A Guias de Laboratorio Curso de Microbio PDF

A
GUÍAS DE LABORATORIO
CURSO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL
NEYLA BENÍTEZ CAMPO Ph.D.
ANA CRISTINA BOLAÑOS Ph.D.
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS
UNIVERSIDAD DEL VALLE
SANTIAGO DE CALI, FEBRERO DE 2017

Benítez-Campo, N. y Bolaños, A.C. 2017. Guía de laboratorio de Microbiología. Dpto. de Biología.
Universidad del Valle. Cali, Colombia.
TABLA DE CONTENIDO
Pág.
RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA..................................................................................................................... 1
PRÁCTICA No. 1. UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS: PRESENCIA DE
MICROORGANISMOS EN DIFERENTES AMBIENTES ...................................................... 3
PRACTICA No. 2. PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS Y COLORACIONES
DIFERENCIALES....................................................................................................................... 6
PRACTICA No. 3. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO......................................... 11
PRÁCTICA No. 4. MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS ............................................................................................................ 14
PRÁCTICA No. 5. PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA .................... 17
PRÁCTICA No. 6. CARACTERIZACION BIOQUÍMICA DE Bacillus cereus ..................... 22
PRACTICA No. 7. HONGOS: IDENTIFICACIÓN DE DIVERSOS GRUPOS ..................... 24
PRÁCTICA No. 8. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS: PREPARACIÓN DE
YOGURT ................................................................................................................................... 29
PRACTICA No. 9. ANALISIS MICROBIOLÓGICO DE SUELOS ....................................... 31
PRÁCTICA No. 10. ANALISIS BACTERIÓLOGICO DE AGUAS ...................................... 34
PRÁCTICA No. 11. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS ............................. 36
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 41
i
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Morfología de las colonias bacterianas ........................................................................ 5

Figura 2. Preparación de extendidos y coloración ...................................................................... 7
Figura 3. Métodos de siembra. Siembra por agotamiento (a). Siembra por estrías (b) ........... 16
Figura 4. Siembra en profundidad (Vertido en placa). ............................................................. 16
Figura 5. Esquema representativo de una caja de Petri con los discos de antibiótico y el halo
de inhibición ............................................................................................................................... 18
Figura 6. Siembra de colonia bacteriana para pruebas: agar almidón, agar leche y agar
gelatina. ...................................................................................................................................... 23
Figura 7. Textura algodosa ........................................................................................................ 27
Figura 8. Textura granular (a) y textura polvosa (b). ............................................................... 27
Figura 9. Textura afelpada (a) y Textura glabra o cerosa (b) .................................................. 28
Figura 10. Esquema de siembra en caja de Petri para la prueba antagonismo ....................... 33
Figura 11. Método del NMP de coliformes totales, fecales y determinación de E. coli ............ 38
ii
LISTA DE CUADROS
Pág.
Cuadro 1. Procedimiento de la coloración de Gram ................................................................... 9

Cuadro 2 Interpretación de resultados en agar TSI. ................................................................ 20
Cuadro 3. Número Más Probable (NMP) por g/mL de muestra, usando tres tubos de 0.1, 0.01
y 0.001 g/mL ............................................................................................................................... 40
iii
RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA
Todos los laboratorios deben seguir normas de seguridad que garanticen el buen uso y conservación
de los mismos para lograr los objetivos de los estudios que allí se desarrollen. En general la labor
del microbiólogo en el laboratorio, consiste en aislar e identificar microorganismos que, en algunos
casos, pueden resultar patógenos. Para aislar el microorganismo de interés, se debe trabajar con
elementos estériles (asas, medios de cultivo, material de vidrio, recipientes, etc.) y manipular las
muestras con sumo cuidado, como potenciales vehículos de microorganismos patógenos. Algunas
de estas normas son:
1. Antes de entrar a trabajar al laboratorio, lea el texto de la práctica que va a realizar y haga el
plan de trabajo.
2. No comer, beber o fumar dentro del laboratorio.
3. Usar siempre bata de laboratorio, que debe lavar periódicamente.
4. No pipetear con la boca el material contaminado, utilice pipeteadores.
5. Reducir al mínimo la producción de aerosoles. (Preferiblemente utilizar mascarilla).
6. Antes y después de cada sesión lave las manos y aplique alguna solución desinfectante.
7. Antes y después de cada sesión de trabajo limpie los mesones con solución desinfectante
(Alcohol o hipoclorito de sodio).
8. Las asas bacteriológicas deben ser esterilizadas en la llama del mechero, poniendo al rojo
vivo todo el alambre, antes y después de su uso.
9. Cada vez que se derrame material contaminado, cubra la mesa con toallas de papel, y
humedézcalas con sustancias bactericidas. (Alcohol o hipoclorito de sodio).
10. Las incubaciones deben realizarse durante el período de tiempo recomendado, no dejar
material contaminado dentro de las incubadoras innecesariamente.
11. Informe inmediatamente al instructor de cualquier accidente, tales como cortaduras,
quemaduras o derrames de cultivos. Tome las precauciones posibles para evitar accidentes
12. Todos los reactivos y equipos deben dejarse organizados y en sus sitios respectivos al final
de cada práctica.
13. Después de realizar las respectivas lecturas de los cultivos, coloque el material contaminado
en la mesa dispuesta para tal fin, o devuélvalo al personal de laboratorio, para su posterior
esterilización y/o desecho.
14. Cada grupo de estudiantes tendrá a su cargo un microscopio que debe aprender a manejar y
cuidar adecuadamente ya que éste será usado durante todo el curso.
15. No olvide traer a las prácticas los siguientes implementos de uso personal:
1
Bata de laboratorio
Bitácora de Laboratorio
Marcador de vidrio o lápiz vidriograf
Guantes desechables
Porta - objetos
Cubre – objetos
Encendedor
Tapabocas
2
PRÁCTICA No. 1. UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS: PRESENCIA DE

MICROORGANISMOS EN DIFERENTES AMBIENTES
1. INTRODUCCION
La ubicuidad de los microorganismos se basa en tres características principales: su tamaño pequeño,

el cual les permite una gran capacidad de dispersión, su variabilidad metabólica, que les permite
tolerar y adaptarse rápidamente a condiciones ambientales desfavorables, y su plasticidad genética
(o gran capacidad de transferencia horizontal de genes), que les permite re-combinar y recolectar
los caracteres positivos y persistir durante largo tiempo adaptándose a condiciones ambientales
cambiantes. Este grupo de organismos "invisibles" representan un vasto terreno inexplorado de
conocimiento y de diversidad biológica. Sin el conocimiento de los microorganismos la biología
sería mucho más limitada, no sabríamos que hay vida en condiciones de temperatura, salinidad o
pH extremas, la fotosíntesis solamente sería aerobia y oxigénica y los seres vivos más longevos
(como las Secuoyas) no superarían los miles de años de edad.
2. OBJETIVOS
Comprobar la presencia de los microorganismos en diversos ambientes

Validar el concepto de ubicuidad microbiana
3. MATERIALES
5 Cajas de Petri con agar nutritivo Exuvias de insectos

5 Cajas de Petri con agar papa dextrosa Semillas varias (ajonjolí, linaza, lentejas,
(PDA) etc)
Mecheros Hojas de plantas
Asas Pinzas estériles
Bisturí
2 Aplicadores (copitos) estériles Bisturí
Encendedor Cinta vinilpel
2 Cajas de Petri vacías estériles
4. METODOS
a. Microorganismos presentes en el aíre

Tome dos cajas de Petri; una de agar nutritivo y otra con PDA. Ábralas en un espacio escogido por
usted y exponga al aire por un período mínimo de 30 minutos. Tape, selle con cinta vinilpel y
marque. Incube y observe el crecimiento de los microorganismos que aparecerán al cabo de 24 y 48
horas.
b. Microorganismos presentes en semillas

Tome dos cajas de Petri; una de agar nutritivo y otra con PDA. Ábralas y al lado del mechero, con
una pinza estéril coloque cinco semillas de una especie seleccionada, en cada caja. Tape, selle con
cinta vinilpel y marque. Incube y observe el crecimiento de los microorganismos que aparecerán al
cabo de 24 y 48 horas.
3
c. Microorganismos presentes en tejido vegetal

Con una piza estéril, tome una hoja de una planta, y con ayuda de un bisturí, fragméntela en
pequeños pedazos y llévelos a cada caja de petri (una de agar nutritivo y otra con PDA). Tape, selle
con cinta vinilpel y marque. Incube y observe el crecimiento de los microorganismos que
aparecerán al cabo de 24 y 48 horas.
d. Microorganismos presentes en insectos

Tome una exuvia o un cadáver de un insecto, fragméntelo en pequeños pedazos y llévelos a cada
caja de petri (una de agar nutritivo y otra con PDA). Tape, selle con cinta winilpel y marque. Incube
y observe el crecimiento de los microorganismos que aparecerán al cabo de 24 y 48 horas.
e. Microorganismos presentes en humanos

Con un copito estéril frote las encías, lengua, dientes, axilas u otra parte de su cuerpo. Luego pase
suavemente el copito sobre una caja de agar nutritivo y sobre otra caja con PDA. Tape, marque y
selle con cinta vinilpel. Incube y observe el crecimiento de los microorganismos que aparecerán al
cabo de 24 y 48 horas.
NOTA: Las cajas con agar nutritivo se incubarán a 35°C y las cajas con PDA a 28°C.
5. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Después del período de incubación observe cada una de las cajas con microorganismos y describa la
coloración, tamaño, elevación, forma y borde de las colonias (Figura 1). Compare los tipos de
colonias obtenidas a partir de los diferentes sustratos. Cuente el número de colonias presentes en las
cajas expuestas al aire y divida el número obtenido sobre el área de la caja de Petri. Exprese el
resultado del análisis del aire como UFC/cm2 (Unidades Formadoras de Colonias/cm2). Las colonias
obtenidas en los otros ambientes solo se describen, no se expresan en UFC/cm2, debido a que no se
muestreo un área conocida.
6. PEGUNTAS
a) Explique cómo inciden los microorganismos del aire en el trabajo de laboratorio en

microbiología.
b) Indique las posibles razones por las cuales se utilizaron dos medios de cultivo y dos
temperaturas de incubación
c) Exprese las razones por las cuales los microorganismos pueden encontrarse en diversos
ambientes
4
Figura 1. Morfología de las colonias bacterianas

Fuente: http://morfologiabacteriana8.blogspot.com.co/2015_09_01_archive.html
5
PRACTICA No. 2. PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS Y COLORACIONES

DIFERENCIALES
I. PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS
1. INTRODUCCIÓN
La determinación de la morfología en la identificación de los microorganismos juega un papel

fundamental, para una diferenciación inicial. A través de las determinaciones morfológicas, se
puede efectuar el reconocimiento de los microorganismos soportada con una adecuada consulta
bibliográfica. Para observar las características de las bacterias es necesario hacer preparaciones
(extendidos o frotis) sobre una lámina porta objetos y lograr luego de un proceso de coloración, ver
las células al microscopio.
2. OBJETIVO
Aprender la técnica del montaje de placas con bacterias y empezar a familiarizarse con el manejo de
los cultivos.
3. MATERIALES
Láminas porta objetos.

Asa de inoculación.
Mechero.
Goteros.
Agua destilada.
Cultivos de bacterias.
4. MÉTODOS
Preparación del extendido
 En una lámina porta objetos limpia, coloque con el asa una gota de agua.
 Esterilice el asa poniéndola verticalmente a la llama del mechero hasta que se ponga de
color rojo en toda su longitud.
 Enfríe el asa introduciéndola en el borde del medio de cultivo.
 Con el asa saque suavemente una pequeña porción de colonia bacteriana sin tomar el medio
de agar.
 Coloque la muestra sobre la gota de agua en el porta objetos, haga una extensión delgada
con el fin de que las bacterias queden bien esparcidas. Si usted observa que la suspensión
no se extiende en la superficie del porta objetos, sino que se recoge en gotas, significa que
el porta objetos está engrasado y deberá repetir el proceso en un porta objetos
completamente limpio.
 Realice extendidos con todos los cultivos de bacterias que se le entregaron (puede poner
dos bacterias diferentes por lámina, siempre y cuando aplique después el mismo colorante).
 Deje que la preparación se seque al aire.
 Fije la preparación pasándola dos veces sobre la llama del mechero, así las bacterias quedan
firmemente adheridas al porta objetos (Figura 2).
6
Nota: Cuando se hacen extendidos a partir de cultivos en medio líquido, no es necesario colocar la
gota de agua.
Preparación de extendidos
Coloración
Colorante
Figura 2. Preparación de extendidos y coloración
II. COLORACIONES DIFERENCIALES
A. COLORACION DE GRAM
1. INTRODUCCIÓN
La morfología de las bacterias se puede confirmar de dos maneras: Observándolas sin teñir donde
se pueda demostrar la movilidad u observándolas muertas teñidas con colorantes. Algunos
colorantes sirven para observar la estructura interna de las células, que de otra manera serán
invisibles. Es importante que todos los colorantes se preparen en el laboratorio siguiendo las
instrucciones específicas del fabricante. Es preciso seguir paso a paso los detalles cuando se
preparan mezclas o compuestos colorantes múltiples, el período y las condiciones de
almacenamiento pueden ser factores críticos para determinar la composición y la calidad de la
solución final.
La coloración de Gram fue elaborada por el Danés Hans Gram en 1884, y permite distinguir entre
diferentes bacterias que puedan mostrar una morfología similar. Al examen microscópico de un
extendido coloreado por el método de Gram que contenga una flora bacteriana mixta, aparecen las
características diferenciales del método. Muchas bacterias conservan la combinación violeta-yodo y
se teñirán de púrpura (Gram positivas), otras se colorean de rojo por la safranina o el colorante que
se emplee en la contra-coloración (Gram-negativas). Con este procedimiento no sólo se hace visible
la forma, tamaño y otros detalles estructurales, sino que pueden agruparse los microorganismos
presentes en tipos Gram-positivos y Gram-negativos, por sus reacciones frente a los colorantes.
La diferencia en la reacción de coloración entre las positivas y las negativas se atribuye a la

diferencia en su composición química. Las paredes de las células Gram-negativas tienen un
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contenido lipídico más elevado que las positivas, y aunque en ambas se forma un complejo cristal
violeta-yodo, el alcohol extrae el lípido de las células Gram-negativas y aumenta por lo tanto la
permeabilidad celular. Esto da como resultado la pérdida del complejo de colorantes y se colorean
de rojo con la safranina o la fucsina. El mismo es retenido por las células Gram-positivas, en las
cuales la deshidratación por el alcohol ocasiona una disminución de la permeabilidad, reteniendo el
cristal violeta tras la decoloración y se observan de color violeta.
Un microorganismo Gram-positivo puede presentar una pared sana, al sufrir daño en esta, se vuelve
Gram-negativo; lo cual indica la importancia de la pared para la retención o escape del colorante.
Las características de coloración de Gram pueden ser atípicas en cultivos muy jóvenes o muy
viejos.
2. OBJETIVO
Aplicar la técnica de coloración de Gram identificar formas y diferenciar grupos bacterianos.

Observar al microscopio la motilidad de algunas especias bacterianas
3. MATERIALES
Cristal violeta
Lugol de Gram
Alcohol-Acetona (decolorante)
Safranina o Fucsina (contracolor)
Cultivos bacterianos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus)
Bandejas de coloración
4. MÉTODO
 Prepare un extendido fino de una colonia bacteriana y dejarlo secar al aire. Utilice los
cultivos de Echerichia coli, Bacillus cereus y Staphylococcus aureus.
 Fije el material al porta objetos de modo que no sea arrastrado durante el proceso de
tinción, pasando el porta objetos 3 o 4 veces sobre la llama del mechero.
 Coloque el preparado sobre un soporte de tinción y cubra la superficie con solución de
cristal-violeta durante 1 minuto.
 Luego lave bien con agua destilada.
 Cubra el preparado con solución de yodo (Lugol de Gram), durante 1 minuto.
 Lave nuevamente con agua.
 Sostenga el porta objetos con una pinza y bañe la superficie con unas gotas del decolorante
(Alcohol-acetona), hasta no arrastrar más colorante violeta (esto requiere habitualmente
unos 10 segundos o menos).
 Lave nuevamente con agua corriente y coloque el porta-objetos nuevamente sobre el
soporte, cubra la superficie con safranina o fucshina, durante 30 seg.; lave con agua
corriente (Cuadro 1).
 Examine el preparado al microscopio, las bacterias Gram positivas se observan de color
violeta y las Gram negativas rojo o rosadas.
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Cuadro 1. Procedimiento de la coloración de Gram
PASO TIEMPO RESULTADOS
GRAM + GRAM -
Colorante Básico Cristal Violeta 1 minuto Se tiñen de Se tiñen de
violeta violeta
Mordiente Lugol 1 minuto Siguen Violeta Siguen Violeta
Decoloración Alcohol-Acetona 10 seg. Permanecen Se decoloran
violeta
Contraste Safranina 30 seg. Permanecen Se tiñen rosado
violeta
B. COLORACIÓN DE CÁPSULA (método de Anthony)
 Prepare un extendido fino y uniforme de Klebisella pneumoniae; extiéndalo con un porta-

objetos en ángulo recto.
 Seque al aire. No exponga al calor.
 Adicione solución acuosa de cristal violeta al 1%, durante 2 minutos.
 Lave con solución de sulfato de cobre al 20%.
 Deje secar al aire en posición vertical y observe al microscopio.
Las células se tiñen de color púrpura intenso y la cápsula aparece sin colorear en el borde externo
de la célula
C. COLORACIÓN DE ESPORAS
 Realice un extendido de una colonia bacteriana tomada de un cultivo con Bacillus cereus.
 Cubra el portaobjetos con una tira de papel filtro.
 Bañe todo el portaobjetos con solución acuosa de Verde Malaquita al 5%.
 Caliente al vapor durante 3 a 6 minutos sin dejar secar.
 Lave con agua
 Contra colorear con solución de Safranina al 0.5 % durante 30 segundos.
 Observe las esporas, estas se ven en forma de esférulas verdes al interior de las células
bacterianas coloreadas de rojo, o junto con desechos de color rojo.
D. PRUEBA DE MOVILIDAD
 Coloque una gota de agua sobre una lámina portaobjetos.

 Suavemente tome con un asa previamente esterilizada un poco de muestra de cultivo
bacteriano.
 Coloque suavemente el asa sobre la gota de agua teniendo cuidado de NO esparcir la gota
sobre toda la lámina.
 Coloque la lámina cubre objetos sobre la gota y observe al microscopio.
4. PREGUNTAS
a) Explique qué es un colorante fluorescente y para qué sirve.
b) Explique qué es una tinción filogenética y su utilidad
9
c) ¿Porque las esporas son más difíciles de teñir que una célula vegetativa?
d) ¿Cómo se correlaciona la presencia de la capsula con la virulencia de una bacteria patogénica?
e) Explique un método por el cual se puedan obtener muestras de pared celular para analizar su
composición química.
RESULTADOS
Preparación de extendidos y coloraciones diferenciales.
Nombre:____________________________________________Código:____________
Microorganismo Técnica Colorantes Esquemas y Observaciones
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PRACTICA No. 3. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
1. INRODUCCIÓN
Los microorganismos tienen alta capacidad para crecer y adaptarse a sustratos de variada
composición. Su estudio ha sido posible gracias a la implementación de los medios de cultivo, los
cuales le suministran al organismo los elementos necesarios para su crecimiento. Los medios de
cultivo son preparaciones utilizadas para muchos propósitos como: aislamiento e identificación de
microorganismos, análisis ambientales, análisis de alimentos y prueba de sensibilidad a los
antibióticos.
Cuidado y recomendaciones. Los medios de cultivo pueden prepararse a partir de sus

componentes o según las recomendaciones del fabricante, cuando este se consigue comercialmente
hay varias reglas que se deben guardar para asegurar la buena calidad del medio preparado.
El agua utilizada debe ser destilada, bidestilada o desmineralizada, proveniente de un sistema
adecuado de destilación; su medida debe ser exacta y en ningún momento con aproximaciones que
generalmente se traducen en una alteración de la consistencia del medio, especialmente cuando se
trata de agares.
Si los ingredientes necesarios para preparar el medio de cultivo son deshidratados deben
permanecer en remojo durante 15 minutos, con la finalidad de permitir una hidratación total de las
moléculas, lo cual evita el calentamiento excesivo que conduce generalmente a evaporación y
descomposición del medio.
Antes de someterse a la acción del autoclave, el medio debe estar completamente disuelto. No
disolverlo con la temperatura del autoclave, pues generalmente el exceso de calor produce un medio
con grumos debido a una deficiente disolución.
Los medios de cultivo que contienen yema de huevo, carbohidratos, urea o cualquier nutriente, no
pueden ser esterilizados en autoclave, estos medios se preparan esterilizando por separado lo que
conocemos como base (se esteriliza en autoclave) y los suplementos por filtración o vapor fluente;
la mezcla de los componentes se realiza cuando la base se ha enfriado entre 45 y 50 °C.
Todos los medios de cultivo después de preparados y vertidos en la caja de petri estériles, deben
secarse, con la finalidad de eliminar el exceso de agua que queda en la superficie para evitar la
coalescencia y mezcla de las colonias cuando se hace la siembra. El secado de la superficie también
previene la contaminación; se lleva a cabo en la estufa incubadora a 37°C durante 20 minutos
aproximadamente, quitando la tapa de la caja y colocando el medio con la superficie hacia abajo.
Después del secado las cajas se pueden guardar en refrigeración envueltas en bolsas plásticas hasta
por tres meses, dependiendo del medio de cultivo. Los medios que contienen antibióticos deben
utilizarse en corto tiempo.
2. OBJETIVO
Aplicar técnicas para la preparación de los medios de cultivo y reconocer la importancia de sus
componentes para el crecimiento bacteriano.
3. MATERIALES
Frasco con agar nutritivo

Frasco con caldo nutritivo
Probeta de 100 mL
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Balanza
Plancha de agitación y magneto
Autoclave
Espátula
Papel aluminio
1 Erlenmeyer de 200 mL
Guantes de protección para calor
Pipeta de 10 mL
Pipeteador
3 cajas de petri vacías
8 tubos de ensayo con tapa
4. MÉTODOS
Preparación de medios sólidos.
 Tome el frasco de agar nutritivo y efectúe los cálculos correspondientes para preparar 80
mL, según las instrucciones de la etiqueta del frasco.
 Lleve la preparación a una plancha de agitación, regule la temperatura y agitación para
diluir la mezcla y deje calentar hasta que la solución se torne traslucida.
 Inmediatamente, baje el Erlenmeyer de la plancha y deje reposar unos cinco minutos. Use
guantes de protección para calor.
 Distribuya la preparación de la siguiente manera:
 7 mL en un tubo de ensayo
 3 mL en un segundo tubo de ensayo
 70 mL en un Erlenmeyer de 200 mL
 Lleve las preparaciones al autoclave y esterilice a 15 lps y 121ºC, durante 15 minutos.
Después de la esterilización, deje enfriar hasta aproximadamente 50°C y vierta el contenido
del Erlenmeyer en tres cajas de petri (15 mL en cada una).
 Coloque el Erlenmeyer con la cantidad sobrante en un baño maría a 45°C, para garantizar
que no se solidifique. Este será usado en la práctica siguiente.
 El tubo de 7 mL, déjelo solidificar en forma inclinada y el tubo de 3 ml déjelo solidificar en
forma vertical en la gradilla, rotule y guarde en la nevera.
Preparación de medios líquidos.
Tome el frasco de caldo nutritivo y efectúe los cálculos correspondientes para preparar 30 mL,
según las instrucciones de la etiqueta del frasco.
Disuelva en la plancha de agitación o con la ayuda de una varilla de agitación. Este medio no es
necesario calentarlo
Vierta porciones de aproximadamente 5 mL en 6 tubos de ensayo, rotule, esterilice en autoclave y
deje enfriar, luego guarde en la nevera.
Estos medios se guardarán para ser empleados en la siguiente práctica.
12
5. PREGUNTAS
a) Investigue como se clasifican los medios de cultivo

b) Cuáles son los nutrientes esenciales para el aislamiento de un microorganismo heterotrófo y
de uno quimioheterótrofo.
13
PRÁCTICA No. 4. MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE

MICROORGANISMOS
1. INTRODUCCIÓN
Existen técnicas de siembra universales básicas para el aislamiento de los microorganismos en el

laboratorio, entre las más usadas se encuentran la siembra por agotameinto y por estrías, la siembra
en profundidad, siembra por punción y siembra por dilución, importantes cuando se trata de estimar
el crecimiento de un microorganismo o simplemente de aislarlo y conservarlo.
La observación e interpretación de los cultivos después de la incubación es el paso definitivo en la

decisión de continuar o no con la identificación de los microorganismos aislados. La decisión se
basa en la observación de las características del crecimiento y número de cada tipo de colonia,
grado de pureza, coloración de Gram y los cambios en el medio de cultivo que rodea la colonia, los
cuales reflejan la actividad metabólica del microorganismo aislado, elemento importante en la
identificación.
2. OBJETIVO
Aplicar los métodos bacteriológicos más usuales para el crecimiento y aislamiento de

microorganismos.
3. MATERIALES
1 Tubo con agar nutritivo inclinado.

1 tubo de ensayo con agar nutritivo en columna
1 tubo con caldo nutritivo.
3 cajas de Petri con agar nutritivo.
1 caja de petri vacía y estéril.
1 Erlenmeyer con 20 mL agar nutritivo fundido y enfriado a 45 °C.
1 tubo con 9.9 mL de Agua peptonada.
4. MÉTODOS
SIEMBRA Y CARACTERIZACION DE CULTIVOS BACTERIANOS
 Escoja uno de los cultivos bacterianos suministrados: Proteus sp, E. coli, B. cereus,
Salmonella, S. aureus, Pseudomonas sp, o Klebsiella sp
 Esterilice el asa en la llama del mechero calentándola completamente hasta el rojo.
 Destape el tubo con agar inclinado y flamee la boca del tubo
 Con el asa previamente esterilizada tome una muestra del cultivo bacteriano y espárzalo en
línea recta sobre la superficie del medio.
 Flamee nuevamente la boca del tubo y tapelo, esterilice nuevamente el asa.
 Repita el anterior procedimiento, utilizando el tubo con agar nutritivo en columna.
 Inocule de manera similar el microorganismo escogido en el tubo con caldo nutritivo,
agitando bien el asa dentro del caldo.
14
 Luego siembre mediante el método de agotamiento (Fig. 1), que consiste en tomar una
muestra del cultivo bacteriano y con el asa rayar suavemente de manera horizontal la
superficie del agar, contenido en una caja de Petri haciendo rayados suaves, de un extremo
a otro de la caja. Tape y esterilice el asa nuevamente.
 Rotule adecuadamente cada uno de los tubos de ensayo y la caja de Petri, proceda a incubar
a 35°C, por 18 - 24 horas.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
a. Siembra por estrías
 Con el asa bacteriológica previamente esterilizada tome una muestra de un tubo que
contiene un cultivo bacteriano mixto, siembre por estrías sobre un extremo de una caja de
Petri con agar nutritivo, y flamee el asa nuevamente.
 Gire la caja 90° y con el asa esparza el cultivo hacia el siguiente extremo de la caja,
realizando rayados suaves en forma horizontal (formando estrías); continúe el aislamiento
realizando el mismo procedimiento en los dos extremos restantes de la caja. En el último
extremo, cuando esté realizando la estriación tenga cuidado de no tocar con el asa el primer
rayado que realizó (Fig. 3). Debe esterilizar el asa cada vez que cambia de extremo en la
caja, para garantizar el aislamiento.
b. Siembra en superficie por perlas de vidrio
 Coloque 100 µl del cultivo bacteriano mixto en la superficie de una caja de Petri con agar
nutritivo
 Adicione 6-8 perlas de vidrio estériles y realice movimientos suaves en varias direcciones.
Descarte las perlas en el recipiente indicado. Incube a 35°C durante 24 horas.
c. Siembra en profundidad (vertido en placa)
 Tome 0.01 mL del cultivo mixto y transfiéralos a un tubo con 9.99 mL de agua peptonada.
 Tome 100 µL de la dilución anterior y deposítelos en el centro de una caja de Petri estéril
vacía.
 Tome el Erlemeyer con el medio de cultivo fundido (45°C) y viértalo en la caja de Petri,
homogenice rápidamente por movimientos giratorios horizontales en varias direcciones,
teniendo cuidado de no formar burbujas (Fig. 4). Deje solidificar e incube en posición
invertida.
 Rotule adecuadamente cada una de las cajas de Petri, proceda a incubar a 35°C, por 18 - 24
horas.
Haga observaciones y esquemas, describa como crece el microorganismo estudiado,
ayúdese con las figuras anexas.
15
a b
Figura 3. Métodos de siembra. Siembra por agotamiento (a). Siembra por estrías (b)
Figura 3. Siembra en profundidad
Figura 3. Siembra en profundidad
Figura 4. Siembra en profundidad (Vertido en placa).

Fuente: Madigan et al. 2004
16
PRÁCTICA No. 5. PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA
1. INTRODUCCIÓN
En múltiples enfermedades infecciosas se requiere aislar el agente causal, probar su sensibilidad

frente a varios antibióticos, interpretar correctamente los resultados para posteriormente, emplear el
más adecuado.
Las técnicas para la determinación de la susceptibilidad son: Dilución y Difusión
Técnica de dilución. Se basa en la realización de una serie de diluciones del antibiótico frente a una
concentración determinada del microorganismo. Esta técnica determina la concentración del
antimicrobiano requerida para inhibir el crecimiento bacteriano (concentración mínima inhibitoria,
CMI) y se expresa usualmente en microgramos por mililitro (μg/mL). Esta técnica puede realizarse
en agar o en caldo (en tubo o en microplacas).
Técnica de difusión en agar (Método de Kirby Bauer). Se basa en la utilización de discos
impregnados con una concentración de antimicrobiano determinada que se coloca sobre la
superficie del agar que presenta una siembra del microorganismo en estudio pero con una
concentración bacteriana conocida (1 x 10 8 UFC/mL). Como medio de cultivo se utiliza el Agar
Mueller-Hinton y ocasionalmente agar sangre.
La preparación se incuba por un periodo determinado durante el cual el antibiótico se difunde
dentro del agar. El diámetro de cada zona debe ser medido e interpretado de acuerdo a estándares
internacionales previamente establecidos. En una sola caja de petri se puede estudiar varios
antibióticos simultáneamente. La preparación del inoculo debe tener la turbidez similar al tubo 0.5
de la escala de Mac Farland. Los halos de inhibición se miden con una regla y se reportan en mm.
Prueba de Epsilon o E-test. Se basa en la utilización de una tirilla de plástico que conlleva un
gradiente de concentraciones del antimicrobiano. Una vez colocada la tira sobre el agar el
antimicrobiano comienza a difundir y produce resultados tanto cualitativos como cuantitativos de la
susceptibilidad del microorganismo frente al agente probado. Es decir permite cuantificar la CMI.
2. OBJETIVOS
 Conocer las técnicas implementadas para la realización del antibiograma.

 Aprender a interpretar los resultados obtenidos en un antibiograma.
3. MATERIALES
 Diluciones seriadas de una suspensión bacteriana

 2 Cajas de Medio Mueller Hinton
 Asas bacteriológicas
 Cultivo de microorganismos Gram positivos en cajas de agar sangre
 Cultivo de microorganismos Gram negativos en cajas de agar sangre
 Reglas para medición de los halos
 Hisopos o escobillones estériles
 Tubos de vidrio estériles (pueden ser de la medida de los tapa roja) con solución salina
estéril.
 Dos discos de antibióticos por cada microorganismo
 Escala de Mc Farland 0,5
 Antibiograma demostrativo en Mueller Hinton con discos de sensibilidad
 Pinza estéril tipo depilador para tomar los discos
17
4. MÉTODOS
 Tomar dos a tres colonias de cada uno de los cultivos bacterianos Gram positivos y
Gram negativos.
 Inocularlos en los tubos estériles que contienen solución salina estéril
 Introducir e impregnar el hisopo estéril en la solución salina con colonias de bacterias.
 Escurrir el hisopo en las paredes del tubo al momento de sacarlo de allí
 Sembrar por el método de siembra en cuadricula masivamente por todo el medio de
cultivo Mueller Hinton.
 Colocar con una pinza, uno a uno los discos de sensibilidad, a una distancia de 40 mm,
entre cada uno de ellos.
 Incubar a 37° C por 24 horas
Después del período de incubación mida el tamaño de los halos de inhibición, que corresponden a la
zona traslucida que se observa alrededor de los discos de antibióticos, según se observa en la Fig. 5.
Figura 5. Esquema representativo de una caja de Petri con los discos de antibiótico y
el halo de inhibición
Se describe a los antimicrobianos como SENSIBLE, INTERMEDIO O RESISTENTE,

dependiendo de los estándares internacionales descritos para cada antimicrobiano sobre cada
bacteria.
ACTIVIDAD DE LA PRÁCTICA
DESARROLLAR LAS SIGUIENTES ACTIVIDADES DURANTE A LA PRÁCTICA

1. Grafique la técnica que se llevó a cabo en el laboratorio
2. Interprete los resultados de la actividad demostrativa:

Tipo de microorganismo:
Discos utilizados:
Interpretación:
Método:
18
PRÁCTICA No. 6. METABOLISMO MICROBIANO: PRUEBAS BIOQUÍMICAS
1. INTRODUCCIÓN
El metabolismo microbiano se define como el conjunto de reacciones químicas que desarrolla una
célula para su funcionamiento. Las reacciones metabólicas pueden ser de dos tipos: catabólicas
cuando descomponen un sustrato y anabólicas cuando forman algunos compuestos a partir de
elementos más simples. Estas reacciones se realizan gracias a la presencia de enzimas que pueden
ser intracelulares o extracelulares.
El número y la clase de enzimas bacterianas son diferentes, debido a que cada enzima está bajo un
control genético, por lo cual se dan variaciones en la utilización de los sustratos. Estas variaciones
se utilizan a su vez para ayudar a caracterizar diferentes géneros y especies bacterianas.
En esta práctica se trabajará con bacterias de la familia Enterobacteriaceae. Esta familia está
compuesta por bacilos Gram negativos y Gram positivos, de tamaño mediano, anaerobios
facultativos, móviles o inmóviles y no esporulados. Este grupo de bacterias crece bien en medios
artificiales, tienen necesidades nutritivas simples, fermentan la glucosa con producción de ácido
y/o gas, reducen los nitratos a nitritos y son oxidasa-variables.
Las Enterobacterias son organismos ubicuos de distribución mundial, se encuentran en el suelo, el

agua, la vegetación y forman parte de la flora bacteriana normal de casi todos los animales incluido
el ser humano. Algunos miembros de esta familia se encuentran asociados a cuadros disentéricos,
mientras que otros pueden producir infecciones oportunistas, las cuales pueden afectar a casi todas
las partes del cuerpo.
2. OBJETIVOS
 Diferenciar la actividad bioquímica de las bacterias mediante la utilización de diferentes

medios de cultivo
 Analizar las pruebas bioquímicas utilizadas y con base en los resultados, realizar la
caracterización de las bacterias
3. MATERIALES
Cepas de Enterobacterias en agar MacConkey

Medios de cultivo para pruebas bioquímicas.
Asa de punta y de argolla
Mechero
4. MÉTODOS
 El laboratorio suministrará a cada grupo de estudiantes, cultivos con las cepas de

Enterobacterias, sembradas en agar MacConkey. Observe la morfología, tamaño, aspecto y
color de las colonias. El color rojo o rosado indica fermentación de la lactosa.
 Tome una de las colonias aisladas, en el agar Mc Conkey y con el asa recta siembre por
punción hasta el fondo del tubo y continúe por estría en la superficie en los tubos con: TSI
(Agar hierro tres azúcares) y Lisina decarboxilasa. Incube a 37°C por 18 - 24 h.
19
 Tome una sola colonia con el asa recta y siembre por punción un tubo con medio SIM
(Sulfuro Indol Motilidad), tenga cuidado de sacar el asa por el mismo sitio de entrada.
Incube a 37°C por 18 - 24 h.
 Continúe la siembra, tomando una sola colonia del cultivo puro y siembre solo en la
superficie inclinada de los tubos con Agar Cirato de Simmons y Agar urea de
Christensen. Incube a 37°C por 18 - 24 h.
 Luego tome una sola colonia con el asa de argolla y siembre dos tubos con caldo MRVP
(Rojo de metilo Voges Proscauer). Incube a 37°C por 24 - 48 h.
El agar TSI, contiene glucosa, sacarosa y lactosa. Además rojo de fenol, como indicador de pH y
sulfato ferroso, para demostrar la producción de H2S, para intrpretar los resultados en este medio
emplee el cuadro 2.
Cuadro 2 Interpretación de resultados en agar TSI.
Reacción Interpretación
Fondo ácido* superficie inclinada alcalina Fermentación a glucosa (K/A)
Todo el medio ácido* Fermentador de glucosa, lactosa (A/A)
Burbujas Aerógenos
Ennegrecimiento del fondo H2S
Medio alcalino** No fermentador de azúcar (K/K)
** alcalino – rojo *Acido-Amarillo
Lisina decarboxilasa: La decarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen la
enzima decarboxilasa específica son capaces de atacar a los aminoácidos en su grupo carboxilo (-
COOH), dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico.
La prueba es positiva cuando hay cambio de color del púrpura a amarillo apagado (producido por la
cadaverina); la prueba es negativa cuando no hay cambio de color.
Prueba de Indol y movilidad: La movilidad se observa en el medio SIM por turbidez formada
alrededor de la de la línea de inoculación.
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa, son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano
con la producción de indol, ácido pirúvico y amonio. Reaccionar que se observa después de la
incubación por 18-24 horas, para su interpretación adicione 2 a 3 gotas del reactivo de Kovac´s a los
tubos con medio SIM, la presencia de indol se destaca por la formación de un anillo rojizo en la
superficie del tubo.
Adicionalmente, algunos microorganismos producen ennegrecimiento del medio por formación de
sulfuro de hidrogeno, a partir del tiosulfato presente en este medio de cultivo.
Citrato de Simmons: Contiene citrato como única fuente de carbono y sales de amonio como
fuente de nitrógeno, no contiene aminoácidos. Las bacterias que pueden utilizar el citrato también
extraen nitrógeno con la producción de amonio que alcaliniza el medio de cultivo. El indicador de
pH es azul de bromotimol.
La prueba es positiva cuando se observa crecimiento con un color azul intenso. La prueba es
negativa cuando no se observa crecimiento ni cambio de color.
20
Urea de Christensen: Si la bacteria posee la enzima ureasa, hidroliza urea del medio liberando
amonio y CO2, el indicador utilizado es rojo de fenol.
La prueba es positiva cuando se observa cambio de color amarillo a rosado. La prueba es negativa
cuando no hay cambio de color.
Reacción del rojo de Metilo: Algunas bacterias utilizan la glucosa con gran formación de ácido, de
forma que el valor del pH del medio desciende a menos de 4.4. Otras bacterias producen menos
ácido, reduciendo en menor cantidad el pH del medio. Esta distinción puede hacerse a través del
rojo de metilo, que presenta color amarillo por encima del pH 5.1 y color rojo cuando el pH
desciende a 4.4.
Después del tiempo de incubación, adicione 5 gotas de la solución rojo de metilo, si se torna rojo, la
prueba será positiva y si no cambia de color, será negativa.
Ensayo de Voges Proscaver: A partir de la glucosa, numerosos microorganismos forman acetoína

(acetilmetilcarbinol), 2,3 butanodiol ó diacetilo. La demostración de estos productos metabólicos se
lleva a cabo con los reactivos de O´MEARA, mejorado por Levine y Col (1932) con sulfato de
cobre ó con el reactivo de BARRIT (1936).
Después del tiempo de incubación, adicione 1 mL de la solución de sulfato de cobre. En caso
positivo se presenta un viraje a rojo después de algunos minutos.
6. PREGUNTAS
a) Investigue la reacción bioquímica que ocurre durante la degradación de la urea, de
producción de indol y de formación de butanodiol.
b) Identifique las principales vías metabólicas de las Enterobacterias que se lograron
comprobar con cada una de las pruebas bioquímicas realizadas en la práctica
21
PRÁCTICA No. 6. CARACTERIZACION BIOQUÍMICA DE Bacillus cereus
1. INTRODUCCION
Bacillus cereus es una bacteria aeróbica facultativa, Gram positiva, formadora de endosporas
altamente resistentes. Puede ser encontrada comúnmente en el suelo como bacteria antagónica de
hongos y bacterias patógenas a plantas, pero también puede ser causante de intoxicación por el
consumo de alimentos contaminados. Los alimentos en los cuales se puede encontrar este bacilo,
son los cereales, puré de papas, verduras, carne picada, embutido de hígado, etc. Sin embargo, es un
microorganismo que por su plasticidad y alta resistencia a condiciones adversas, ha desarrollado
características que le han permitido destacarse en procesos de biorremediación de contaminantes
como metales pesados y plaguicidas.
2. OBJETIVO
Realizar el diagnóstico bacteriológico de Bacillus cereus.
3. MATERIALES
Caja de petri con medio MYP (Manitol-Levadura-Peptona) selectivo para Bacillus cereus
Caja de petri con: Agar leche, Agar Almidón, Agar Gelatina.
Tubos de ensayo con Caldo Nitrato, Caldo Glucosa, Caldo Arabinosa y Caldo Xilosa
Solución de Lugol
Reactivo de Griess.
Cloruro de Mercurio a 15 %.
4. MÉTODOS
 Realice la caracterización morfológica de Bacillus cereus
 Con el asa previamente esterilizada al mechero, inocule una colonia de B. cereus formando
una línea horizontal sobre Agar almidón sin tocar los bordes de la caja.
 Repita el procedimiento anterior, sembrando una colonia sobre Agar leche y Agar Gelatina.
Incube a 35° C durante 48 horas. Ver Fig. 6.
 Prueba de catalasa. Tome una asada de la bacteria y colóquela en un portaobjetos limpio y
estéril. Agregue 2 o 3 gotas de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 30% sobre la muestra.
Homogenice la muestra con un asa o palillo de madera. Si la prueba es positiva se formarán
burbujas inmediatamente.
 Prueba de oxidasa. Tome una porción de la bacteria y estríela sobre el borde de la tira con
BACTIDENT OXIDASA (para-amino-N- dimetil-anilina). Si se torna de color violeta la
reacción será positiva.
AGAR ALMIDÓN: Después del tiempo de incubación cubra la superficie del medio con solución
de lugol, si no se ha producido la hidrólisis del almidón, se teñirá de azul. Las áreas hidrolizadas
22
aparecerán como zonas claras.
Figura 6. Siembra de colonia bacteriana para pruebas: agar almidón, agar leche y
agar gelatina.
AGAR GELATINA: Añada a la superficie con agar gelatina, 5 gotas de cloruro de mercurio al
15%, elimínelo después de 5 minutos, lave con agua corriente. La reacción es positiva cuando una
zona clara rodea la estría.
AGAR LECHE: Observe una zona clara que aparece alrededor del crecimiento, que indica
degradación de la caseína.
CALDO GLUCOSA, ARABINOSA Y XILOSA: Observe si hubo o no fermentación, indicada por

un color rosado en el medio de cultivo, y si hubo o no producción de gas, indicada por la aparición
de burbujas en el caldo.
Glucosa + (sin gas)
Arabinosa ( - )
Xilosa ( - )
CALDO NITRATO: Añada al tubo tres gotas del reactivo de Griess. El color rojo indica prueba
positiva de reducción de nitratos. Si no hay cambio de color la prueba es negativa.
6. PREGUNTAS
¿En que difiere la gelatina de la mayoría de las demás proteínas?

¿Diga cuál es la ventaja de las enzimas hidrolíticas como la AMILASA a nivel ecológico en
ecosistemas terrestres?
23
PRACTICA No. 7. HONGOS: IDENTIFICACIÓN DE DIVERSOS GRUPOS
1. INTRODUCCIÓN
Los hongos son organismos con características particulares, las cuales permiten ubicarlos en un
reino separado, EL REINO FUNGI. Actualmente este reino está constituido por cinco phyla:
Phylum Chytridiomycota, Phylum Glomeromycota, Phylum Zygomycota, Phylum Ascomycota y
Phylum Basidiomycota. Las células fúngicas son eucariotas, están compuestas por una pared celular
que varía en composición química de acuerdo al grupo taxonómico; algunos de estos constituyentes
son: ß- glucano y quitina.
Morfológicamente las formas más sencillas poseen un solo núcleo (levaduras) y las más complejas
forman filamentos multinucleados y se denominan hongos filamentosos. Estos filamentos son
llamados hifas y son la unidad constituyente de su cuerpo o soma, la cual crece únicamente por su
ápice y se ramifica periódicamente dando como resultado un conjunto de hifas denominada micelio.
Los hongos presentan diversas características nutritivas: parásitos, simbióticos o saprofitos cuando
requieren materiales orgánicos preformados que utilizan como fuente de energía y como esqueletos
carbonados para la síntesis celular.
Algunas características morfológicas como el color y hábito de crecimiento se ven influenciadas por
el medio de cultivo utilizado. La mayoría de las descripciones existentes se basan en las
observaciones obtenidas sobre Agar papa dextrosa o Agar Sabouraud.
Microscópicamente los hongos se pueden caracterizar de acuerdo a su organización celular y
estructuras presentes. Macroscópicamente se puede caracterizar la colonia de un hongo de acuerdo
a la textura, color presente en el verso y anverso de la colonia en un medio de cultivo. En el verso se
define como la altura del micelio y puede ser: algodonosa o aérea, granular o polvosa, afelpada y
glabra. En el anverso las colonias pueden ser lisas, rugosas o verrugosas.
Formas macroscópicas se encuentran en Ascomycota y Basidiomycota y hay estructuras
características para la identificación de las especies.
2. OBJETIVOS
 Reconocer las diferentes estructuras o cuerpos reproductivos de algunos hongos.

 Conocer el protocolo general para la observación e identificación de hongos.
 Aislar, sembrar y observar hongos presentes en diversos tejidos.
3. MATERIALES
 Asas curvas y rectas

 Cajas de petri con medios de cultivo específicos para el crecimiento de hongos
 Cultivos de hongos diversos
 Muestras de materiales afectados por hongos
 Portaobjetos
 Cubreobjetos
 Azul de lactofenol o azul de algodón
24
 Reactivo de Melzer
 Frasco para descartar porta y cubreobjetos
 Mechero
4. MÉTODOS
4.1 Descripción e identificación de caracteres macroscópicos de hongos.
Tome las diferentes cajas de cultivo y describa las características de la colonia en la superficie o en
el verso de cada colonia. Registre estas características en el cuadro que se suministra.
Realice una caracterización morfológica de los hongos suministrados enfatizando en las

características de la superficie superior e inferior (Verso y anverso) de acuerdo a los siguientes
parámetros:
SUPERFICE SUPERIOR (VERSO)
- Algodonosa: Se caracteriza por un micelio aéreo, denso y muy alto, con aspecto de algodón
(Figura 7).
- Granular y/o polvosa: Se caracteriza por la facilidad con que se desmenuza y la excesiva
producción de conidias. Con frecuencia estos dos términos se intercambian, sin embargo la
textura granular es más rugosa semejante al azúcar granulado, mientras que la polvosa
parece harina o polvo (Figura 8).
- Afelpada: Se caracteriza por presentar un micelio aéreo bajo, con aspecto de felpa o
terciopelo (Figura 9a).
- Glabra o cerosa: No producen micelio aéreo, por lo tanto tiene una superficie pareja.
Generalmente se presentan en las colonias de levaduras (Figura 9b).
SUPERFICIE INFERIOR
- Rugosa: tiene pliegues irregulares que irradian el centro de cultivo.

- Verrugosa o cerebriforme: Posee una superficie delgada que semeja un cerebro.
- Topografía lisa: No posee irregularidades en su superficie.
4.2 Descripción e identificación de caracteres microscópicos de hongos.
Haga un montaje directo de micelio, para esto coloque una gota de azul de algodón con
lactofenol en un porta-objetos. Seguidamente, tome con el asa de punta recta estéril una
porción de micelio de la parte más externa. Lleve la muestra sobre la gota azul de lactofenol.
Coloque el cubre-objetos y observe cada uno de los especímenes representativos para cada
Phylum al microscopio.
a. CHITRIDIOMYCOTA
Tome cajas de petri con colonias aisladas previamente, monte en una lámina y observe al
microscopio
25
b. ZIGOMYCOTA
Tome microcultivos preparados previamente de Rhizopus sp.; Mucor sp. Lleve la placa al
microscopio y observe estructuras sexuales y asexuales e hifas.
c. GLOMEROMYCOTA
Tome suelo de raíces previamente colectado, tamícelo y observe en vidrio reloj la forma, color y
ornamentación de las esporas presentes.
d. ASCOMYCOTA
Tome microcultivos preparados previamente de diferentes cepas de hongos pertenecientes a este
grupo. Lleve cada placa al microscopio y observe estructuras asexuales (conidióforo,
conidiosporas, fiálides e hifas). Para observar estructuras sexuales (ascas, ascosporas), tome un
apotecio de un liquen indicado en la práctica, haga un corte transversal delgado. Observe algunas
levaduras.
e. BASIDIOMICOTA
Tome un cuerpo fructífero de un macrohongo indicado en la práctica, diferencie cada una de sus
partes, haga un corte transversal y observe basidios y basidiosporas.
Examine al microscópico y haga una identificación del hongo. Tenga en cuenta que de acuerdo al
Phylum se deben buscar determinadas características o estructuras.
En la observación se debe tener en cuenta:

El tipo de hifa (septada, aseptada, hialina, pigmentada)
Forma de la estructura reproductiva en estado anamórfico o telemórfico
En estado anamórfico se observa conidióforo, tipo de conidias, color, tamaño, forma.
En la fase telemórfica se observan esporas, las cuales presentan forma, tamaño, color
ornamentación, que definen el género y/o la especie del hongo
4.3 Siembra de hongos en medio de cultivo

Con el asa para hongos, tome inóculo de un cultivo puro de un hongo suministrado en la
práctica, fragmente y coloque en una caja con PDA (papa dextrosa agar). Incube a 28°C
observe el crecimiento.
5. PREGUNTAS
a) ¿En que difieren los hongos filamentosos de las levaduras?

b) Defina los siguientes términos:
Hifa, micelio, esporangios, gametangios, conidios, ascosporas, basidios,
endomicorrizas, ectomicorrizas.
c) ¿En qué se diferencian los conidios de las ascosporas?
d) Describa las características distintivas de los Phylum Chytridiomycota, Zygomycota,
Ascomycota y Basidiomycota.
26
e) La mayoría de los hongos pueden reproducirse tanto asexual como sexualmente. ¿Cuáles
son las ventajas y desventajas de cada tipo de reproducción?
Tabla sugerida para la descripción de los hongos observados

ASPECTO MACROSCÓPICO ASPECTO MICROSCÓPICO ESQUEMA
Textura: Tipo de hifa:
Topografía: Tipo de conidia:
Color:
Figura 7. Textura algodosa
a b
. .
Figura 8. Textura granular (a) y textura polvosa (b).
27
a b
. .
Figura 9. Textura afelpada (a) y Textura glabra o cerosa (b)
28
PRÁCTICA No. 8. APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS: PREPARACIÓN DE

YOGURT
1. INTRODUCCIÓN
Las bacterias lácticas son un grupo de bacterias unidas por una amplia serie de características
morfológicas, metabólicas y fisiológicas. Están generalmente asociadas a la industria
agroalimentaria ya que son consideradas agentes de alteración de las materias primas para la
obtención de la calidad organoléptica de los alimentos.
La producción de yogurt es el resultado del desarrollo de determinados microorganismos que

modifican los componentes normales de la leche, donde la lactosa se transforma parcialmente en
ácido láctico. Entre estos microorganismos se encuentran Lactobacillus bulgarus y Streptococcus
thermophilus. Estas bacterias soportan muy bien los medios ácidos y cuando se cultivan
conjuntamente producen más ácido láctico que cuando crecen aislados.
2. OBJETIVO
Aprender la técnica básica de siembra de microorganismos en leche para la producción de yogurt.

Caracterizar las bacterias que participan en la fabricación de productos lácteos como el yogurth.
3. MATERIALES
Frascos con 250 mL de leche pasteurizada entera

2 Cajas de Petri con medio MRS
Balanza
Papel para pesar
Espátula
Azúcar
Cepa madre (yogurt comercial)
Pipeta de 10 mL estéril
pH-metro
Incubadora a 45 °C
Becker de 100 mL
4. MÉTODOS
Tome el frasco con 250 mL de leche pasteurizada entera y caliéntelo a 45 °C en incubadora, mida el
pH inicial.
Adicione 10 mL de la cepa madre (yogurt comercial) en una concentración del 4%, Adicione 20g
de azúcar.
Incube a 45 °C durante 3 horas, midiendo el pH de la leche cada hora.
Deje en incubación por 24 horas, mida nuevamente el pH.
Con un asa estéril tome una muestra del yogurt y siémbrela por estrías en una caja de Petri con
medio MRS. Incube a 37°C por 2-3 días.
Después de observar el crecimiento, tome una colonia representativa y realice un extendido para
hacer coloración de Gram.
Realice esquemas y describa las características macro y microscópicas de los microorganismos
observados.
29
5. PREGUNTAS
a) ¿Cuál es el pH óptimo de un yogurt de buena calidad?
b) ¿Cuáles son los microorganismos que producen el yogurt, haga una breve caracterización
de estos?
30
PRACTICA No. 9. ANALISIS MICROBIOLÓGICO DE SUELOS
1. INTRODUCCION
El suelo ha sido definido como la capa del planeta que provee el sustrato que hace posible la vida
vegetal y animal. Las características biológicas del suelo varían según su localización, clima
profundidad, propiedades físicas, etc. La población de bacterias del suelo sobrepasa los demás
grupos de microorganismos: hay varios millones por gramo; hay bacterias autótrofas, mesófilas,
termófilas, aerobias y anaerobias. Degradadoras de celulosa y oxidantes del azufre, fijadores de
nitrógeno, degradadoras de proteínas, y otros tipos. Abundan los Actinomicetos de los géneros
Nocardia, Estreptomyces, Micromonosporas. Abundan los hongos que puedan degradar celulosa,
lignina y pectina.
2. OBJETIVOS
 Determinar la abundancia de bacterias, hongos y actinomicetos presentes en una muestra de

suelo, mediante el método de recuento estándar en placa.
 Determinar el antagonismo que se presenta entre algunos microorganismos del suelo.
3. MATERIALES
Barreno estéril
Balanza analítica y balanza gramera
Horno a 105 C
Vórtex
1 tamiz de 2 mm esterilizado
10 g de suelo tomado a 10, 20 y 30 cm. de profundidad
90 mL de solución salina estéril
1 tubo con 9.9 mL de solución salina estéril
2 tubos con 9.0 mL de solución salina estéril
6 cajas con agar para Actinomicetos
6 cajas con agar nutritivo
6 cajas con Agar PDA
1 caja de Agar nutritivo para la prueba de antagonismo
4 pipetas se 1.0 mL estériles
3 asas de vidrio estéril
Espátula estéril
Mechero y alcohol para manos
Solución desinfectante para desecho de pipetas
Cucharas estériles
Bolsas plásticas estériles
Marcadores sharpie
Cinta de enmascarar
Papel aluminio estéril
31
4. MÉTODOS
Toma de muestras del suelo

Demarquer el transecto o área de toma de muestra, se hace una caracterización del terreno:
vegetación dominante, pendiente, presencia de erosión, cultivos, estado de cultivo, o actividad sobre
el terreno, altura sobre el nivel del mar y si es posible, temperatura, así como la localización
geográfica.
Proceda a tomar una muestra de suelo a una profundidad de 20 a 30 cm, con la ayuda de un barreno.
Deposite la muestra en una bolsa plástica nueva, cuidando de no crear anaerobiosis. La bolsa debe
rotularse con la fecha, el sitio, la hora y el nombre de quien tomo la muestra.
Transporte la muestra al laboratorio, y guárdela en la parte de abajo de la nevera para procesarla lo

más pronto posible.
Preparación de la muestra
Tamizar en condiciones de asepsia la muestra de suelo por tamiz de malla de 2 mm. Se determina la
humedad total del suelo para hacer la respectiva corrección a peso seco, de la siguiente manera: Se
seca un poco más de 10 g de suelo a 105 C por 24 horas, posteriormente se deja reposar dentro de
un desecador y se vuelve a pesar hasta que el peso de la muestra se estabilice. Para el cálculo de la
humedad utilice la siguiente fórmula:
A. MÉTODO DE RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA
Preparación de las diluciones


Pese 10 g de suelo, con corrección al peso seco (Se le suma el valor en g, correspondiente al
porcentaje de humedad)
 Viértalos en un frasco con 90 mL de solución salina estéril. Agite vigorosamente por 30
min., esta es la dilución 10-1
 Realice la segunda dilución tomando 0.1 mL de la primera dilución y viértalos en otro tubo
con 9.9 mL de solución salina estéril, esta es la dilución 10-3.
 Tome ahora 1 mL de esta dilución y viértalos en un tubo con 9.0 mL de solución salina,
esta será la dilución 10-4.
 Repita el procedimiento a partir de la última dilución y prepare la dilución 10 -5.
Recuento Total de bacterias aerobias, Actinomicetos y Mohos y Levaduras
 Para el recuento de bacterias aerobias, siembre por duplicado, 0.1 mL de las diluciones 10-
3
a 10-5 en las cajas de Petri con Agar Nutritivo. Esparza rápidamente el inóculo con asa de
vidrio. Incube a 28oC por 24-48 horas.
32
 Para el recuento de Actinomicetos siembre 0.1 mL de las diluciones 10-2 a 10-4 en las cajas
de Petri con Agar para Actinomicetos. Esparza rápidamente el inóculo con asa de vidrio.
Incube a 28oC por 5 a 7 días.
 Para el recuento de Mohos y Levaduras siembre por duplicado, 0.1 mL de las diluciones
10-2 a 10-4 en las cajas de Petri Agar PDA (Papa Dextrosa Agar). Esparza rápidamente el
inóculo con asa de vidrio. Incube a 28oC por 5 a 7 días.
B. PRUEBA DE ANTAGONISMO
Después de las 24 horas de incubación, escoja 3 colonias de bacterias distintas aisladas de su

muestra de suelo en agar nutritivo, rotule las colonias como A, B y C.
Con el asa tome muestra de cada una de las colonias seleccionadas y transfiéralas a una caja de agar
nutritivo siguiendo el esquema de la Fig. 10.
Después de 48 horas de incubación, siembre el hongo Penicillium sp., el cual actuará como
microorganismo antagónico. Deje en incubación a 28°
C, por 5 días.
Figura 10. Esquema de siembra en caja de Petri para la prueba antagonismo
Para la interpretación de resultados del recuento realizado por el método de recuento estándar en
placa, siga las siguientes indicaciones:
Después del período de incubación respectivo para cada tipo de microorganismo, proceda a contar
el número total de colonias en cada dilución y reporte los resultados como unidades formadoras de
colonia (UFC/g) de suelo seco. Para el reporte de sus resultados tenga en cuenta las
recomendaciones del documento que encontrará en:
https://campusvirtual.univalle.edu.co/moodle/pluginfile.php/1090342/mod_resource/content/1/Recu
ento%20en%20placa.pdf
Para la prueba de antagonismo, determine si se presenta o no inhibición del crecimiento de alguno

de los microorganismos, lo cual indicará el antagonismo.
33
PRÁCTICA No. 10. ANALISIS BACTERIÓLOGICO DE AGUAS
DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR EL MÉTODO DE

FILTRACIÓN POR MEMBRANA
1. INTRODUCCIÓN
La orientación de estos análisis se ha basado principalmente en el interés en los aspectos sanitarios.

No se conocen bien las bacterias cuyo medio propio es el agua, en parte porque es difícil que
muchas de ellas crezcan en medios de cultivo en laboratorio, pero hay muchas que se han
identificado como población natural, entre las cuales encontramos Serratia, Pseudomonas, Sarcina,
Micrococcus y Caulobacterias.
Es necesario el análisis bacteriológico del agua para determinar su calidad para el consumo
humano, así como para controlar la eficacia de los sistemas de potabilización del agua y de las
piscinas de uso público. Como indicadores bacteriológicos de la calidad del agua se han establecido
los coliformes totales y fecales, bacterias que en aguas se analizan por medio de la técnica de
filtración por membrana. En este método una medida del volumen de agua es filtrado a través de
una membrana que retiene las bacterias en su superficie por su tamaño de poro (0.45 micras). La
membrana es luego incubada sobre un medio selectivo, que permite que las bacterias crezcan y
formen colonias. Este método es recomendable para aguas claras y es adaptable a aguas con altas
turbiedades cuando se hacen diluciones apropiadas de la muestra.
2. OBJETIVO
Determinar el número de coliformes totales y fecales en una muestra de agua, por el método de
filtración por membrana
3. MATERIALES
1 Frascos estériles para toma de muestras

3 Frascos para agua de dilución
3 cajas de Petri pequeñas con medio chromocult
1 Pinza estéril
1 Probeta estéril de 100 mL
Agua destilada estéril en Erlenmeyers de 500 mL
3 Filtros de membrana de 0.45 micras
3 Pipetas estériles Mechero
4. MÉTODOS
Preparación de las diluciones
Es necesario realizar diluciones para las aguas no potables y para aquellas que tienen una alta
turbiedad y contaminación ya que al sembrarlas directamente no permiten un recuento apropiado,
puesto que se recomienda que el crecimiento por caja esté entre 20 y 200 colonias, para hacer el
recuento.
a. Para agua cruda
34
 Tome asépticamente 20 mL de la muestra y llévelos a un frasco que contiene 180 mL de

agua de dilución (agua peptonada estéril). Márquelo como dilución 10 -1.
 Luego, tome asépticamente 20 mL de la dilución 10 -1 y llévelos a un frasco que contiene
180 mL de agua de dilución (agua peptonada estéril). Márquelo como dilución 10 -2.
 Finalmente, tome asépticamente 20 mL de la dilución 10-2 y llévelos a un frasco que
contiene 180 mL de agua de dilución (agua peptonada estéril). Márquelo como dilución 10-
3
.
b. Para agua potable y agua de piscina

 Las muestras de agua potable y agua de piscina no requieren la preparación de diluciones.
100 mL, por duplicado.
Filtración y siembra
 Proceda a ensamblar el embudo de filtración sobre el Erlenmeyer con desprendimiento

lateral. Coloque la membrana de filtración estéril con la ayuda de una pinza estéril.
 Para agua potable y agua de piscina. Con una probeta estéril mida 100 mL de la muestra
de agua y filtre. Lave el embudo con aproximadamente 50-70 mL de agua estéril después
de la filtración y filtre nuevamente, con el objeto de dejarlo limpio el embudo para las
posteriores filtraciones.
 Remueva el filtro con una pinza estéril y colóquelo sobre el medio contenido en la caja de
Petri. Rotule cada una de las cajas y coloque en la incubadora a 44.5oC por 24 horas.
 Para agua cruda. Con una probeta estéril mida 100 mL de la dilución 10-3 y filtre. Lave el
embudo con aproximadamente 50-70 mL de agua estéril después de cada filtración y filtre
nuevamente, con el objeto de dejarlo limpio para las posteriores filtraciones.
 Remueva el filtro con una pinza estéril y colóquelo sobre el medio contenido en la caja de
petri. Rotule cada una de las cajas y coloque en la incubadora a 44.5 oC por 24 horas.
 Haga lo mismo con la dilución 10 -2 y finalmente con la dilución 10 -1. Incube a 44.5oC por
18-24 horas.
5. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
 Después de la incubación cuente las colonias para determinar la concentración de

organismos en la muestra de agua original.
 El número total de bacterias para una muestra de agua se expresa en Unidades Formadores
de Colonias UFC/100 mL, según la siguiente fórmula:
35
PRÁCTICA No. 11. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS
1. INTRODUCCIÓN
La investigación sobre los productos alimenticios o sus constituyentes requiere especial atención
para detectar aquellos microorganismos que los deterioran o que son patógenos para el consumidor.
El examen microbiológico permite obtener pautas para el establecimiento de normas de higiene
aplicables durante la producción, y de métodos eficaces de conservación.
Microorganismos indicadores: Este término se aplica a cualquier grupo taxonómico, fisiológico o

ecológico de microorganismos cuya presencia proporcione evidencia indirecta de que los alimentos
estuvieron expuestos a condiciones que pudieron determinar la llegada de microorganismos
peligrosos o permitir la proliferación de especies patógenas o toxigénicas. Los organismos
patógenos son de gran utilidad tanto para determinar la calidad bacteriológica de los alimentos
como la garantía que ofrecen al consumidor.
Escherichia coli y coliformes: Son organismos que habitan en el tracto digestivo de los hombres y
otros animales. Su presencia en un alimento indica contaminación directa o indirecta de origen
fecal. La presencia de E. coli advierte el riesgo de que pudieran estar presentes bacterias patógenas
entéricas, entre ellas algunas de los géneros Salmonella, Shigella y Vibrio; así como virus entéricos
y parásitos diversos. Los otros coliformes (especies de varios géneros de la familia
Enterobacteriaceae), son buenos indicadores de limpieza y desinfección inadecuadas, o de una
manipulación o tratamiento incorrecto de los alimentos. La presencia de niveles altos de coliformes
en un alimento tratado, no indica necesariamente un contacto inmediato con heces o con superficies
contaminadas con heces. Indica que pudieron existir circunstancias favorecedoras de la
multiplicación de estos microorganismos introducidos probablemente por deficiente limpieza o
desinfección.
2. OBJETIVOS
Determinar la calidad de un producto alimenticio en términos de contaminación microbiana.

Establecer el número y tipo de microorganismos que se encuentran en distintos alimentos.
3. MATERIALES
6 Cajas de petri vacías esterilizadas. 6 Pipetas estériles de 5 mL

1 Frasco con 90 mL de agua peptonada. 1 Pipeta estéril de 10 mL
6 Tubos de ensayo con 9 mL de agua peptonada. 1 Espátula
9 Tubos de ensayo con 10 mL de caldo Lauryl sulfato 1 Mechero.
60 ml de Agar base Ogye o Saboreaud fundido Papel para pesar estéril
60 ml de Agar cuentagérmenes fundido 1 Stomacher
1Gradilla para tubos. Balanza
A las 24 – 48 h
2 Tubos con Caldo Brilla 1 Tubo con caldo triptona
1 Caja de agar EMB Reactivo de Kovac's.
1 asa 1 Mechero
36
4. MÉTODOS
DILUCION DE LA MUESTRA

Analice la muestra rápidamente después de recogida o manténgala en refrigeración hasta 24
horas después de tomada.

Pese 10g del alimento a analizar, para alimentos líquidos o sólidos blandos como las
verduras y las frutas, homogenice durante 30 seg. a 1 min, en un Stomacher. Para alimentos
como carnes, embutidos o harinas, homogenice por cinco minutos.
 Para preparar la dilución 10 -1, mida 10 mL o gramos de muestra en un frasco que contenga
90 ml de diluyente (agua peptonada).
 Para obtener la dilución 10-2, Transfiera 1 ml de la dilución 10-1 a un tubo que contenga 9
mL de diluyente y así sucesivamente prepare diluciones hasta 10-6. Cada dilución sucesiva
disminuirá 10 veces la concentración.
 Recuerde marcar convenientemente los tubos.
INOCULACION DEL ALIMENTO
A. Número más probable de coliformes totales y fecales:
Prueba presuntiva para coliformes totales.

 Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones (10 -1 a 10-6) en tubos con Caldo lauryl sulfato o
Caldo brilla, utilizando 3 tubos por dilución. El instructor le indicará el número de
diluciones a sembrar, porque estas dependerán de que tan contaminado se sospecha que está
el alimento a analizar.
 Incubar los tubos a 37°C por 24-48 horas.
 Pasadas las 24-48 horas anotar los tubos que muestren turbiedad y producción de gas, esta
última puede observar por el desplazamiento del tubo de Durham.
Prueba confirmativa para coliformes totales.

 Confirmar que los tubos con producción de gas en la prueba presuntiva son positivos,
inoculando 3 a 5 gotas en otros tubos con caldo brilla y en otro tubo con Caldo triptona.
 Incube los tubos a 44.5 °C por 24 horas en baño maría (Ver Figura 11).
 Pasadas las 24 horas anotar los tubos que muestren turbiedad y producción de gas.
 Revelar el Caldo triptona adicionando 3 a 5 gotas del reactivo de Kovac's, agitar
suavemente y observar la presencia de un anillo rojo en la superficie, cuando la reacción es
positiva para la formación de indol, cuando es negativa no se observa cambio.
 Interpretación de los resultados.

 Leer la tabla del NMP (Número Más Probable), del cuadro 3, para calcular el resultado de
acuerdo con el número de tubos positivos, para los coliformes totales, según el resultado de
la prueba confirmativa y para los fecales, según el caldo brilla y el caldo triptona incubados
a 44.5 °C.
37
Figura 11. Método del NMP de coliformes totales, fecales y determinación de E. coli
Determinación de E. Coli.
 A partir del tubo positivo de la prueba confirmativa en el caldo brilla incubado a 44.5 oC,
sembrar por estría, tomando una asada del tubo en la superficie de una placa de agar EMB
(Eosina azul de metileno).
 Incubar las cajas invertidas a 37°C por 24-48 horas.
38
 Pasado este tiempo hacer la lectura de las colonias típicas de E. coli, aquellas que presentan
un brillo verde metálico.
 En caso positivo, es necesario realizar las pruebas bioquímicas para identificación de E. coli
B. Recuento de mesófilos por el método de recuento estándar en placa
Su presencia puede reflejar deficiencias en el proceso de elaboración y contaminación en la

manipulación durante el empaque.
 Transferir 1 mL de cada una de las diluciones de la muestra del alimento (10 -1 a 10-6, o las
indicadas por el instructor) a cajas de Petri vacías estériles y previamente marcadas.
 Inmediatamente adicione el agar cuenta gérmenes fundido (aproximadamente 20 mL)
 Mezclar el inóculo con el medio fundido, moviendo suavemente la caja en forma circular.
 Dejar solidificar el agar.
 Invertir e incubar las cajas de petri a 37°C durante 24 horas.
 Pasado este tiempo, contar las colonias que hayan crecido en cajas que contengan entre 30 a
300 colonias. Siga las instrucciones dadas en:
https://campusvirtual.univalle.edu.co/moodle/pluginfile.php/1090342/mod_resource/conten
t/1/Recuento%20en%20placa.pdf.
 Los resultados se deben expresar con 2 dígitos y el resto en potencia de 10.
 Ej.: Si el recuento se realiza en una dilución 10-2 y fue de 148 colonias, el tercer dígito por
ser mayor a 5 se aproxima al siguiente número, o sea que el recuento sería 150x10 2, se
expresa mejor como 15x103.
Si el recuento fue 234, por ser el tercer dígito menor que 5 se anula y se expresa: 230x10 2, o
mejor 23x103.
 Cuando el recuento se utiliza para determinar la aceptación de un alimento, se compara con
los valores límites establecidos según la normatividad del Ministerio de Salud, del INVIMA
o las Normas Icontec.
C. Recuento de hongos y levaduras
La presencia de hongos y levaduras en los alimentos, se da generalmente por contaminación del aire
en el momento de empaque, por manipulación de personas con lesiones en la piel ocasionadas por
hongos o por mal almacenamiento del producto. El procedimiento es el siguiente:
 Transferir por duplicado alícuotas de 1 mL de cada una de las diluciones (10-1 a 10-3) en
cajas de petri estériles previamente marcadas.
 Inmediatamente adicionar el agar Ogye o Saboreaud fundido y mantenido a 45°C, mezclar
suavemente.
 Dejar solidificar.
 Invertir e incubar las cajas a temperatura ambiente durante 5 a 8 días.
 Se procede de aquí en adelante igual que el recuento de mesófilos.
39
Cuadro 3. Número Más Probable (NMP) por g/mL de muestra, usando tres
tubos de 0.1, 0.01 y 0.001 g/mL
Numero de Tubos Numero de Tubos Numero de Tubos Numero de Tubos

positivos positivos positivos positivos
0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001 NMP
NMP NMP NMP
0 0 0 3 1 0 0 3.6 2 0 0 9.1 3 0 0 23
0 0 1 3 1 0 1 7.2 2 0 1 14 3 0 1 39
0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64
0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95
0 1 0 3 1 1 0 7.3 2 1 0 15 3 1 0 43
0 1 1 6.1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75
0 1 2 9.2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120
0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160
0 2 0 6.2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93
0 2 1 9.3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150
0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210
0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290
0 3 0 9.4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240
0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460
0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100
0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 1100
5. PREGUNTAS
a) ¿Cuál es el fundamento de las diferentes pruebas que se han realizado?.

b) ¿Cuáles son los componentes de cada uno de los medios de cultivo y porqué se
utilizan?
40
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alexopolus, C.J & C.W.Mims.1979 Introductory Micology. Third edition. Jhon Willey & Sons.
New York, 632 p.
Alvarez,V. M.I. 1996.Guía de Laboratorio de Micología. Universidad del Valle. Facultad de Salud.
Departamento de Microbiología. Sección de Micología. Cali Colombia.
APHA, AWWA, WPCF. 1992. Métodos Normalizados, para el análisis de aguas potables y
residuales. Ediciones Díaz de Santos, S.A. Madrid (España).
Astudillo, M. Barona, G. Carmona, F. Daza, L.H. 1998. Manual de Bacteriología Postgrado.
Universidad del Valle. Departamento de Microbiología. Cali Colombia.
Benítez, N. 2002. Manual de laboratorio de Microbiología. Universidad del Valle. Facultad de
Ciencias. Departamento de Biología. 75p.
Deacon, J.W.1993. Introducción a la micología moderna. Ed Limusa. México. D.F. 350 p.
Holguín, M.S. Higuera, I.M. Rubio, L.B. Vargas, M. Muñoz, A.I. Díaz, G. 1998. Manual de
Técnicas de Análisis para Control de Calidad Microbiológico de alimentos para Consumo
Humano. Instituto Nacional de Vigilancia de Medicamentos y Alimentos. División
Laboratorio de Alimentos y Bebidas Alcohólicas. Sección de Microbiología de Alimentos.
Santafé de Bogotá, Colombia.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J. 2004. Brock. Biología de los Microorganismos. Décima
edición. Pearson Educacion, S.A. Madird. 1096p.
Margulis, L & Schwartz, K.V. 1998. Fivew Kingdoms.W.H.Freeman and Co EUA.
MERCK. 1994. Manual de Medios de Cultivos. Darmstadt, Alemania..
Pascual, Anderson. M. R, 1992. Microbiología Alimentaria Metodología Analítica para Alimentos y
Bebidas. Ediciones Díaz de Santos S.A. Madrid. España.
http://Micolog.com/chap 3b.htm
http://biology.iastate.edu/fungi/fungi/FungINDX.htm
https://campusvirtual.univalle.edu.co/moodle/pluginfile.php/1090342/mod_resource/content/1/Recu
ento%20en%20placa.pdf.
41

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CURSO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

NEYLA BENÍTEZ CAMPO Ph.D.

ANA CRISTINA BOLAÑOS Ph.D.

SANTIAGO DE CALI, FEBRERO DE 2017

RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

Figura 1. Morfología de las colonias bacterianas ........................................................................ 5

Cuadro 1. Procedimiento de la coloración de Gram ................................................................... 9

RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

PRÁCTICA No. 1. UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS: PRESENCIA DE

La ubicuidad de los microorganismos se basa en tres características principales: su tamaño pequeño,

Comprobar la presencia de los microorganismos en diversos ambientes

5 Cajas de Petri con agar nutritivo Exuvias de insectos

a. Microorganismos presentes en el aíre

b. Microorganismos presentes en semillas

c. Microorganismos presentes en tejido vegetal

d. Microorganismos presentes en insectos

e. Microorganismos presentes en humanos

a) Explique cómo inciden los microorganismos del aire en el trabajo de laboratorio en

Figura 1. Morfología de las colonias bacterianas

PRACTICA No. 2. PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS Y COLORACIONES

La determinación de la morfología en la identificación de los microorganismos juega un papel

Láminas porta objetos.

Preparación del extendido

Figura 2. Preparación de extendidos y coloración

II. COLORACIONES DIFERENCIALES

La diferencia en la reacción de coloración entre las positivas y las negativas se atribuye a la

Aplicar la técnica de coloración de Gram identificar formas y diferenciar grupos bacterianos.

Cuadro 1. Procedimiento de la coloración de Gram

PASO TIEMPO RESULTADOS

B. COLORACIÓN DE CÁPSULA (método de Anthony)

 Prepare un extendido fino y uniforme de Klebisella pneumoniae; extiéndalo con un porta-

 Coloque una gota de agua sobre una lámina portaobjetos.

Preparación de extendidos y coloraciones diferenciales.

Microorganismo Técnica Colorantes Esquemas y Observaciones

PRACTICA No. 3. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Cuidado y recomendaciones. Los medios de cultivo pueden prepararse a partir de sus

Frasco con agar nutritivo

Preparación de medios sólidos.

Preparación de medios líquidos.

Estos medios se guardarán para ser empleados en la siguiente práctica.

a) Investigue como se clasifican los medios de cultivo

PRÁCTICA No. 4. MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE

Existen técnicas de siembra universales básicas para el aislamiento de los microorganismos en el

La observación e interpretación de los cultivos después de la incubación es el paso definitivo en la

Aplicar los métodos bacteriológicos más usuales para el crecimiento y aislamiento de

1 Tubo con agar nutritivo inclinado.

SIEMBRA Y CARACTERIZACION DE CULTIVOS BACTERIANOS

a. Siembra por estrías

b. Siembra en superficie por perlas de vidrio

c. Siembra en profundidad (vertido en placa)

Figura 3. Siembra en profundidad

Figura 3. Siembra en profundidad

Figura 4. Siembra en profundidad (Vertido en placa).

PRÁCTICA No. 5. PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

En múltiples enfermedades infecciosas se requiere aislar el agente causal, probar su sensibilidad

 Conocer las técnicas implementadas para la realización del antibiograma.

 Diluciones seriadas de una suspensión bacteriana

Se describe a los antimicrobianos como SENSIBLE, INTERMEDIO O RESISTENTE,

DESARROLLAR LAS SIGUIENTES ACTIVIDADES DURANTE A LA PRÁCTICA

2. Interprete los resultados de la actividad demostrativa:

PRÁCTICA No. 6. METABOLISMO MICROBIANO: PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Las Enterobacterias son organismos ubicuos de distribución mundial, se encuentran en el suelo, el