PRÁCTICA 6

LEUCEMIAS: OBSERVACIÓN MORFOLOGICA Y PRUEBAS CITOQUÍMICAS

1. OBJETIVO.

1) Observar la morfología microscópica de los diferentes tipos de leucemias, realizar su

Identificación e interpretación clínica dentro del laboratorio.
2) Conocer los fundamentos básicos para realizar la tipificación y diferenciación
morfológica de los tipos de leucemias a través de pruebas citoquímicas.

2. INTRODUCCION.

Las leucemias constituyen un crecimiento exagerado y degenerativo de los elementos de

la sangre, con supresión de hematopoyesis normal e invasión de otros tejidos. Lo que
ocasiona daños severos al organismo y en el mayor de los casos la muerte.
De etiología desconocida. Sus signos y síntomas son: Infecciones, hemorragias, palidez,
anemia, debilidad, en algunas de ellas dolor óseo, etc.

CLASIFICACIÓN

Se pueden clasificar en dos grandes grupos: agudas y crónicas. (Ver el cuadro 1)

Cuadro 1 Leucemias agudas y crónicas: comparación de las manifestaciones clínicas y

de laboratorio

Presentación Leucemia aguda Leucemia crónica

Comienzo Abrupto (rápido y repentino) Insidioso (lento y gradual)
Muerte Meses Años
Edad Todas Adultos
Recuento leucocitario Elevado, normal o bajo Elevado
Aspecto de las células Blastos (inmaduras) Maduras (bien diferenciadas)
Neutropenia Presente Ausente
Anemia Presente Presente
Plaquetas Bajas Normal o aumentadas
Organomegalia Leve Intensa

Los pacientes con LMC por lo general sufren una fase crónica con una duración promedio
de tres años, y posteriormente si no se da el tratamiento adecuado, se presenta el
periodo de crisis blástica, el cual es de mal pronóstico, con supervivencia menor a los seis
meses. Las leucemias agudas y crónicas se clasifican en mieloides o linfoides de acuerdo
al origen de la clona de la célula progenitora leucémica. (Ver cuadro 2).

Cuadro 2. Clasificación de las leucemias

Fuente: Mckenzie, 2000
Mieloide Linfoide Otras
 Mieloblástica
Promielocítica Linfocítica T Indiferenciada
Leucemias Monocítica Linfocítica B de línea celular mixta
agudas Mielomonocítica De células nulas De células asesinas
Eritrocítica (indiferenciada) Mieloide/natural
Megacariocítica
Mieloide (LMC) o
granulocítica Linfocítica
crónica(LGC) Plasmocítica
Mielomonocítica (Mieloma múltiple)
Leucemias Células peludas
crónicas Variantes de LMC: Prolinfocítica
Clásica, atípica, Linfocitosis de
juvenil, células grandes
eosinofilica,basofilica granulares
y neutrofilica.

Tipos de leucemias agudas (FAB)

La clasificación de las leucemias agudas de más difusión y aceptación en el ámbito
hematológico internacional es la elaborada en 1976 por el grupo cooperativo Franco-
Americano-Británico (FAB). Esta clasificación se basa únicamente en el aspecto
morfológico y en el comportamiento citoquímico de las células blásticas (ver cuadro 3).

Cuadro 3. Clasificación morfológica de las leucemias agudas.

Fuente: Ruiz, 2003
Leucemias agudas linfoblásticas Leucemias agudas mieloblásticas (LAM)
(LAL)
LA-L1: linfoblástica “típica” LA- Mo: mieloblástica diferenciada mínimamente
LA-L2: linfoblástica “atípica” LA- M1: mieloblástica sin maduración
LA-L3: parecida al linfoma de LA- M2: mieloblástica con maduración granulocítica
burkitt LA- M3: promielocítica hipergranular
LA M4: mielomonoblástica
LA M5: monoblástica pura
LA M6: eritroleucemia
LA M7: megacarioblástica

En la actualidad los estudios de laboratorio morfológicos son indicadores importantes para

detectar casos de leucemias, sin embargo estos no son suficientes para determinar de
manera clara y específica el tipo de leucemia a tratar. Cabe mencionar que existen
diversos métodos con una gran especificidad para identificarlas y tipificarlas. Dentro de los
métodos que contribuyen a tipificar de manera específica las leucemias linfoides de
mieloides, tanto agudas como crónicas son: la citoquímica, la citometría de flujo, la
inmunocitoquímica y la citogenética.

PRUEBAS CITOQUIMICAS

Las pruebas citoquímicas se basan en estudiar la presencia de ciertos componentes

químicos (enzimas o sustancias diversas) en el interior de las células sanguíneas tanto
hematopoyéticas como circulantes en sangre periférica. Estas pruebas son útiles para
lograr la diferenciación de leucemias agudas y crónicas, tanto mieloides como linfoides.

Esquema simplificado de pruebas citoquímicas que ayudan

a identificar blastos en las leucemias agudas:

Tinción citoquímica Linfoblasto Mieloblasto

Mieloperoxidasa Negativo Positivo
M1-M4 y M6
PAS Positiva Negativa

Sudan Negro B Negativo Positivo

M1-M4 y M6 y M5 ±
Naftol ASD Negativa Positiva
Cloroacetato esterasa M1-M4 y M6
específica

α-naftil butirato Negativa Positiva en:

inespecífico L. mielomonocítica M4
L. monocítica M5

MIELOPEROXIDASA.

1. FUNDAMENTO.
La mieloperoxidasa (MPO) es una enzima que se encuentra en los gránulos primarios de
neutrófilos, eosinófilos y, en los monocitos. Los linfocitos no presentan actividad de MPO.
Es útil para diferenciar la estirpe celular mieloide de la linfoide en blastos.
La demostración de la existencia de esta enzima, sintetizada en el retículo endoplásmico
rugoso, se basa en su acción oxidante sobre su sustrato, bencidina, en presencia de
peróxido de hidrógeno. La positividad de la reacción se pone de manifiesto por la
aparición de un precipitado amarillento ocre a marrón rojizo en el citoplasma.

2.-MUESTRA PRIMARIA.

Sangre total con EDTA. Tubo con tapón morado (lila). Muestra de mèdula osèa.

3.- EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS.

Equipo.
- Microscopio
- Contador
- Cronómetro o reloj

Material.
- Laminillas preparadas con diferentes tipos de leucemias.
- Pinzas

Reactivos.
- Diaminobenzidina
- Nitrato cúprico
 - Tampòn trizmal conc.
- Solución de glutaradehìdo
- Soluciòn EA modificada por Gill
- Soluciòn de hematoxilina de Gill
- Conentrado de Scott sustituto de agua corriente
- Etanol al 95%
- Etanol absoluto
- Peroxido de hidrogeno al 1%
- acetona

1. PROCEDIMIENTO.
a) Disolver un vial de diaminobenzidina en 50 ml de soluciòn de trabajo trizmal
(esta souciìn de trabajo se prepara disolviendo el concentrado 1 a 9 en agua
desionizada)
b)Preparar la sig. Serie de vasos de Tinciòn:
1)Soluciòn fijadora glutaraldehido-acetona(25 ml acetona 75 ml glutaradehido) mantener
entre 4 y
8ºC.
2)Solucion de diaminobenzidina
3)Soluciòn de nitrato cùprico ( 1 vial de Nitrato cùprico en 50 m de agua desionizada)
4)Soluciòn de hematoxilina de Gill
5)Soluciòn de Scott sustituto de agua corriente(diluciòn 1 a 10 de la sol’n concentrada)
6)EA modificada por Gill
7) 2 vasos con Etanol al 95%
8) 2 vasos con etanol absoluto
9) 3 vasos con xileno

c) Justo antes de fijar las preparaciones con la muestra añadir 0.5 ml de peròxido de
hidrógeno al 1% a la soluciòn de diaminobenzidina.
d) Fijar los portaobjetos(muestras) en la soluciòn 1) durante 1’ .
e) Lavar por 30’’ con agua desionizada
f) Incubar 45’’ en soluciòn 2.
g)Lavar 30’ con agua desionizada
h)Sumergir por 2’ en vaso 3.
i) Lavar 30’’ con agua desionizada
j)Sumergir en vaso 4 por 8’’
k)Lavar por 5’’ en agua desionizada 2 veces.
l)Sumergir 12’ en vaso 5
m)Lavar por 5’’ 2 veces
n)Sumergir por 1’ en vaso 6
ñ) Lavar en vaso 7 por 3 ‘’ 2 veces
o)Lavar en vaso 8 por 3’’ 2 veces
p) Lavar en vaso 9 por 3’’ 3 veces.

Dejar secar la o las laminillas y revisarlas al microscopio.

El alumno revisará microscópicamente las preparaciones con los diferentes tipos de

leucemias, dibujando cada una de ellas y anotando sus características morfológicas.
 2. CÁlCULOS.

Verificar las laminillas preparadas con las tinciones y contar 100 células blancas para
determinar el porcentaje de positividad de acuerdo a la tinción observada.

3. RESULTADOS.

LA PEROXIDASA TENDRA UN ASPECTO ROJO-NARANJA. DANDO ESTO LA

POSITIVIDAD.

4. VALORES DE REFERENCIA (INTERVALOS BIOLÓGICOS).

Negativo

5. CONTROL DE CALIDAD.
Utilizar preparaciones de muestras ya conocidas.

6. CONCLUSIONES E INTERPRETACIÓN.

7. BIBLIOGRAFIA

1. Mcdonald A.G. (1991). Atlas de Hematología. Editorial Panamericana (5ª ed.). Madrid
España.
2. Mckenzie, Shirlyn. B. (2000) Hematología Clínica. Editorial el Manual Moderno (2ª
ed.). México, D.F. México.
3. Rizo Ríos, P. et. Al. Mortalidad por leucemias en menores de 20 años. Bol. Méd.
Hospital Infantil México. 2005; 62:9-18.
4. Rodak, Bernardette F. (2002). Hematología, Fundamentos y aplicaciones Clínicas.
Editorial Panamericana (2ª ed.). Buenos Aires, Argentina.
5. Anna Merino. Clasificación de las leucemias agudas mieloides. Rev. Lab. Clin.
Servicio de Hemoterapia y hemostasia, Hospital clínico Universidad de Barcelona,
IDIBAPS, Barcelona España. 2010;3(3):139–147

TINCIÓN DE PAS
1.- FUNDAMENTO

La tinción de PAS es útil para el diagnóstico de algunas LLA y del tipo FAB M6 de la LMA
Hay muchos tipos diferentes de células que contienen glucógeno. El ácido
peryódico oxida glucógeno, mucoproteínas y otros carbohidratos de alto peso
molecular a aldehídos. Estos reaccionan con el reactivo incoloro de Schiff, y tiñen
de un color rojo rosado brillante. La intensidad de la tinción depende del número
de grupos aldehídos liberados con el ácido peryódico
 2.-MUESTRA PRIMARIA.

Sangre total con EDTA. Tubo con tapón morado (lila). Muestra de mèdula osèa.

3.- EQUIPO, MATERIAL Y REACTIVOS.

Equipo.
- Microscopio
- Contador
- Cronómetro o reloj

Material.
- Laminillas preparadas con diferentes tipos de leucemias.
- Pinzas

Reactivos.

- Solución de Ac. peryodico

- Reactivo de Schiff’s
- Solución de hematoxilina
- Solución Formaldehido-etanol.
-

4.-PROCEDIMIENTO.

1.- Fijar la laminilla con la muestra por 1’ en solución formaldehido-alcohol a temp.

Ambiente
Esta solución se prepara mezclando 5 ml de formaldehido con 45 ml de etanol al
95%.
2.- Lavar por 1’ con agua.
3.- Sumergir por 5’ en Ac. Peryodico a temperatura ambiente.
4.- Lavar con agua destilada.
5.- Sumergir en reactivo de Schiff’s por 15’ a temperatura ambiente.
(Nota: inmediatamente después de su uso este reactivo tiene que refrigerarse)
6.- Lavar en un frasco con agua durante 5’
7.- Sumergir en solución de hematoxilina por 90’’
8.- Lavar con agua entre 15 y 30’’
9.- fijar las preparaciones en Tolueno o Xileno.
Dejar secar la o las laminillas y revisarlas al microscopio.

El alumno revisará microscópicamente las preparaciones con los diferentes tipos de

leucemias, dibujando cada una de ellas y anotando sus características morfológicas.

8. CÁlCULOS.

Verificar las laminillas preparadas con las tinciones y contar 100 células blancas para
determinar el porcentaje de positividad de acuerdo a la tinción observada.
 9. RESULTADOS.

La prueba de PAS será positiva dando una tonalidad rosa a las celúlas.

10. VALORES DE REFERENCIA (INTERVALOS BIOLÓGICOS).

Negativo

11. CONTROL DE CALIDAD.

Utilizar preparaciones de muestras ya conocidas.

12. CONCLUSIONES E INTERPRETACIÓN.

13. BIBLIOGRAFIA

6. Mcdonald A.G. (1991). Atlas de Hematología. Editorial Panamericana (5ª ed.). Madrid
España.
7. Mckenzie, Shirlyn. B. (2000) Hematología Clínica. Editorial el Manual Moderno (2ª
ed.). México, D.F. México.
8. Rizo Ríos, P. et. Al. Mortalidad por leucemias en menores de 20 años. Bol. Méd.
Hospital Infantil México. 2005; 62:9-18.
9. Rodak, Bernardette F. (2002). Hematología, Fundamentos y aplicaciones Clínicas.
Editorial Panamericana (2ª ed.). Buenos Aires, Argentina.
10. Anna Merino. Clasificación de las leucemias agudas mieloides. Rev. Lab. Clin.
Servicio de Hemoterapia y hemostasia, Hospital clínico Universidad de Barcelona,
IDIBAPS, Barcelona España. 2010;3(3):139–147