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RESUMEN

El análisis microbiológico básico del agua y de alimentos comprende la


determinación de coliformes totales y fecales. La ausencia o presencia de los
coliformes fecales en el agua define su potabilidad. El objetivo del presente trabajo
pre-profesiones consistió en el diseño y ejecución de un esquema del principal
método utilizado en el laboratorio de microanálisis de alimento y agua para la
determinación de coliformes en aguas, sobre la técnica de referencia de Número
Más Probable (NMP) derivada del Standard Methods for the Examination of Water
and Wastewater. Específicamente, las modificaciones incluyeron el tipo de medio
utilizado en la fase presuntiva de la técnica y el uso de incubadora, alternativo al
baño de maría en la fase confirmatoria. Simultáneamente, se comparó el efecto
del uso de diferentes equipos. Para tal efecto, se utilizaron muestras de agua y
alimentos, se elaboró con material del laboratorio e inoculadas. Además de
aportaciones de protocologos que se observó durante el tiempo de prácticas.

PALABRAS CLAVES

Coliformes, microanálisis, medios, fase, presuntiva


ABSTRACT

The basic microbiological analysis of water and food comprises the determination
of total and fecal coliforms. The absence or presence of fecal coliforms in the water
defines their potability. The objective of this pre-professions work consisted of the
design and execution of a scheme of the main method used in the microanalysis
laboratory of food and water for the determination of coliforms in water, on the
reference technique of Most Likely Number (NMP) derived from the Standard
Methods for the Examination of Water and Wastewater. Specifically, the
modifications included the type of medium used in the presumptive phase of the
technique and the use of an incubator, alternative to the maria bath in the
confirmatory phase. Simultaneously, the effect of the use of different equipment
was compared. For this purpose, water and food samples were used, it was
elaborated with laboratory material and inoculated. In addition to contributions of
protocologists that was observed during the practice time.
INTRODUCCION

La demanda de agua para consumo requiere de un abastecimiento sanitario de


este recurso, esto sólo se puede lograr mediante una adecuada vigilancia
microbiológica. En diferentes partes del mundo, una parte significativa del agua
destinada para el consumo humano, no está sujeta a una vigilancia sanitaria
sistemática, en parte por limitación de recursos e infraestructura y en parte por la
carencia de recursos humanos calificados. Esta situación resulta en un mayor
riesgo de la población a enfermedades infecciosas transmitidas a través del agua.
Se pretende que, con uso de este manual como guía, podamos adquirir los
conocimientos y experiencia necesarios para aplicar las técnicas bacteriológicas
estandarizadas a la vigilancia sanitaria del agua y alimento.
El agua y alimento para el consumo humano debe ser de excelente calidad, la cual
inicia desde su origen natural, el recorrido hasta la planta de tratamiento en caso
de alimentos por diferentes distribuidores, los procesos realizados en esta, hasta
su llegada al servicio domiciliario y a su post preparación. A pesar de ello, las
enfermedades de origen hídrico son frecuentes en los países en desarrollo, por lo
que los estudios de la bacteriología del agua se han orientado en su mayor parte
hacia el aspecto sanitario de la misma. (Salgado MT. Pag 34)
Primeramente, para implementar cualquier método de detección, se requiere
preparar las muestras del alimento, lo que generalmente consiste en la
elaboración de diluciones que permitan disminuir la concentración del
microorganismo en la muestra y poder hacer una mejor determinación y observar
mejor las condiciones en las que se encuentra el alimento. El objetivo de este
informe es el complementar el tema practico de prevención y control del monitoreo
sanitario microbiológico de coliformes totales en el sector de agua y alimento, para
contribuir con la capacitación de recursos humanos en aspectos relacionados con
la vigilancia sanitaria del agua y alimentos.

OBJETIVOS GENERAL
Aplicar el método número más probable (NMP) para la evaluación sanitaria
microbiológico de coliformes totales en el sector de agua y alimento en la ciudad
de Trujillo, para contribuir con la capacitación de recursos humanos en aspectos
relacionados con la vigilancia sanitaria del agua y alimentos.
OBJETIVOS ESPECIFICO

Determinación de coliformes totales y fecales aplicando el método NMP en


alimentos de consumo directo expendidos en los meses diciembre del 2018 hasta
abril del 2019.

MATERIALES Y MÉTODOS
Para la realización de este trabajo se utilizaron los equipos, materiales y reactivos
apropiados y de uso habitual en el laboratorio de análisis de alimentos y Aguas de
la subgerencia de la municipalidad de Trujillo.
Validación de la técnica de coliformes totales y E. coli por el método de NMP
Antes de la validación, y como se recomienda, fueron realizados diversos
controles.

ACTIVIDADES REALIZADAS:
Preparación de los cultivos

Control de calidad de los medios de cultivo


A los medios de cultivo utilizados (caldo brilla simple y lauril sulfato) se les realizó
prueba de esterilidad mediante la autoclave anteriormente puesto tapones de
algodón y luego doblemente amarrados y cubiertos con papel.
Prueba de esterilidad. Una vez preparados los medios de cultivo según las
indicaciones posteriormente se debe seguir con el protocolo de esterilización de
para cada cultivo para ello se utilizó la autoclave sometiendo a un proceso de
esterilización (con el tiempo que será requerido), posteriormente. De los diferentes
medios de cultivo preparados fueron separados aleatoriamente en botes plásticos
diferentes y luego de enfriarse a temperatura ambiente se paso a refrigerar
correctamente por orden de fechas según estas están preparadas (Fernández
Escartín, E., 1981).
Preparaciones de los materiales de vidrio
Cada instrumento requerido anteriormente luego de enjuagarse con agua corriente
se es posicionado en un recipiente de plástico ancho en el cual es sumergido
totalmente, a la vez son agregados una porción de detergente y legía son dejados
en posición de remojo por unos 15min luego posteriormente se pasa a lavar
correctamente estos son secados a temperatura ambiente luego son limpiados
con gaza sumergidos alcohol; luego cada frasco es tapado con papel y amarrado
con pabilo luego esterilizados en el horno(autoclave).
Con instrumentos de vidrio como tubos, matraces, pipetas y probetas. Son lavadas
respectivamente y secadas a temperatura ambiente, en caso de las pipetas estas
son lavadas con agua hervida de jabón con lejía estas de una vez secadas son
puestas un tapón de algodón y enrolladas con papel para luego pasar a ser
esterilizadas. siguiendo las recomendaciones del protocolo actualizado de la
municipalidad de Trujillo.

Preparación de utensilios para el muestreo


Para cada muestreo dependiendo la cantidad de muestras se utilizan culer aptos y
debidamente limpios en este se pasan a llenar en la parte inferior como base gel
en hielo refrigerante y luego llenados los frascos de vidrio debidamente ordenados
en otro culer es puesto material de primer uso como guantes, tapa boca y
protector de cabello(toca) en caso de que la muestra fuera agua potable también
es agregado un rollo de pabilo para el cual se utiliza para alcanzar una
profundidad adecuada en el pozo cisterna bajo de cada establecimiento público.
Extracción de las muestras determinadas y solicitadas
Siendo el muestreo inopinado; cada establecimiento está en el deber de facilitar a
los agentes o técnicos para que estos prosigan según el protocolo de muestreo
según convenga para cada tipo de muestreo estos pueden ser muestreo de
superficies inertes y vivas (siendo mesas o manos del empleado de acceso directo
al alimento ingerido por el público) o muestreo de agua potable o de alimento
Para el caso de agua potable se debe agregar también un rollo de pabilo el cual se
utiliza para alcanzar una profundidad adecuada en el pozo cisterna bajo de cada
establecimiento publico
En el caso de alimento este se debe extraer la muestra con un cubierto o cuchara
provisto por el propio establecimiento es en el caso de ser comida sólida y el
alimento acuoso este se debe mesclar para que esta muestra sea homogénea
Procesado de la muestra:
Diluciones de la muestra de alimento para detección de contaminación
Cuando se tiene una muestra de alimento líquida y sólida se procede a elaborar
una solución madre que consiste en colocar el material cubierto con el
microorganismo en un recipiente que contiene 10 ml de agua destilada estéril,
solución salina, agua de peptona etc., cuya suspensión resultante se debe agitar
por 1 minuto, para obtener la suspensión concentrada del inóculo.
Etapas de la Prueba presuntiva
1. Preparación del material.
2. Realizar diluciones servidas de la muestra de agua hasta 10-3 en agua
peptonada.
3. Realizar 5 pases de 1 ml. de cada una de las diluciones (10-1, 10-2, 10-3) a
tubos con 9 ml.de caldo Lauril sulfato y campanas Durham.
4. Dejar incubando de 24 a 48 hrs. a 35°C.
Etapas de la prueba confirmativa
1. Realizar pases con alícuotas de 1ml. De cada los 5 tubos por dilución a tubos
con medio caldo brilla con su respectiva campanas Durham.
2. Dejar incubando de 24 a 48 hrs. a 35°C.

METODO:
TÉCNICA DE TUBOS MULTIPLES.
Los análisis microbiológicos del agua, ya sea para la prueba de tubos múltiples o
de filtro de membrana requieren del empleo de cantidades variables de muestra,
esto se logra mediante el proceso de diluciones decimales seriadas, las cuales se
deben utilizar cuando se siembren volúmenes de muestra menores de 1mL. El
diluente se debe preparar en tubos añadiendo 9 mL de éste para la preparación de
diluciones 1:10 (IO**1) las botellas con capacidad para 500 mL para la preparación
de diluciones 1:100 (10~2).
Es recomendable destinar tubos y botellas exclusivamente para dilución de
muestras, conviene calibrar los tubos y las botellas de dilución respectivamente,
marcando el nivel con un lápiz de diamante o rotulador. Este procedimiento
permite al técnico descartar tubos o botellas que contengan volúmenes diferentes
a los requeridos para realizar adecuadamente las diluciones decimales seriadas.
El diluente ideal es aquel que no provoca cambios en el número de bacterias
presentes en la muestra y que no deprime la recuperación de organismos
debilitados. La sobrevivencia de microorganismos en un determinado diluente
puede ser muy variable, y está influenciada por el tiempo de permanencia en éste,
temperatura, pH, gradiente osmótico, capacidades amortiguadora y quelante,
presencia de iones calcio, magnesio y hierro. El agua destilada no es
recomendable como diluente puesto que carece de iones metálicos esenciales asi
como de capacidad quelante y amortiguadora. Se han utilizado diferentes tipos de
soluciones para dilución, las más comunes son la peptonada y la de fosfatos. La
primera contiene 0.1 de peptona en agua destilada y se recomienda en la
detección de organismos debilitados provenientes de aguas residuales industriales
o de aguas superficiales con contenidos altos de iones de metales pesados
(Merck, E., 1972)
La segunda, se prepara a partir de una solución madre (A), que lleva 34.0 g de
KH2PO4, pH 7.2, y de otra (B) preparada con 50 g de MgSO4*7H2O por litro de
agua destilada. Para preparar el diluente fosfatado, se agregan a un litro de agua
destilada 1.25 mL de la solución A y 5.0 mL de la B, el producto final deberá tener
un pH de 7.2bO.l. Esta solución de fosfato y magnesio mejora la recuperación de
bacterias con lesiones metabólicas inducidas por agua de alta calidad o por aguas
con contenidos altos de iones de metales pesados. Se ha observado que cuando
se utiliza el agua peptonada como diluente a temperatura ambiente, puede haber
multiplicación bacteriana cuando el tiempo de preparación de las diluciones y el
sembrado exceden de 40 minutos, por esta razón, se requiere que cuando se use
este tipo de diluente estos pasos no tarden más de 30 minutos (Geldrich E. Edwin.
1975)
Las diluciones no se deben prepara bajo la luz del sol, ya que, esto representa un
efecto adverso para las bacterias presentes, en la muestra, las que en muchas
ocasiones ya se encuentran, debilitadas.
Se recomienda un mínimo de tres diluciones seriadas para asegurar, la obtención
de datos cuantitativos. Cuando se carezca de datos, bacteriológicos previos de
una muestra, es recomendable emplear 5 diluciones decimales para contar con
una certeza razonable de que se va a obtener un punto límite entre resultados
positivos y negativos. Una dilución decimal se obtiene mezclando 9 partes de
diluyente y una parte de muestra, esta mezcla debe ser homogenizada mediante
pipeteo o utilizando un homogenizador. Un aspecto muy importante en este
procedimiento es el cambiar de pipeta cada vez que se haya despachado líquido
para evitar errores por acarreo de microorganismos.
Una vez formada una dilución decimal el procedimiento se repite en forma seriada
hasta alcanzar la dilución deseada.
Técnica de tubos múltiples.
La prueba de tubos múltiples constituye un método estandarizado para la
determinación de la densidad de bacterias indicadoras de contaminación. En esta
prueba, réplicas de tubos de medios de cultivo específicos, son inoculados con
diluciones decimales de una muestra dada de agua. La densidad bacteriana es
calculada por medio de fórmulas de probabilidad que estiman el número más
probable de bacterias para producir ciertas combinaciones de resultados positivos
(como turbidez o formación de gas) y negativos.
Prueba confirmativa coliformes
Cada tubo del ensayo previo que muestre formación de gas en el tubo Durham, se
siembra con un asa de inoculación en tubos de ensayo son caldo verde brillante
dotados de tubos Durham. Luego se incuba durante 48p3 horas a 35b_.5^C. Los
tubos con formación de gas se consideran como positivos, con respecto a
bacterias coliformes (SARH.1983)
Prueba confirmativa coliformes fecales
Para la prueba confirmativa de coliformes fecales, se realizan inoculaciones en
caldo EC, provenientes de los tubos del ensayo previo que mostraron formación
de gas, incubar durante 24 horas a 44.5b_0.2%C. Bajo estas condiciones la
formación de gas en caldo brilla indica el origen fecal de las bacterias coliformes.
Cuando se analizan muestras de agua potable, se utilizan 5 tubos de
fermentación, cada uno con contenidos de 10 o 100ml de la muestra y mínimo 3
diluciones. Pero resulta impráctico usar porciones de 100ml.
Cuando se trata de agua no potable, se inoculan los tubos con cantidades
decimales del agua. La selección de éstas va a depender de la densidad probable
de coliformes y la experiencia del analista.
Esta técnica puede también ser usada para sedimentos, haciendo una dilución de
10”. Se pesan 50 gr de muestra (sólida o semisólida) y se adicionan 450 ml de
agua de dilución y se agita por 1 o 2 minutos.
Los resultados del análisis de los tubos de réplica y diluciones son reportados en
términos del Número Más Probable (NMP).
El valor numérico de la estimación del contenido bacteriano es determinado por la
dilución que mostró ambos resultados positivos y negativos.
La mejor evaluación de la calidad sanitaria del agua depende de la interpretación
de resultados de la técnica de los tubos múltiples o de otros métodos,
posiblemente más precisos y de toda la demás información relativa al agua que
pueda ser obtenida.
CONCLUSIONES:

Se determinó que el método del numero mas probable es uno de los más eficaces
siendo el método que requiere menos tiempo y más preciso para determinar
coliformes totales y fecales en alimentos expendidos y agua potable en la ciudad
de Trujillo puestos en disposición de la subgerencia municipal área de salud
(laboratorio de análisis microbiológico de alimentos y agua).
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

 Salgado MT. Microbiología de los Alimentos. Editorial Universidad de


Caldas. 1 edición. 2006. pág. 34. ISBN: 9588231175.
 Fernández Escartín, E., 1981. Microbiología Sanitaria Agua y alimentos.
Vol. 1. Ed. Universidad de Guadalajara, México. 1020pp.
 Geldrich E. Edwin. 1975. Handbook for evaluating water bacteriological
laboratories. U.S. Environmental Protection Agency. Cincinnati, Ohio.
 Merck, E., 1972., Examen bacteriológico de aguas.
 SARH.1983. Manual del Curso: Estudios de Calidad del Agua.
ANEXOS:
FIG 1. PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO.

FIG 2. SE PROCEDE A PESAR SIGIENDO LO ESTABLESIDO PARA CADA


MEDIO
FIG 3. EL MEDIO PASA A SER HIDRATADO CON AGUA DESTILADA

FIG 4. LLENADO DEL MEDIO EN TUBOS Y DEBIDAMENTE TAPADOS CON


ALGODÓN.
FIG 5. EXTRACCION DE ALIMENTO EN MERCADOS DE TRUJILLO