Análisis comparativo 2D-DIGE de proteínas microsomales sensibles a la salinidad de hojas

de Arabidopsis thaliana sensible a la sal y Thellungiella salsuginea tolerante a la sal.

Los halófitos han desarrollado estrategias moleculares únicas para superar la alta salinidad del
suelo, pero aún sabemos muy poco sobre los principales mecanismos que utilizan estas plantas
para completar su ciclo de vida bajo estrés de salinidad. Un enfoque útil para ampliar nuestra
comprensión en esta área es comparar directamente la respuesta a la salinidad de dos especies
estrechamente relacionadas que muestran diversos niveles de tolerancia a la sal. Aquí
presentamos un estudio proteómico comparativo utilizando DIGE de proteínas microsomales de
la hoja para identificar proteínas asociadas a la membrana sensibles a la sal en Arabidopsis
thaliana (un glucófito) y Thellungiella salsuginea (un halófito). Si bien se observó un pequeño
número de cambios distintos en la abundancia de proteínas con el estrés salino en ambas
especies, las diferencias más notables se observaron entre especies y específicamente, en
plantas no tratadas con un total de 36 proteínas que muestran cambios de abundancia
significativos. El análisis de enriquecimiento del término de ontología génica (GO) mostró que la
mayoría de estas proteínas se distribuyeron en dos categorías funcionales; transporte (31%) y
metabolismo de carbohidratos (17%). Los resultados identifican varias proteínas novedosas
sensibles a la sal en este sistema y apoyan la teoría de que T. salsuginea muestra un alto grado
de tolerancia a la sal porque los mecanismos moleculares están preparados para lidiar con el
estrés. Esta capacidad intrínseca para anticipar el estrés de salinidad lo distingue del glucófito A.
thaliana. Los resultados identifican varias proteínas novedosas sensibles a la sal en este sistema
y apoyan la teoría de que T. salsuginea muestra un alto grado de tolerancia a la sal porque los
mecanismos moleculares están preparados para lidiar con el estrés. Esta capacidad intrínseca
para anticipar el estrés de salinidad lo distingue del glucófito A. thaliana. Los resultados
identifican varias proteínas novedosas sensibles a la sal en este sistema y apoyan la teoría de
que T. salsuginea muestra un alto grado de tolerancia a la sal porque los mecanismos
moleculares están preparados para lidiar con el estrés. Esta capacidad intrínseca para anticipar
el estrés de salinidad lo distingue del glucófito A. thaliana.

SIGNIFICADO BIOLÓGICO

Existe un interés significativo en comprender los mecanismos moleculares que las plantas usan
para tolerar la salinidad, ya que la salinización del suelo se está convirtiendo en una
preocupación creciente para la agricultura con altos niveles de Na (+) en el suelo que conducen
a rendimientos reducidos y pérdidas económicas. Gran parte de nuestro conocimiento sobre los
mecanismos moleculares empleados por las plantas para combatir el estrés por salinidad
proviene del trabajo en plantas sensibles a la sal, pero los estudios sobre plantas, halófitos y
halófitas altamente resistentes a la sal que ocurren naturalmente podrían ayudarnos. Para
ampliar nuestra comprensión de los mecanismos de tolerancia a la salinidad. En este estudio,
empleando dos especies estrechamente relacionadas que difieren notablemente en su
tolerancia a la sal, Llevamos a cabo un enfoque proteómico cuantitativo utilizando 2D-DIGE para
identificar proteínas sensibles a la sal y comparar y contrastar las diferencias entre las dos
especies de plantas. Nuestro trabajo complementa un estudio anterior que utiliza la tecnología
iTRAQ (34) y destaca los beneficios de utilizar tecnologías y enfoques alternativos para obtener
una representación más amplia del proteoma sensible a la sal en estas especies.

INTRODUCCIÓN
La acumulación de sal en el suelo de la tierra utilizada para la producción de cultivos se ha
convertido en un problema importante en la agricultura; Limitando el crecimiento y la
productividad de muchos cultivos importantes. La mayoría de las plantas de cultivo son sensibles
a la sal y no pueden adaptarse a los factores de estrés abiótico asociados con los niveles cada
vez más elevados de sales en el suelo; incluyendo estrés iónico, osmótico y oxidativo. Esto
significa que grandes extensiones de tierra agrícola están siendo abandonadas, lo que resulta en
pérdidas económicas y destrucción ecológica. Como consecuencia, existe un gran interés en
estudiar los mecanismos de tolerancia a la salinidad en las plantas. En los últimos años, se ha
logrado un progreso significativo en la comprensión de las respuestas a nivel de toda la planta y
celular cuando las plantas están sujetas a una alta salinidad. Sin embargo, la mayoría de estos
estudios se han realizado utilizando Arabidopsis thaliana, una planta que es muy sensible a la
salinidad [1] pero que es atractiva como modelo, ya que fue la primera planta con un genoma
anotado completamente secuenciado [2]. Por otra parte, numerosas herramientas moleculares
que incluyen ADNc y mutantes inducidos químicamente, y una gran cantidad de bibliotecas de
expresión obtenidas en diferentes condiciones de salinidad, están disponibles para facilitar los
estudios funcionales [3]. En A. thaliana se ha demostrado que los transportadores de Na +,
incluidos los miembros de la familia de intercambiadores de Na + / H +, NHX / SOS [4,5] y el
transportador HKT [6–8], así como los componentes de la vía de transducción de señales,
incluidos Los CBL y CIPK que regulan la actividad de diversas proteínas [9] están involucrados en
la respuesta de las plantas al estrés salino. Sin embargo, cada vez es más claro que los
mecanismos que están presentes y son inducibles por la sal en A. thaliana no explican la
adaptabilidad de los halófitos a las condiciones extremas de sal, ya que los procesos
identificados parecen ser comunes a ambos glucófitos.

y halófitas [10]. Por lo tanto, los halófitos podrían haber desarrollado mecanismos únicos o vías
reguladoras que presumiblemente no se encuentran en los glucófitos, y el estudio de plantas
halófitas como Mesembryanthemum crystallinum, Salicornia brachiata, Salicornia europaea y
Atriplex gmelini, entre otros [11-16], ha ayudado a avanzar Nuestro conocimiento en esta área.
Desafortunadamente, ninguna de estas plantas tiene buenos sistemas de modelos genéticos
debido a la falta de herramientas moleculares. Recientemente, nosotros y otros hemos
informado del uso de la planta extremófila Thellungiella salsuginea como modelo para estudiar
los mecanismos de tolerancia a la sal de la planta [17–28]. T. salsuginea comparte una homología
de secuencia del 92% con el genoma de A. thaliana [17, 29] y presenta muchos de los atributos
que hicieron de A. thaliana un modelo tan exitoso [27], pero a diferencia de A. thaliana, T.
salsuginea es extremadamente salado tolerante.

Al aprovechar la alta similitud entre los genomas de A. thaliana y T. salsuginea, y la notable

diferencia en la tolerancia a la salinidad, los estudios comparativos están demostrando ser
exitosos para dilucidar rasgos importantes de tolerancia a la salinidad [10,18,23,30–35] . Los
estudios demuestran que, en condiciones de salinidad, los cambios en los niveles de
transcripción, proteínas y metabólicos específicos pueden ayudar a explicar la diferencia entre
estos dos miembros de la familia de los crucíferos.

Para ampliar nuestro conocimiento en este campo, informamos aquí un enfoque proteómico
cuantitativo, empleando fracciones de membrana microsómica aisladas de hojas de plantas
adultas de A. thaliana y T. salsuginea cultivadas en ausencia o presencia de NaCl 150 mM, y 2D-
DIGE para comparar y contrastar las respuestas del proteoma de la membrana foliar de estas
dos especies a la salinidad.

MATERIALES Y METODOS
2.1. Materiales vegetales y condiciones de crecimiento.

Las plantas de T. salsuginea (derivadas del material recolectado originalmente de la provincia de

Shandong en China y amablemente suministrado por los doctores Hans Bohnert y Ray Bressan)
y A. thaliana (cultivar Columbia) se cultivaron a partir de semillas en el suelo (Metro mix 510,
Scotts, Marysville , OH), suplementado con perlita 3: 1, en una bandeja de propagación. Cuatro
semanas después de la germinación, las plántulas individuales (aproximadamente 30) se
transfirieron a tinas opacas de 12 l que contenían 10 l de medio Hoagland's de resistencia media
[36], que se cambió semanalmente. El tratamiento con sal (150 mM) se inició 7 semanas después
de la germinación (aproximadamente 3 semanas después de la transferencia a condiciones
hidropónicas) mediante inclusión en el medio de Hoagland. A esta edad, las plantas de A.
thaliana y T. salsuginea cultivadas en condiciones de control muestran un tamaño de roseta
similar y las plantas de A. thaliana aún no han mostrado signos de atornillado (Fig. 1
suplementaria). Las plantas se cultivaron en un invernadero bajo irradiación natural y
fotoperíodo. Las temperaturas mínimas oscilaron entre 20 y 24 ° C y la temperatura máxima se
mantuvo a 25 ° C. La densidad de flujo de fotones fotosintéticos de invernadero alcanzó un valor
máximo de 500 mmol m − 2 s − 1 durante la mitad del día. Los experimentos se llevaron a cabo
en los meses de mayo a octubre a una altitud de 1800 m sobre el nivel del mar. Para la longitud
de la hoja de roseta, se cortaron hojas individuales y se midió la longitud de la hoja más el pecíolo
para aproximadamente 30 hojas.

2.2. Aislamiento microsomal

Las hojas de las plantas de T. salsuginea y A. thaliana fueron cosechadas y cortadas en trozos
pequeños. El material de la hoja (30 g de peso fresco) se colocó directamente en 300 ml de
medio de homogeneización helado (manitol 400 mM, 10% [p / v] glicerol, 5% [p / v] PVP-10,
0.5% [p / v ] BSA, PMSF 1 mM, Tris 30 mM, DTT 2 mM, EGTA 5 mM, MgSO4 5 mM, hidroxitolueno
butilado 0,5 mM, dibucaína 0.25 mM, benzamidina 1 mM y K + - metabisulfito 26 mM, ajustado
a pH 8.0 con H2SO4), y todas las operaciones posteriores se llevaron a cabo a 4 ° C. El tejido
foliar se homogeneizó en una licuadora comercial, se filtró a través de cuatro capas de gasa y se
centrifugó a 10,000 × g (20 min a 4 ° C) usando un rotor JA25.2 (Beckman, México) en una
centrífuga de supervelocidad (Avanti J301, Beckman , México). Se descartaron los gránulos y los
sobrenadantes se centrifugaron a 80,000 × g (50 min a 4 ° C) usando un rotor de ángulo fijo 45
Ti (Beckman, México) en una ultracentrífuga L8-M (Beckman, México). El sobrenadante se aspiró
y el sedimento microsomal se resuspendió en medio de suspensión (que consta de manitol 400
mM, glicerol al 10% [p / v], Tris / Mes 6 mM, pH 8.0 y DTT 2 mM) y se almacenó a -80 ° C. Hemos
informado que este método da como resultado una fracción microsómica que es una mezcla de
todas las membranas celulares, como lo demuestra el análisis de anticuerpos marcadores de
membranas microsomales aisladas de M. crystallinum y posteriormente separadas por
electroforesis de flujo libre [37].

2.3. Determinación de proteínas

El contenido proteico de los microsomas se midió mediante una modificación del método de
unión al colorante [38] en el que la proteína de membrana se solubilizó parcialmente con Triton
X-100 al 0,5% (v / v) durante 5 minutos antes de la adición del concentrado de reactivo colorante
(Bio -Rad, México). BSA se empleó como el estándar de proteína.

2.4. Preparación de muestra para 2D-DIGE

La proteína (75 μg de cada muestra) se desaló / limpió con el kit de limpieza 2D ReadyPrep (Bio-
Rad, México) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El sedimento proteico final se
resuspendió en tampón de etiquetado (Tris-HCl 30 mM pH 8, urea 5,7 M, tiourea 2 M, CHAPS al
2% y amidosulfobetaína-14 al 2% (ASB-14). Las muestras de proteínas se marcaron con el CyDye
apropiado (Cy2, Cy3 o Cy5) según el protocolo de etiquetado mínimo DIGE (GE Life Sciences,
Suecia), como se muestra en la Tabla 1. Una mezcla igual de las tres muestras de cada réplica
biológica se marcó con Cy2 como patrón interno durante la electroforesis en gel para permitir
el emparejamiento de gel a gel y los análisis en gel de las intensidades relativas de las manchas
de proteínas. Las muestras marcadas con Cy2, Cy3 y Cy5 para cada experimento se mezclaron y
el volumen se ajustó a 300 μl con tampón de rehidratación obteniendo una solución de muestra
final compuesta de 7 M de urea, 2 M de tiourea, 2% (w / v) CHAPS, 2% (w / v) ASB-14, 0.5% DTT,
0.5% IPG buffer 3–10 Nl (BioRad, México) en un 17 cm ReadyStrip IPG (pH lineal 3–10; BioRad,
México) y el IEF se ejecutó en una célula Protean IEF (Bio-Rad, México), con una rehidratación
activa a 50 V (20 ° C) durante 16 h, seguido de unas condiciones de enfoque de rampa de tres
pasos para un total de 40,000 V / ha 20 ° C y una configuración de corriente máxima de 50 mA
por tira. Después de IEF, las tiras se equilibraron 15 minutos en tampón de equilibrio de DTT
(urea 6 M, Tris-HCl 0,375 M, pH 8,8, SDS al 2%, glicerol al 20% y DTT al 2%) en un agitador,
seguido de 15 minutos adicionales. en tampón de equilibrio de yodoacetamida (urea 6 M, Tris-
HCl 0,375 M, pH 8,8, SDS al 2%, glicerol al 20% y yodoacetamida al 2,5%). Las tiras se cargaron
en geles SDS-PAGE de acrilamida al 10% moldeados entre placas con bajo contenido de
fluorescencia recubiertas en un lado con solución de silano de unión (80% de etanol, 2% de ácido
acético glacial y 0,01% de silano de unión). Se incluyeron dos marcadores fluorescentes de
referencia en la placa de vidrio que contenía el silano de unión para facilitar la selección robótica
de manchas. Las tiras se superpusieron con agarosa de bajo punto de fusión al 0,5% en tampón
de ejecución SDS (Tris-HCl 25 mM, pH 8,3, glicina 192 mM, SDS al 0,1% y azul de bromofenol), y
se realizó SDS-PAGE utilizando el aparato de electroforesis Ettan Daltsix. Los geles se escanearon
tres veces utilizando un generador de imágenes Typhoon TM 9410 (GE Healthcare Life Sciences,
Suecia) para obtener las imágenes de cada uno de los tres CyDyes de acuerdo con las condiciones
de adquisición descritas en la Tabla complementaria 1. El análisis de imágenes se realizó con el
software DeCyder 2D v6.5 siguiendo las instrucciones del fabricante (GE Healthcare Life
Sciences, Suecia) y como se describe [39]. El módulo de análisis diferencial en gel (DIA) se usó
para detectar y cuantificar las manchas de proteínas en los geles individuales y el módulo de
análisis de variación biológica (BVA) se usó para unir los geles con respecto a un estándar interno
(etiquetado con Cy2) y estadísticamente analizar las diferencias en la abundancia de manchas
de proteínas normalizadas entre los geles. ANOVA se usó para evaluar las diferencias entre los
puntos coincidentes entre los geles y la prueba t se usó posteriormente para analizar y comparar
pares individuales de puntos de proteínas coincidentes. Las manchas que muestran un valor p
≤0.05 en comparación con los grupos de tratamiento se consideraron estadísticamente
significativas. Los puntos de proteínas que muestran una diferencia de abundancia de al menos
1,5 veces entre los tratamientos se seleccionaron y extirparon utilizando el robot Ettan Spot
Picker (GE Healthcare Life Sciences, Suecia) y el mapa de selección de puntos generado por el
software DeCyder, de acuerdo con el manual del instrumento y el usuario manual (GE
Healthcare Life Sciences, Suecia).

2.5. Identificación de proteínas por espectrometría de masas en tándem (LC – MS / MS)

Las manchas de proteínas del experimento DIGE se enviaron al Centro de Proteómica en el

Institut de Recherches Cliniques de Montreal, Canadá. Las manchas de proteínas se lavaron y se
tiñeron en 0,5 ml de metanol al 50% / ácido acético al 5% durante la noche a temperatura
ambiente. La digestión de proteínas se realizó de acuerdo con el método en gel con algunas
modificaciones [40]. Las manchas de gel extirpadas se deshidrataron en 100 μl de acetonitrilo
(CH3CN) durante 5 minutos a temperatura ambiente, el sobrenadante se eliminó y los
fragmentos de gel se secaron al aire. Las muestras se rehidrataron en 20 μl de tripsina (25 ng /
μl) hasta que la solución se absorbió (10 min). Se añadió bicarbonato de amonio (NH4HCO3, 50
mM) para cubrir completamente el gel rehidratado y las muestras se incubaron durante la noche
a 37 ° C. Posteriormente, se agregaron 20 μl adicionales de NH4HCO3 50 mM a las muestras y
se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las muestras se centrifugaron y los
extractos se transfirieron a tubos Eppendorf vacíos de 0,5 ml. Las manchas de gel se volvieron a
extraer con 20 μl de solución de extracción (ácido fórmico al 5% en CH3CN al 50%) y se incubaron
durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se sometieron a vórtice y se
centrifugaron durante 30 s. Los sobrenadantes se recogieron sin alterar la pieza de gel y se
combinaron con el extracto anterior. Los digeridos de proteínas se desalaron mediante
extracción en fase sólida mediante un protocolo modificado para puntas de pipeta Zip C18 de
Millipore (Bedford, MA). Para la unión y lavado de péptidos, las muestras se aspiraron 60 veces,
y los péptidos se eluyeron en 15 μl de ácido fórmico al 1% en CH3CN al 50%. Las mezclas de
péptidos se analizaron mediante nano LC-MS / MS utilizando un auto muestreador Finnigan
MicroAS y un sistema de bomba Surveyor MS acoplado a un LTQ-Orbitrap (Thermo, San José,
CA). Cuarenta microlitros de cada mezcla se cargaron en una precolumna C18 (Symmetry 300
C18 5 μm, nano-Esi Trap Column, Waters, Boston, MA) a 3 μl / min durante 15 minutos en ácido
fórmico al 0,1% en CH3CN al 5%. Los péptidos se eluyeron usando un gradiente de 5–35% de
disolvente B (ácido fórmico al 0,1% en CH3CN al 100%) durante 60 minutos a un caudal de 300
nl / min con una columna BioBasic C18 PicoFrit (PFC7515 / BI / 10, New Objective , MA). El modo
de adquisición dependiente de los datos se realizó con el software Xcalibur. Se obtuvo un
escaneo completo transformado de Fourier (FT) por medio del Orbitrap, de 300 a 1800 m / z con
un poder de resolución establecido en 30,000 (400 m / z). Los cinco picos más intensos se
aislaron secuencialmente para los experimentos de MS / MS en la trampa de iones lineal (LTQ)
usando disociación inducida por colisión. El rango de relación de masa sobre carga fue de 380 a
2000 para escaneo MS con un valor objetivo de 1,000,000 de cargas y de ~ 1/3 de la relación m
/ z principal a 2000 para escaneo MS / MS con un valor objetivo de 10,000 cargas. Los eventos
de exploración dependientes de los datos utilizaron un tiempo máximo de llenado de iones de
100 ms y 1 microscan. Para evitar la duplicación de datos MS / MS para el mismo péptido, la
exclusión dinámica se estableció en 2 y los iones seleccionados se colocaron en la lista de
exclusión durante 45 s. Los datos de espectros sin procesar de MS / MS se convirtieron en
archivos DTA usando Thermo Electron Bioworks 3.2 y se analizaron mediante TurboSEQUEST
(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Los voltajes de nanoespray y lente S se ajustaron a
0.9–1.8 kV y 50 V, respectivamente. La temperatura capilar se ajustó a 225 ºC. Las condiciones
de MS / MS fueron: energía de colisión normalizada, 35 V; activación Q, 0.25; tiempo de
activación, 10 ms.

2.6. Búsqueda de bases de datos

Los espectros de masas en tándem se extrajeron utilizando el programa Mascot Daemon versión
2.3.02. Todas las muestras de MS / MS se analizaron usando Mascot (Matrix Science, Londres,
Reino Unido) y X! Tandem (The GPM, thegpm.org; versión 2007.01.01.1). Mascot se configuró
para buscar en la base de datos nr_20101214 (Viridiplantae, 20101214, 848702 entradas),
suponiendo la enzima de digestión tripsina. ¡X! Tandem se configuró para buscar un subconjunto
de la base de datos nr_20101214 también suponiendo tripsina. Mascota y X! Se realizaron
búsquedas en tándem con un fragmento de tolerancia de masa de iones de 0,60 Da y una
tolerancia de iones parental de 12 ppm. La oxidación de la metionina y el derivado de
yodoacetamida de la cisteína se especificaron en Mascot y X! Tándem como modificaciones
variables.

2.7. Criterios para la identificación de proteínas.

Se usó Scaffold (Scaffold_4.0.5, Proteome Software Inc., Portland, OR) para validar las
identificaciones de péptidos y proteínas basadas en MS / MS. Las identificaciones de péptidos
se aceptaron si podían establecerse con una probabilidad superior al 95% mediante el algoritmo
de péptido profeta [41] con corrección de masa delta de andamio. Las identificaciones de
mascotas requieren que las puntuaciones de iones sean mayores que las puntuaciones de
identidad asociadas y 20, 15 y 15 para péptidos con carga doble, triple y cuádruple,
respectivamente. ¡X! Las identificaciones en tándem requirieron al menos −log (Esperar)
puntajes superiores a 25. Las identificaciones de proteínas se aceptaron si podían establecerse
con una probabilidad superior al 99% y contenían al menos dos péptidos identificados únicos.
La ubicación prevista de la proteína se obtuvo a partir de la anotación de ontología general de
la ubicación subcelular en la base de conocimiento de UniProt [42]. Si bien estas asignaciones
proporcionan información sobre las proteínas identificadas, se basan principalmente en la
homología y predicción de secuencias y, con menos frecuencia, en evidencia experimental.

2.8. SDS-PAGE e inmunotransferencia de proteínas

Para confirmar algunos de los resultados obtenidos de los experimentos DIGE, utilizamos el
análisis de transferencia Western. La proteína se precipitó por dilución de las muestras 50 veces
en etanol: acetona 1: 1 (v / v) y se incubó durante la noche a -30 ° C según el método de Parry
et al. [43] Luego, las muestras se centrifugaron a 13,000 × g durante 20 minutos a 4 ° C usando
un rotor F2402 en una centrífuga de mesa GS-15R (Beckman, México). Los pellets se secaron al
aire, se volvieron a suspender con tampón de muestra Laemmli [44] (concentración final de SDS
al 2,5% [p / v]) y se calentaron a 60 ° C durante 2 minutos antes de cargarlos en una mini
acrilamida lineal al 12,5% (p / v) -gels. Después de la electroforesis, los geles se prepararon para
inmunotransferencia. Las proteínas separadas por SDS-PAGE se transfirieron
electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa (ECL, Amersham, Reino Unido) como se
describió anteriormente [13]. Después de la transferencia, las membranas se bloquearon con
TBS (Tris 100 mM, NaCl 150 mM) que contenía 0,02% [p / v] de Na-azida y 5% [p / v] de leche en
polvo sin grasa (Svelty, Nestlé, México) para 2 ha temperatura ambiente. Las membranas
bloqueadas se incubaron durante un mínimo de 3 ha temperatura ambiente con los anticuerpos
primarios apropiados, seguido de la adición de una dilución 1: 5000 de anticuerpos secundarios
(anti-conejo de cabra) conjugados con peroxidasa de rábano picante. La inmunodetección se
llevó a cabo utilizando los sustratos Luminata Western HRP (Millipore, MA). La intensidad media
de las bandas de proteínas inmunodetectadas se calculó utilizando marcadores de peso
molecular de Fermentas como patrones de control de carga (Fermentas, México). Las imágenes
se capturaron utilizando un escáner de C-Digit Blot y el software de análisis Image Studio Lite
Western Blot (Li-Cor, Lincoln, NE).

2.9. Mediciones de osmolaridad

Las hojas fueron recolectadas y lavadas dos veces con agua desionizada. El tejido (2 g), cortado
en trozos pequeños, se cargó en una jeringa de 5 ml que contenía un disco de filtro Whatman
No. 1. El material se congeló a -30 ° C y la savia celular se obtuvo en muestras descongeladas por
centrifugación a 1200 × g durante 15 minutos usando un rotor S4180 en una centrífuga de mesa
GS-15R (Beckman, México). La osmolaridad de la savia celular se midió en muestras de 50 μl con
un osmómetro crioscópico (Osmomat 030, Gonotec, Alemania)

2.10. Medición de clorofila

La clorofila se midió de acuerdo con Porra et al. [45] Se recogieron, lavaron, cortaron en trozos
pequeños y molieron en un mortero hojas de plantas de A. thaliana o T. salsuginea tratadas con
sal y control con 1 ml de acetona al 80% (v / v). Las muestras se centrifugaron a 12,000 × g
durante 10 min y se recogió el sobrenadante. La clorofila se midió utilizando un
espectrofotómetro de matriz de diodos (Hewlett Packard, CA). Se detectó la absorbancia de la
clorofila a extracto a 648 nm, clorofila b a 664 nm. Los valores se calcularon utilizando los
coeficientes de extinción molar 20.2 y 8.02 para las clorofilas ayb, respectivamente.

2.11. Anticuerpos primarios y secundarios

Los anticuerpos se compraron de Agrisera (Agrisera, Suecia) contra: las subunidades V-ATPasa
de A. thaliana, VHA-A (69 kD; Cat. # AS09467), VHA-B (55 kD; Cat. # AS09503) y VHA-E (29 kD;
Cat. # AS07213), fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa (ALD, 38 kD; Cat. # AS08294); y la proteína de
membrana de envoltura externa de cloroplasto Pisum sativum (PsTOC75; 75 kD; Cat. #
AS08351). La proteína de andamio tipo A. thaliana WD-40, RACK1A (35 kD; Cat. # AS111810) fue
un regalo de Agrisera.