Cultivo de Embriones de Vasconcellea Candicans

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL
FACULTAD CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA
Escuela Profesional de Biología
CULTIVO DE EMBRIONES DE Vasconcellea candicans

(A Gray.)
Tesis para optar el Título de Licenciado en Biología
Bach. JAIME BERNABE MANSILLA CORIMANYA
Lima, Perú
2010
AGRADECIMENTOS
A Dios, a pesar que no hice muchos méritos, pero le agradezco de todo corazón
lo que me ha dado, mucho para un hijo.
A mis padres por su gran apoyo incondicional que permitieron realizar mis
sueños.
Mis agradecimientos a mi asesor Rafael La Rosa, Jefe del Laboratorio de
Ecofisiología Vegetal cuya formación y asesoramiento permitió desarrollarme
profesionalmente.
Al Biólogo Augusto Mendoza por su dedicación y gran amor por las Lomas.
Al Biólogo Roobert Jiménez, amigo de muchos trabajo de investigación por su
interés en las lomas, su pasión por los Mitos y gracias a su aporte me permitió
el desarrollo del presente trabajo.
A la Bióloga Guisella Coronel Guevara por su apoyo incondicional en mi vida
tanto en lo personal y lo profesional.
A la Biologa Nelly Canto por su apoyo en los momentos de flaqueza, por las
largas caminatas en las lomas y los proyectos que realizamos.
No puedo dejar de expresar mi agradecimiento a los técnicos de laboratorio en
especial a Francisco “Panchito”, Vicenta, Denia y Mara.
A mis amigos del laboratorio de Ecofisiologia Vegetal aunque algunos ya los he
mencionado: Catherine Espinoza, José Manrique, Meylin Vásquez, Roobert
Jiménez, Nelly Canto, Fabiola Guzmán, Guisella Coronel, Johana López y
Sandra Villar.
DEDICATORIA
A un gran maestro y amigo

Augusto Mendoza, que Díos lo
tenga en su gloria!!!
INDICE
ABSTRACT
I.- INTRODUCCIÓN 1
II.- MARCO TEORICO 3
2.1.- ANTECEDENTES 3
2.2.- GENERALIDADES 4
2.2.1.- Fenología de Vasconcellea candicans 4
2.2.2.- Taxonomía 4
2.2.3 Descripción morfología de Vasconcellea candicans 5
2.2.4.- Distribución de Vasconcellea candicans 5
2.2.5.- Importancia del cultivo de Vasconcellea candicans 6
2.2.6.- La semilla 8
2.2.7.- Germinación y dormancia 8
2.2.8.- La dormancia y su papel en la ecología 9
2.2.9.- Reguladores de crecimiento en la germinación 10
2.2.10.- Cultivo de Tejidos Vegetales 11
2.2.11.- Cultivo de Embriones 13
III.- MATERIALES Y MÉTODOS 14
3.1.- MATERIALES 14
3.1.1.- Material biológico 14
3.1.2.- Material del laboratorio 14
3.2.- METODOS 14
3.2.1.- Diseño experimental 14
3.2.1.1.- Lugar de ejecución 14
3.2.1.2.- Recolección de Semillas 15
3.2.1.3.- Limpieza y Desinfección de la semilla 15
3.2.1.4.- Escarificación de semilla de V. candicans 16
3.2.1.5.- Estandarización de cultivo de embriones 17
3.2.1.6.- Crecimiento de las plántulas obtenidas del cultivo de embriones 18
3.2.2.- Diseño Estadístico 20
IV.- RESULTADOS 21
4.1.- Limpieza y desinfección de las semillas 21
4.2.- Germinación producida por la escarificación de las semillas de mito 22
4.3.- Evaluación del porcentaje de germinación de las semillas 23
4.4.- Crecimiento de las plántulas obtenidas del cultivo de embriones 25
V.- DISCUSIÓN 30
VI.- CONCLUSIONES 33
VII.- RECOMENDACIONES 34
VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 35
IX.- ANEXOS 42
CULTIVO DE EMBRIONES DE Vasconcellea candicans (A Gray.)
RESUMEN
Vasconcellea candicans Gray “Mito” (CARICACEAE), es una especie de
valor ecológico en las lomas que está en peligro de desaparecer debido al
sobre pastoreo de ganado caprino, tala indiscriminada y la falta de regeneración
adecuada de individuos. Por estas razones se propuso desarrollar un sistema
de regeneración in vitro usando embriones. Como medio básico se usaron sales
hidropónicas, suplementado con azúcar comercial 3 % (p/v), agar 0.8 % (p/v),
vitaminas del complejo B COFANA ® 0,5 % (v/v) y un factorial de las siguientes
hormonas AG3 (0; 0,5; 1 y 1,5 ppm) y AIA (0, 0.5, 1 y 1.5) con pH de 5.6 y una
CE de 1.5 mS. En una cámara de siembra estéril se sembraron semillas
completas, con y sin escarificación, en medio sin hormonas, obteniéndose
solamente imbibición en ambos tratamientos después de 30 días de sembrado.
Después se sembraron sólo embriones, mostrando un 94% de germinación en
el medio donde está presente AG3 (1 ppm) y AIA (0.5 ppm) a los 6 días
después de realizada la siembra. Estos resultados nos indican que el factor que
induce la dormancia de los embriones está presente en la cubierta seminal, por
lo que al ser retirada los embriones germinan rápidamente. Esta técnica debería
ser usada para conseguir, posteriormente, reforestar los ecosistemas de lomas,
propios de la costa peruana, y así hacer un uso racional de este recurso.

ABSTRACT
Vasconcellea candicans GRAY “Mito”, specie of ecological value in hills,
that is in danger of disappearing, due to overgrazing by goats, indiscriminate tree
felling and lack of regeneration of individuals. For these reason we proposed to
develop in vitro regeneration system using embryos. As basal medium were used
hydroponic salts, supplemented with 3% (w/v) commercial sugar; 0,8 % (w/v) agar-
agar; 5 % B-complex vitamins from Cofana® and hormonal combinations of GA3
(0; 0,5; 1; 1,5 ppm) and IAA (0; 0,5; 1; 1,5 ppm) at 5,6 of pH and 1,5 mS of
electrical conductivity. The seeds were collected from immature fruits, sowing was
conducted in a chamber seeding and sterilized previously with a fluorescent UV-C.
Seeds were sown complete with and without scarification, in medium without
hormones, obtaining only imbibition in both treatments after 30 days of sowing.
Then we planted only embryos, showing 96 % germination after 6 days on the
medium with 1 ppm GA3 and 0,5 ppm IAA. These results showed that dormancy
from embryos germinate rapidly. This technique should be used to reforest the
typical hills from Peruvian coast, and thus make a rational use of this resource.
I.- INTRODUCCIÓN
Vasconcellea candicans Gray “Mito” (CARICACEAE), conjuntamente con
las lomas de la costa de Lima, están en peligro de desaparecer, debido
fundamentalmente al sobrepastoreo del ganado caprino, tala indiscriminada del
estrato arbóreo-arbustivo (Rostworowski, 1981). Además, no existe una
regeneración adecuada de individuos de V. candicans, debido a no tener éxito
de manera natural su germinación, por lo que el Instituto Nacional de Recursos
Naturales (INRENA) lo ha incluido dentro de su lista de especies amenazadas
(categoría: CR) (INRENA, 2006).
A pesar que V. candicans es una especie de valor ecológico y económico
con gran potencialidad para su agrosilvicultura, especialmente en tierras sin
capacidad de uso agrícola, aún no se ha puesto en práctica un sistema que
consiga la formación de rodales de mito, para la recuperación de las lomas
costeras del Perú. (Mendoza, 2004; comunicación personal)
Las técnicas de propagación in vitro nos dan la ventaja, que se puedan
imitar las condiciones de campo en el laboratorio, además de manejar muchos
más individuos que lo que se haría en campo, y estudiar de esta manera las
respuestas de la especie cuando es sometida a estrés (Hurtado y Merino,
1994).
En la presente investigación tiene como objetivo principal de:
Estandarizar un protocolo para el cultivo de embriones de Vasconcellea
candicans en condiciones in vitro. Así como también los siguientes objetivos
específicos: a) Obtener un método de desinfección de semillas para la
1
extracción de embriones de Vasconcellea candicans b) Determinar la influencia
de la testa de la semilla en la germinación de semilla de Vasconcellea
candicans; y c) Evaluar el crecimiento de las plántulas obtenidas de embriones
de Vasconcellea candicans en un medio basal alternativo de sales
hidropónicas. Con el fin de obtener una regeneración adecuada de individuos
de V. candicans para un posterior programa de reforestación en las lomas
costeras.
2
II.- MARCO TEORICO
2.1.- ANTECEDENTES
El cultivo de embriones permite que estos germinen y se desarrollen en
plantas (Burgos y Ledbetter, 1993). Las técnicas de rescate de embriones se
han desarrollado para numerosas especies y se han utilizado rutinariamente en
los programas de mejoramiento. Esta tecnología permite la recuperación de una
creciente progenie, incluyendo progenie de cruces interesantes que de otra
manera podrían perderse. (Scemama y Raquin, 1990; Sharma et al., 1996).
Bhattacharya y Khuspe (2001) obtuvieron un promedio de germinación
máxima de 95 % a los 7-8 días por cultivo de embriones de Carica papaya en el
medio Murashige and Skoog (MS) suplementado con Thidiazuron (1.0 μM/L).
Trabajos realizados por Soto (1999) muestran que solo el 5 % de las
semillas germinan en una cámara de germinación, mientras que con el cultivo
de embriones se obtuvo 60% de germinación en medio de White. Además el
establecimiento de yemas in vitro de plántulas provenientes del cultivo de
embriones de mito, resultó en medio MS con 0,1 ppm de ácido-3-indolacético
(AIA) y 0,5 ppm de 6-bencilaminopurina (BAP). Por último la micropropagación
de los explantes se logró en medio Murashige and Shoog con 0,5 ppm de BAP
y 0,1 ppm de AIA así como con 0,5 ppm de BAP y 2,0 ppm de AG3.
3
2.2.- GENERALIDADES
2.2.1.- Fenología de Vasconcellea candicans
Uno de los aspectos más importante es su adaptación al medio xerófito
donde se desarrolla, se presenta deciduo en la época seca, además su tallo
tiene características subfrutescentes. Su fenología varía si se desarrolla o en
las lomas o en el flanco andino (Weberbauer, 1945; Torres, J. y López, C.
1981). En las lomas la floración ocurre en los meses de Enero, Febrero, Marzo,
la fructificación entre Abril y Mayo, de Junio a Octubre están frondosos, se
presentan caducifolios entre Octubre, Noviembre, Diciembre. En la sierra,
ocurre lo contrario, en los meses de Enero a Mayo se presentan con follaje, en
los meses de Junio a Diciembre se mantienen defoliados, la floración ocurre
entre Julio y Agosto, la fructificación entre Septiembre y Octubre (Cuya, 1992).
2.2.2.- Taxonomía
De acuerdo al sistema de clasificación filogenético de Cronquist (1988)
División: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Orden: Parietales
Familia: Vasconcelleaceae
Genero: Vasconcellea
Especie: Vasconcellea candicans (A. Gray)
Nombre vulgar: mito, ulicana, papayo, jerju, quemish, ckemish.
(Soukup, 1970)
4
2.2.3.- Descripción morfológica de Vasconcellea candicans
Es un arbusto pluviofolio, diocos en cuanto a su altura puede alcanzar
alturas de entre 6 y 8 metros. Sus hojas son palmado-pentalobuladas, verdes
oscuras, de envés blanquecido y pubescentes, coriáceas y de pecíolo robusto.
(Mac Bride, 1941).
Sus flores son unisexuales, amarillo blanquecino o verdusca. Las flores
masculinas se agrupan en inflorescencia racemosas. Las flores femeninas se
presentan solitarias (Mac Bride, 1941).
Sus frutos son tipos bayas, aromáticos, amarillos verdosos, ovalados
(cortos o alargados) con cinco protuberancias longitudinales, de tamaño que
van entre 12 a 15 cm. de largo a 6 a 7 cm. de ancho y pesos de hasta 300 g
(Mac Bride, 1941; Calderon, 1988; Cordova et al 1980).
Sus semillas son numerosas, ovoides con longitudes de 8 mm., cubiertas
por una masa viscosa (sarcotesta); con una testa o esclerotesta de color marrón
y con protuberancias poco elevadas (Mac Bride, 1941, Badillo, 1967; Calderón,
1988).
2.2.4.- Distribución de Vasconcellea candicans
El género Vasconcellea es el más grande de la familia CARICACEAE,
comprende 21 especies de las 35 taxas descrita en esta familia (Badillo, 1971,
1993, 2001.), en el Perú se presentan 9 especies, dentro de las cuales está el
Vasconcellea candicans GRAY “Mito” (Badillo, 1971 y Calzada, 1993).
Esta especie ocupa 2 áreas de distribución bien diferenciada, una
costeña (lomas) (Figura 7) y otra andina o de serranía esteparia (ecorregión
5
según Brack, 1986), separadas ambas por una franja desértica. Weberbauer
(1945) precisa que su distribución se extiende desde el sur hasta el centro,
ascendiendo la vertiente occidental hasta los 3000 msnm. Asimismo, Ferreyra
(1986) anota que se distribuye en las vertientes occidentales andinas peruanas,
incluyendo lomas.
En las lomas, esta especie, ocupa las partes más elevadas,
generalmente sobre los 300 m de altitud (Weberbauer, 1945). Su área de
distribución abarca desde el río Saña (7°sur) hasta el valle de Coruma (17°sur).
Cordova et al. (1980; citado por Cuya, 1992) registran su presencia en Piura.
Con este dato podría extenderse la información sobre su distribución hasta los
(5° sur) un poco más al norte que los datos de Weberbauer.
2.2.5.- Importancia del cultivo de Vasconcellea candicans
Vasconcellea candicans es una especie que puede vivir bajo condiciones
de deficiencia de agua, ya que solo está disponible cuando las lomas están
cubiertas por la densa neblina que cubre nuestra costa durante los meses de
Junio a Octubre. Esta especie también se caracteriza porque sus frutos son
comestibles y su látex puede ser usado para la cura de algunas enfermedades,
todas estas características le dan a esta especie un valor económico que debe
ser tomado en cuenta. (Cuya, 1992).
2.2.5.1.- Importancia Ecológica
Dentro del ecosistema de lomas, Vasconcellea candicans cumple un papel
ecológico importante como captador de neblinas en la época húmeda (es
6
cuando presenta abundante follaje) (Figura 8), esto favorece a que una
diversidad de vegetación herbácea y arbustiva se desarrolle en torno a esta
especie (La Rosa et al. 2004). (Figura 7).
2.2.5.2.- Importancia Económica
Engel (1982; citado por Cuya, 1992) anota que entre los vegetales
consumidos por hombres pre-agrícolas de nuestra costa (5000 - 6000 A.C.) se
encontraban los frutos del mito, los cuales son tan agradables como la papaya,
y pueden encontrarse en algún mercado costeño, con un valor nutritivo
importante, consumiéndolas al natural o soasadas, pudiendo prepararse de
ellas, bebidas, mermeladas, etc., también se les considera digestivas (Soukup,
1987, Aldave, 1988; citados por Cuya, 1992).
Calderón (1988) estudió bromatológicamente la pulpa del fruto y
recomendó la difusión de su consumo por presentar un apreciable contenido de
vitamina C (45 mg), que es similar al de los frutos cítricos. Siendo rica también
en carbohidratos (70.1 %) y un buen contenido de proteínas (8.2 % en base al
peso seco) (De Feo, et al. 1999) (Tabla 9).
Además, Brack (1999) menciona que la importancia de esta planta
radica, principalmente, en su fruto por su alto contenido de papaína, enzima
empleada en la industria de carnes; adicionalmente, el fruto podría ser
incorporado para el consumo humano y promover su consumo como fruto
nativo tanto en el mercado interno como externo.
Según Calderón (1988) y De Feo et al (1999), el rendimiento de aceite de
las semillas de mito es aceptable, es un aceite que pertenece a los no secantes
7
y sus características son semejantes al del olivo, siendo rico especialmente en
ácido oleico, linoleico y palmítico; también señalan aceptable el contenido de
pectina del fruto convirtiéndolo en una nueva fuente de esta sustancia, por lo
que su cultivo tendría ventajas frente a otros frutos no silvestres dada su
adaptación a hábitats poco favorables.
2.2.6.- La semilla
Una semilla es producto de un ovulo fertilizado, madurado y contiene un
embrión que ha sido derivado tanto sexualmente o asexualmente. Una semilla
verdadera es morfológicamente compleja, contiene tejidos de diferentes
composición genética, los embriones en la mayoría de casos, son diploides,
excepto para especies apomícticas. (Copeland y McDonald, 1985)
2.2.7.- Germinación y Dormancia
La germinación comienza con toma del agua por la semilla seca y finaliza
con el alargamiento del eje embrionario. La consecuencia visible de la
germinación es la saliente del extremo de la radícula a través de la cubierta de
la semilla. (Bewley, 1997). Subsecuentemente incluye la movilización de las
grandes reservas de almacenamiento están asociadas con el crecimiento de la
plántula.
La dormancia en la semilla se puede definir como “estado en el cual las
semillas estén previniendo la germinación incluso bajo condiciones ambientales
normalmente favorable a la germinación" (Copeland y McDonald, 1985). La
dormancia de la semilla puede ser impuesto por el embrión, por la cubierta
8
(capa de semilla, endospermo, etc.), o una combinación de ambos factores a tal
grado que depende de la especie vegetal (Bewley, 1997).
La cubierta de la semilla es un órgano de funcionamientos múltiples que
desempeña un papel importante en nutrición del embrión durante el desarrollo
de la semilla y en la protección contra agentes perjudiciales contra el ambiente
posterior (Mohamed-Yasseen et al., 1994; Weber et al., 1996). La dormancia de
la semilla impuesta por la cubierta en particular es parte de la estrategia de la
supervivencia de la semilla de muchas especies (Werker, 1981; Kelly et al.,
1992). La cubierta de la semilla ejerce su acción restrictiva a la germinación por
mayor parte del tiempo siendo impermeable al agua y/o oxígeno o por su
resistencia mecánica a la radícula saliente. Estas características se han
correlacionado positivamente con el color de la cubierta de semilla debido a los
compuestos fenólicos en especies diversas. (Copeland y McDonald, 1985)
2.2.8.- La dormancia y su papel en la ecología
La dormancia en la semilla es relevante para la ecología vegetal. La
diversidad de la especie y la composición de su comunidad están influenciadas
por la productividad y el substrato (del Moral, 1983; Loneragan y del Moral,
1984). Parece probablemente que la dormancia de la semillas juegan un rol en
la composición de la comunidad vegetal porque la sincronización y la proporción
de la germinación influencian la supervivencia y la capacidad competitiva de la
plantas. (Harper, 1977).
9
2.2.9.- Germinación y reguladores de crecimiento
La regulación hormonal del rompimiento de la dormancia y la
germinación están afectadas por la relación entre promotores e inhibidores
endógenos (Tillberg, 1984). Los reguladores de crecimiento, tales como
auxinas, citoquininas, giberelinas y otros, se han aplicado con resultados
positivos para romper la dormancia de las semillas (Koller et al., 1962).
2.2.9.1 Giberelinas (AGs)
Entre los reguladores de crecimiento, las AGs tienen una función
primordial, como su aplicación exógena que contrapesa la inhibición impuesta
por el ácido abscísico y por lo que desempeña un papel dominante en la
germinación de la semilla. El ácido giberélico está implicado en la superación de
la dormancia y en controlar la hidrólisis de las reservas. La presencia de niveles
adecuados de este ácido en las semillas estimula la síntesis, activación y
secreción de enzimas hidrolíticas como por ejemplo, α-amilasa, liberando
principalmente los azúcares reducidos y los aminoácidos que son esenciales
para el crecimiento del embrión (Khan, 1971; Metivier, 1979; Mayer y Poljakoff-
Mayber, 1989)
2.2.9.2 Acido abscísico (ABA)
Es un regulador de crecimiento que ha recibido la atención considerable
debido a su papel importante ya que induce y mantiene la dormancia de la
semilla (Walker-Simmons y Sessing, 1990). Por lo que, Bewley y Black (1994)
10
muestra que la diferencias entre los cultivares con semillas dormantes y no
dormantes, radica en la capacidad para conservar ABA durante su madurez
2.2.9.3 Auxinas
Existen reportes que el Acido indol acético (AIA) está involucrado en la
regulación de la dormancia, considerando que el efecto de las auxinas sobre la
germinación ha estado ampliamente en discusión. (Tillberg, 1984). Sin
embargo, en las semillas de frijol, maíz y pino se encontraron los niveles más
altos de AIA se habían expandido durante 24 - 48 horas, periodo durante el cual
las radículas comenzaron a emerger de la testa de la semilla, posteriormente
durante el periodo de crecimiento radical rápido el contenido de AIA decrece.
(Tillberg, 1977).
2.2.10.- Cultivo de Tejidos Vegetales
El cultivo de tejidos vegetales (CTV) es una serie de técnicas empleadas
actualmente para hacer estudios de fisiología, bioquímica, morfogénesis y
anatomía, entre otros, así como contribuciones prácticas en la multiplicación y
mejoramiento de plantas útiles y en peligro de extinción (Villalobos, 1990). El
CTV también se ha empleado ampliamente en estudios de síntesis (Nabeta et
al., 1983) y biotransformación de metabolitos secundarios (Ambid et al., 1983).
El CTV se basa en el concepto de totipotencia, término que se aplica a
que todas las células de una planta tienen la capacidad de regular la división
celular y diferenciación para crecer y así regenerar una nueva planta (Teutonico
y Knorr, 1984).
11
Los cultivos in vitro pueden iniciarse prácticamente a partir de cualquier
parte de la planta (tallo, hoja, semilla, fruto, embrión, cotiledones, raíz, etc.).
Comúnmente se seleccionan aquellas partes de la planta que se encuentran en
división activa, como las regiones meristemáticas (Ochoa-Alejo, 1990) bajo
condiciones asépticas en presencia de un medio artificial químicamente definido
provisto de todos los factores adecuados para su expresión morfogénetica
(Abdelnour y Vicent, 1994)
2.2.10.1.- Esterilización y desinfección del material vegetativo
La esterilización y la asepsia son factores importantes en la iniciación de
un cultivo in vitro ya que el crecimiento de los tejidos vegetales puede ser
alterado o afectado por la presencia de hongos y bacterias. Así mismo es
necesario esterilizar los medios, instrumentos y recipientes de cultivo para
eliminar cualquier microorganismo vivo o espora. (Hurtado y Merino, 1991).
De igual manera el material vegetativo (explante) debe pasar por un
proceso de desinfección para ser introducido in vitro mediante condiciones
asépticas en un área estéril proporcionada por una cámara de flujo laminar para
reducir el riesgo de contaminación, es necesario que se mantenga una limpieza
y organización adecuada tanto en el laboratorio como en el área de trabajo.
(Calderón et al. 1995)
2.2.10.2.- Medio de cultivo
Los medios de cultivo son combinaciones de sustancias químicas, que
los investigadores han descrito después de numerosos experimentos y que
12
permiten que las plantas crezcan y se multipliquen in vitro. El medio de cultivo
es específico para cada género, especie o variedad, aunque existen ciertos
medios básicos que pueden ser utilizados en todas las plantas. (Roca y
Mroginski, 1993).
El éxito que se obtenga en un cultivo adecuado, depende de las
sustancias químicas y las combinaciones apropiadas de nutrientes. Las
variaciones fundamentales se hacen en cuanto a los niveles y tipos de
suplementos orgánicos, también de los estadios del crecimiento in vitro y de los
explantes que se están cultivando (Calderón et al., 1995). El uso de las sales
hidropónicas han sido probados como medio básico alternativo, debido a su
costo con referencia al medio comercial Murashige and Shoog ®. (Mansilla et
al., 2001).
2.2.11.- Cultivo de Embriones
El cultivo in vitro de embriones ha sido efectivo en el rescate de
embriones abortivos derivados a partir de hibridación interespecífica o
intergenérica (Mendoza, 1994) y en el rescate de material de propagación de
frutales con semillas de baja viabilidad (Litz, 1991). Así como también, para
acortar la latencia de semillas que en algunos casos es debida a inhibidores del
desarrollo del embrión, presentes en el endospermo o en la cubierta de la
semilla. El cultivo de embriones ha ayudado al mejoramiento genético de
especies arbóreas porque permite acortar el período de siembra a floración
(Litz, 1991).
13
III.- MATERIALES Y METODOS
3.1.- MATERIALES
3.1.1 Material biológico
El material biológico fueron las semillas de Vasconcellea candicans de
Lomas de Villa María del Triunfo en la localidad de Lomas, del distrito de Villa
María del Triunfo, Lima – Perú.
3.1.2 Material del laboratorio
Los equipos esenciales que se utilizaron son: (1) Estufa de aire seco,
para secar las semillas (2) Cámara de siembra para realizar la extracción del
embrión e introducción en condiciones in vitro (3) Cámara de crecimiento (4)
Hormonas vegetales Sigma ®, (5) Medio de sales hidropónicas (Tabla 10), (6)
Agar-agar Sigma ®, (6) Balanza de precisión, (7) pHmetro HANNA®, (8)
Conductimetro HANNA®, (9) Materiales de vidrio, etc.
3.2.- METODOS
3.2.1.- Diseño experimental
3.2.1.1.- Lugar de ejecución
El presente trabajo se desarrolló en el Laboratorio de Ecofisiología
Vegetal de la Facultad de Ciencias Naturales y Matemática de la Universidad
Nacional Federico Villarreal, Lima-Perú.
14
3.2.1.2.- Recolección de Semillas
La colecta de frutos inmaduros (Figura 9) se realizó en las Lomas de Villa María
del Triunfo (latitud sur 12º 08’ 36’’ y longitud oeste 76º 58’ 12’’), ubicadas en el
A.H. El Manantial de Paraíso, Localidad José Carlos Mariátegui, Distrito de Villa
María del Triunfo, en el cono sur de la provincia de Lima – Perú. durante los
meses de Junio del 2004, las cuales se llevaron al laboratorio para el presente
trabajo.
3.2.1.3- Limpieza y desinfección de la semilla
La limpieza de las semillas se realizó con abundante agua de caño,
tratando de separar la pulpa y la sarcotesta; dichas semillas lavadas se
colocaron sobre un papel secante para luego ser secadas en una estufa a 20°C
por 48 horas para evitar el desarrollo de hongos; para su posterior siembra.
(Figura 10)
Para obtener un protocolo de desinfección de manera efectiva, las
semillas fueron desinfectadas con 6 tratamientos (TD), que consisten en
diferentes tiempos de exposición de alcohol e hipoclorito de sodio. (Tabla 1)
Las semillas tratadas se sembraron en un medio básico a base de sales
de hidroponía (MSH) (Tabla 10), suplementado con tiamina HCl 100 ppm.,
riboflavina 40 ppm., piridoxina HCl 40 ppm., nicotinamida 400ppm, azúcar
comercial 3% (p/v), agar 0.8% (p/v), ajustados a un pH de 5.6 y una
conductividad eléctrica de 1.5 mS.; previamente esterilizado en la autoclave a
15 lb/plg2, 121°C por 15 minutos.
15
Tabla 1: Tratamientos de desinfección de las semillas de V. candicans
Tratamientos TD1 TD2 TD3 TD4 TD5 TD6
Alcohol de 70 % 30 s 0s 20 s 30 s 20 s 30 s
Hipoclorito de sodio 0 5.25 % 5.25 % 5.25 % 5.25 % 5.25 %
Tiempo de exposición 0 min 5 min 5 min 10 min 15 min 20 min
Agua destilada estéril 3 veces 3 veces 3 veces 3 veces 3 veces 3 veces
Medio MSH MSH MSH MSH MSH MSH

MSH = medio de sales hidropónicas
Dicha siembra se realizó en una cámara de siembra estéril donde se
colocó una semilla por cada tubo de ensayo que contenía 3 mL de MSH, con 15
repeticiones por cada tratamiento. La desinfección de las semillas fue
determinado por la ausencia de hongos, bacterias y levaduras de manera
visual, al cuarto día después de realizado la siembra.
3.2.1.4.- Escarificación de la semilla de V. candicans
Las semillas antes de ser tratadas fueron desinfectadas con alcohol 70%
por 20 segundos, después de eliminar el alcohol se agregó NaOCl 5.25 % por
15 minutos, finalmente se enjuagó con agua destilada estéril 3 veces.
Para observar la influencia de la testa en la dormancia de la semilla, se
sembraron semillas desinfectadas en los tres tratamientos TAs. Un tratamiento
sin escarificar TA1, solo se sembró las semillas desinfectadas como control; y
dos tratamientos de escarificación (TA2 y TA3), en TA2, las semillas
desinfectadas se sumergieron en hipoclorito de sodio por 15 minutos y
posteriormente enjuagaron 4 veces con agua destilada estéril. Y en TA3, la
16
escarificación se realizó sumergiendo las semillas en ácido sulfúrico
concentrado, durante 20 minutos, luego se enjuagó 4 veces con agua destilada
estéril (Tabla 2). Se consideran semillas escarificadas cuando la testa ha sido
desgastado manera parcial hasta observarse la cubierta semilla de color crema
(figura 12 ).
Las semillas tratadas se sembraron en un medio básico MSH,
suplementado con tiamina HCl 100 ppm., riboflavina 40 ppm., piridoxina HCl 40
ppm., nicotinamida 400ppm, azúcar comercial 3% (p/v), agar 0.8% (p/v),
ajustados a un pH de 5.6 y una conductividad eléctrica de 1.5 mS.; previamente
esterilizado en la autoclave a 15 lb/plg2, 121°C por 15 minutos.
Tabla 2: Tratamientos de escarificación de las semillas de Vasconcellea
candicans
Tratamientos TA1 TA2 TA3
Medio de cultivo MSH MSH MSH
Hipoclorito Acido
Reactivo -----
de Sodio sulfúrico
Tiempo de exposición ----- 15 minutos 20 minutos
Agua destilada estéril ----- 4 veces 4 veces

24 h de 24 h de 24 h de
Fotoperíodo
oscuridad oscuridad oscuridad
MSH = medio de sales hidropónicas
La siembra se realizó en una cámara de siembra estéril donde se colocó
una semilla por cada tubo de ensayo, con 100 repeticiones por cada
tratamiento.
17
3.2.1.5.- Estandarización de cultivo de embriones
Para el cultivo de embriones, las semillas se enjuagaron con agua
corriente, luego alcohol 70% por 20 segundos, después de eliminar el alcohol
se agregó NaOCl 5.25 % por 15 minutos, finalmente se enjuagó con agua
destilada estéril 3 veces.
Una vez desinfectadas las semillas, se aislaron los embriones de las
mismas, con ayuda de un microscopio estereoscopio, una pinza y bisturí. Se
realizó un corte longitudinal obteniéndose dos mitades y con el mismo bisturí sin
causar daños se aisló el embrión, ubicado en una de las mitades de la semilla.
(Figura 11)
Para estandarizar el cultivo de embriones (Figura 13), se realizaron 16
tratamientos (TE) que consisten en diferentes combinaciones de AIA y AG3 en
un medio básico MSH (Tabla 3), suplementado con tiamina HCl 100 ppm.,
riboflavina 40 ppm., piridoxina HCl 40 ppm., nicotinamida 400ppm, azúcar
comercial 3% (p/v), agar 0.8% (p/v), ajustados a un pH de 5.6 y una
conductividad eléctrica de 1.5 mS.; se esterilizó en la autoclave a 15 lb/plg2,
121°C por 15 minutos.
Después de la siembra se llevaron los embriones a un ambiente de
cultivo, el cual se encontraba a 20°C ± 2°C, con una humedad relativa
promedio de 56 %, durante 15 días en penumbra, periodo necesario para se
produzca la germinación. Se consideraron embriones germinados solamente
aquellos embriones que presentaron emergencia de la radícula. Posteriormente
se trasladaron a un ambiente de crecimiento a temperatura de 20°C ± 2°C, con
18
una humedad relativa de 56 % y un fotoperiodo de 16 horas luz, con intensidad
luminosa de 2000 lux.
Se realizaron 6 evaluaciones cada 5 días durante un periodo de 30 días
donde se midieron las características de crecimiento: longitud de plántulas y
longitud de raíces mediante una cinta métrica.
Tabla 3: Determinación del tratamiento para la germinación de los
embriones de Vasconcellea candicans colectadas en las Lomas de Villa
María en 2004
Medio Repetición Nº de
Hormonas
Tratamientos de por embriones
cultivo AG3 AIA tratamiento por tubo
TE1 MSH 0 0 25 1
TE2 MSH 0 0.5 25 1
TE3 MSH 0 1 25 1
TE4 MSH 0 1.5 25 1
TE5 MSH 0.5 0 25 1
TE6 MSH 0.5 0.5 25 1
TE7 MSH 0.5 1 25 1
TE8 MSH 0.5 1.5 25 1
TE9 MSH 1 0 25 1
TE10 MSH 1 0.5 25 1
TE11 MSH 1 1 25 1
TE12 MSH 1 1.5 25 1
TE13 MSH 1.5 0 25 1
TE14 MSH 1.5 0.5 25 1
TE15 MSH 1.5 1 25 1
TE16 MSH 1.5 1.5 25 1
MSH= Medio de sales hidropónicas
19
El diagrama de los experimentos realizados en este trabajo se muestra en la
Figura 6.
3.2.2.- Diseño Estadístico
Para este trabajo se utilizó un diseño Completamente al Azar con arreglo
factorial de hormonas acido giberélico a concentraciones (0, 0,5, 1,0 1,5 ppm.) y
ácido indol acético (0, 0,5, 1,0 1,5 ppm.). El número de repeticiones fue de 25
por cada tratamiento. Las conversiones de los datos se transformaron a log (X +
0,5) para evitar la presencia de ceros.
Para analizar la eficacia de los diferentes tratamientos en el cultivo de
embriones se usó el siguiente modelo estadístico lineal aditivo
Yij = µ + αi + βj + (αi x βj) + εij

Donde:
µ= Media
αi = Efecto producido por ácido giberélico
βj = Efecto producido por ácido indol acético
(αi x βj)= Efecto conjunto del ácido giberélico y ácido indol acético
εij = Error experimental
20
IV.- RESULTADOS
4.1.- Limpieza y desinfección de las semillas
La inspección de las semillas que fueron tratadas con los tratamientos
TD5 (hipoclorito de sodio al 5.25 % por 15 minutos) y TD6 (hipoclorito de sodio
al 5.25 % por 20 minutos) mostraron un 100 % de desinfección, por el contrario
se observó un 0 % de asepsia en el tratamiento TD1 (alcohol 70% por 1
minutos. Además se obtuvo en el tratamiento TD4 (hipoclorito de sodio al 5.25
% por 10 minutos) se obtuvo un 53% de asepsia.
Ambos tratamientos TD3 (hipoclorito de sodio al 5.25 % por 5 minutos) y
TD2 (alcohol 70% por 1 minutos y hipoclorito de sodio al 5.25 % por 5 minutos)
mostraron un 27 % de asepsia. (Tabla 4 y figura 1)
Tabla 4.- Resultados de los tratamientos de desinfección de las semillas
Número de semillas
Tratamiento
Contaminadas No contaminadas
TD1 15 0
TD2 11 4
TD3 11 4
TD4 7 8
TD5 0 15
TD6 0 15
21
Figura 1. Porcentaje de asepsia de las semillas de “Mito” en diferentes
tratamientos
4.2.- Germinación producida por la escarificación de las semillas de Mito
En los tratamientos TA2 y TA3 se observó el desgaste de la testa por los
agente químicos escarificantes (hipoclorito de sodio y ácido sulfúrico) en las
semillas de Vasconcellea candicans. (Figura 12)
En ninguno de los tratamientos; TA2 (hipoclorito de Sodio a 5,25 % por 15
minutos) y TA3 (Acido sulfúrico concentrado por 20 minutos) como en el testigo
TA1 se evidenciaron la emergencia de la raicilla (germinación visible) (Tabla 5).
Solamente se observaron en las semillas sembradas un hinchamiento
(imbibición) a los 2 días después de sembrados permaneciendo en ese estado
hasta los 30 días. (Figura 2 y 12)
22
Tabla 5.- Resultados de la escarificación sobre la germinación de las
semillas de V. candicans
Tiempo de Porcentaje de
Tratamientos Características
exposición germinación
TA1 ……. …….. 0%
TA2 Hipoclorito de Na 15 minutos 0%
TA3 Acido sulfúrico 20 minutos 0%
Figura 2. Porcentaje de germinación e inbibición de las semillas de “Mito”

en el tratamiento de escarificación a los 30 días después de la siembra.
4.3.- Evaluación del porcentaje de germinación de las semillas
La germinación de los embriones se produjo en los tratamientos (TE3,
TE6, TE7, TE10, TE11, TE14 y TE15), caso contrario no se observaron ningún
embrión germinado en los tratamientos (TE1, TE2, TE4, TE6, TE8, TE9, TE13 y
TE16) durante un periodo de 30 días. (Figura 3).
23
Con respecto al tiempo de germinación, los embriones se empezaron a
observar la formación de raicillas (> 2 mm) durante un periodo de 5 a 12 días;
en el tratamiento TE3 a los 5 días; seguido de los TE7, TE10, TE11 y TE14 a
los 6 días (Figura 3).
Figura 3. Efecto de AG3 y AIA sobre el tiempo de germinación de

embriones de “Mito” a los 30 días después de la siembra.
En el caso de los tratamientos TEs donde se obtuvo embriones
germinados, en los tratamientos TE10 y TE14 se observo el mayor porcentaje
de germinación con 96 % y 80 % respectivamente y el menor porcentaje de
germinación se observo en el TE5 con 24 % (Tabla 6)
24
Tabla 6.- Efecto de ácido giberélico y ácido indol acético en la germinación
de embriones de “Mito”
Medio Hormonas Número de Porcentaje

Tratamientos de (ppm) embriones de
cultivo AG AIA germinados germinación
3
TE1 MSH 0 0 0 0%
TE2 MSH 0 0.5 0 0%
TE3 MSH 0 1 13 52 %
TE4 MSH 0 1.5 0 0%
TE5 MSH 0.5 0 6 24 %
TE6 MSH 0.5 0.5 0 0%
TE7 MSH 0.5 1 15 60 %
TE8 MSH 0.5 1.5 0 0%
TE9 MSH 1 0 0 0%
TE10 MSH 1 0.5 24 96 %
TE11 MSH 1 1 19 76 %
TE12 MSH 1 1.5 0 0%
TE13 MSH 1.5 0 0 0%
TE14 MSH 1.5 0.5 20 80 %
TE15 MSH 1.5 1 11 44 %
TE16 MSH 1.5 1.5 0 0%
4.4.- Crecimiento de las plántulas obtenidas del cultivo de embriones.
Después de 30 dds., los embriones sembrados mostraron un crecimiento
en la altura plántulas y longitud de raíces en los tratamientos TE3, TE5, TE7,
TE10, TE11, TE14, TE15.
Con respecto a la longitud de raíces, en los tratamientos se TE3, TE11 y
TE14 mostraron mayor longitud radicular con valores de 19,77; 19,58 y 19,40
25
mm respectivamente. Sin embargo, en el TE5 se obtuvo el menor valor de 5,83
mm.
El ANVA muestra que en la longitud de raíces existen diferencias
significativas entre los tratamientos TEs (el efecto conjunto de AIA, AG3 y por la
interacción de estas dos fitohormonas) durante los 30 dds. (Tabla 11). Además
el efecto de las variables AIA y AG3 al igual que la interacción de AIA x AG3
muestran diferencias significativas en la longitud radicular durante todas las
evaluaciones realizadas (Tabla 13 -18).
Tabla 7.- Promedio de longitud de raíces obtenidas del cultivo de
embriones de mito en las 6 evaluaciones durante 30 dds.
Medio Hormona Longitud de la raíz (mm)

Tratamientos de (ppm)
cultivo AG3 AIA 5 10 15 20 25 30
TE1 MSH 0 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE2 MSH 0 0.5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE3 MSH 0 1 3,75 6,69 10,46 12,92 16,85 19,77
TE4 MSH 0 1.5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE5 MSH 0.5 0 0,00 0,00 2,83 4,67 5,00 5,83
TE6 MSH 0.5 0.5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE7 MSH 0.5 1 0,00 5,50 8,40 12,93 16,27 17,47
TE8 MSH 0.5 1.5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE9 MSH 1 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE10 MSH 1 0.5 2,29 4,43 9,39 11,96 15,65 18,39
TE11 MSH 1 1 0,00 5,79 11,74 16,00 18,89 19,58
TE12 MSH 1 1.5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE13 MSH 1.5 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE14 MSH 1.5 0.5 0,00 4,65 9,32 12,95 18,65 19,40
TE15 MSH 1.5 1 0,00 5,09 8,00 9,91 11,91 12,91
TE16 MSH 1.5 1.5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
26
Figura Nº 4 Longitud de raíces de los tratamientos del cultivo de embriones durante un periodo de 30 días
27
Con respecto a la altura de plántula en los tratamientos se TE11, TE14 y
TE17 se observó un crecimiento con valores de 19,77; 17,88 y 15,05 mm. Sin
embargo, en el TE5 al igual que en crecimiento radicular se obtuvo el menor
valor de 7 mm. El ANVA muestra que en la altura de plántulas existen
diferencias significativas entre los tratamientos TEs (el efecto conjunto de AIA,
AG3 y la interacción entre las fitohormonas GA3 y AIA durante los 30 dds.
(Tabla 12). Además el efecto de las variables AIA y AG3 al igual que la
interacción de AIA x AG3 muestran diferencias significativas en el crecimiento
radicular durante todas las evaluaciones (Tabla 19-24).
Tabla 8.- Promedio de altura de las plántulas obtenidas del cultivo de
embriones de mito en las 6 evaluaciones durante 30 dds.
Medio Hormona Altura de plántula (mm)

Tratamientos de (ppm)
cultivo AG3 AIA 5 10 15 20 25 30
TE1 MSH 0 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE2 MSH 0 0.5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE3 MSH 0 1 0,00 5,00 8,25 10,75 11,67 12,92
TE4 MSH 0 1.5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE5 MSH 0.5 0 0,00 0,00 0,00 1,00 6,00 7,00
TE6 MSH 0.5 0.5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE7 MSH 0.5 1 0,00 0,00 5,54 9,57 12,29 13,79
TE8 MSH 0.5 1.5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE9 MSH 1 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE10 MSH 1 0.5 0,00 0,00 4,23 9,04 11,48 14,26
TE11 MSH 1 1 0,00 0,00 8,95 12,11 16,16 19,47
TE12 MSH 1 1.5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE13 MSH 1.5 0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
TE14 MSH 1.5 0.5 0,00 0,00 6,28 10,11 12,95 15,05
TE15 MSH 1.5 1 0,00 0,00 7,00 11,88 14,75 17,88
TE16 MSH 1.5 1.5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
28
Figura Nº 5 Altura de las plántulas de los tratamientos del cultivo de embriones durante un periodo de 30 días
29
V.- DISCUSIÓN
Desinfección de semillas
En la desinfección de semilla los tratamientos: TD5 (hipoclorito de sodio
al 5.25 % por 15 minutos) y TD6 (hipoclorito de sodio al 5.25 % por 20 minutos)
fueron capaces de controlar la contaminación de semillas de mito introducidas a
condiciones in vitro ya que fueron expuesta al agente desinfectante como
hipoclorito de sodio con mucho mayor tiempo.
Para obtener un protocolo eficiente de desinfección utilizamos el TD5
debido que solo con 15 minutos de exposición en hipoclorito de sodio es capaz
de obtener un 100 % de asepsia ya que es recomendable solo utilizar el efecto
desinfectante del producto mas no el efecto toxico que se obtiene por largos
periodos de exposición. (Solis, 2001).
Soto (1999) obtuvo resultados similares en la desinfección de las
semillas de V. candicans, sin embargo utilizó Tween 20 adicionalmente al
hipoclorito de sodio y alcohol.
Escarificación de las semillas de V. candicans
En los tratamientos TA2 (hipoclorito de sodio por 15 minutos) y TA3 (Acido
sulfúrico concentrado por 20 minutos) el proceso de escarificaron fue de 100 %,
observándose solo imbibición de la semilla a partir de los 2 días después de
haberse sembrado hasta los 30 días.
No se observó la germinación en ningún tratamiento de escarificación y ni
en el testigo de las semillas, lo cual nos indica que la cubierta seminal de las
30
semillas de Vasconcellea candicans es bastante permeable, ya que incluso se
inbibieron las semillas que no fueron escarificadas, por lo tanto el inhibidor de la
germinación de la cubierta seminal aun persiste después de la escarificación,
algo parecido sucede con las semillas de Carica papaya, donde se ha
descubierto con los trabajos de Chow y Lin (1991), que el ácido p-
hidroxibenzoico, un compuesto fenólico que se sintetiza en la cubierta de las
semillas, es el responsable de la inhibición de la germinación de estas semillas
y no el ácido abscísico; también se confirman estos resultados con los trabajos
de algunos investigadores como Pérez, A. y col. (1980) quienes probaron
eliminar la sarcotesta de las semillas de C. papaya y consiguieron un mejor
porcentaje de germinación. Estos resultados nos estarían indicando que
probablemente V. candicans también tenga inhibidores de este tipo, ya que la
dormancia de las semillas de esta especie llega hasta 1 año para luego
germinar en condiciones de invernadero (Mendoza, A. 2003. Comunicación
personal).
Cultivo de embriones
Después de observar que la escarificación no permite la germinación de
las semillas de V. candicans se propuso obtener la germinación de las semillas
de Vasconcellea candicans por cultivo de embriones, extrayéndose
cuidadosamente el embrión de las semillas desinfectadas en una cámara de
siembra, este procedimiento concuerda con el trabajo de Soto (1999) que utilizó
semillas desinfectadas para aislar los embriones y observar la germinación.
31
Con respecto a la germinación de embriones, Soto (1999) obtuvo un 60%
de germinación de los embriones de V. candicans después de 15 días de
siembra, siguiendo el protocolo de cultivo de embriones de papaya propuesto
por Litz (1991), a diferencia de los resultados obtenidos en el presente trabajo
donde se obtuvo un 96% de germinación a los 6 días en el tratamiento TE10
(MSH con 1 ppm de GA3 y 0,5 ppm de AIA), además de presentar un
crecimiento promedio entre los tratamientos TEs (Tabla 14).
Con respecto a la longitud de raíces de V. candicans el mayor
crecimiento se obtuvo en el tratamiento TE3 debido a que este tratamiento tuvo
sólo el efecto de la hormona de auxinas. En el caso del crecimiento de plántula
se obtuvo la mayor longitud de crecimiento de las plántulas en el tratamiento
TE11 (MSH con 1 ppm de GA3 y 1 ppm de AIA). Además se observaron
diferencias estadísticas en la longitud de raíces y altura de plántulas entre los
medios tratados con diferentes concentraciones de las hormonas de GA3 y AIA
durante los 30 dds. Estos resultados no concuerdan con los de Soto (1999) ya
que ella no encontró ninguna diferencia entre las plántulas que se desarrollaron
del cultivo de embriones.
Ross y O’Neill (2001) describe que existe interacciones de intersección o
antagonismo de hormonas en la de las vías de señalización, sin embargo existe
otro tipo importante de interacción que involucra el efecto de una hormona en el
nivel de una segunda hormona. Se ha demostrado que niveles de auxina (AIA)
son requeridos para mantener niveles normales de AG3 en Pisum sativum
(Ross, et al., 2000). Además esta interacción explica cómo las hormonas
pueden causar diferentes respuestas en diferentes órganos. Ross y O’Neill
32
(2001). En nuestros datos se observó diferencias estadísticas por efecto de la
interacción de las dos hormonas AG3 y AIA en altura de plántula y longitud de
raíces hasta los 30 dds.
Soto (1999) obtiene el mayor porcentaje de germinación por el cultivo de
embriones y plántulas entre los 15 a 20 días en medio White modificado en
oscuridad , sin embargo presentaron síntomas de etiolación tallo blanquecino y
hojas muy pequeñas, por lo que utilizaron un medio adicional para el
fortalecimiento de las plántulas de V. candicans. Por el contrario, nuestros
resultados observo en el tratamiento TE10, el mayor porcentaje de germinación
a los 6 dds y además permite el crecimiento de las plántulas hasta los 30 dds
sin necesidad de trasplantar en otro medio.
33
VI.- CONCLUSIONES
1. El protocolo de desinfección eficiente para las semillas de V. candicans
es el tratamiento de con alcohol por 20 segundos y luego con hipoclorito
de sodio al 5.25 % por 15 minutos.
2. El ingreso del agua a través de la testa no es una limitante para
germinación de la semilla de V. candicans
3. Las semillas de V. candicans tienen una prolongada dormancia debido a
los inhibidores persistente después de la escarificación.
4. En el cultivo de embriones de V. candicans, el tratamiento TE10 con
medio con sales hidropónicas suplementado con 0,5 ppm de IAA y 1 ppm
de GA3 se obtiene 96 % de geminación a los 6 días después de la
siembra.
5. El medio de cultivo de embriones permite el crecimiento de las plántulas
obtenidos de los embriones germinados, sin necesidad de trasplantar a
otro medio de crecimiento durante 30 días.
6. En nuestro sistema de cultivos de embriones, el tratamiento TE10 nos
permite obtener un alto porcentaje de germinación y el crecimiento de las
plántulas de V. candicans.
34
VII.- RECOMENDACIONES
• Estandarizar un medio de micropropagación y conservación in vitro con
el fin de obtener fuente continúa de material para investigaciones
posteriores.
• Se recomienda realizar protocolos de aclimatización a invernaderos y
viveros con fines de reforestación.
• Se recomienda utilizar cultivo de embriones como una alternativa para
rescatar del estado crítico que se encuentra la especie.
35
VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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42
IX.- ANEXOS
Figura 6.- Diagrama de flujo de la estrategia que se abordo para obtener la
geminación de las semillas de V. candicans
Recolección de
semillas de
Ensayos de germinación en vivero Ensayos de germinación in vitro
Germinan después de un año

Fuente: Mendoza, comunicación general
Protocolo de desinfección de
semillas de mito
Cultivo de Escarificación de
embriones la semilla
No germinaron Germinaron Semillas Semillas

los embriones los embriones escarificadas sin escarificar
No germinaron No germinaron
Medición del crecimiento

de las plántulas
Raíces Plántulas
43
Tabla 9.- Contenido del fruto de Vasconcellea candicas
Fruto
Seco Fresco
- Humedad 88,8 ± 5,1
- Lípidos totales 2,9 ± 0,2 0,3 ± 0,1
- Proteínas totales 8,2 ± 0,4 0,9 ± 0,1
- Fibra cruda 10,6 ± 0,6 1,2 ± 0,2
- Ceniza totales 8,3 ± 0,5 0,9 ± 0,2
Ceniza soluble 7,5 ± 0,2 0,8 ± 0,1
- Carbohidratos 70,1 ± 0,2 7,9 ± 1,3
Azúcar reducido directa 25,4 ± 2,6 2,8 ± 0,3
Azúcar reducido indirecta 26,9 ± 1,7 3,0 ± 0,7
- Pectinas 1,2 ± 0,1
- Minerales (mg %)
- Calcio 134,0 ± 7,2 134,0 ± 7,2
- Magnesio 89,1 ± 5,7 89,1 ± 5,7
- Hierro 4,0 ± 0,2 4,0 ± 0,2
- Fósforo 117,0 ± 0,2 117,0 ± 0,2
- Sodio 26,0 ± 0,2 26,0 ± 0,2
- Cloro 712,4 ± 0,2 712,4 ± 0,2
- Acides (mg de ácido cítrico) 2,9 ± 0,2
- Vitamina C (mg) 2,9 ± 0,2
Fuente: De Feo et al., 1999
44
Tabla 10.- Composición química del medio de cultivo a base de sales
hidropónicas (MSH)
Sales Hidropónicas
(mg/L)
Nombre común Formula
- Nitrato de Calcio Ca(NO3)2 635,3
- Nitrato de Potasio KNO3 238,3
- Sulfato de Magnesio MgSO4 429,0
- Fosfato Monopotásico KH2PO4 240,6
- Fosfato Monoamónico NH4H2PO4 31,3
- Quelato de Fe 18,7
- Cloruro de Potasio ClK 5,0
- Acido Bórico H3BO3 4,1
- Sulfato de cobre CuSO4 0,9
- Sulfato de Zinc ZnSO4 0,8
- Sulfato de Manganeso MnSO4 0,5
- Molibdato de amonio (NH4)6Mo7O24.4H2O 0,1
Fuente: Ventura et al., 2002
45
Tabla 11.- Análisis de Varianza con arreglo factorial (16 x 6) para la longitud de
raíz durante 30 días.
Fte de Var gl SC SCAdj CM F P

REP 24 19,1521 0,6222 0,0259 3,02 0,546
TRAT 15 225,9013 225,9013 15,0601 1756,11 Sig
DIAS 5 24,7311 37,1559 7,4312 866,52 Sig
TRAT x DIAS 75 54,8620 54,8620 0,7315 85,30 Sig
Error 1860 15,9511 15,9511 0,0086
Total 1979 340,5976
S = 0,0926059 R-Sq(adj) = 95,02%
Tabla 12.- Análisis de Varianza con arreglo factorial (16 x 6) para altura de
plántula durante 30 días

REP 24 16,9404 0,9310 0,0388 3,43 0,378
TRAT 15 212,7676 212,7676 14,1845 1255,88 Sig
DIAS 5 17,5503 29,1735 5,8347 516,60 Sig
TRAT x DIAS 75 50,2127 50,2127 0,6695 59,28 Sig
Error 1932 21,8209 21,8209 0,0113
Total 2051 319,2919
S = 0,106275 R-Sq(adj) = 92,74%
Tabla 13.- Análisis de Varianza con arreglo factorial (4 x 4) para longitud de raíz
al 5º dds.

REP 24 0,131535 0,137711 0,005738 1,12 0,324
AG3 3 0,055715 0,072150 0,024050 4,68 Sig
AIA 3 0,091263 0,092911 0,030970 6,03 Sig
AG3*AIA 9 0,446952 0,446952 0,049661 9,66 Sig
Error 290 1,490580 1,490580 0,005140
Total 329 2,216046
S = 0,0716933 R-Sq(adj) = 23,69%
46
al 10º dds.

REP 24 1,86996 0,16409 0,00684 0,63 0.547
AG3 3 1,68496 1,31546 0,43849 40,33 Sig
AIA 3 17,28372 16,58396 5,52799 508,46 Sig
AG3*AIA 9 5,52646 5,52646 0,61405 56,48 Sig
Error 290 3,15291 3,15291 0,01087
Total 329 29,51802
S = 0,104269 R-Sq(adj) = 87,88%
al 15º dds.

REP 24 4,0089 0,2418 0,0101 1,13 0,313
AG3 3 3,7656 2,4438 0,8146 91,11 Sig
AIA 3 28,8958 26,3221 8,7740 981,39 Sig
AG3*AIA 9 13,4929 13,4929 1,4992 167,69 Sig
Error 290 2,5927 2,5927 0,0089
Total 329 52,7559
S = 0,0945538 R-Sq(adj) = 94,42%
al 20º dds.

REP 24 5,1621 0,1822 0,0076 0,92 0,581
AG3 3 4,6833 3,1077 1,0359 124,94 Sig
AIA 3 36,4076 32,9484 10,9828 1324,67 Sig
AG3*AIA 9 17,6388 17,6388 1,9599 236,39 Sig
Error 290 2,4044 2,4044 0,0083
Total 329 66,2962
S = 0,0910546 R-Sq(adj) = 95,89%
47
al 25º dds.

REP 24 6,3740 0,1814 0,0076 0,79 0,749
AG3 3 5,6339 3,8770 1,2923 135,03 Sig
AIA 3 43,0187 39,1231 13,0410 1362,58 Sig
AG3*AIA 9 21,7978 21,7978 2,4220 253,06 Sig
Error 290 2,7755 2,7755 0,0096
Total 329 79,6000
S = 0,0978305 R-Sq(adj) = 96,04%
al 30º dds.

REP 24 7,0148 0,2513 0,0105 1,01 0,449
AG3 3 5,7978 3,7113 1,2371 119,64 Sig
AIA 3 45,8501 41,8463 13,9488 1349,00 Sig
AG3*AIA 9 23,8190 23,8190 2,6466 255,95 Sig
Error 290 2,9986 2,9986 0,0103
Total 329 85,4804
S = 0,101686 R-Sq(adj) = 96,02%

plántula al 5º dds.

REP 24 0,126309 0,099779 0,004157 0,85 0,671
AG3 3 0,082034 0,279365 0,093122 19,04 Sig
AIA 3 0,142455 0,178884 0,059628 12,19 Sig
AG3*AIA 9 0,579854 0,579854 0,064428 13,17 Sig
Error 302 1,477416 1,477416 0,004892
Total 341 2,408067
S = 0,0699436 R-Sq(adj) = 30,72%
48

REP 24 1,95265 0,43018 0,01792 1,15 0,289
AG3 3 2,37578 2,15600 0,71867 46,06 Sig
AIA 3 20,99319 20,47837 6,82612 437,51 Sig
AG3*AIA 9 5,08634 5,08634 0,56515 36,22 Sig
Error 302 4,71189 4,71189 0,01560
Total 341 35,11985
S = 0,124909 R-Sq(adj) = 84,85%


REP 24 3,8037 0,3146 0,0131 1,18 0,258
AG3 3 4,7149 3,9170 1,3057 117,51 Sig
AIA 3 30,3483 30,5857 10,1952 917,57 Sig
AG3*AIA 9 10,2229 10,2229 1,1359 102,23 Sig
Error 302 3,3556 3,3556 0,0111
Total 341 52,4453
S = 0,105409 R-Sq(adj) = 92,78%


REP 24 4,6362 0,2799 0,0117 1,21 0,233
AG3 3 6,1247 5,2939 1,7646 1 82,79 Sig
AIA 3 36,7332 36,8804 12,2935 1273,43 Sig
AG3*AIA 9 13,2798 13,2798 1,4755 152,84 Sig
Error 302 2,9155 2,9155 0,0097
Total 341 63,6893
S = 0,0982539 R-Sq(adj) = 94,83%
49

REP 24 4,6362 0,2799 0,0117 1,21 0,233
AG3 3 6,1247 5,2939 1,7646 1 82,79 Sig
AIA 3 36,7332 36,8804 12,2935 1273,43 Sig
AG3*AIA 9 13,2798 13,2798 1,4755 152,84 Sig
Error 302 2,9155 2,9155 0,0097
Total 341 52,4453
S = 0,109558 R-Sq(adj) = 94,35%


REP 24 5,0590 0,2041 0,0085 0,51 0,975
AG3 3 8,1074 7,5188 2,5063 149,95 Sig
AIA 3 40,9435 41,1739 13,7246 821,17 Sig
AG3*AIA 9 16,4490 16,4490 1,8277 109,35 Sig
Error 302 5,0475 5,0475 0,0167
Total 341 75,6064
S = 0,129281 R-Sq(adj) = 92,46%
50
Figura 7.- Vasconcellea candicans en las lomas de Villa María del Triunfo.
1 cm
Figura 8.- Agua condensada en el envés de las hojas de V. candicans.
51
A B
1 cm 1 cm
Figura 9.- Fruto de Vasconcellea candicans A) Fruto inmaduro B) corte

longitudinal del fruto.
1 mm
Figura 10.- Semillas de Vasconcellea candicans.
52
Embrión
1 mm
Figura 11.- Corte longitudinal de semilla de Vasconcellea candicans.
TA1 TA2 TA3
1 mm
Figura 12.- Tratamientos de escarificación de semillas TR a los 30 dds.
53
Embrión
1 mm
Figura 13.- Embrión aislado y sembrado en el medio de cultivo de

embriones.
Figura 14.- Crecimiento de plántulas de V. candicans obtenidas en el

tratamiento T10 del cultivo de embriones
54
ABREVIATURAS
ANVA: Análisis de varianza
F: F calculado
Fte de Var: Fuente de variación
Sig: Diferencia significativa
MS: Murashige and Shoog
Rep: Repeticiones
Trat: Tratamientos
cm: Centímetros
mm: Milímetros
min: Minutos
P: Probabilidad
dds.: Días después de sembrado
gl: Grados de libertad
SC: Suma de cuadrados
SCAdj: Suma de cuadrados ajustados
CM: Cuadrado medio
msnm: Metros sobre el nivel del mar
55
56

Cultivo de Embriones de Vasconcellea Candicans - Tesis Final JM

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UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA

Escuela Profesional de Biología

Tesis para optar el Título de Licenciado en Biología

Bach. JAIME BERNABE MANSILLA CORIMANYA

A un gran maestro y amigo

Vasconcellea candicans Gray “Mito” (CARICACEAE), es una especie de

valor ecológico en las lomas que está en peligro de desaparecer debido al

sobre pastoreo de ganado caprino, tala indiscriminada y la falta de regeneración

adecuada de individuos. Por estas razones se propuso desarrollar un sistema

de regeneración in vitro usando embriones. Como medio básico se usaron sales

hidropónicas, suplementado con azúcar comercial 3 % (p/v), agar 0.8 % (p/v),

vitaminas del complejo B COFANA ® 0,5 % (v/v) y un factorial de las siguientes

CE de 1.5 mS. En una cámara de siembra estéril se sembraron semillas

completas, con y sin escarificación, en medio sin hormonas, obteniéndose

solamente imbibición en ambos tratamientos después de 30 días de sembrado.

Después se sembraron sólo embriones, mostrando un 94% de germinación en

induce la dormancia de los embriones está presente en la cubierta seminal, por

ser usada para conseguir, posteriormente, reforestar los ecosistemas de lomas,

propios de la costa peruana, y así hacer un uso racional de este recurso.

Vasconcellea candicans GRAY “Mito”, specie of ecological value in hills,

that is in danger of disappearing, due to overgrazing by goats, indiscriminate tree

felling and lack of regeneration of individuals. For these reason we proposed to

agar; 5 % B-complex vitamins from Cofana® and hormonal combinations of GA3

conducted in a chamber seeding and sterilized previously with a fluorescent UV-C.

hormones, obtaining only imbibition in both treatments after 30 days of sowing.

Then we planted only embryos, showing 96 % germination after 6 days on the

Vasconcellea candicans Gray “Mito” (CARICACEAE), conjuntamente con

las lomas de la costa de Lima, están en peligro de desaparecer, debido

fundamentalmente al sobrepastoreo del ganado caprino, tala indiscriminada del

estrato arbóreo-arbustivo (Rostworowski, 1981). Además, no existe una

regeneración adecuada de individuos de V. candicans, debido a no tener éxito

de manera natural su germinación, por lo que el Instituto Nacional de Recursos

Naturales (INRENA) lo ha incluido dentro de su lista de especies amenazadas

(categoría: CR) (INRENA, 2006).

A pesar que V. candicans es una especie de valor ecológico y económico

con gran potencialidad para su agrosilvicultura, especialmente en tierras sin

capacidad de uso agrícola, aún no se ha puesto en práctica un sistema que

consiga la formación de rodales de mito, para la recuperación de las lomas

costeras del Perú. (Mendoza, 2004; comunicación personal)

Las técnicas de propagación in vitro nos dan la ventaja, que se puedan

imitar las condiciones de campo en el laboratorio, además de manejar muchos

respuestas de la especie cuando es sometida a estrés (Hurtado y Merino,

En la presente investigación tiene como objetivo principal de:

Estandarizar un protocolo para el cultivo de embriones de Vasconcellea

candicans en condiciones in vitro. Así como también los siguientes objetivos

específicos: a) Obtener un método de desinfección de semillas para la

de la testa de la semilla en la germinación de semilla de Vasconcellea

candicans; y c) Evaluar el crecimiento de las plántulas obtenidas de embriones

de Vasconcellea candicans en un medio basal alternativo de sales

hidropónicas. Con el fin de obtener una regeneración adecuada de individuos

de V. candicans para un posterior programa de reforestación en las lomas

El cultivo de embriones permite que estos germinen y se desarrollen en

plantas (Burgos y Ledbetter, 1993). Las técnicas de rescate de embriones se

han desarrollado para numerosas especies y se han utilizado rutinariamente en

los programas de mejoramiento. Esta tecnología permite la recuperación de una

creciente progenie, incluyendo progenie de cruces interesantes que de otra

manera podrían perderse. (Scemama y Raquin, 1990; Sharma et al., 1996).

Bhattacharya y Khuspe (2001) obtuvieron un promedio de germinación

máxima de 95 % a los 7-8 días por cultivo de embriones de Carica papaya en el

Trabajos realizados por Soto (1999) muestran que solo el 5 % de las

semillas germinan en una cámara de germinación, mientras que con el cultivo