Ministerio de Medio Ambiente y Agua

Viceministerio de Recursos Hídricos y Riego Ministerio de Medio Ambiente y Agua

Estado Plurinacional de Bolivia

Guía para
Ministerio de Medio Ambiente y Agua
Viceministerio de Recursos Hídricos y Riego

la evaluación
Con el apoyo de:
genotóxica de
cuerpos de agua
utilizando células de
raíces de
cebollines
www.cuencasbolivia.org
Calle: Héroes del Acre esquina Conchitas Nº 1778
Telf. (591-2) 2124484 – 2117391
 Guía para la Evaluación Genotóxica en Cuerpos de Agua Utilizando Células de Raíces de Cebollines

Autor
Ministerio de Medio Ambiente y Agua (MMAyA)
Edición y diseño
Viceministerio de Recursos Hidricos y Riego (VRHR)
Texto:
Gloria Rodrigo Lira

El presente documento fue elaborado en el marco del Programa Plurianual de Gestión Integrada de Recursos Hídricos y Manejo
Integral de Cuencas 2013 – 2017 y su impresión fue posible gracias al apoyo de la Cooperación Suiza en Bolivia a través de
HELVETAS Swiss Intercooperation, programa CONCERTAR miembro de GESTOR.

Está permitida la reproducción del presente documento, siempre que se cite la fuente..

La Paz –Bolivia
2014
 Contenido

1
Recordando la división celular 1

2
¿Qué es genotoxicidad
? 5
3 ¿Cómo se evalúa genotoxicidad en cuerpos de agua? 11

4
Protocolo de evaluación 15

4.1 Reactivos y material 18

4.2 Procedimiento de muestreo 19

4.3 Medición de micronúcleos 22

4.4 Datos y cálculos 26

4.5 Interpretación de resultados 28

5
Glosario 30

6
Bibliografía consultada 31
 Presentación
Con el objetivo de facilitar la labor de vigilancia, control y monitoreo de la calidad de los cuerpos
de agua, en cumplimiento con los artículos 9, 10 y 11 del Reglamento en Materia de Contaminación
Hídrica, de la ley del Medio Ambiente (Ley 1333), el Ministerio de Medio Ambiente y Agua (MMAyA),
a través del Viceministerio de Recursos Hídricos y Riego (VRHR), elaboró la presente cartilla que se
espera pueda ser difundida y aplicada de manera efectiva y concreta por técnicos de medio ambiente
de los gobiernos municipales y departamentales, monitores comunales, empresas y cooperativas
prestadoras de servicios de agua potable y saneamiento básico e instituciones u organizaciones
involucradas y comprometidas con este tema.
Como resultado de su aplicación, se espera que se pueda mejorar y ampliar el presente documento,
por lo que será de mucho valor toda observación, sugerencia y comentario que se pueda hacer llegar
al VRHR para su incorporación en sus próximas ediciones con los reconocimientos que correspondan.

Ing. Carlos Ortuño Yáñez

VICEMINISTRO DE RECURSOS HÍDRICOS Y RIEGO
1 Recordando la división celular
Las plantas y los animales están formados por miles de
millones de células individuales organizadas en tejidos
nes de nuevas células cada segundo simplemente para
mantener su estado de equilibrio. Si la división celular se
y órganos que cumplen diferentes funciones específicas detiene el individuo moriría en pocos días.
y que se reproducen duplicando tanto su contenido nu-
clear como el citoplasmático para luego dividirse en dos
nuevas células.

En especies unicelulares, como las bacterias, hongos,

algas, protozoos y las levaduras (Figura 1), cada división Protozoo
de la célula única produce un nuevo organismo.
Alga
En especies pluricelulares se requieren muchas secuen-
cias de divisiones celulares para crear un nuevo individuo.

En cuerpos adultos, la división celular es también necesa-

Bacterias
ria para reemplazar las células perdidas por su desgaste,
Hongos
deterioro o por muerte celular programada o envejeci-
miento. Un humano adulto debe producir muchos millo- Figura 1. Organismos unicelulares

1
El ciclo celular comprende el conjunto de procesos que
una célula debe realizar para replicar de manera exacta
el ADN1 y separar o dividir los cromosomas replicados
en dos nuevas células distintas.
La gran mayoría de las células también doblan su masa
y duplican todos sus orgánulos citoplasmáticos en cada
ciclo o división celular. De este modo, durante el ciclo
celular un conjunto complejo de procesos citoplasmáti-
cos y nucleares tienen que coordinarse unos con otros.
Dependiendo del tipo de célula, existen dos variantes
en la división celular: la mitosis y la meiosis.
Mitosis. La mitosis es la división celular asociada a las
células somáticas. Las células somáticas representan la
totalidad de las células del organismo excepto las célu-
las germinales o sexuales y las células embrionarias, que
1
La molécula de ADN (ácido desoxirribonucleico) tiene la estructura de una escalera formada
por azúcares, fosfatos y cuatro bases nucleotídicas llamadas adenina (A), timina (T), citosina (C) y
guanina (G). El código genético queda determinado por el orden de estas bases, y cada gen tiene
una secuencia única de pares de bases. Los científicos utilizan estas secuencias para localizar la
posición de los genes en los cromosomas y elaborar el mapa del genoma humano. En casi todos
los organismos celulares el ADN está organizado en forma de cromosomas, situados en el núcleo
de la célula.
2
son el origen de los gametos. Por lo tanto, se encuentran
en los huesos, la piel, los tejidos, los órganos y la sangre.
Se componen de 23 pares de cromosomas2. Las células
somáticas pueden mutar sin transmitir sus modificacio-
nes a los futuros descendientes. Las células somáticas
que mutan pueden, sin embargo, ser la causa de dife-
rentes tipos de cáncer.
La mitosis, entonces, es el proceso de división o repro-
ducción nuclear de cualquier célula que no sea germinal.
Meiosis. Se debe recordar que los organismos superio-
res que se reproducen de forma sexual se forman a partir
de la unión de dos células germinales o sexuales espe-
ciales denominadas gametos. Cada célula germinal es
diferente genéticamente por la recombinación genética
que se da durante la meiosis.
Las células germinales son las responsables de la forma-
ción de las células reproductoras o gametos, los esper-
2
Dentro del núcleo, una de las estructuras más importantes son los cromosomas, formados por el
ADN y las proteínas presentes en el núcleo. Los cromosomas son semejantes a dos brazos, unidos
por el centrómero, donde se ordena el ADN.
matozoides en los hombres y los óvulos en las mujeres.
Las células germinales contienen toda la información
genética de un individuo y la transmiten al embrión, in-
cluyendo eventuales mutaciones genéticas.
Estas células están situadas en las gónadas de los apa-
ratos reproductores femenino y masculino. Los gametos
contienen la mitad de la información genética de un in-
dividuo, es decir 23 cromosomas, por lo que se dicen
que son células haploides. Estas células necesitan unirse
al gameto complementario, que ocurre en el proceso de
fecundación, para completar así la información para dar
lugar a un individuo humano completo.
Los gametos se originan mediante meiosis, proceso ex-
clusivo de división de las células germinales o también lla-
madas células sexuales. La meiosis es un mecanismo de
división celular que, a partir de una célula diploide (2n),
permite la obtención de cuatro células haploides (n) con
diferentes combinaciones de genes. La meiosis consta de
dos divisiones sucesivas de la célula con una única réplica
del ADN. El producto final son cuatro células con n cro-
mosomas.
En la meiosis, a diferencia de la mitosis, sólo se trans-
mite a cada célula nueva un cromosoma de cada una
de las parejas de la célula original. Por esta razón, cada
gameto contiene la mitad del número de cromosomas
que tienen el resto de las células del cuerpo, es decir, 23
cromosomas.
Cuando en la fecundación se unen dos gametos, la célu-
la resultante, llamada cigoto, contiene toda la dotación
doble de cromosomas. Es decir, 46 cromosomas. La mi-
tad de estos cromosomas proceden de un progenitor y la
otra mitad del otro. La meiosis, entonces, consiste en dos
divisiones sucesivas de una célula diploide acompañadas
por una sola división de sus cromosomas (Figura 2).
3
 Tabla 1. Diferencias entre la mitosis y la meiosis

Mitosis Meiosis 2n 2n

A nivel genético

Reparto exacto del material Segregación al azar de los cro- 2n 2n

genético mosomas homólogos y entre-
cruzamiento como fuente de
variabilidad genética.

Meiosis I
Mitosis
A nivel celular
1n 1n
Como consecuencia de lo an- Produce una reducción del jue-
Meiosis II
terior se forman células genéti- go de cromosomas a la mitad
camente iguales. exacta de los cromosomas ho-
mólogos.
2n 2n 1n 1n 1n 1n

A nivel orgánico

Se da este tipo de división en Sirve para la formación de las Figura 2. Procesos de división del núcleo en células
los organismos unicelulares células reproductoras sexuales. somáticas (mitosis) y células germinales o sexuales
para su reproducción asexual y (meiosis).
en pluricelulares para su desa-
rrollo, crecimiento y la repara-
ción y regeneración de tejidos
y órganos.

4
2 ¿Qué es genotoxicidad?
Genotoxicidad es la capacidad relativa que tiene un
agente físico, químico o biológico de ocasionar un daño
A objeto de sistematizar e interpretar estos fenómenos,
se desarrolló la Genética Toxicológica, que se constituye
en el material genético, originando efectos biológicos como una de las ramas de las ciencias biológicas encar-
adversos en los seres vivos. gada de evaluar el daño causado en el ADN (Figura 3)
por distintos tipos de exposición a potenciales agentes
De acuerdo a su modo de acción o efectos que puede
genotóxicos y que se evalúa a partir del monitoreo am-
ocasionar se clasifican en mutágenos3, carcinógenos4 y
biental y humano.
teratógenos5 , dando lugar a los procesos de mutagéne-
sis, carcinogénesis y teratogénesis respectivamente. Los primeros estudios llevados a cabo por Ames7, en
bacterias que presentaban mutaciones en genes espe-
El daño en el material genético se da en el ADN y en to-
cíficos y el desarrollo de la fracción S98 para activación
dos aquellos componentes celulares que se encuentran
relacionados con la funcionalidad y comportamiento de 7
La prueba de Ames se utiliza en la evaluación de mutagenicidad de muestras problema (agua,
aire, lixiviados de residuos sólidos, extractos acuosos, etc.). Es considerada parte esencial de las
los cromosomas dentro de la célula, como son las pro- pruebas toxicológicas para la detección y localización de fuentes que generen un daño potencial
por la presencia de compuestos genotóxicos.
teínas y el ARN6. 8
Fracción sobrenadante obtenido del hígado de rata a partir de un homogeneizado por centrifu-
gación a 9000 g durante 20 minutos en un medio adecuado; esta fracción contiene citosol y micro-
3
Agente químico, físico o biológico capaz de causar daño al ADN somas. Las ratas utilizadas son de las líneas Sprague-Dawley y Wistar. La fracción S9 se utiliza en
4
Agente químico, físico o biológico qué actúa sobre los tejidos vivos, causando cáncer. conjunción con la prueba de Ames para evaluar el potencial mutagénico de compuestos químicos
5
Agente o sustancia que actúa sobre el embrión en desarrollo causando alteraciones morfo-fisiológicas. debido a que permite predecir el posible comportamiento del compuesto a evaluar en su paso por
6
Ácido ribonucleico, es la molécula que dirige la síntesis de proteínas a partir de la información la vía hepática.
contenida en el ADN.

5
metabólica, permitió demostrar, en experimentos con
animales de laboratorio, que entre el 60 y el 90% de las
sustancias carcinogénicas fueron mutagénicas.
En la década de los 80’s se confirma la función de las mu-
taciones en el desarrollo del cáncer con el descubrimien-
to de los oncogenes por activación de protooncogenes.
Ahora se sabe que además de las sustancias denomi-
nadas carcinógenos genotóxicos, existen también otros
carcinógenos no genotóxicos o epigenéticos que actúan
por otros mecanismos.

Copia mutada

Adenina

Timina
Citosina

Guanina

Cadena
azúcar - fosfato

Figura 3. Esquema del proceso de mutación en la

cadena del ADN.

6
El descubrimiento de la relación entre mutagénesis y el
desarrollo de tumores permitió establecer la necesidad
de evaluar el riesgo de carcinogenicidad por exposición
a sustancias químicas mediante la evaluación de muta-
genicidad.
Por tanto, las pruebas para la detección de mutágenos
adquirieron su importancia debido a que estos com-
puestos tienen la capacidad de alterar el material ge-
nético en los organismos y producir: malformaciones en
el embrión o feto, mutaciones en las células germinales
reduciendo la fertilidad, enfermedades cardíacas, arte-
rioesclerosis, influir en los procesos de envejecimiento y
provocar mutaciones que pueden generar cáncer (Majer
et al., 2005).
Según Fiskesjo (1985), los organismos biológicos tienen
la capacidad de detectar cambios en la calidad del agua
y expresar las alteraciones más sutiles que operan duran-
te cierto tiempo en un ecosistema mediante respuestas
individuales o de conjunto. En este sentido, los ensayos
o test biológicos se están transformando en herramien-
tas valiosas para la evaluación del impacto ambiental ge-
nerado por los compuestos mutágenos.
7
 Mitocondria Citoesqueleto
Núcleo
Retículo
Ribosomas endoplasmático

Centriolo

Membrana
plasmática

Citoplasma

Peroxisoma

Aparato de Golgi Nucleólo

Figura 4. Célula eucariota animal

8
 Citoesqueleto
Aparato de Golgi
Reticulo
Endoplasmático

Cloroplasto
Núcleo
Nucleolo
Mitocondria

Ribosomas
Vacuola

Citoplasma

Membrana
Plasmática

Pared celular

Figura 5. Célula eucariota vegetal

9
 Telofase

Anafase

Metafase
Interfase

Profase

Células de raiz de cebollin en diferentes estadios de división

3 ¿Cómo se evalúa genotoxicidad en
cuerpos de agua?
Los ensayos de genotoxicidad están diseñados para de-
tectar compuestos que inducen directa o indirectamente
a daños genéticos por diferentes mecanismos. General-
mente, se considera que este daño produce efectos he-
redables y provocan la formación de tumores.
Actualmente, se dispone de pruebas con las que se
puede determinar un daño genético y así detectar com-
puestos genotóxicos. Muchas de estas pruebas son
bioquímicas, in vivo o in vitro, con micro o macro orga-
nismos. Mediante estos ensayos se pueden determinar
daños microscópicos o moleculares, o bien la formación
de aductos, es decir, complejos que se forman cuando
un compuesto químico se une a una molécula biológica,
como el ADN o a ciertas proteínas.
Para detectar con exactitud o predecir confiablemente
los efectos genotóxicos de una sustancia en el ser hu-
mano no es suficiente una sola prueba, sino que se debe
disponer de por lo menos dos o más alternativas.
La correlación entre mutagenicidad y carcinogenicidad
es cada día más evidente. Se ha demostrado que 157
de los 175 carcinógenos conocidos también son mutá-
genos. De ahí la conveniencia de saber con precisión
el posible daño que un compuesto puede tener sobre
nuestro organismo o sobre otros seres vivos.
El monitoreo de los contaminantes por análisis directo
requiere conocer el agente químico a verificar, y su eva-
luación está limitada por la sensibilidad y especificidad
del método utilizado
11
 Ante esto, los bioensayos ofrecen ventajas considera-
bles debido a que un organismo puede metabolizar un
compuesto cualquiera y convertirlo en otro que puede
ser aún más tóxico que el original.
Actualmente, a nivel mundial, las agencias reguladoras
de medio ambiente exigen una batería o conjunto es-
tándar de estudios de genotoxicidad antes de dar au-
torización para liberar productos de consumo humano,
entre ellos el agua potable debido a que el proceso de
potabilización requiere de cloro, el mismo que ha mos-
trado ser mutagénico en diferentes ensayos.
La batería estándar para determinar genotoxicidad inclu-
ye el llamado test de Ames, que es un ensayo biológico
rápido utilizado para determinar el potencial mutagénico
y cancerígeno de compuestos químicos9. El procedimien-
to se describe en una serie de documentos de principios
de 1970, escritos por Bruce Ames y su grupo de investi-
gación de la Universidad de California, Berkeley. En este
9
Las pruebas estándar para la carcinogenicidad hechas sobre roedores toman años para comple-
tarse y son caras de realizar.
12
sentido, el test de Ames es utilizado mundialmente como
un ensayo inicial para discriminar nuevos químicos y fár-
macos por su potencial mutagénico.
En varios estudios, las aguas contaminadas han mostra-
do que pueden inducir daño genético en mamíferos y
organismos acuáticos (Minissi y Lombardi, 1997). El efec-
to mutagénico de estas aguas y sus sedimentos puede
ser evaluado bajo condiciones de laboratorio usando
sistemas biológicos como bacterias, levaduras, plantas y
peces (Minissi et al., 1996).
El protocolo mejorado para micronúcleos en raíces de
Vicia y Allium (raíces de habas y cebollas) fue establecido
como un ensayo estándar internacional por el Interna-
tional Program on Plant Bioassays bajo el auspicio del
Programa Ambiental de las Naciones Unidas (Ji et al.,
1999; Majer et al., 1999)
Entre los diferentes ensayos citogenéticos en plantas,
el test de micronúcleos (MCN) en raíces de Vicia faba
(haba) es el más sensible para agentes aneugénicos y
clastogénicos, además de ser simple, barato y requerir
condiciones mínimas de laboratorio (Minassi y Lombardi,
1997). En China el test de MCN en Vicia faba (haba) es
un método estándar en monitoreo ambiental (Kong et
al., 1998).
Figura 6. Plantines de purpurina (Tradescantia
paludosa)
Sin embargo, en este tipo de ensayos con MCN también
puede utilizarse raíces de Tradescantia paludosa (purpu-
rina o amor de hombre) y Allium cepa (cebolla) debido
a que resultaron ser bioindicadores altamente sensibles,
fáciles de aplicar en diferentes situaciones empleando
procedimientos y protocolos sencillos y de bajo costo.
Figura 7. Cebollines (Allium cepa)
13
Figura 8. Cebollines en proceso de ensayo
4 Protocolo de evaluación
Los micronúcleos son fragmentos de cromosomas o cro-
mosomas completos que, espontáneamente o por cau-
mico que no posea centrómero o el cromosoma des-
orientado no podrá integrarse a un núcleo por carecer
sa de agentes que rompen cromosomas o que alteran del elemento indispensable para orientarse en el huso
el huso10 de división, quedan fuera del núcleo durante acromático.
la mitosis11. Entre estos agentes están las radiaciones,
Luego, en la telofase, los cromosomas normales, así
sustancias químicas, plaguicidas, fármacos y otros conta-
como los fragmentos que posean centrómeros, dan ori-
minantes ambientales.
gen a los núcleos de las células hijas. Sin embargo, los
Los micronúcleos son conocidos, en el campo de la he- elementos rezagados, que pueden ser fragmentos o cro-
matología, como cuerpos de Howell-Jolly. Su forma es mosomas completos, quedan incluidos en el citoplasma
generalmente redonda u ovalada, con un diámetro que de las células hijas y una proporción de ellos se transfor-
varía desde 0,4 a 1,6 micras. Su formación ocurre en la ma en uno o varios núcleos secundarios. Tales núcleos
anafase de la mitosis12 donde el fragmento cromosó- son mucho más pequeños que el núcleo principal, de
10
Durante la división celular se forma una estructura especial para desplazar a los cromosomas
ahí su nombre de micronúcleos (Figura 9, Figura 10). Si
que recibe el nombre de huso acromático. Después de la división, el huso se desmonta porque el compuesto estudiado es un clastógeno, se formarán
no es necesario.
11
La mitosis es la división de la célula en la que, previa duplicación del material genético, cada micronúcleos pequeños, pero si es un aneuploidógeno,
célula hija recibe una dotación completa de cromosomas.
12
Durante la anafase, los centrómeros se dividen, lo que permite que cada una de las cromátidas lo que se observará será la formación de micronúcleos
idénticas que formaban el par se separen (cromosomas hijos) y se dirijan a los dos polos de la
célula arrastradas por los microtúbulos del huso mitótico. grandes (Terradaset. al. 2010).

15

Figura 9. Formación de núcleos y micronúcleos a partir
de una célula madre
Los micronúcleos son núcleos citoplasmáticos redondos
y de tamaños variables con las mismas características his-
toquímicas que el núcleo principal, pero están envueltos
dentro de un pedazo separado de membrana nuclear.
Para la realización de esta prueba es indispensable utili-
zar un tejido en constante división, pero debe conside-
rarse que en las células con poco citoplasma los micro-
núcleos no son fácilmente distinguibles de los lóbulos o
proyecciones del núcleo normal.
La prueba se realiza en diferentes tipos celulares como:
16
eritrocitos policromáticos de la médula ósea, cultivos
de linfocitos de sangre periférica, células de la mucosa
bucal, hepatocitos de rata, eritrocitos en peces y aves.
Como se indicó antes, en células vegetales, las más utili-
zadas son las células meióticas de la purpurina ó amor de
hombre y las células meristemáticas de cebolla y haba.
Como ventajas de la técnica de micronúcleos están:
- La posibilidad de probar un sólo agente o
sustancia química sin otros compuestos,
- La posibilidad de probar mezclas o
muestras complejas en su composición,
- La abundancia de células analizables en
diferentes periodos del ciclo celular y el
que los micronúcleos formados durante la
división celular persisten al menos durante
la siguiente interfase.
Adicionalmente, la prueba no deja lugar a dudas sobre
el daño producido, pues lo que se observa como micro-
núcleos es claramente una pérdida de ADN.
Entre las principales desventajas están:
- La prueba no detecta agentes que no - Tampoco es útil en poblaciones celulares
producen pérdidas de material genético o que no se dividen.
rezagos anafásicos, y

Figura 10. Formación de micronúcleos en raíces de

habas (Vicia faba) que fueron germinados en aguas
con arsénico.

17
4.1 Reactivos y material
Los reactivos y material requeridos para el ensayo de una
muestra se presentan en las Tablas 2 y 3. Sin embargo,
Tabla 3. Material requerido
Material
Bisturí o gillete
Cantidad
3u
éstos pueden ser utilizados hasta para 10 muestras, con Copas de coctel de 100 mL 24 u*
excepción de los recipientes para la toma de muestras y Cubreobjetos 1 caja 100 u
las copas de coctel. Gradilla para tubos largos 1u
Jarra plástica de 1 L 1u
Tabla 2. Reactivos requeridos para uno a diez ensayos
Lápiz negro con goma 1u
Reactivos Cantidad Marcador indeleble 1 u
Ácido acético 99% 100 mL Masking de 1 pulgada 1u
Microscopio con objetivos 4x a 120x 1u
Solución de ácido clorhídrico 1 N 50 mL
Pinza metálica de punta fina 1u
Etanol 70% 500 mL
Piseta para agua de 500 mL 1u
Solución Etanol: ácido acético (3:1) 100 mL Portaobjetos 1 caja 50 u
H2O hervida de grifo 1 000 mL Probeta de 100 mL 3u
Recipiente plástico de 5 L 1 u*
H2O destilada 1 000 mL
Servilletas de papel o papel filtro rápido 1u
Solución de orceína13 acética 45% 50 mL
Tubos de ensayo de boca ancha 40 u
Vaso de precipitados de 250 mL 7u

Colorante de color rojo violáceo, extraído de líquenes y que tiñe con preferencia núcleos y cro-
13 Viales o frascos de 5 mL con tapa 10 u
mosomas. Contómetro o contador de células 1u
*Material requerido por muestra a ensayar

18
4.2
siguientes precauciones14:
Procedimiento de muestreo
Durante el muestreo de agua se recomienda tomar las
a) Las muestras no deben incluir partículas
grandes, desechos, hojas u otro tipo de
material accidental, salvo cuando se trate
de muestras de sedimentos. Además,
deben ser filtradas para la realización de los
ensayos o determinaciones. Si no hubiera
papel filtro, se puede usar servilletas de
papel.
b) Para minimizar la contaminación de la
muestra, conviene recogerla con la boca
del frasco en la misma dirección de la
corriente (Figura 11).
c) Se debe tomar un volumen suficiente
de muestra, se recomienda entre 2 a 3
14
Litter et al., 2009.
litros para eventuales necesidades de
repeticiones.
d) Se debe realizar todas las determinaciones
posibles de campo, como las mediciones
de pH, temperatura y conductividad. Para
evitar riesgos de contaminación, estas
determinaciones deben realizarse en
alícuotas de muestras separadas de las que
serán enviadas al laboratorio.
e) Se deben limpiar muy bien los frascos
y demás materiales de recolección. Es
importante recordar que en gran parte de
los casos la contaminación de los frascos
no es visible ni siquiera al microscopio.
f) La parte interna de los frascos no debe
ser tocada con la mano ni debe quedar
expuesta al polvo, humo u otras impurezas.
19
 g) Las personas encargadas de la recolección
de muestras deben mantener las manos
limpias y usar guantes.
h) Los frascos deben ser llenados completa-
mente y de manera rápida con la muestra y
luego resguardadas fuera del alcance de la
luz solar.
i) En lo posible, para la preservación en su
traslado al laboratorio (Figura 12), las
muestras deben ser refrigeradas en cajas
de poliestireno de manera inmediata.
Para evitar posible contaminación de las
muestras, no debe añadirse sal al hielo de
refrigeración.
j) Se debe mantener un registro de toda la
información de campo. Para esto se deberá
llenar una ficha de recolección por muestra
o conjunto de muestras de las mismas
características.
k) El muestreo en pequeños cursos de agua
debe hacerse aguas arriba y aguas debajo
de las fuentes de contaminación, con la
inclusión opcional de puntos adicionales
20
para evaluar el grado de contaminación o
asimilación de carga orgánica a lo largo del
tramo en estudio.
l) En el caso de aguas subterráneas, deben
considerarse protocolos específicos para
evitar la alteración de las muestras. Entre
los datos que se deberán registrar están:
- Tiempo de bombeo,
- Profundidades de donde se realizaron las re-
colecciones,
- Profundidad del pozo,
- Profundidad de los niveles estático y dinámico,
- Tipo de bomba,
- Profundidad del ranurado, etc.
Para determinar si existe una relación de dosis – efecto,
la muestra de agua debe evaluarse considerando las si-
guientes proporciones de dilución:
- Sin dilución (100% la muestra),
- Dilución al 50%,
 - Dilución al 25%, Las diluciones pueden realizarse con agua hervida de
- Dilución al 12,55%, y grifo o agua destilada, la misma que deberá utilizarse
también para el control negativo o blanco.
- Dilución al 6,25%.

Figura 11. Toma de muestra para ensayos. Figura 12. Lectura de micronúcleos en microscopios.

21
4.3 Medición de micronúcleos
Para el ensayo con bulbos de Allium cepa (cebollines),
se debe seleccionar el número necesario o suficiente de
bulbos con el mismo tamaño y apariencia. Se recomien-
da bulbos con diámetro de 1 cm. Mínimamente debe-
rá considerarse un número de 140 bulbos, 20 para el
control negativo o blanco (agua de grifo o destilada), 20
para el control positivo (muestra sin dilución) y 20 para
cada una de las diluciones de la muestra (80 bulbos). Los
restantes 20 servirán para reemplazar algún imprevisto.
En cada caso deberán realizarse 2 réplicas de 10 bul-
bos cada una. Si se ve por conveniente, también puede
hacerse 3 réplicas para facilitar luego la aplicación de
análisis estadístico. De usarse cabezas de cebollas más
grandes, tres son suficientes por tratamiento.
Para proceder con los ensayos se deberá seguir la si-
guiente secuencia de acciones:
22
1) Preparación de cebollines: Con un estilete
u cuchillo muy fino, de la zona radicular se
debe quitar o cortar con cuidado todas las
raíces. Se debe evitar lastimar la cofia o
lugar de nacimiento de las raíces. Luego se
debe retirar la cascara externa de la cabeza
del cebollín y finalmente cortar las hojas
dejándolas con unos 5 a 7 cm de longitud
(Figura 13).
2) En vasos de precipitados o en copas
de coctel con agua hervida de grifo o
destilada (2 réplicas por tratamiento), se
debe colocar 10 bulbos, asegurándose
que la zona radicular quede en contacto
con el agua (Figura 14), pero nunca
tocando la base o fondo del vaso porque
se inhibiría el crecimiento radicular. Se
puede insertar y sujetar los 10 tallos con
palitos mondadientes.
 la muestra de agua que se está evaluando
(control negativo, 6,25%, 12,5%, 25%,
50% y 100%, si fuera necesario también
en control positivo) todo por duplicado o
triplicado).

Figura 13. Cebollines preparados para ser

ensayados

3) Dejar reposar en esta agua, a temperatura

ambiente, por 48-72 horas hasta que las
raíces alcancen una longitud de 1 – 1,5 cm.
4) Al segundo o tercer día, según el
crecimiento de las raíces (en invierno estas
suelen crecer más lentamente), sacar el
Figura 14. Bulbos de cebollines en
manojo de cebollines del agua, lavarlos agua hervida de grifo
con agua hervida de grifo y colocarlos en

23
 5) Dejar el ensayo corriendo por 24 o 48
horas. Anotar en el reporte este dato de
tiempo.
6) A las 24 o 48 horas, sacar el manojo de
cebollines de las muestras de agua, lavar
con agua hervida de grifo o destilada y
observar inicialmente las características de
las raíces como color, grosor y forma de la
terminación, Se debe contar y medir las
raíces, reportar los datos en una tabla para
procesarlos.
7) Cortar y colectar las raíces de los 20
cebollines de cada tratamiento en viales
con tapa conteniendo la solución de
etanol: ácido acético 3:1. Se puede utilizar
también botellitas de antibióticos. Se debe
guardarlos por un máximo de 22 horas
para que se fijen y detengan los procesos
metabólicos.
8) A las 22 horas se debe cambiar las raíces
colectadas a otro vial con etanol al 70%
y rotular cada muestra con cuidado. Se
puede colocar dentro del vial, junto con
24
las raíces, un papel cebolla con el nombre
de la muestra, código, fecha, etc. escrito
con lápiz negro. Estas raíces están listas
para evaluar micronúcleos. La muestras así
preparadas se pueden guardar hasta tres
meses en refrigeración.
9) Colocar unas cuantas raíces, pueden
ser 5, en un tubo con solución de ácido
clorhídrico (HCl) 1 N, tapar y dejar en baño
María de 3 a 5 minutos. Si no se cuenta
con baño María, se puede usar un vaso con
agua hervida. Se debe cuidar que el vial no
se abra cuando está en el baño María.
10) Sacar 1 a 2 raíces sobre un portaobjetos,
cortar aproximadamente los 3 mm finales
de la raíz y eliminar el resto.
11) Cortar las raíces con el gillete o bisturí,
de manera transversal en forma de micro
rodajas, lo más finamente posible.
12) Añadir una gota de orceína acética y dejar
10 a 15 minutos. Si se seca, añadir más
orceína acética.
 13) Tapar con un cubreobjetos, presionar fuer- 1 000 células por placa. Esta acción debe
temente y repiquetear con la goma de un realizarse por duplicado.
lápiz.
15) Reportar las células que contengan uno o
14) Observar al microscopio, ubicar campos más micronúcleos (Figura 15).
donde las células estén dispersas, contar

Figura 15. Células binucleadas presentando más de 3

micronúcleos

25
4.4 Datos y cálculos
El recuento de micronúcleos se realiza en microscopio
binocular con el objetivo de 40X. El criterio para análisis
7) No debe estar sobrepuesto a ninguno de
los núcleos,
de micronúcleos de las células debe cumplir con los si- 8) El micronúcleo dudoso será descartado en
guientes requisitos (Fenech 2000; Figura 16): el análisis.

1) Debe tener morfología idéntica a los

núcleos principales,
2) Debe tener una forma redonda u ovalada,
3) Su diámetro debe estar entre 1/16 y 1/3 de
los núcleos principales,
4) Debe tener el mismo color, textura y retrac-
ción que el núcleo principal,
5) No debe presentar refringencias (núcleos o
partes de núcleos brillosos),
6) Debe estar claramente separado del
Figura 16. Célula con núcleo y micronúcleo
núcleo principal, identificado.

26
 9) Cuando la frecuencia de micronúcleos sea
menor de 3/1 000 (0,3%) se deberá evaluar
un máximo de 3 000 células. Esto para dis-
minuir la probabilidad de que la presencia
de los micronúcleos se pudiese deber a un
evento al azar.
La frecuencia de Micronúcleos (MCN %) se calcula como
sigue:
MCN%= Número de células con micronucleos
Número total de celulas contadas
x 100
Para el análisis estadístico se puede hacer uso de Micro-
soft Excel y determinar medias y error estándar en cada
grupo experimental, así como el cálculo de la varianza
de todos los tratamientos. Asimismo, se puede utilizar el
t-test Dunnett, que se aplica para determinar la diferen-
cia significativa entre medias del control y los grupos de
tratamiento (Duan et al, 1999).
Interpretación de
27
4.5 Resultados
Los resultados son considerados positivos cuando se
observa un aumento significativo en la frecuencia de
células con micronúcleos respecto al grupo de control
negativo o blanco. En este entendido, si el número de
micronúcleos (MCN) formados en el agua evaluada es
igual o mayor al doble de los formadas en el ensayo en
blanco, se dirá que el agua tiene riesgos genotóxicos.
MCN muestra ≥ 2MCN blanco => Tiene riesgo genotóxico
Los resultados son considerados negativos cuando no
28
hay un aumento significativo en la presencia de micronú-
cleos. Es decir, si en el agua evaluada el número de mi-
cronúcleos formados es menor al doble de micronúcleos
formados en el grupo de control negativo o blanco, se
dirá que el agua no tiene riesgos genotóxicos.
MCN muestra < 2MCN blanco => No tiene riesgo genotóxico
La Figura 17 muestra parte de los resultados con células
de raíces de haba (Vicia faba) y la Figura 18 resultados
con raíces de cebollines (Allium cepa).
Figura 17. Micronúcleos desarrollados en ensayos con Figura 18. Micronúcleos desarrollados en ensayos con
células de raíces de Vicia faba (haba). células de raíces de Allium cepa (cebolla).

29
5 Glosario
Aneugénicos: Agente capaz de producir en la célula
que uno o más cromosomas completos de un conjunto
normal falten o se presenten más de una vez.
Clastogénicos: Agente que causa rotura de los cromo-
somas y/o consecuentemente, ganancia, pérdida o reor-
denamiento de los fragmentos cromosómicos
Micronúcleos: Fragmentos de cromosomas o cromoso-
mas completos que espontáneamente o por causa de
agentes que rompen cromosomas, como las radiaciones
(agentes que se denominan clastógenos) o que dañan
el huso mitótico, como la vincristina (aneuploidógenos),
quedan fuera del núcleo durante la mitosis.
Mutación: Alteración en la secuencia de ADN. Puede
ser causado por daños producidos por químicos, por
radiación o por errores durante la replicación y la repa-
ración del ADN. Entre sus consecuencias están las enfer-
medades genéticas y el cáncer.
Mutagenicidad: Propiedad de agentes físicos o quími-
cos de inducir cambios en el material genético que se
transmiten durante la división celular.
Mutágenos: Un agente químico, físico o biológico que
altera o cambia la información genética de un organis-
mo y causa un incremento en la frecuencia de mutacio-
nes espontanea. Cuando numerosas mutaciones causan
cáncer, se denominan carcinógenos.
Genotóxico: Tóxico o dañino para el ADN. Las sustan-
cias genotóxicas pueden unirse directamente al ADN
o actuar indirectamente mediante la afectación de las
enzimas involucradas en la replicación del ADN y cau-
sando, en consecuencia, mutaciones que pueden o no
desembocar en un cáncer. Las sustancias genotóxicas no
son necesariamente cancerígenas, pero la mayor parte
de los cancerígenos son genotóxicos.
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