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GUÍA DE LABORATORIO 2019 – I

GUÍA DE LABORATORIO
CURSO: BIOQUÍMICA

0 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA


© Derechos Reservados 2018
© Área de Química

Tercera Edición
Segunda reimpresión

Diseño, Diagramación e Impresión


Universidad Científica del Sur
Panamericana Sur Km 19. Lima – Perú
Teléfono: 610 – 6400

Tiraje 1500 ejemplares


IMPRESO EN PERÚ
GUÍA DE LABORATORIO 2019 – I

Dr. Manuel Efraín Rosemberg Barrón


Rector

Dr. Christian Jesús Mesías Montenegro


Vicerrector Académico

Dr. José Agustín Ortiz Elías


Director General Académico

Mg. Álvaro Rodrigo Pinillos Osnayo


Director de Formación Básica

Mg. Juan Alberto Salazar Sánchez


Coordinador de Área de Química y Física

Autores:
Mg. Juan Alberto Salazar Sánchez
Bach. Yojani Bereniz Salazar García

Reservados todos los derechos: ningún material de este manual puede ser
reproducido sin autorización expresa por escrita por los autores. La autorización
será en hoja aparte y firmada y adosada a este material. Todo compromiso suscrito
aparte, no se refiere a este manual. Queda exento del compromiso, el fotocopiado
interno en una cantidad no mayor de 100, solo para uso con fines educativos y sin
lucro.

0 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 – I

CONTENIDO

Prologo 1

Instrucciones generales y medidas de bioseguridad 2

CAPÍTULO 1. Espectrofotometría 7

CAPÍTULO 2. Factores que afectan la actividad enzimática 14

CAPÍTULO 3. Determinación de ácido úrico en suero sanguíneo 21

CAPÍTULO 4. Digestión enzimática del almidón 25

CAPÍTULO 5. Efecto del ayuno en el glucógeno hepático 31

CAPÍTULO 6. Cálculo del balance energético 46

CAPÍTULO 7. Hidrólisis de lípidos 51

CAPÍTULO 8. Determinación de triglicéridos y colesterol en suero 58

CAPÍTULO 9. Determinación de HDL y LDL en plasma 58

CAPÍTULO 10. Determinación de proteínas plasmáticas 58

CAPÍTULO 11. Determinación de vitamina C en alimentos vegetales 63

CAPÍTULO 12. Determinación de hemoglobina y urea 68

0 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PROLOGO

La química es una ciencia activa y en continuo movimiento; tiene una


importancia fundamental para nuestro mundo, tanto en el ámbito de la
naturaleza como de la sociedad. Sus orígenes son muy antiguos, pero como
se verá en este curso, es también una ciencia moderna y en continua
renovación.

La enseñanza de la Química equilibra el desarrollo teórico de sus


conocimientos con el trabajo experimental de Laboratorio como curso básico
que se imparte a los estudiantes de las diferentes Facultades de la
Universidad Científica del Sur, motivo por el cual la "GUIA DE
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA " está orientada exclusivamente hacia el
desarrollo de prácticas experimentales, con la finalidad de que el alumno
complemente conocimientos, genere habilidades y destrezas en la
manipulación de materiales, equipos e instrumental de Laboratorio,
incentivando así la adquisición de los hábitos del método científico -
observando los fenómenos que ocurren en los ensayos respectivos y tomando
datos necesarios para obtener resultados y conclusiones confiables.

Al término de cada práctica se propone un cuestionario de preguntas teóricas


y problemas variados, con el objetivo de reforzar los conocimientos adquiridos
en el desarrollo de las prácticas de Laboratorio realizadas.

Los Autores

1 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INSTRUCCIONES GENERALES Y MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

1. LABORATORIO DE QUÍMICA 1, 2, 3 y 4 UCSUR

El Laboratorio es un ambiente físico estratégico donde se desarrolla


diferentes experimentos, con la finalidad que el alumno complemente
conocimientos, genere habilidades y destrezas en la manipulación de
materiales, equipos e instrumental de laboratorio, incentivando así la
adquisición de los hábitos del método científico- observando los fenómenos
que ocurren en los ensayos respectivos y tomando datos necesarios para
obtener resultados confiables.

2. INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO


 Llegar puntual a las prácticas (tolerancia 5 minutos).
 Leer con anticipación la Práctica a realizar.
 Cada sesión de Laboratorio genera un Informe; el que será
entregado en la siguiente práctica en su respectivo horario. Es la
única fecha y la entrega es de carácter obligatorio. El informe se
debe desarrollar de acuerdo a formato que se encuentra en la Guía
de Práctica.
 La inasistencia injustificada a cualquier práctica impide al alumno
la presentación del informe correspondiente y por lo tanto tendrá
la nota mínima de cero.
 El alumno con inasistencia justificada deberá recuperar la
práctica durante la misma semana para lo que recabará de su
profesor de prácticas el formato de autorización correspondiente.

2 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

3. MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO


a) Higiene personal
 Queda terminantemente prohibido fumar, comer y/o beber
durante las prácticas en el laboratorio. Así mismo el uso de
celulares y otros equipos electrónicos.
 Se debe lavar las manos al finalizar el trabajo de laboratorio y
cada vez que se sospecha que ha estado en contacto con algún
material contaminado.
 Al entrar en contacto la piel con ácidos o bases fuertes, lavarse
inmediatamente con abundante agua. Para el caso de ácidos
aplicarse una solución saturada de bicarbonato, para las bases
utilice una solución al 5% de ácido acético (vinagre).
 Para quemaduras leves el área afectada se debe aplicar
inmediatamente una crema de picrato de Butesín.
 Mantener limpio el área de trabajo. Al derramar alguna
sustancia limpiar inmediatamente. Al final de la práctica dejar
todo el material limpio y ordenado.

b) Comportamiento de los alumnos durante las prácticas


 Está terminantemente prohibido ingresar a l Laboratorio
mochilas, carteras o bolsos, teléfono celulares, animales
domésticos, etc.
 Una vez que el alumno haya ingresado al laboratorio no puede
salir por ningún motivo.
 El trabajo con sustancias volátiles se debe realizar haciendo
uso de la campana extractora.
 Para diluir ácidos, siempre se debe agregar los ácidos al
agua, y no en sentido contrario.
 Cuidar como propio todo bien que encuentre o utilice en el
laboratorio. El alumno es responsable de los materiales
asignados para el desarrollo de la práctica, el deterioro implica
su reposición obligatoria.
 El manejo de materiales, reactivos y el desarrollo de los

3 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

experimentos sólo se realizan con autorización del profesor.


Los experimentos no autorizados están prohibidos.
 Observar cuidadosamente que los frascos con reactivos estén
etiquetados indicando el contenido y la concentración
respectiva, antes de ser usados.
 Obtener las sustancias químicas de los frascos de reactivos,
en un vaso de precipitados o en u n t u b o d e e n s a y o s
l i m p i o , c u i d a n d o d e no usar cantidades mayores que las
necesarias, está terminantemente prohibido regresar
sustancia alguna no utilizada al frasco original.
 Al encender el mechero Bunsen, primero encender el fósforo
y luego abrir la llave de gas.

c) Eliminación de residuos
 Los desechos sólidos, líquidos y las sales solubles, deben ser
depositados en los recipientes indicados por el profesor para
su posterior tratamiento.
 Todo desperdicio de papel o residuo sólido debe dirigirse al
respectivo recipiente de basura situados en ambas
paredes laterales de cada Laboratorio
 No se debe arrojar residuos sólidos al
lavadero.

4. ELEMENTOS DE PROTECCIÓN PERSONAL Y DE LOS EQUIPOS


a) Mandil
 Para cada sesión de prácticas el estudiante debe llevar un
mandil (guardapolvo), el cual es de carácter obligatorio.
Cuando el experimento lo amerite, los estudiantes usarán
lentes de seguridad industrial tipo MERCK.
 Los estudiantes vestirán sus mandiles antes de ingresar al
Laboratorio y dejarán de vestirlos a la finalización de las
actividades correspondientes.

4 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

b) Lentes de seguridad y respiradores


 Se debe usar lentes de seguridad cuando sea necesario
proteger la cara de salpicaduras y/o sustancias corrosivas.
Igualmente se utilizará respiradores cuando sea necesario. En
ambos casos el estudiante tiene a su disposición estos
materiales y los solicitará al responsable del laboratorio.
 En la parte lateral central del Laboratorio se encuentra la ducha
española, la que será usada para casos de salpicaduras o
derrames en el cuerpo de la víctima con sustancias ácidas,
básicas o corrosivas. Así mismo a la entrada parte izquierda se
encuentra un kit lavador de ojos que se aplicará directamente
al ojo de la víctima en caso de salpicadura de alguna sustancia
dañina al ojo.

c) Extinguidores contraincendios
 El alumno debe conocer el uso y la ubicación de los extintores
contra incendios que en caso de emergencia se descolgará
de la pared con cuidado. El extintor, en la parte superior tiene
una palanca circular que se saca (se tira) para activar y se
presiona la manija con la mano derecha y con la mano
izquierda se coge la manguera la cual se orientará hacia la
fuente de peligro.
 En el caso de incendiarse la ropa de una persona, se deberá
pedir ayuda inmediatamente, se debe estirar en el piso y
rodar sobre sí mismo para apagar las llamas. No se
recomienda utilizar el extintor sobre el cuerpo o rostro de una
persona.

5 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

d) Botiquín de primeros auxilios


 Existe un botiquín perfectamente identificado y de fácil acceso
cono los elementos necesarios para prestar primeros auxilios
en el laboratorio.
 Será responsabilidad de todos los usuarios del laboratorio
conocer la ubicación y el uso del botiquín y de los elementos
de protección personal.

5. TOMA DE DATOS
 Manipular con habilidad, criterio y en forma adecuada los
diferentes materiales de laboratorio.
 Desarrollar los experimentos en forma ordenada y con mucha
responsabilidad.
 Observar con mucho cuidado los fenómenos que ocurren durante
el desarrollo de los experimentos.
 Realizar las mediciones con precisión y efectuar las
anotaciones pertinentes, para obtener resultados satisfactorios
disminuyendo el margen de error. “un error mínimo al principio
puede ser máximo al final” (Aristóteles).
 Todo alumno deberá contar con una calculadora personal que
contenga como mínimo funciones de potencia y logaritmo. No se
permitirá usar celulares como calculadora personal.

6. SISTEMA DE EVALUACIÓN
Laboratorio: 35%
RUBRO %
Control de aprendizaje I 10
Control de aprendizaje II 10
Informes 5

6 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

CAPÍTULO

1
ESPECTROFOTOMETRÍA

7 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA N°1

ESPECTROFOTOMETRÍA

Conocimiento el uso y aplicación del espectrofotómetro.


Aplicación de la ley de Lambert – Beer en el empleo del
Logro de
espectrofotómetro.
aprendizaje:
Determinación de una curva de calibración con la solución de azul
de metileno.
MATERIALES

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 gradilla
 05 tubos de ensayo 13x100mm
 01 piseta con agua destilada
 02 pipeta graduada 10mL

II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

 01 solución de azul de metileno 1mg/dL frasco 100mL


 01 espectrofotómetro
 01 micropipeta 100-1000 µL y/o de 5-50µL
 12 cubetas para espectrofotometría
 12 puntas descartables respectivas

PROCEDIMIENTO

 Solución azul de metileno 1mg/dL


Pesar en la balanza analítica 1mg de azul de metilo. Mezclar 1mg/dL de azul de
metileno previamente pesados en 100mL de agua destilada. Agitar hasta que se
disuelva completamente.

8 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

Entre los diversos métodos de análisis de tipo cuantitativo que se utilizan para
la determinación de moléculas o elementos constitutivos de los organismos se
encuentra la espectrofotometría, que utiliza la medición de la intensidad de la
luz transmitida y/o absorbida, a determinada longitud de onda, por compuestos
químicos en solución.

I. Objetivos
 Conocer el uso y aplicación del espectrofotómetro.
 Aplicar la Ley de Lambert – Beer en el empleo del
espectrofotómetro.
 Determinar una curva de calibración, usando la solución de azul de
metileno.

II. Fundamento teórico


El paso de un haz de luz de una longitud de onda determinada a través
de una solución es reflejado en parte, mientras que la mayor fracción
de esta es absorbida por la sustancia disuelta. La absorción es
proporcional a la concentración del soluto.

La propiedad de una sustancia para absorber radiación de una


determinada longitud de onda es dependiente de su estructura
química. La ley de Lambert y Beer expresa las relaciones antes
mencionadas mediante la siguiente ecuación:

𝐼𝑜
𝐿𝑜𝑔 = 𝜀. 𝐼. 𝑐
𝐼𝑡

9 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

Io Luz incidente
It Luz transmitida
ɛ Coeficiente de extensión
Distancia recorrida por la luz a través de
I
la solución
c Concentración del absorbente

El log Io/It también se conoce como densidad óptica (D.O.) o


absorbancia de la solución y es directamente proporcional a la
concentración del soluto.

Para determinar la concentración de una determinada sustancia


puede hacerse uso del factor de calibración o de una curva de
calibración.

La preparación de una curva de calibración se realiza utilizando


concentraciones conocidas de la sustancia cuya concentración
deseamos conocer. Luego se determina la absorbancia de cada una
de dichas concentraciones y se procede a preparar un gráfico, donde
en el eje de abscisas se disponen las concentraciones de la sustancia
y en el eje de ordenadas la absorbancia.

 Factor de calibración
Se define como la relación que existe entre la concentración
del estándar y su respectiva absorbancia. Este factor puede
obtenerse de la siguiente manera:

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎

10 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

La concentración del estándar puede expresar como: mg/dL,


µg/dL, mEq/L, U/L, etc. Para encontrar la concentración de una
sustancia problema se multiplica el factor de calibración por la
absorbancia del problema, operación que se realiza de
acuerdo al siguiente procedimiento que se aplicará en el
desarrollo del experimento.

III. Parte experimental


 Preparación de una curva de calibración
Para elaborar una curva de absorción se preparará el siguiente
sistema:

Solución de azul de metileno 1mg/dL 1mL


Agua destilada 4mL

Luego se procederá a realizar lecturas en el espectrofotómetro a


las siguientes longitudes de onda: 560, 580, 600, 620, 640, 660,
680 y 700 nm.
Graficar utilizando papel milimetrado las absorbancias en función
de las longitudes de onda y determinar el pico de máxima
absorción de azul de metileno, el cual corresponde al mayor valor
de la absorbancia.

11 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

Preparar el experimento de la siguiente manera:

1 2 3 4 5

mL Azul de metileno 0.5 1 2 3 4


mL Agua destilada 4.5 4 3 2 1

Llevar el espectrofotómetro a cero. Luego leer los tubos a una


longitud de onda de 660 nm.
Graficar en un papel milimetrado los resultados, disponiendo las
concentraciones en el eje de abscisas en el eje de las ordenadas,
luego trazar una recta a través de los puntos obtenidos
experimentalmente.
Utilizando la curva de calibración o el factor de calibración
determinará la concentración de la sustancia problema en la
presente práctica.

12 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 1

INFORME
ESPECTROFOTOMETRÍA

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

13 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

CAPÍTULO

2
FACTORES QUE AFECTAN
LA ACTIVIDAD
ENZIMÁTICA

14 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA N°2

FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA


Determinación del efecto de la concentración del sustrato
Logro de Determinación del efecto de la concentración de la enzima
aprendizaje:
Determinación del efecto del pH sobre la actividad enzimática

MATERIALES

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 gradilla
 17 tubos de ensayo 13x100mm
 01 hígado de pollo (enzima fosfatasa ácida del hígado)
 01 termómetro
 01 piseta con agua destilada
 02 pipetas graduadas o volumétricas 10mL
 01 propipeta

II. REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 albúmina a [1.3] absorbancia 450nm frasco 12mL


 01 pepsina 2% frasco 3mL
 01 buffer acetato 0.1M pH 3.6 frasco 5mL

III. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

 01 baño maría 37°C o plancha de calentamiento


 01 beaker 250 mL
 01 termómetro

PROCEDIMIENTO
 Buffer Acetato 0.1M pH 3.6
Para obtener soluciones de buffer acetato 0.1M de pH 3.6 se deberá preparar:

Solución A (Acido acético 0.2M) medir 1,15 ml de ácido acético en una pipeta
de 2 ml. Colocar en una fiola de 100mL y aforar con agua destilada.
Solución B (Acetato de sodio 0.2M) pesar 2.72 g de Acetato de sodio en una
balanza analítica. Colocar en una fiola de 100mL y aforar con agua destilada.

Colocar en una fiola de 100 ml 46.3 de la solución A + 3.7 ml de la solución B y


aforar con agua destilada. Ajustar el pH si fuese necesario.

15 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

 Pepsina al 2%
Pesar 2g de pepsina en la balanza analítica, luego agregar agua destilada hasta
completar un volumen de 100mL.

 Albúmina [1.3] de Absorbancia a 450 nm

Solución madre: Cocer en un beaker de 1000 ml dos huevos (15 minutos


aproximadamente). Separar la clara y licuar con agua destilada a una capacidad
para 250 ml. Luego filtrar 2 veces con papel toalla.

Realizar una dilución de la solución madre de albumina a 3.7x (5.40 ml para cada
20 ml). Verificar con el espectrofotómetro una absorbancia de 1.3
aproximadamente a una longitud de onda de 450 nm.

16 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

Las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que tienen la propiedad de


acelerar las reacciones químicas sin modificar la constante de equilibrio del
sistema. Su actividad es afectada por diversos factores: concentración de
sustrato, pH, concentración de enzima, temperatura, inhibidores, fuerza iónica,
constante dieléctrica, etc.

I. Objetivos
 Explicar la actividad enzimática de la pepsina sobre la actividad de
la pepsina.
 Explicar el efecto de un factor enzimático sobre la actividad de la
pepsina.
 Determinar el Km y Vmáx experimental de la pepsina para la
albúmina a partir de la gráfica de Vi contra [S].
 Determinar el Km y Vmáx experimental de la pepsina para la
albúmina a partir de la gráfica de dobles recíprocas 1/Vi contra 1/[S].

II. Fundamento teórico


Los biocatalizadores específicos sintetizados por el organismo,
llamados enzimas, son proteínas que intervienen en las reacciones
biológicas, acelerando la velocidad de reacción hasta alcanzar su
punto de equilibrio. Las enzimas son sumamente específicas en las
reacciones que catalizan y en los compuestos (llamados substratos)
sobre los que actúan.

La cinética enzimática es el estudio del comportamiento de la


velocidad en reacciones catalizadas por enzimas. Las mediciones de
la cinética proporcionan una herramienta bioquímica muy útil para
calcular la concentración de una enzima en una muestra biológica y
comparar su actividad catalítica con la de otras enzimas. Además, las
mediciones cinéticas permiten describir de manera cuantitativa el
efecto de un veneno o medicamento sobre la actividad de una enzima.

La velocidad a la que procede una reacción enzimática está controlada


en parte por las concentraciones de la enzima y el substrato. A medida
que progresa la reacción, aumenta la concentración de los productos
a expensas de la desaparición de los correspondientes substratos, en
tanto que la concentración de la enzima no se altera.

17 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

La actividad enzimática puede expresarse:


a) Por la desaparición del Substrato (S)
b) Por la aparición de Productos (P)
c) Por modificación de Cofactores (C)
El mecanismo de reacción enzima-sustrato puede simbolizarse así:

[E] + [S]  [E] + [P]


C C’

Diversos factores modifican la actividad enzimática, tales como:


1) Concentración de Substrato [S]
2) Concentración de la Enzima [E]
3) pH del medio
4) Influencia de la temperatura
5) Efecto de inhibidores y activadores

En las siguientes prácticas estudiaremos el efecto de estos factores


sobre la actividad enzimática de la pepsina en presencia de albúmina.

La pepsina es un enzima proteolítico (proteasa ácida) segregada por


las células principales de las glándulas gástricas, tiene un peso
molecular de 34 644 Da. Hidroliza los enlaces peptídicos,
descomponiendo así las proteínas en aminoácidos. La pepsina solo
realiza la proteólisis en medio ácido, actúa a un pH bajo, por lo que es
precisa la presencia de ácido clorhídrico para la realización de la
digestión gástrica de las proteínas. Las células de las glándulas
gástricas no producen directamente pepsina, sino que su producto es
el pepsinógeno, sustancia precursora sin capacidad digestiva que se
convierte en pepsina en la luz de la glándula, al entrar en contacto con
el ácido clorhídrico y con la pepsina ya producida.

18 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

III. Parte experimental


 La actividad enzimática se medirá por la desaparición del
substrato (disminución de la turbidez en los tubos que contiene
albúmina), la cual se determinará en el Espectrofotómetro a 450
nm.

1 2 3 4 5 6 7 8 9
Agua
destilada 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 -
(mL)
HCl 1N
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 -
(mL)
Albúmina
5% (MmL) 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 -

Pepsina
2% P/V - - - - - - - - 4
(mL)

- Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 en el


espectrofotómetro. Considerar las Absorbancias como
Lectura Inicial.
- Luego, Incubar los nueve tubos a 37ºC por 5 min. Añadir
0.5 ml de pepsina a cada tubo (del tubo 9 a los tubos 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7 y 8). Incubar a 37ºC por 5 min o hasta que el
tubo 1 este claro.
- Detener la reacción colocando los tubos en un baño de
hielo.
- Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 en el
espectrofotómetro. Considerar las Absorbancias como
Lectura Final.

 Hacer la diferencia:
Actividad Enzimática = Lectura Inicial - Lectura Final
El resultado de ésta diferencia se considerará como Actividad
Enzimática.

 Graficar en papel milimetrado:


Actividad Enzimática en el eje Y versus [S] en el eje X.
1/Actividad Enzimática en el eje Y versus 1/[S] en el eje X.

 Calcular el Km y Vmáx de la pepsina en cada una de las


gráficas

19 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 2

INFORME
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

20 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

CAPÍTULO

3
DETERMINACIÓN DE
ÁCIDO ÚRICO EN SUERO
SANGUÍNEO

21 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA N°3

DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO EN SUERO SANGUÍNEO

Logro de
Determinación del ácido úrico en suero sanguíneo.
aprendizaje:
MATERIALES

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 gradilla
 04 tubos de ensayo 13 x 100mm
 01 piseta de agua destilada
 03 pipetas de 5mL
 03 propipetas

II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

 01 suero sanguíneo tubo con tapa rosca 1mL


 01 estándar de ácido úrico frasco 1mL
 01 reactivo de trabajo de urea frasco 3mL
 01 espectrofotómetro
 01 baño maría 37°C
 01 micropipeta 100-1000 µL y/o de 5-50µL
 12 puntas descartables respectivas
 12 cubetas para espectrofotometría
 01 vórtex

PROCEDIMIENTO

El personal técnico colocará en las mesas TODO el material requerido.

22 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

El ácido úrico es un compuesto que se forma en el organismo como producto de


excreción de las purinas. Los niveles séricos se encuentran elevados en diversas
enfermedades tales como: insuficiencia cardiaca crónica, leucemia, gota,
síndrome de Lesch – Nyhan, etc.

I. Objetivos
 Determinar el nivel de ácido úrico en el suero sanguíneo,

II. Fundamento teórico


La determinación de ácido úrico en suero se realiza utilizando dos
enzimas, la uricasa que transforma el ácido úrico en alantoína y la
enzima peroxidasa, que en presencia de 4 – aminofenazona forma
quinonimina de color rojo.

uricasa
Ácido úrico + 2H2O + O2 Alantoína + H2O2 + CO2

POD roja
2H2O2 + 4 – AF Quinonimina

III. Parte experimental


Preparar los siguientes medios de ensayo:

B x St

Suero o plasma (µL) - 20 -


Estándar (µL) - - 20
Reactivo de trabajo (mL) 1.0 1.0 1.0

Mezclar suavemente e incubar durante 5 minutos en baño maría a


37°C. Enfriar y leer la densidad óptica en el espectrofotómetro a 505
nm.

VALORES DE REFERENCIA:
Hombres: 2.5 – 6.0 mg/dL
Mujeres: 2.0 – 5.0 mg/dL

23 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 3

INFORME
DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO EN SUERO SANGUÍNEO

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

24 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

CAPÍTULO

4
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA
DEL ALMIDÓN

25 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA N°4

DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN

Logro de Identificar la digestión enzimática del almidón mediante la hidrólisis


aprendizaje: por efecto de la amilasa salival

MATERIALES

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 gradilla
 03 tubos de ensayo 13x100mm
 01 piseta con agua destilada
 02 pipetas graduadas o volumétricas 5mL
 02 pipetas graduadas o volumétricas 10mL
 01 propipeta

II. REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 tampón fosfato 0.1M pH 6.5 frasco 3mL


 01 almidón 1% frasco 6mL
 01 cloruro de sodio 0.5N gotero 25mL
 01 gotero con solución de Lugol

III. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

 01 baño maría 37°C

PROCEDIMIENTO
 Tampón Fosfato 0.1M pH 6.5
Para obtener las soluciones buffer fosfato 0.1M a pH de 6.5, se mezcla 68.5mL de
Solución 1 y 31.5mL de la Solución 2. Luego se completa a un volumen total de
200mL con agua destilada. (Para otro pH y concentración ver el Anexo 1).

Solución 1: 0.2M de NaH2PO4


Disuelva 24g de NaH2PO4 y lleve a un volumen de 1Litro con agua destilada.

Solución 2: 0.2M de Na2HPO4


Disuelva 53.6g de Na2HPO4*7H2O y lleve a un volumen de 1Litro con agua
destilada.

26 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

 Almidón 1%

Colocar 1L de agua en una plancha de calentamiento hasta llegar a ebullición.


Luego, añadir 10 gr de almidón hasta su disolución.

Conservación: Con el objetivo de que el almidón dure más tiempo, luego de la


ebullición se puede agregar 3gr de NaCl, disolver y añadir 10gr de almidón.

Verificación: Colocar en un tubo de ensayo 10 mL de la solución de almidón y


agregar 2-3 gotas de Lugol. La reacción positiva dará una coloración azul-violeta.

 Cloruro de sodio NaCl 0.5N

Medir un volumen de 29.25gr en una probeta, luego llevar a un recipiente y


agregar agua destilada hasta completar un volumen de 1L.

27 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

El almidón constituye un importante componente de la dieta de los seres


humanos. El proceso de digestión de este nutriente se inicia en la cavidad oral,
lugar en que actúa la α – amilasa salivar, enzima que tiene la propiedad de
hidrolizar los enlaces α 1.4 del almidón y forma polisacáridos de menor peso
molecular.
I. Objetivos
 Hidrolizar el almidón por efecto de la amilasa salival

II. Parte experimental


 Hidrólisis del almidón por efecto de la amilasa salival
Para realizar el experimento se prepararán los siguientes medios
de reacción:

1 2 3

Tampón fosfato 0.1M pH 6.5 (mL) 1.0 1.0 1.0

Almidón 1% (mL) 2.0 2.0 2.0

Cloruro de sodio 0.5N (mL) - - 1.5

Agua destilada (mL) 2.0 1.5 -

Colocar los tubos de ensayo en el baño maría a 37°C durante 2


minutos, luego adicionar:

1 2 3

Solución de saliva (mL) - 0.2 0.2

28 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

Colocar nuevamente los tubos en baño maría y sacar alícuotas de


0.5mL de cada uno de los tubos a los 5, 10, 15 y 20 minutos, y
adicionarlos a los tubos previamente preparados que contienen
2.0mL de ácido clorhídrico 0.5N, de acuerdo al siguiente esquema:

1 2 3

Cloruro de sodio 0.5N (mL) 2.0 2.0 2.0

Luego adicionar a cada tubo:

1 2 3

Solución de Lugol (gota) 1 1 1

Dejar en reposo durante 1 minuto y observar el color formado,


Durante el desarrollo del experimento se observarán
modificaciones del color inicial de los tubos como consecuencias
de la acción de la α – amilasa salival.
El experimento concluye cuando uno de los tubos muestre un color
pardo claro.

29 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 4

INFORME
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

30 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

CAPÍTULO

5
EFECTO DEL AYUNO
SOBRE EL CONTENIDO
HEPÁTICO

31 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA N°5

EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL CONTENIDO DE GLUCÓGENO HEPÁTICO

Logro de Identificación del glucógeno en un hígado en ayunas vs con comida.


aprendizaje:
MATERIALES

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 gradilla
 05 tubos de ensayo 13x100mm
 01 piseta con agua destilada
 04 embudos para tubos de ensayo
 01 plancha de calentamiento
 01 beaker 250mL
 03 pipetas graduadas o volumétricas de 5mL
 03 propipetas

II. REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 estándar de glucosa frasco 1mL


 01 alcohol etílico 5mL

III. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

 01 hidróxido de potasio ̴ KOH 30% 15mL


 01 beaker con hielo 250mL (colocar cuando sea solicitado por el docente)
 01 hígado de roedor en ayunas por 24h 3g
 01 hígado de roedor alimentado Ad libitum 3g
 01 kit de quirúrgico
 01 estándar de glucosa frasco 6mL

32 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PROCEDIMIENTO
 Hígado de roedor
Se deberán solicitar los roedores con 3 días de anticipación a los
colaboradores de veterinaria.
 Estándar de glucosa 5mg/dL
En la balanza analítica pesar 0.005g de glucosa (se puede emplear azúcar)
y luego agregar 100mL de agua destilada. Agitar y calentar. Dejar que
disuelva completamente y enfriar.
NOTA: Se debe preparer con al menos 1 día de anticipación.
 KOH 30%
En un beaker de 250mL colocar 75g de KOH y luego agregar agua
destilada hasta llenar los 250mL. Agitar hasta lograr una mezcla completa.

33 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

El hígado es el órgano que almacena glucógeno como un elemento de particular


importancia energética, que le permite al organismo mantener la glicemia
durante los periodos en que no se ingiere alimentos. A diferencia del tejido
muscular, el hígado puede degradar el glucógeno y liberar glucosa a la sangre.

I. Objetivos
 Identificar el glucógeno en un hígado en ayunas versus con comida.

II. Parte experimental


 Preparación de los animales de experimentación
Se dispondrá de 2 ratas en jaulas diferentes, una de las cuales
recibirá su dieta habitual, mientras que la otra será sometida a
un ayuno de 24 horas. A ambas se les proporcionará agua “ad
libitum”.

 Extracción del glucógeno


Se sacrificarán ambos animales previamente anestesiados con
cloroformo y se procederá a extraerles el hígado. Luego, se
realizará una observación del tamaño y color del mencionado
órgano.
Se pesará 0.5g de hígado de cada animal y se colocarán en
tubos de boca ancha, luego se les adicionará 1mL de KOH 30%.
Se colocará en la boca de cada tubo un embudo pequeño y se
le someterá a la ebullición por 30 minutos.
Después de enfriar, se les adicionará 3mL de agua destilada y
5mL de alcohol etílico.

NOTA: Se formará precipitado en aquel hígado que contenga


glucógeno.

1 2 3 4

Disolución de hígado en
1.0 - - -
ayunas (mL)
Disolución de hígado normal
- 1.0 - -
(mL)
Estándar de glucose 5mg/dL
- - 1.0 -
(mL)
Agua destilada (mL) - - - 1.0

34 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 5

INFORME
EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL CONTENIDO DEL GLUCÓGENO
HEPÁTICO

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

35 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

CAPÍTULO

6
CÁLCULO DEL BALANCE
ENERGÉTICO

36 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA N°6

CÁLCULO DEL BALANCE ENERGÉTICO

Calculo de las propias necesidades energéticas (gasto energético)


del alumno
Logro de Calculo de la ingesta energética del alumno
aprendizaje:
Determinación del balance energético del alumno
Determinación del % de adecuación de la dieta del alumno

Esta práctica no requerirá de materiales ni reactivos de Laboratorio.


Únicamente del Manual de laboratorio de Bioquímica I.

El docente podrá solicitar materiales adicionales, previo requerimiento


anticipado.

37 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

Los lípidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por acción de la lipasa
pancreática. En este proceso juegan un papel muy importante las sales biliares,
compuestos que tienen la propiedad de emulsionar los lípidos para una eficiente
acción de la lipasa pancreática.
El Balance Energético es el equilibrio que debe existir entre el gasto energético
y diario de un individuo, de acuerdo a su metabolismo basal, edad, sexo,
actividad física y la ingesta energética diaria a través de los macronutrientes de
los alimentos consumidos.
Si predomina el gasto energético sobre la ingesta energética, en un tiempo
prolongado, el individuo tiende a perder sus reservas, y como consecuencia se
adelgaza. Por otro lado, si predomina la ingesta, el exceso de energía se
acumulará en el cuerpo, en forma de triglicéridos, en el tejido adiposo,
observándose un aumento de peso.
Para realizar este balance, es necesario, calcular, en forma independiente, el
gasto energético en las 24 horas de cualquier día rutinario, de acuerdo a la tasa
metabólica basal (TMB) y la actividad física realizada, luego compararlo con la
ingesta energética que proporcionaron los alimentos consumidos el mismo día,
utilizando la Tabla de composición química de los alimentos peruanos y Tabla
auxiliar de alimentos peruanos.

I. Objetivos
 Calcular las propias necesidades energéticas (gasto energético)
del alumno
 Calcular la ingesta energética del alumno
 Determinar el balance energético del alumno
 Determinar el % de adecuación de la dieta del alumno

II. Parte experimental


 Calcular la ingesta energética, utilizando:
- Tabla de trabajo
- Listado de alimentos consumidos en 24 horas
- Tabla de composición química de alimentos peruana
- Tabla auxiliar de alimentos peruana

DISPONIBLE EN:
-Tablas Auxiliares para la Formulación y Evaluación de Regímenes Alimentarios (CENAN)
http://www.ins.gob.pe/repositorioaps/0/5/jer/doc_tec_norm/TAFERA_1_compressed.
pdf
- Tablas Peruanas de Composición de Alimentos (CENAN)
http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Tabla%20de%20Alimentos.pdf

38 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

“CÁLCULO DE LA INGESTA ENERGÉTICA”

a) En la lista de consumo de alimentos, desglosar las preparaciones de


todo el día en cada uno de sus constituyentes. En columnas ordenadas
calcular mediante regla de tres el contenido de proteínas, grasas y
carbohidratos de cada alimento respectivamente, según la cantidad que
se haya consumido.
Ejemplo 1:
 Ingesta de leche fluida de vaca = 250 mL
 Leche fluida de vaca en 100 mL contiene 3.1gr de proteínas
Para calcular la cantidad de proteína que existe en 250 mL de leche
fluida de vaca:
Leche fluida de vaca en 250 mL “x”
Leche fluida de vaca en 100 mL 3.1gr de proteínas

X = 7.75gr de proteínas

Ejemplo 2:
 Ingesta de pulpa de carne vacuno = 90gr
 Pulpa de carne vacuno en 100gr contiene 21.3gr de proteínas
 Para calcular la cantidad de proteína que existe en 90gr de pulpa
de carne de vacuno:
Pulpa de carne de vacuno en 90gr “x”
Pulpa de carne de vacuno en 100gr 21.3gr de proteínas

X = 19.17gr de proteínas

La tabla de Composición química de los alimentos


indica los valores en 100 g de porción comestible
cruda (a menos que indique los valores en cocido).

39 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

b) Totalizar luego de cada una de las tres columnas, y el valor obtenido


en gramos de cada macronutriente se multiplica por el factor
respectivo.

Proteína x 4.0 Kcal

Grasa x 9.0 Kcal

Carbohidratos x 4.0 Kcal

c) Sumar los totales, y el resultado obtenido corresponde a la cantidad de


energía (Kilocalorías) que aportan los alimentos consumidos ese día.

TABLA DE TRABAJO

Cantidad Proteína Grasa CHO


Cantidad Energía
ALIMENTO en medida (gr) (gr) (gr)
(gr) (Kcal)
casera

Desayuno

SUB – TOTAL

ALMUERZO

SUB – TOTAL

CENA

SUB – TOTAL

MERIENDAS

SUB – TOTAL
FACTOR x4 x9 x4
TOTAL (Kcal)

Ingesta Energética = Ʃ (kcal)/d

40 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

 Calcular el gasto energético, utilizando:


- Ecuaciones para calcular la tasa metabólica basal (TMB)
- Tabla de categorías y factores de la actividad física

“CÁLCULO DEL GASTO ENERGÉTICO”

G.E. = TMB x FACTOR DE ACTIVIDAD

a) Se calcula la tasa metabólica basal (TMB) o gasto en reposo, aplicando


la fórmula de la siguiente tabla:

Ecuaciones para calcular la tasa metabólica basal (TMB) a partir del


peso corporal (P).

RANGO DE EDAD (años) Kcal/día


HOMBRES
0–3 60.9 (P) – 54
3 – 10 22.7 (P) + 495
10 – 18 17.5 (P) + 651
18 – 30 15.3 (P) + 679
30 – 60 11.6 (P) + 879
> 60 13.5 (P) + 487
MUJERES
0–3 61.0 (P) – 51
3 – 10 22.5 (P) + 499
10 – 18 12.2 (P) + 746
18 – 30 14.7 (P) + 496
30 – 60 8.7 (P) + 829
> 60 10.5 (P) + 596
Fuente: Organización Mundial de la Salud (OMS). 1985.

41 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

Ejemplo 1:

La TMB para una estudiante de 19 años de edad, con 55 kg. de peso,


será:

TMB = 14.7 (P) + 496


TMB = 14.7 (55) + 496
TMB = 1305 Kcal/d

b) Con la lista de actividades, se agrupan éstas por categorías, tomando


en cuenta el tiempo empleado (en minutos) y multiplicándolas por el
múltiplo de la TMB o factor de actividad (o gasto de energía promedio
por actividad). Las categorías de actividad física son las siguientes:

ACTIVIDAD FÍSICA CATEGORÍA MÚLTIPLO DE LA TMB o


FACTOR DE ACTIVIDAD
Dormir, descansar Reposo 1.0
Manejando automóvil,
escribiendo a máquina,
atendiendo a clase, trabajando Muy ligera 1.5
en laboratorio, viendo TV,
cocinando, planchando, jugando
cartas, tocando un instrumento
musical
Caminando a 4 – 5km/h,
atendiendo al público, limpieza Ligera 2.5
de la casa, cuidando niños,
trabajo de carpintería y
electricidad, jugar tenis de mesa
Caminando a 5.5 – 6.5km/h,
manejando bicicleta, bailando, Moderada 5.0
trabajando en jardinería,
cargando bultos pesados
Jugando fútbol, vóley, básquet,
caminando con carga pesada Pesada 7.0
cuesta arriba, cortando árboles,
trabajo de excavación manual

* Asignar 1/3 de hora para el mantenimiento cardiovascular y


muscular. Recomendación FAO/OMS 1985.

42 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

1) Ordenar las actividades de acuerdo al tiempo empleado:

HORA ACTIVIDAD TIEMPO


6:00 – 6:15 a.m. Aseo personal 15´
6:15 – 6:45 a.m. Tomar desayuno 30´
Caminar para tomar el
6:45 – 7:00 a.m. 15´
bus
7:00 – 8:00 a.m. Viajar en bus 60´
8:00 – 10:00 a.m. Asistir a clase 120´
etc. (Debe completar 1440 minutos).

2) Agrupar por categoría de actividad:

TIEMPO MÚLTIPLO DE FACTOR DE


CATEGORÍA EMPLEADO LA TMB O TMB
DE ACTIVIDAD (HORA) FACTOR DE PONDERADO
ACTIVIDAD

En reposo 8 1.0 8.0


Muy ligera 14 1.5 21.0
Ligera 2 2.5 5.0
TOTAL 34.0
Promedio / hora 1.417
(Factor TMB/24h)
Gasto energético 1850.0
(1.417 x TMB)

Gasto Energético = 1850 Kcal/d

 Calcular el balance energético:

Balance Energético = Ingesta Energética – Gasto Energético

Obtener la respuesta respetando el signo (+) (exceso) ó (-)


(déficit)
EQUILIBRIO Ingesta energética = Gasto energético
BALANCE (+) Ingesta energética > Gasto energético
BALANCE (-) Ingesta energética < Gasto energético

43 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

 Calcular el porcentaje de adecuación de la dieta

𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔í𝑎 𝑖𝑛𝑔𝑒𝑟𝑖𝑑𝑎
% 𝑑𝑒 𝑎𝑑𝑒𝑐𝑢𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑥 100
𝐸𝑛𝑒𝑟𝑔í𝑎 𝑟𝑒𝑞𝑢𝑒𝑟𝑖𝑑𝑎

Energía ingerida = Ingesta de alimentos


Energía requerida = Gasto energético

Analizar el % de adecuación de la dieta obtenido, según los


siguientes parámetros:

VALORES NORMALES 90 – 110%


DÉFICIT < 90%
EXCESO > 110%

44 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 6

INFORME
CÁLCULO DEL BALANCE ENERGÉTICO

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

45 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

CAPÍTULO

7
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA
DE LOS LÍPIDOS

46 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA N°7

HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS LÍPIDOS

Logro de Comprender la acción hidrolítica de las enzimas sobre los lípidos.


aprendizaje:
MATERIALES

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 gradilla
 05 tubos de ensayo 13x100mm
 01 piseta con agua destilada
 01 bureta de 25Ml
 01 soporte universal con pinza mariposa

II. REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 fenolftaleína gotero 25mL


 01 hidróxido de sodio ̴ NaOH 0.05N gotero 25mL

III. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

 01 solución de pancreatina 1% frasco 100 mL


 01 sales biliares 1% frasco 50 mL
 01 aceite vegetal 30 mL
 01 tampón fosfato 0.1M pH 7.8 frasco 5 0mL

PROCEDIMIENTO

 Fenolftaleína
Pesar 1.25gr de fenolftaleína y diluir con etanol al 95% hasta un volumen
de 250mL.
 Hidróxido de sodio NaOH 0.05N
Pesar 1.9g de NaOH en la balanza analítica, luego agregar agua destilada
hasta completar un volumen de 1L. (¡PRECAUCION!, la reacción es
exotérmica, es decir que desprende calor).
Es recomendable almacenar en envases de plástico para mayor duración
del reactivo.
 Pancreatina al 1%
En un beaker de 1L colocar 10gr de Pancreatina y luego agregar agua
destilada hasta llenar 1L. Agitar hasta lograr una mezcla completa.
 Sales biliares al 1%
En un beaker de 1L colocar 10gr de Sales Biliares y luego agregar agua
destilada hasta llenar 1L. Agitar hasta lograr una mezcla completa.

47 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

 Tampón fosfato 0.1M pH 7.8


Para obtener las soluciones buffer fosfato 0.1M a pH de 7.8, se mezcla 8.7mL
de Solución 1 y 91.3mL de la Solución 2. Luego se completa a un volumen
total de 200mL con agua destilada.

Solución 1: 0.2M de NaH2PO4


Disuelva 24g de NaH2PO4 y lleve a un volumen de 1Litro con agua destilada.

Solución 2: 0.2M de Na2HPO4Disuelva 53.6g de Na2HPO4*7H2O y lleve a


un volumen de 1Litro con agua destilada.

48 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

Los lípidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por acción de la lipasa
pancreática. En este proceso juegan un papel muy importante las sales biliares,
compuestos que tienen la propiedad de emulsionar los lípidos para una eficiente
acción de la lipasa pancreática.

I. Objetivos
 Hidrolizar a los lípidos por la lipasa pancreática.

II. Parte experimental


Para la demostración experimental de la acción hidrolítica de esta
enzima, se prepararán los siguientes medios de reacción;

B 1 2 3

Tampón fosfato 0.1M (mL) 2.0 2.0 2.0 -


Aceite (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0
Sales biliares 1% (mL) 2.0 2.0 - 2.0
Agua destilada (mL) 5.0 - 2.0 2.0

Añadir 2 gotas de fenolftaleína a cada uno de los tubos, luego


adicionar gota a gota una solución de NaOH 0.05N hasta que aparezca
una coloración débilmente grosella estable, luego adicionar:

B 1 2 3

Pancreatina 1% (mL) - 5.0 5.0 5.0

Volver a incubar los tubos a la misma temperatura durante 1 hora,


agitándolos cada 5 minutos.

Al finalizar el tiempo de incubación, adicionar nuevamente a cada tubo


2 gotas de fenolftaleína y proceder a titular, utilizando una bureta, con
una solución de NaOH 0.05N hasta que aparezca nuevamente la
coloración ligeramente grosella.

Los resultados se expresarán como miliequivalentes de ácido


esteárico liberado por acción de la lipasa pancreática.

49 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 7

INFORME
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS LÍPIDOS

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

50 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

CAPÍTULO

8
DETERMINACIÓN DE
TRIGLICÉRIDOS Y
COLESTEROL EN SUERO

51 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA N°8

DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROL EN SUERO


Determinación del nivel de triglicéridos en suero sanguíneo.
Logro de
aprendizaje: Determinación del nivel de colesterol en suero sanguíneo.

MATERIALES

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 gradilla
 06 tubos de ensayo 13x100mm
 01 piseta con agua destilada
 03 pipetas graduadas o volumétricas de 5mL
 03 propipetas

II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

 01 suero tubo de tapa rosca 2mL


 01 estándar de triglicéridos frasco 2mL
 01 reactivo de trabajo para triglicéridos frasco 36mL
 01 estándar de colesterol frasco 2mL
 01 reactivo de trabajo para colesterol frasco 36mL
 01 espectrofotómetro
 01 micropipeta 10 – 100 µL y/o de 5 – 50 µL
 12 puntas descartables respectivas
 12 cubetas para espectrofotometría
 01 baño maría 37°C
 01 vórtex

PROCEDIMIENTO

El personal técnico colocará en las mesas TODO el material requerido.

52 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

La determinación de triglicéridos en plasma constituye un dato muy importante


en el manejo de ciertas dislipidemias. Su incremento en el plasma constituye un
factor de riesgo positivo para aterosclerosis.

I. Objetivos
 Determinar el nivel de triglicéridos en suero sanguíneo.

II. Fundamento teórico


Los triglicéridos del plasma son hidrolizados por una lipoproteína
lipasa (LPL) que forma como productos glicerol y ácidos grasos. El
glicerol en presencia de ATP por acción del glicerol quinasa es
convertido en glicerol – 1 – fosfato, compuesto que es convertido por
el glicerol fosfato oxidasa (GPO) en dihidroxiacetona fosfato y peróxido
de hidrógeno, este compuesto en presencia de 4 – aminofenazona (4
– AF), clorofenol y peroxidasa (POD) es transformado en una
quinonimina de color rojo.

LPL
Triglicérido Ácido graso + Glicerol

Glicerol quinasa
Glicerol + ATP ADP + Glicerol – 1 – fosfato

GPO
Glicerol – 1 – fosfato + O2 Dihidroxiacetona fosfato + H2O2

POD
2H2O2 + 4 – AF + clorofenol Quinonimia roja

53 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

III. Parte experimental

B x St

Suero o plasma (µL) - 20 -


Estándar de TGC (µL) - - 20
Reactivo de trabajo (mL) 2 2 2

Mezclar e incubar durante 5 minutos en baño maría a 37°C, luego leer


en el espectrofotómetro a 505 nm.

VALORES DE REFERENCIA:
< 150 mg/dL

54 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 8

INFORME
DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

55 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

.
El colesterol es una sustancia cuyos niveles en la sangre mantienen una
estrecha relación con diversas patologías, por cuyo motivo su determinación
puede contribuir al diagnóstico de: aterosclerosis, mixedema, diabetes mellitus,
nefrosis, hipertiroidismo, etc.

I. Objetivos
 Determinar el nivel de colesterol en suero sanguíneo

II. Fundamento teórico


La técnica utilizada para la determinación se fundamenta en la
hidrólisis previa de los ésteres de colesterol por la colesterol esterasa,
la posterior acción de la enzima colesterol oxidasa que formará
peróxido de hidrógeno en cantidades estequiométricas y finalmente la
participación de la peroxidasa que en presencia de reactivos químicos
formará un compuesto coloreado proporcional a la cantidad de
colesterol existente en la muestra de sangre.

Colesterol esterasa
Esteres de colesterol + H2O Colesterol + AGNE

Colesterol oxidasa
Colesterol + O2 Colesten – 3 – ona + H2O

Peroxidasa
2H2O2 + 4 – AF + fenol Quinonimia coloreada + 4 H2O

III. Parte experimental

B x St

Suero o plasma (µL) - 20 -


Estándar de colesterol (µL) - - 20
Reactivo de trabajo (mL) 2 2 2

Incubar durante 5 minutos en baño maría a 37°C y leer en el


espectrofotómetro a 505 nm.

56 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 8

INFORME
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

57 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

CAPÍTULO

9
DETERMINACIÓN DE HDL Y
LDL COLESTEROL EN
PLASMA

58 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA N°9

DETERMINACIÓN DE HDL Y LDL EN PLASMA


Determinación del nivel de HDL en plasma sanguíneo.
Logro de
aprendizaje: Determinación del nivel de LDL en plasma sanguíneo.

MATERIALES

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 gradilla
 06 tubos de ensayo 13x100mm
 01 piseta con agua destilada
 03 pipetas graduadas o volumétricas de 5mL
 03 propipetas

II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

 01 suero tubo de tapa rosca 2mL


 01 estándar de colesterol frasco 2mL
 01 reactivo de trabajo para HDL frasco 18mL
 01 reactivo de trabajo para LDL frasco 18mL
 01 reactivo de trabajo para colesterol frasco 10mL
 01 espectrofotómetro
 01 micropipeta 10 – 100 µL y/o de 5 – 50 µL
 12 puntas descartables respectivas
 12 cubetas para espectrofotometría
 01 baño maría 37°C
 01 vórtex

PROCEDIMIENTO

El personal técnico colocará en las mesas TODO el material requerido.

59 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

Las LDL y VLDL son precipitadas en forma selectiva con sulfato de dextrano en
presencia de iones magnesio, de tal manera que en el sobrenadante que se
obtiene después de centrifugar, quedan las HDL, donde se realiza la
determinación de colesterol que esta lipoproteína transporta.

I. Objetivos
 Determinar el nivel de HDL en plasma.
 Determinar el nivel de LDL en plasma.

II. Parte experimental


 Determinación de HDL:
Medir en un tubo de ensayo 200µL de suero o plasma luego
adicionarle 500µL del Reactivo precipitante, agitar durante 20
segundos y dejar en reposo por 15 minutos en baño de agua a una
temperatura de 4 – 10º C. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos
y proceder a preparar el siguiente sistema:

B x St

Sobrenadante (µL) - 10 -
Estándar de colesterol (µL) - - 10
Reactivo de trabajo HDL
(mL) 1.0 1.0 1.0

Incubar durante 10 minutos a 37°C y leer en el espectrofotómetro a


505 nm.

 Determinación de LDL
Las LDL se precipitan selectivamente con el uso de heparina,
quedando en el sobrenadante las HDL y VLDL. El colesterol que se
encuentran con estas lipoproteínas se determina enzimáticamente,
correspondiendo el valor de las LDL a la diferencia entre el colesterol
total y el determinado en este sobrenadante.

Medir en un tubo de ensayo 50µL de suero o plasma luego adicionarle


500µL del Reactivo precipitante, agitar durante 20 segundos y dejar
en reposo por 15 minutos en un baño a 20 – 25º C. Centrifugar a 3000
rpm y separar inmediatamente el sobrenadante. Preparar el siguiente
esquema:

60 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

B x St

Sobrenadante (µL) - 10 -
Estándar de colesterol (µL) - - 10
Reactivo de trabajo LDL
(mL) 1.0 1.0 1.0

Incubar durante 10 minutos a 37°C y leer en el espectrofotómetro a


505 nm.

VALORES DE REFERENCIA
HDL 0,40 - 0,60 g/l
LDL
Riesgo bajo < 1.29 g/l
Riesgo moderado 1.30 – 1.89 g/l
Riesgo muy elevado ≥ 1.90g/l

61 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 9

INFORME
DETERMINACIÓN DE HDL Y LDL EN PLASMA

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

62 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

CAPÍTULO

10
DETERMINACIÓN DE
PROTEÍNAS PLASMÁTICA

63 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA N°10

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

Determinación el nivel de las proteínas plasmáticas total en el suero


Logro de sanguíneo.
aprendizaje:
Determinación el nivel de albúmina en el suero sanguíneo.

MATERIALES

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 gradilla
 04 tubos de ensayo 13 x 100mm
 01 piseta de agua destilada
 03 pipetas de 5mL
 03 propipetas

II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

 01 suero sanguíneo tubo con tapa rosca 1mL


 01 estándar de proteínas frasco 1mL
 01 reactivo BCF frasco 11mL
 01 reactivo EDTA/Cu frasco 11mL
 01 espectrofotómetro
 01 espectrofotómetro
 01 baño maría 37°C
 01 micropipeta 100-1000 µL y/o de 5-50µL
 12 puntas descartables respectivas
 12 cubetas para espectrofotometría
 01 vórtex

PROCEDIMIENTO

El personal técnico colocará en las mesas TODO el material requerido.

64 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

Las proteínas plasmáticas cumplen diversas funciones que son muy importantes
para un apropiado funcionamiento de los diversos tejidos del organismo. Pueden
cumplir cuantitativa es muy útil para el diagnóstico de algunas patologías como:
desnutrición, deshidratación, cirrosis, etc.

I. Objetivos
 Determinar el nivel de las proteínas plasmáticas total en el suero
sanguíneo.
 Determinar el nivel de albúmina en el suero sanguíneo.

II. Parte experimental


 Determinación de proteínas plasmáticas total (Método de
Biuret)
La determinación de las proteínas totales se realiza utilizando iones
cúpricos que en medio alcalino reacciona con las proteínas
formando compuestos de coordinación de color violeta, cuyo pico
de máxima absorción es de 540 nm y su intensidad es proporcional
a la concentración de proteínas.
Preparar los siguientes medios de reacción:

B x St

Agua destilada (µL) 50 - -


Suero o plasma (µL) - 50 -
Estándar de proteínas (µL) - - 50
Reactivo EDTA/Cu (mL) 3.5 3.5 3.5

Incubar durante 15 minutos a 37°C y leer en el espectrofotómetro


a 540 nm.

VALORES DE REFERENCIA:
6.0 – 8.3 g/dL

65 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

 Determinación de albúmina
La albúmina reacciona con el bromo cresoldulfonftaleína a pH 3.8
formando un compuesto coloreado que absorbe a 625 nm.
Preparar el siguiente sistema:

B x St

Suero o plasma (µL) - 10 -


Estándar de albúmina (µL) - - 10
Reactivo BCF (mL) 3.5 3.5 3.5

Colocar los tubos en una gradilla a temperatura ambiente durante


10 minutos y leer en el espectrofotómetro a 625 nm.

VALORES DE REFERENCIA:
3.0 – 5.0 g/dL

66 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 10

INFORME
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

67 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

CAPÍTULO

12
DETERMINACIÓN DE
HEMOGLOBINA –
DETERMINACIÓN DE UREA

68 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA N°12

DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA Y UREA


Determinación de hemoglobina en sangre.
Logro de
aprendizaje: Determinación de urea en suero sanguíneo.

MATERIALES

I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

 01 gradilla
 05 tubos de ensayo 13x100mm
 01 piseta con agua destilada
 01 pipeta volumétrica o graduada 5 mL
 01 pipera volumétrica o graduada 10 mL
 02 propipetas

II. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

 01 sangre tubo tapa rosca 2mL


 01 estándar de hemoglobina frasco 1mL
 01 reactivo de trabajo para hemoglobina frasco 11 mL
 01 suero tubo de tapa rosca 2mL
 01 estándar de urea (0.60g/L) frasco 1mL
 01 ureasa frasco 1 mL
 01 reactivo de trabajo 1 frasco 12 mL
 01 reactivo de trabajo 2 frasco 12 mL
 01 espectrofotómetro
 01 micropipeta 10 – 100 µL y/o de 5 – 50 µL
 12 puntas descartables respectivas
 12 cubetas para espectrofotometría
 01 baño maría 37°C
 01 vórtex

PROCEDIMIENTO

El personal técnico colocará en las mesas TODO el material requerido.

69 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

La hemoglobina es una proteína que tiene un papel muy importante en el


transporte de gases en todo el organismo. Sus niveles en sangre mantienen una
estrecha relación con la anemia, policitemia o deshidratación.

I. Objetivos
 Determinar el nivel de hemoglobina en sangre.

II. Fundamento teórico (Método de Drabkin)


La determinación de hemoglobina se realiza utilizando el reactivo de
Drabkin, en cuya composición se encuentra el ferricianuro de potasio,
cianuro de potasio y bicarbonato de sodio. El ferricianuro transforma
las hemoglobinas en metahemoglobina, compuesto que luego
reacciona con el cianuro de potasio para formar
cianometahemoglobina, que tiene la propiedad de absorber a 540 nm.

III. Parte experimental

B x St

Sangre (µL) - 20 -
Estándar de hemoglobina
(µL) - - 20
Reactivo de trabajo (mL) - 5 5
Agua destilada (mL) 5 - -

Mezclar y después de 3 minutos leer en el espectrofotómetro a 540


nm.

70 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 12

INFORME
DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

71 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

INTRODUCCIÓN

La urea es un compuesto nitrogenado que se sintetiza en el hígado a partir del


ion amonio, bicarbonato y ATP. La enzima que cataliza esta primera reacción es
la carbamoil fosfato sintetasa I, cuya actividad es regulada por el N – acetil
glutamato. La excreción de urea por la orina depende fundamentalmente de la
ingesta proteica. Un incremento de urea en sangre puede ocurrir a causa de una
probable disfunción renal.

I. Objetivos
 Determinar el nivel de urea en suero.

II. Fundamento teórico


La determinación de urea en orina se fundamenta en la acción que
ejerce la enzima ureasa sobre la urea, descomponiéndola en anhídrido
carbónico y amoniaco. Este amoniaco reacciona con hipoclorito y fenol
en medio alcalino, formando un compuesto coloreado denominada
azul de indofenol, cuya intensidad es proporcional a la concentración
de urea.

III. Parte experimental


Preparar el siguiente sistema:

B x St

Estándar de urea (µL) - - 20


Suero (µL) - 20 -
Ureasa (gota) 1 1 1

Mezclar mediante agitación e incubar a 37°C por 5 minutos.

B x St

Reactivo 1 (mL) 1 1 1
Reactivo 2 (mL) 1 1 1

Mezclar e incubar 37°C por 5 minutos y leer en el espectrofotómetro a


540 nm.

72 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.


GUÍA DE LABORATORIO 2019 - I

PRÁCTICA 12

INFORME
DETERMINACIÓN DE UREA

Apellidos Nombres N° Mesa Fecha

INTRODUCCIÓN

OBJETIVOS

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

73 Autores: Salazar, J.; Salazar, Y.