UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE

BASADRE GROHOMANN
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS

ALIMENTARIAS

PRACTICA Nº07

AISLAMIENTO DE ENTEROBACTERIAS

CURSO: Microbiología de alimentos l

DOCENTE: MSc. Sonia Pomadera Angulo

ALUMNA: Diana Carolina Cinticala Quispe 2016 - 111007

TACNA-PERU
2018
 PRACTICA Nº07

AISLAMIENTO DE ENTEROBACTERIAS

I. OBJETIVO

 Aislar enterobacterias en medios adecuados y desarrollar la prueba de IMVIC

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Según (Bergamini & Gamero, 2013). La familia enterobacteriaceae, está formada por
bacterias patógenas y no patógenas, su morfología es en forma de pequeños bastones,
son gram – negativos y fermentan la glucosa. Las que tienen mayor importancia son las
de los géneros Escherichia, Shigella y Salmonella. En el género Escherichia o
coliformes se considera como indicador a E. Coli de origen fecal, por su frecuencia.
Son lactosa positivos, crecen a 37ºC a pH = 2 – 7,4. Las bacterias del género
Salmonella son lactosas negativas; crecen a 37oC, a pH = 7, 2,6. A 65oC mueren en
15min. Y a 100oC en forma instantánea.
ENTEROBACTERIAS

Es la forma común de denominar a las bacterias Gram. negativas. Reciben este nombre
porque suelen encontrarse en el intestino de los mamíferos. Las especies que poseen
flagelos son móviles; el resto, inmóviles. La capacidad para fermentar la lactosa y el
tiempo empleado en hacerlo sirven para diferenciar los géneros. Los que no realizan la
fermentación son patógenos, los fermentadores, saprofitos. Hay enterobacterias que
provocan intoxicaciones alimentarias, como la salmonelosis. Los síntomas son fiebre,
diarrea y dolores abdominales. Es una intoxicación muy rápida. Las epidemias de peste,
que fueron muy importantes en la antigüedad, también son producidas por una
enterobacteria.

IMPORTANCIA DE RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS EN ALIMENTOS

La presencia de determinados microorganismos en los alimentos se puede aprovechar

como un indicador potente sobre algunos aspectos fundamentales relacionados con los
mismos. Este tipo de microorganismos recibe la denominación común de
microorganismos indicadores y su investigación y cuantificación nos puede aportar
información sobre la seguridad sanitaria del alimento, su grado de alteración, su nivel de
envejecimiento, la bondad de su proceso de elaboración, etc. La presencia de
microorganismos que modifican o degradan las características organolépticas de los
productos, aunque no causen intoxicaciones, incapacitan los alimentos para su consumo
o disminuyen su vida comercial.
ENTEROBACTERIAS PATÓGENAS

La presencia de Enterobacterias patógenas en los alimentos supone un grave riesgo para

los consumidores que van a ingerirlos. Debemos garantizar la ausencia de este tipo de
microorganismos en los alimentos.
 Bacillus cereus
 Escherichia coli
 Salmonella
 Shigella
 Staphylococcus aureus

PRUEBA DE IMVIC

El IMViC es una prueba utilizada en biología para la identificación bacterias. Se compone

de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato. El resultado de este
test se expresa mediante símbolos de positivo o negativo (+ o -) según el resultado de
cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del método. Así, por
ejemplo, el IMViC para E. coli es ++--.

1. Indol (I)
Consiste en cultivar la especie en estudio en un caldo rico entriptófano; después de
24-48 horas de crecimiento, se extrae el indol producido con un disolvente orgánico,
como xileno, y se determina su presencia con reactivos específicos como el reactivo
de Kovacsel que adquiere un color rojo en la prueba del indol positiva.

2. Rojo de Metilo (M)

Se usa para determinar si un microorganismo que crece en un medio peptonado,
glucosado y tamponado (medio de Clark y Lubs, RMVP) es capaz de producir ácidos
en cantidad suficiente para bajar el pH a valores inferiores a 4.4, lo que se comprueba
con el viraje del indicador de pH, el rojo de metilo, añadido al final de la incubación.

El método de realizar este ensayo es sembrar con el asa curva el medio líquido con la
cepa e incubar a 37ºC a 48-72 horas, tras esto, añadir 5 gotas del rojo de metilo al
medio.
Dado que para la prueba del rojo de metilo y Voges Proskauer se utiliza el mismo
tubo de ensayo que incubamos y luego se reparte a partes iguales en un tubo estéril
(con 2,5 mL de medio inoculado) teniendo así dos tubos de ensayo a partir del primero
para realizar los dos test por separado.
Se considera que la reacción es positiva si se observa un viraje del medio a rojo y
sería negativa si se observa una coloración amarilla inicial. En nuestro caso, la cepa
el resultado es positivo porque el medio vira a un color rojo intenso.

3. Voges-Proskauer (Vi)
Se utiliza para determinar la formación de acetil metil carbinol, que es un producto
intermediario de la fermentación que conduce a la formación de 2,3 butanodiol que
 indicará que la glucosa es fermentada por vía butanodioica. Para ello, sobre el tubo
con medio inoculado se añaden 0,6 mL de α-naftol al 5% adquiriendo así un color
lechoso y posteriormente, se le añaden 0,2 mL de KOH al 40% por lo que desaparece
el color y se agita fuertemente. Se considera que el test es positivo si antes de 5
minutos aparece un color rosa-violeta, mientras que será negativo si no adquiere
coloración en caso de presencia de Ecoli.

4. Citrato (C)
se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo para usar citrato como
única fuente de carbono. Esta reacción es llevada a cabo por la encima citrasa.
Se siembra con asa recta en un tubo con Agar Citrato de Simmons, realizando una
estría sobre la superficie inclinada y se incuban los tubos durante 24 horas.
Transcurrido este tiempo se hace la lectura del test. Este agar contiene citrato sódico
como única fuente de carbono y ión amonio como única fuente de nitrógeno. Además,
contiene azul de bromotimol como indicador de pH. El agar citrato de Simmons es
inicialmente de color verde, si el microorganismo es capaz de crecer en este medio y
utilizar el citrato se producirán productos alcalinos. El azul de bromotimol por encima
de pH 7,6 produce un viraje del medio a azul.

III. MATERIALES

1. Material de vidrio
 Pipeta
 Placa Petri
 Tubos de ensayo

2. Equipo
 Microscopio
 Mechero de bunsen
 Autoclave
 Estufa

3. Otros materiales
 Lamina portaobjetos
 Asa de col
 Algodón

4. Medios de cultivo
 Agar Plate Count
 EBM
 BPLS
 VRBA
 SS
 Tetrationato
 Caldo verde brillante bilis
 5. Reactivos y/o elementos
 Lugol
 Aceite de cedro
 Agua
 Safranina
 Alcohol – acetona
 Solución cristal violeta

6. Muestra orgánica
 Muestra de heces

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Preparación del caldo Brila

 Disuelva 8 g del medio en un 15 ml de agua purificada hasta que esté

uniformemente disperso.
 Caliente con agitación frecuente para disolver completamente el medio.
 Distribuya en el tubo de ensayo ya preparado.
 Con un hisopo especial tomar la muestra de heces e introducir dentro del tubo ya
con la tetrationina ya preparada
.

 Una vez introducido se procederá a tapar el tubo con algodón de forma segura.
 Llevar a la estufa por 48 horas a 37ºC
Preparación de la tetrationina

 Disuelva 8 g del medio en un 15 ml de agua purificada hasta que esté

uniformemente disperso.
 Caliente con agitación frecuente para disolver completamente el medio.
 Distribuir en el tubo de ensayo ya preparado.
 Con un hisopo especial tomar la muestra de heces e introducir dentro del tubo ya
con la tetrationina ya preparada.

 Una vez introducido se procederá a tapar el tubo con algodón de forma segura.
 Llevar a la estufa por 48 horas a 37ºcC

Preparación de los medios de cultivo

1. EMB
 Primero sacando los cálculos para su preparación se tiene:
36 g /Lt= 4 placas =80 ml = 2,88g del agar
 Luego se enrrollara en papel y se llevara a autoclavado a 21ºC por 15 minutos.

2. VRBA
 Primero sacando los cálculos para su preparación se tiene:
39 g /Lt= 4 placas =80 ml = 3,12g del agar
 Luego a vapor fuerte se esterilizará.

3. BLPS
 Primero sacando los cálculos para su preparación se tiene:
52 g /Lt= 4 placas =80 ml = 4,16g del agar
 Luego se enrollará en papel y se llevará a autoclavado a 21ºC por 15 minutos.
4. SS
 Primero sacando los cálculos para su preparación se tiene:
60 g /Lt= 4 placas =80 ml = 4,18g del agar
 Luego a vapor fuerte por 1minuto.
Siembra
 Sembrar en estría del Caldo Brilla al VRBA Y EBM
 Sembrar en estría del Caldo tetrationato al BPLS Y SS.
 De ambos caldos pueden sembrar al VRBA Glucosado
 Luego de incluir a las temperaturas y tiempos adecuados realizar la prueba de
IMVIC para una colonia representativa de E. Coli.

Prueba de indol:

 Inocular en tubos con caldo peptonado o triptosa.

 Incubar por 24 horas adicionar de 2 a 3 gotas de reactivo de Kovacs por las
paredes.
 Dejar los tubos en reposo y observar la formación de un anillo de color rojo para
el resultado positivo, o anillo color amarillo para negativo.

Prueba del rojo de metilo.

 Inocular los tubos conteniendo caldo MR – VP.

 Incubar a los tubos por 72 horas a 37oC.
 Después de las 72 horas adicionar a 5 gotas de solución Rojo de metilo y agitar.
 Anotar como el Rojo de metilo positivo, la aparición de un color rojo, y como
negativo la operación de un color amarillo.

Prueba de Voges – proskauer:

 Inocular los tubos de caldo MR – VP.

 Incubar a 37oC por 48 horas.
 A 1ml de cultivo añadir 0.6 ml de solución de alfa naftol y 0.2 ml de sol. KOH
40%. Agitar. Dejar reposar de 2 a 4 horas.
 Reacción positiva: coloración rosada o carmesí.
 Prueba del citrato:

 Inocular los tubos de citrato de Simmons.

 Incubar a 37oC por 24 horas.
 Anotar como positivo un crecimiento visible, acompañado de un cambio de color
verde al azul.

V. RESULTADOS

Sembrando con la tetrationina y el caldo Brila se obtuvo:

 EMB
 BLPS

 SS

 BRVA
Se observó puntos rosados en la muestra sembrada lo cual indica la presencia de
enterococos.
Con la prueba de IMVIC se obtuvo:
Voges
Indol Rojo de metilo Citrato
Proskawer
 - - - +
Se observó un No se observó En este caso no Se observó que la
anillo amarillo por ninguna hubo reacción. visibilidad de un
lo tanto es reacción por lo color azul de
negativo. cual es negativo. forma que es
positivo
Debía observarse Para que sea
un anillo rojo con positivo debió Pero para
amarillo presentar la presencia de E.
aparición de un coli debía ser
color rojo negativo.

Indol Rojo de metilo Voges Proskawer Citrato

+ + - -
Presencia de E. coli
 Otra observación:
En nuestra prueba de IMVIC realizado se observó que en la prueba de citrato salio
positivo debido a que se observó la visibilidad de un color azul lo cual podría
indicar la presencia de K. pneumoniae de acuerdo a la figura vista, claro que solo
funcionaria para la prueba de citrato; la prueba de indol y la prueba de rojo de
metilo, pero no para la prueba de voges proskawer debido a que nos salió negativo.

VI. CONCLUSIONES

 Se observó con la prueba de IMVIC que no había presencia E. coli, debido a que el E.
coli no consume carbono del citrato de sodio. Para deducir que es en ecoli tiene que
ser ++-- (positivo, positivo, negativo y negativo) con respecto a la prueba de IMVIC.
Por lo tanto, se concluye que en la muestra tomada no había presencia de E. coli
realizando la prueba de IMVIC.

VII. RECOMENDACIONES

 Estriar correctamente o los resultados podrían variar de lo esperado.

 Algunos cultivos son algo tóxicos de preferencia no aspirar y ser cuidadoso (usar
mascarilla)

VIII. CUESTIONARIO

1. Interprete los resultados de la prueba de IMVIC, para E. coli. Explique la

formación de indol.

Según los resultados obtenidos se obtuvo:

Indol Rojo de metilo Voges Proskawer Citrato

- - - +
Entonces:
  La positividad viene dada por la formación de un anillo de color rojo o fucsia
que se forma al añadir el revelador: reactivo de Kovacs. Sin embargo, como
se muestra en el resultado obtenido de la prueba de indol se observó que al
agregar el revelador no se observa formación del anillo rojo, por lo tanto, la
prueba es negativa.

2. ¿Cuáles son las bacterias coliformes, qué géneros son no patógenos?

El «total de bacterias coliformes» (o «coliformes totales») incluye una amplia

variedad de bacilos aerobios y anaerobios facultativos, gramnegativos y no
esporulantes capaces de proliferar en presencia de concentraciones relativamente
altas de sales biliares fermentando la lactosa y produciendo ácido o aldehído en 24 h
a 35–37 °C. Escherichia coli y los coliformes termotolerantes son un subgrupo del
grupo de los coliformes totales que pueden fermentar la lactosa a temperaturas más
altas.
Los coliformes totales producen, para fermentar la lactosa, la enzima β-galactosidasa.
Tradicionalmente, se consideraba que las bacterias coliformes pertenecían a los
géneros:

 Escherichia
 Citrobacter
 Klebsiella
 Enterobacter

Pero el grupo es más heterogéneo e incluye otros géneros como Serratia y Hafnia. El
grupo de los coliformes totales incluye especies fecales y ambientales.

3. ¿Cómo crece E. coli en el agar azul de metileno? ¿Cómo actúa este medio?

Los colorantes de anilina (eosina y azul de metileno) inhiben el desarrollo de bacterias

Gram positivas y a las Gram negativas exigentes. También se combinan precipitando
a pH ácido, actuando como indicadores de producción de ácidos. El medio incluye
lactosa, lo que permite la diferenciación de los fermentadores de lactosa de los no
fermentadores. Los fermentadores fuertes de lactosa, sobre todo Escherichia coli,
producen colonias de color negro verdoso con brillo metálico.
 Presencia E. coli

IX. BIBLIOGRAFÍA

Bergamini, L. L., & Gamero, A. C. (2013). MICROBIOLOGIA GENERAL Y DE

LOS. Recuperado de
https://www.scribd.com/document_downloads/direct/228692860?extension=pdf&f
t=1539545580&lt=1539549190&show_pdf=true&user_id=315608121&uahk=rz6
g2bY5UgoW8OmoSvYhrnw00wY
Rodriguez E. (2012). Prueba de Indol. Publicado en Microbiología para bioanálisis.
Recuperado de http://microbiologiabioanalisis.blogspot.com/2012/06/prueba-de-
indol-fundamento-evalua-la.html