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Folleto de Banco de Sangre 20142
Folleto de Banco de Sangre 20142
La técnica de antiglobulina indirecta, permite detectar los anticuerpos de tipo IgG, que
no tienen la capacidad de aglutinar de manera espontánea y requiere de una fase de
revelado para poder evidenciarlos. Se utiliza en el fenotipaje de
grupos sanguíneos, en los que los antígenos se encuentran en baja densidad
antigénica y donde el anticuerpo utilizado es IgG., Igualmente es aplicable en aquellos
casos en los que se buscan anticuerpos de tipo IgG en el suero de una persona.
Una vez terminada esta incubación, se pasa a realizar lavados con el fin de
remover inmunoglobulinas u otro tipo de proteínas, que no se unieron al eritrocito y
que pueden interferir con la reacción. La fase de los lavados es crítica, ya que la
presencia de anticuerpos u otros interferentes en el suero podrían llevar a la
neutralización del reactivo. Asimismo, es sumamente importante eliminar el exceso de
solución salina al finalizar estos lavados, ya que de lo contrario, el reactivo de
antiglobulina es diluido, lo cual puede afectar la sensibilidad de la prueba.
Posterior a los lavados, y de haber eliminado la última gota de solución salina se añade
el reactivo de antiglobulina, fase de revelado se centrifuga y se lee la prueba.
De haberse dado sensibilización, los anticuerpos adheridos a la superficie eritrocitaria
serán reconocidos por el reactivo de antiglobulina y se podrá observar una reacción de
aglutinación.
Muestras y reactivos
• Solución salina
• Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA.
• Baño maría a 37ºC.
• Juego de células rastreadoras 3%.
• Reactivo de Antiglobulina Humana.
• Albúmina bovina 22%.
• Células de control de antiglobulina humana.
Método
1. Rotular tubos para las Células I, Células II y Células III.
2. Mezclar y homogenizar con suavidad el juego de reactivo de células
rastreadoras.
3. Añadir al tubo rotulado como células I, 50 ul del pool I. Debe tenerse
especial cuidado en no intercambiar las tapas de los goteros y en
minimizar la posibilidad de contaminación de los mismos.
4. Añadir al tubo rotulado como células II, 50 ul del pool II.
5. Añadir al tubo rotulado como células III, 50 ul del pool III.
6. Añadir 100 ul del suero en análisis a cada uno de los tubos.
7. Agregue 100 ul de albúmina al 22%.
Procedimiento 2
Prueba de Antiglobulina Directa
v
Principio
La prueba de antiglobulina directa se utiliza primordialmente para determinar si los
eritrocitos del paciente en análisis están recubiertos por inmunoglobulinas o fracciones
de complemento. Esto puede llegar a presentarse en diferentes condiciones, como por
ejemplo, la presencia de aloanticuerpos, producto de una reacción hemolítica tardía o
por enfermedad hemolítica del recién nacido o autoanticuerpos en anemias hemolíticas
autoinmunes, dirigidos contra antígenos de propios de la superficie eritrocitaria, de
anticuerpos dirigidos contra drogas que se adsorben a la membrana del glóbulo rojo o
por la activación de complemento en esta superficie.
Muestras y Reactivos
• Solución salina
• Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA.
• Baño maría a 37ºC.
• Reactivo de Antiglobulina Humana
• Células de control de antiglobulina humana.
Método
1. Rotular tres tubos con el número de muestra por analizar.
2. Tomar una alícuota de la muestra y transferir al tubo correspondiente.
3. Realizar tres lavados con solución salina fisiológica.
4. En el segundo tubo hacer una suspensión de trabajo al 3-5% a partir de
la muestra de eritrocitos lavada.
5. Añadir al tercer tubo 50 ul de la suspensión de trabajo realizada.
6. Añadir 100 ul del reactivo de antiglobulina humana.
7. Mezclar y centrifugar por 30 segundos a 3000 rpm
8. Resuspender levemente, leer por aglutinación y hacer las anotaciones
respectivas.
9. En caso de obtener un resultado negativo, corroborar el mismo
utilizando las Células Control.
Procedimiento 3
Estudio de Anticuerpos Irregulares utilizando Células
Rastreadoras
v
Principio
Los anticuerpos irregulares son por lo general del tipo IgG, reactivos a 37ºC y/o
en la prueba de antiglobulina. Son ejemplos de este tipo de anticuerpos los dirigidos
contra los antígenos de los grupos sanguíneos Rh, Kell, Duffy, Kidd y SsU. Se ha
estimado que la incidencia de anticuerpos irregulares, en diferentes poblaciones oscila
entre el 0,78% y el 1,64%. En poblaciones hospitalarias especiales, que por su
condición de fondo reciben transfusiones de hemocomponentes con frecuencia, esta
incidencia puede ser mucho mayor.
Muestras y reactivos
• Solución salina
• Muestras de sangre con EDTA.
• Baño maría a 37ºC.
• Juego de células rastreadoras 3%.
• Reactivo de Antiglobulina Humana
• Albúmina bovina 22%.
• Células de control .
Método
Grupo ABO
Materiales y reactivos:
Frascos de anti A, anti B, anti AB, anti D, anti A1, Reactivo de antiglobulina
humana, albúmina al 22%, células A y B al 3%.
Tubos con muestras de eritrocitos a analizar.
Tubos con muestras de suero a analizar.
Células rastreadoras.
Tubos de 12 x 75 mm para realizar las reacciones
Solución salina al 0.85% (Pizetas).
Centrífugas Serológicas.
Microscopios.
Frascos con células control de antiglobulina humana.
Pipetas Pasteur.
Bulbos para pipeta Pasteur.
Baños de María a 37ºC.
Portaobjetos.
Caja de aplicadores.
Gradillas metálicas.
Gradillas madera.
Papel toalla.
Método:
‐ Rotular los tubos con el nombre Paciente 1, Paciente 2, Paciente 3
y Paciente 4
‐ Realizar suspensiones de trabajo 3-5% de los donantes 1, 2, 3 y 4.
‐ Añadir 50ul de la suspensión del donante 1 al tubo rotulado como
Paciente 1.
‐ Añadir 50ul de la suspensión del donante 2 al tubo rotulado como
Paciente 2.
‐ Añadir 50ul de la suspensión del donante 3 al tubo rotulado como
Paciente 3.
‐ Añadir 50ul de la suspensión del donante 4 al tubo rotulado como
Paciente 4.
‐ Añadir 100ul del suero del paciente 1 al tubo rotulado como
paciente 1.
‐ Añadir 100ul del suero del paciente 2 al tubo rotulado como
paciente 2.
‐ Añadir 100ul del suero del paciente 3 al tubo rotulado como
paciente 3.
‐ Añadir 100ul del suero del paciente 4 al tubo rotulado como
paciente 4.
‐ Añadir 100 ul de albúmina bovina al 22% a todos los tubos.
‐ Mezcle los tubos, a partir de este momento iniciamos con las tres fases
de la prueba de antiglobulina humana indirecta.
‐ Fase I: Centrifugación inmediata o prueba rápida:
Centrifugar los tubos 30 segundos a 3500 rpm. En esta fase se establece la
compatibilidad al sistema ABO, sin embargo, otros anticuerpos (ejemplo: auto-anti-I),
pueden también ser detectados en esta fase. Leer y realizar las anotaciones.
‐ Fase II
Después de la lectura anterior colocar todos los tubos a 37ºC por 30 minutos.
Al concluir la incubación sacar los tubos del baño y centrifugar por 30
segundos a 3000 rpm.
Leer y hacer las anotaciones correspondientes.
Realizar tres lavados con solución salina fisiológica.
Secar la ultima gota de salina.
Recomendaciones:
Los resultados de las pruebas deberán ser leídos contra luz blanca.
Se puede utilizar espejos magnificadores, lentes y microscopios que ayuden con la
lectura de las pruebas.
El botón de las células se resuspenderá, se hará la lectura y se asignará los
puntajes en cruces en la hoja de trabajo.
En caso de resultados incompatibles deberán ser investigados en busca de su
causa.
Procedimiento 5
Identificación de Anticuerpos
Principio
Una vez que se ha detectado la existencia de un anticuerpo irregular, através de un
estudio de anticuerpos positivo, se debe identificar su especificidad y definir su
importancia clínica.
Los paneles de identificación están compuestos por juegos de 11 o más tipos diferentes
de células del grupo O, con fenotipo conocido de los principales antígenos de grupo
sanguíneo, a saber:
D, C,E, c, e y usualmente f, Cw
M, N, S, s
Fya, Fyb
Jka, Jkb
K, k y usualmente Kpa, Kpb, Jsa, Jsb
Lua, Lub
Lea, Leb
P1
Xga
Otros antígenos de fenotipo poco frecuente, pueden ser incluidos dentro del panel e
incluso pueden estar incluidos dependiendo de la zona geográfica, donde se encuentre
la investigación. Lo anterior de acuerdo a la disponibilidad de células por parte del
fabricante.
El panel de identificación dispone de una tabla antigénica de reacción, donde se indica
la positividad de los diferentes antígenos en relación a la célula que se está
analizando, así como el lote del reactivo, fecha de vencimiento y un lugar destinado
para hacer las anotaciones de los resultados obtenidos y sus interpretaciones.
Para el estudio de anticuerpos es importante tener presente las características de los
anticuerpos como son:
- rango térmico,
- respuesta a la reacción de la enzima,
- fuerza de reacción, (tanto aglutinación como hemólisis).
- Resultado del autocontrol para la detección de autoanticuerpos.
Cuando el patrón de aglutinación del panel muestra diferencias, se sospecha de mezcla
de anticuerpos.
La aplicación de técnicas enzimáticas o de reactivos especiales, permite separar los
anticuerpos, en base a sus características de los antígenos respectivos,
de tal manera que permitan separarlos y diferenciarlos con mayor claridad.
Dentro de estas técnicas se deben considerar para separar las mezclas de anticuerpos se
pueden mencionar:
absorción/elución
variación de temperaturas de reacción
uso de medios como el polietileno glicol y enzimas
los medios reductores.
Características de los anticuerpos en las fases de reacción:
• Fase de Centrifugación Inmediata:
A 22ºC reaccionan mejor los anticuerpos del tipo IgM como el M, N, Lewis, y el
P.
El anti I tiene un rango térmico desde 4ºC hasta fase de antiglobulina, sin
embargo, su temperatura óptima es de 4ºC.
• INCUBACION A 37ºC:
En este grupo se incluyen los anticuerpos del tipo IgG que tiene la capacidad
de aglutinar sin llegar a la fase de antiglobulina humana. Se pueden mencionar
los anti D, C, c, E, e, que reaccionan óptimamente al ser incubados por 30
minutos.
• FASE DE ANTIGLOBULINA HUMANA:
En esta fase se incluyen todos los anticuerpos tipo IgG no aglutinantes como el
anti Duffy, Kidd, Lutheran, S, s, Kell y Cellano.
EQUIPOS Y REACTIVOS:
Solución salina fisiológica
Panel de identificación
Panel de identificación tratado con enzima
Tubos 12 x 75mm para reacción.
Centrífugas serológicas.
Papel toalla.
Pipetas Pasteur.
Bulbos para pipetas Pasteur.
Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar.
Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar.
Método:
Panel de identificación
‐ Mezclar con suavidad y homogenizar el juego de reactivos del panel de
identificación según corresponda.
‐ Rotular un juego de 11 tubos con el número y la muestra a analizar.
‐ Añadir 50ul de las células reactivo correspondiente 1 al tubo rotulado como
células 1. y así sucesivamente hasta completar los 11 tubos.
‐ Añadir 100ul del suero o plasma a estudiar a los 11 tubos.
‐ A todos los tubos añadir 100ul del reactivo de albúmina bovina al 22%.
‐ Mezclar y a partir de este momento se inicia con las tres fases de la prueba de
antiglobulina humana indirecta.
‐ Anotar los resultados obtenidos en la tabla antigénica que corresponde al lote
del panel.
‐ Identificar según perfil antigénico obtenido el antígeno contra el cual va dirigido
el anticuerpo en estudio.
Procedimiento 6
Técnica de adsorción de anticuerpos
Principio
En inmunohematología se habla de adsorción cuando se utilizan células con
fenotipo conocido para provocar que el anticuerpo correspondiente, se pegue a la
superficie del glóbulo rojo.
A partir de un proceso de adsorción se pueden separar a nivel de laboratorio
dos o más anticuerpos mezclados en un suero.
Como primer punto para seleccionar las células a utilizar en la absorción, se
deben interpretar las reacciones obtenidas en el panel de identificación y
establecer cuáles anticuerpos pueden estar involucrados.
Seguidamente se debe buscar células cuyo fenotipo posea sólo uno de los antígenos que
se sospecha.
Una vez seleccionada la célula, se toma partes iguales de células y plasma y se realiza el
proceso de adsorción, bajo las condiciones óptimas del anticuerpo en estudio.
La parte final del proceso establece una centrifugación, que sirve para separar
los glóbulos rojos sensibilizados del plasma y así obtener los dos anticuerpos
separados.
EQUIPOS Y REACTIVOS:
Solución salina fisiológica
Panel de identificación
Panel de identificación tratado con enzima
Tubos 12 x 75mm para reacción.
Centrífugas serológicas.
Papel toalla.
Pipetas Pasteur.
Bulbos para pipetas Pasteur.
Tubos rotulados como muestra 1 con de suero/plasma a identificar.
Tubos rotulados como muestra 2 con de suero/plasma a identificar.
Tubos con eritrocitos a analizar
Baños a 37ºC
Tubos 13 X 100 mm.
Tapones rojos.
Pipetas 10 ml.
Pipeteadores.
Método:
- Seleccionar los glóbulos rojos adecuada para adsorción y tomar
estérilmente una alícuota de unos 10 ml.
- Lavar tres veces el paquete con solución salina fisiológica.
- Dejar el paquete el máximo posible sin salina después del último lavado.
- Agregar igual cantidad del suero en estudio.
- Incubar a 37ºC por 30 minutos.
- Mezclar cada 10 minutos para ayudar al proceso de adsorción.
- Tomar una muestra de eritrocitos y realizar una prueba de antiglobulina
humana directa.
- Mantener en incubación a 37ºC, hasta que se alcance el máximo de
positividad de antiglobulina humana directa, idealmente debe tener una
aglutinación de 3 a 4 cruces.
- Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m, para separar el suero adsorbido y los
eritrocitos sensibilizados.
- Rotular un tubo con los datos necesarios y transferir el suero del tubo
centrifugado.
- Al suero realizar el panel de identificación de anticuerpos.
- Al paquete globular realizar procedimiento de elución.
Procedimiento 7
Técnica de Elución de Anticuerpos
Principio
El término elución significa en Inmunohematología liberar los anticuerpos unidos a la
membrana del glóbulo rojo proveniente de un proceso de adsorción.
Dependiendo de las necesidades y protocolos de trabajo del Banco de Sangre se
puede:
‐ Separar el anticuerpo conservando la integridad de la membrana del glóbulo
rojo.
‐ Separar el anticuerpo rompiendo las membranas del eritrocito mediante
agentes químicos como el éter, cloroformo, digitonina o mediante condiciones
físicas extremas como la congelación o el calor.
Una vez liberado el anticuerpo el eluato, se procede a determinar su especificidad a
través del panel de identificación de anticuerpos.
EQUIPOS Y REACTIVOS:
Solución salina fisiológica
Panel de identificación
Panel de identificación tratado con enzima
Tubos 12 x 75mm para reacción.
Centrífugas serológicas.
Papel toalla.
Pipetas Pasteur.
Bulbos para pipetas Pasteur.
Tubos rotulados como muestra 1 con de plasma a identificar.
Tubos rotulados como muestra 2 con de eluato a identificar.
Tubos con eritrocitos a analizar
Frascos con cloroformo.
Baños a 37ºC.
Tubos 13 X 100 mm.
Tapones rojos.
Pipetas 10 ml.
Pipeteadores.
Método:
Técnica de elución con cloroformo
- Tomar el paquete de glóbulos rojos sensibilidados después del proceso de
adsorción.
- Lavar tres veces con solución salina.
- A un volumen igual de células lavadas agregar un volumen de cloroformo.
- Tapar el tubo y agitar fuertemente por 1 minuto. Con cuidado de que el contenido del
tubo sea expulsado sobre algún compañero.
- Centrifugar 10 minutos a 2000 r.p.m,
- El tubo queda dividido en tres capas, una del cloroformo (trasparente), otra de restos
de membrana (turbia) y un eluato o hemolizado (rojo traslúcido) donde se encuentra el
anticuerpo separado.
- Transferir el eluato a otro tubo y realizar un panel de identificación de
anticuerpos.
Recomendaciones:
Para encontrar la especificidad del anticuerpo los resultados positivos por aglutinación
así como los negativos deben ser comparados con la tabla antigénica del panel en su
lote respectivo.
Para trabajar procedimientos de adsorción/elución siempre tomar en consideración la
temperatura óptima de reacción. Esta va a ser la temperatura donde ocurrió la
aglutinación más fuerte.
Procedimiento 8
Incompatibilidad materno- fetal
Principio
La enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) es una enfermedad, en la cual la
madre en gestación transfiere aloanticuerpos del tipo IgG, via placentaria, contra
antígenos de glóbulo rojo del feto.
Debido a esta sensibilización, los glóbulos rojos fetales sufren una destrucción
acelerada tanto antes como después del nacimiento.
Para los recién nacidos que padecen la enfermedad hemolítica, la elevación de los
niveles de bilirrubina se convierte en un problema clínico grave, la pérdida de
la capacidad de transporte de oxígeno, así como resultado de la hemólisis, los niveles
altos de bilirrubina indirecta que pueden depositarse a nivel del sistema nervioso
central.
Los antígenos localizados en la membrana de los eritrocitos, se desarrollan en
diferentes etapas de la vida intrauterina o postnatal.
Los antígenos contra el sistema de grupo sanguíneo Rh, Kell, MNSs, Duffy por
mencionar algunos, presentan desde el primer de gestación una potencia antigénica
similar a la observada en los eritrocitos de una persona adulta.
Otros, por el contrario, se encuentran poco desarrollados, de ahí que su expresión
antigénica sea menor que los antígenos de un eritrocito de una persona adulta,
ejemplos de estos antígenos pueden ser los sistemas ABO, P1 y Lutheran.
Estos antígenos están muy pobremente expresados al nacimiento y es
hasta después del primer año de vida cuando logran expresarse completamente.
En estos casos la debilidad o ausencia antigénica en el eritrocito del feto, impide que se
inicie o exprese la enfermedad, por lo anterior se puede tener la incompatibilidad
eritrocitaria, sin embargo, no una enfermedad hemolítica.
Las acciones básicas en el estudio de la EHRN, se ajustan a las circunstancias en que
se ubica el médico y el paciente.
Una manera de estudiar los casos es dividiendo a los sujetos de estudio en tres
grupos: el feto o neonato, la madre y el padre.
Al feto o neonato se le debe realizar al menos las siguientes pruebas para su estudio:
Grupo ABO/Rh, prueba de antiglobulina directa, fenotipo eritrocitario, (previo elución
de anticuerpos) rastreo de anticuerpos con las células pantallas y con células A1 y B.
Que se busca con estos análisis?
‐ Demostrar la presencia del antígeno en los glóbulos rojos del feto/neonato.
‐ Demostrar la presencia del anticuerpo en el suero o glóbulo del feto neonato.
Análisis en la madre:
‐ Determinar grupo ABO/Rh.
‐ Realizar estudio de anticuerpos.
‐ Fenotipo
Análisis al padre:
‐ Determinar grupo ABO/Rh.
‐ Determinar el fenotipo eritrocitario.
Materiales y Reactivos:
Tubos 12 x 75 mm de reacción.
Pipetas Pasteur.
Bulbos pipetas.
Muestras de suero y eritrocitos a analizar
Solución salina fisiológica.
Juego de reactivos anti A, anti B, anti AB, anti D, albúmina bovina al 22%,
reactivo de antiglobulina hunana.
Panel de identificación de anticuerpos.
Frascos con células control de AGH.
Juego de células rastreadoras 3%.
Baños maría a 37°C.
Centrífugas serológicas.
Gradillas de madera.
Gradillas de metálicas.
Microscopios.
Papel toalla.
Método:
‐ Realizar a la muestra de sangre rotulada como niño una prueba de
inmunoglobulina directa.
‐ Determinar el grupo sanguíneo ABO/Rh del niño.
‐ Realizar a la muestra de plasma de la madre un rastreo e identificación de
anticuerpos.
‐ Realizar una prueba cruzada entre los eritrocitos del niño y el plasma del donador.
Procedimiento 9
Anemia Hemolítica Autoinmune
Principio
La anemia hemolítica inmune se define como un acortamiento en la sobrevida del
glóbulo rojo debido a una desregulación del sistema inmune, específicamente generado
por autoanticuerpos.
Las anemias hemolíticas autoinmune se clasifican en:
‐ Anemia Hemolítica Autoinmune por anticuerpos calientes
‐ Síndrome de aglutininas frías
‐ Hemoglobunuria paroxística al frío
‐ Anemia Hemolítica Autoinmune Combinada (Anticuerpos fríos y calientes)
‐ Anemia Hemolítica Inmune inducida por drogas
La mayoría de los casos de AHAI son causados por autoanticuerpos cuya reacción es
en caliente, es decir, anticuerpos cuya reactividad optima con los glóbulos rojos
humanos es a 37ºC y que por lo general es una inmunoglobulina de la clase IgG.
Reactivos y materiales:
Tubos 12 x 75 mm de reacción
Pipetas Pasteur.
Bulbos pipetas.
Muestras de suero y eritrocitos a analizar
Solución salina.
Reactivo de antiglobulina humana poliespecífico.
Reactivo de antiglobulina humana monoespecífico IgG.
Reactivo de antiglobulina humana monoespecífico C3
Panel de identificación eritrocitos.
Frascos con células control de AGH.
Juego de células rastreadoras 3%.
Baños maría a 37°C.
Centrífugas serológicas.
Gradillas de madera.
Gradillas de metálicas.
Microscopios.
Papel toalla.
Método:
De la muestra en estudio:
Hacer una suspensión de trabajo entre el 3-5% y:
‐ Realizar una prueba de antiglobulina humana directa utilizando el reactivo
poliespecífico, monoespecífica IgG, monoespecífico C3.