MUTAGENESIS AL AZAR POR TRANSPOSON

Cepas

 E. coli S17-1 λ-pir, portadora de pUT mini-Tn5 Km (Resistente a

Kanamicina)
 E. coli DH5; Helper pRK2073 (Resistente a Kanamicina)
 Bacteria problema (Debe ser Gram negativa, sensible a Kanamicina y
resistente a otro antibiótico)

Procedimiento

1.- Cultivar cada una de las cepas en 20mL de caldo LB con el antibiótico
correspondiente, hasta alcanzar una DO600 de 1. Considerar los tiempos de
incubación para que lleguen similares a esa densidad. Si tu bacteria problema
es lenta, puedes cultivarla horas antes de las E. coli.

Opcional: Centrifugar 1.5 mL de cada cultivo a 4000 rpm por 4 minutos y

resuspender en 1mL de MgSO4 10mM.

2.- Colocar en tres tubos de 1.5 mL lo siguiente

A) 250µL de E. coli S17-1 (Control)

B) 250µL de E. coli DH5 Helper (Control)
C) 1000 µL de bacteria problema + 250µL de E. coli DH5 Helper +250µL de
E. coli DH5 Helper (Mezcla)

3.- Centrifugar de inmediato a 4000 rpm por 4 minutos, decantar y

resuspender el pellet en 1000 µL de MgSO4 10mM. Repetir este paso 2 veces
más para eliminar restos de antibiótico.

4.- Resuspender cada pellet en 100 µL de MgSO4 10mM. Posteriormente

colocar 10 gotas de 10 µL en placas de agar LB e incubar a 30 °C por 24
horas.

5.- Checar que en todas las gotas haya spot de crecimiento, posteriormente
agregar a cada caja 2000 µL de MgSO4 10mM y recuperar los spots
bacterianos en tubos de 1.5mL (uno por caja).

6.- Hacer diluciones hasta 10-7 de la mezcla (Tubo C) y 10 -2 de los controles

(Tubo A y B) y platear 150 µL en agar LB con antibióticos de contra selección
(Km + resistencia de la bacteria problema). Incubar a 30°C por 24 horas

7.- Recuperar las transconjugantes aisladas y resembrarlas en placas con

antibióticos de contraselección. Nota: los controles no deben crecer.

8.- Conservar transconjugantes en glicerol y someter a evaluación de

fenotipo.