas se meten en la papilla previamente hecha de silica gel
dejando alrededor de un centímetro con el borde sin mezcla. Se sacan y se les quita el
exceso de los lados, se separan. Estas placas necesitan ser activadas así que se meten a
un horno a calentar a una temperatura de 110ºC por aproximadamente 15 minutos.

28.- ¿Cuál es la aplicación de la cromatografía en capa preparativa?

Para identificar compuestos de una mezcla desconocida.

29.- ¿Qué diferencia existe entre c.c.f y cromatografía en capa preparativa?

Las placas preparativas vienen listas para su uso, tienen una capa más resistente, están
compuestas de hojas de plástico que son recubiertas con silica gel y ácido poliacrílico que
sirve como aglutinante, vienen con un indicador fluorescente que se combinará con la sílica
gel, mostrando la presencia de los compuestos.

30.- En forma general ¿Cómo se clasifican a los reveladores?

Para los componentes que no tienen color se ocupan los reveladores uv, químicos o
sometidos a procesos de vapor.

31.- Cuando una sustancia orgánica o revela con I2 o Luz U.V ¿Qué otros reveladores
pueden emplearse para obtener la mancha?

La placa o reactivo es rociada con vapores de ácido sulfúrico, permanganato de potasio,

ácido fosformilibico, ninhidrina, para que reaccionen los componentes.