a GENESER H | STO LOGIAPF NN Ge Ne Sobre bases biomoleculares case BY, ara FLAS, FEL. > Tercera edicioén a Dp tare FECHA. (AM - AZ. adele PROceD Ag Ot go De ae EDITORIAL MEDICA c panamericana 5) BUENOS AIRES - BOGOTA - CARACAS - MADRID - MEXICO - SAO PAULO e-mail: info@medicapanamericana.com.ar www.medicapanamericana.comIndice 1 Introduccién {Qué es la histologia? Qué es una célula? Forma y tamajio de las células Caracteristicas fisiolégicas de las células Componentes quimicos de las células WNP. ib 2 Métodos histolégicos Analisis micrascépico Microscopio 6ptico Microscopio de campo oscuro Microscopio de contraste de fase Microscopio de interferencia Microscopio de luz polarizada Microscopio de fluorescencia Microscopio de barrido confocal Microscopio de luz ultravioleta Microscopio electr6énico Microscopio electrénico de barrido Microscopio de ttinel de barrido Difraccién de rayos X Métodos de observacién directa de células y tejidos vivos Cultivo de tejidos Manipulacién experimental de células vivas Métodos de fraccionamiento celular Preparacién e investigacién de tejidos muertos Preparacién de tejidos para microscopia 6ptica Preparacion de tejidos para microscopia electrénica Métodos histoquimicos Acidofilia y basofilia Metacromasia Métodos basados en la reaccién de Schiff para grupos aldehido Determinacién histoquimica de lipidos Determinacién histoquimica de enzimas ; Métodos inmunohistoquimicos Histoquimica con lectinas Hibridacién in situ Radioautografia Problenias en la interpretacién de cortes de tejido 19 19 20 21 21 22 22 22 23 24 25 26 26 26 27 29 31 32 32 35 38 39 40 40 41 42 42 45 45 46 47 3 Citoplasma 51 Organelas citoplasmaticas 52: _Membrana celular (plasmalema) 52 Reticulo endoplasmatico granular (rugoso) 60 Reticulo endoplasmatico agra- nular (liso) 68 Aparato de Golgi 69 Lisosomas y endocitosis 75 Peroxisomas 81 Proteasomas 83 Mitocondrias 83 Laminillas anulares 88 Centrosoma y centriolos 86 Citoesqueleto 90 Filamentos de actina 91 Microttibulos 94 Filamentos intermedios 98 Inclusiones citoplasmaticas 99 Depésitos de nutrientes 99 Pigmentos 100 4 Niicleo celular 103 Morfologia general del nticleo 103 Organelas nucleares 104 Nucleolema 104 Cromatina 105 Nucléolo 113 Ciclo vital celular - 116 Ciclo celular 119 Regulaci6én del ciclo celular 120 Replicacién de cromosomas 125 Divisién celular 128 Mitosis 129 Meiosis 133 Cromosomas humanos 138 Anomalias cromosémicas 143 Cromosomas sexuales y croma- tina sexual 146 5 De células a tejido 149 Histogénesis 149 Diferenciacion celular 151 6 Epitelio 157 Clasificacién de epitelios 157 Epitélio plano simple 158 Epitelio ciibico simple 158 Epitelio cilfndrico simple 158 Epitelio cilindrico seudoestra- tificado 159Epitelio plano estratificado” « 159 Epitelio ctibico estratificado 160 Epitelio cilfndrico estratifi- cado 160 Epitelio de transicién 160 Caracteristicas citolégicas especializadas de los epitelios 160 Especializaciones de la super- ficie lateral - 161 Especializaciones de la super- * ficie basal 169 Especializaciones de la super- ficie libre 170 Renovaci6n y regeneracién de epitelios 175 7 Glandulas y secrecioén 177 Glandulas exocrinas 178 Mecanismos de secrecién 179 Clasificacién de las glandulas exocrinas 179 Caracterfsticas histolégicas de las glandulas exocrinas 182 Regulacién de la secrecién exocrina 183 Glandulas endocrinas 183 Caracteristicas histolégicas de las glandulas endocrinas 185 | Células glandulares endocrinas pro- | ductoras de proteinas y polipéptidos 185 Células glandulares endocrinas secretoras de esteroides 187 Regulacién de la secrecién endocrina 187 Efecto de las moléculas senal sobre las células blanco 189 Efecto de las moléculas sefial por medio de receptores intracelulares 189 Efecto de las moléculas sefial por medio de receptores de superficie celular 192 Terminacién de la respuesta a la senal 195 8 Tejido conectivo 197 Matriz extracelular (MEC) 198 Fibras de colageno 198 Fibras reticulares 201 Fibras eldsticas 202 Matriz amorfa 203 Glucoproteinas adhesivas 205 Biogénesis de los componentes extracelulares 206 Células 207 | Fibroblastos 207 Células reticulares 208 Células mesenquimaticas 208 Adipocitos 209 Monocitos y macréfagos 209 Células dendriticas 212 Linfocitos 214 Células plasmaticas 215 Granulocitos eosinéfilos 215 Granulocitos neutr6filos 216 Mastocitos 217 Inflamacién 219 Tipos de tejido conectivo 222 Tejido conectivo laxo 222 Tejido conectivo denso mee Tejido conectivo mucoide 224 Tejido conectivo reticular 224 Tejido adiposo 224 9 Tejido adiposo 227 Histologia del tejido adiposo 227 Tejido adiposo comun (unilocular) 227 Tejido adiposo marrén (multilocular) 228 Histogénesis del tejido adiposo 229 Histofisiologia del tejido adiposo = - 232 Producci6én de calor en el tejido adiposo marrén 233 10 Sangre 235 Elementos figurados de la sangre 235 Células sanguineas vivas 236 Morfologia de las células san- guineas en extendidos tenidos 236 Ultraestructura de las células sanguineas 239 Funciones de la sangre 242 Eritrocitos 242 Plaquetas 242 Granulocitos neutréfilos 243 Granulocitos bas6filos 243 Granulocitos eosinéfilos 243 Monocitos 243 Linfocitos 243 CICLO VITAL DE LAS CELULAS SANGUINEAS 244 Origen y desarrollo de las células sanguineas 245 Hemopoyesis en el feto 245 Células madre hemopoyéticas 245 Regulacién de la hemopoyesis 249 Ciclo vital de los eritrocitos 250 Reticulocitos 251 Ciclo vital de los granulocitos 252 Ciclo vital de los monocitos 254 Ciclo vital de los linfocitos 254 Ciclo vital de los trombocitos 254 11 Médula 6sea 257 Aspecto macroscépico de la médula 6sea 257 Caracterfsticas histolégicas de la médula 6sea 257 feN@ DT avemer C E 12 Tejido esquelético 263 CARTILAGO 263 Cartilago hialino 263 Histogénesis 263 _ Condrocitos 264 Matriz cartilaginosa 265 Cartilago elastico 266 Cartilago fibroso - 266 Variaciones etarias del cartilago = 267 Regeneracién de cartilago 267 Histofisiologia 267 TEJIDO OSEO 268 Organizacién macrosc6pica del tejido 6seo 268 Caracteristicas histolégicas del tejido 6seo 269 Matriz 6sea 271 Sustancia fundamental 27 Coldgeno 271 Sales minerales 272 Células éseas 273 Células osteoprogenitoras 273 Osteoblastos 274 Osteocitos 275 Células de recubrimiento 6seo (osteocitos de superficie) 275 Osteoclastos 275 Histogénesis 278 Osificacién intramembranosa 278 Osificacién endocondral 280 Desarrollo de los huesos cortos 285 Modelacién de los huesos 285 Irrigacién e inervacién de los huesos 288 Histofisiologia 290 ARTICULACIONES 292 Sinartrosis (articulaciones fibrosas y cartilaginosas) 292 Sindesmosis 292 Sincondrosis 292 Sinostosis 293 _Sinfisis 293 Diartrosis (articulaciones sinoviales) 294 Cartilago articular 294 C4psula articular fibrosa 295 Membrana sinovial 295 Liquido sinovial 296 13 Tejido muscular 299 Misculo liso 300 Caracteristicas del musculo liso con el microscopio 6ptico 300 Ultraestructura de la muscu- latura lisa 301 Inervacién de la musculatura lisa 304 Histogénesis de la musculatura lisa 305 Miusculo esquelético Caracteristicas del mtisculo estriado con el microscopio 6ptico Ultraestructura de la muscu- latura esquelética Contacto neuromuscular Fibras musculares rojas, inter- medias y blancas Histogénesis Crecimiento y regeneracion Miasculo cardiaco Caracteristicas del muisculo cardfaco con el microscopio 6ptico Ultraestructura de la muscula- tura cardiaca Histogénesis Crecimiento y regeneraci6n 305 306 309 318 319° 321 321 321 322 322 325 325 14 Tejido nervioso Neuronas Niicleo Pericarion Prolongaciones de la neurona (dendritas y axén) Tipos de neuronas y distribucién Terminales ax6nicas y sinapsis Neuroglia o glia Células de la neuroglia Epéndimo Revestimiento de las fibras nerviosas Fibras nerviosas periféricas amielinicas Fibras nerviosas periféricas mielinicas Fibras nerviosas centrales mielinicas Sustancia gris y sustancia blanca Nervios periféricos Ganglios El sistema nervioso aut6énomo Neurotransmisores en el sistema nervioso aut6nomoa Terminales nerviosas periféricas Terminales nerviosas eferentes (motoras) Terminales nerviosas aferentes (sensitivas) Meninges, vasos sanguineos y cavidades del sistema nervioso central Duramadre Aracnoides Piamadre Ventriculos cerebrales y plexos coroideos Barrera hematoencefélica Histogénesis del sistema nervioso Degeneracién y regeneraci6n de neuronas 327 328 329 329 332 334 336 344 345 348 348 349 353 354 354 356 357° 359 360 360 360 365 365 365 366 367 368 369 373 XI15 Aparato circulatorio 377 Estructura de los vasos sanguineos 377 Arterias 378 Arterias eldsticas 379 Arterias musculares 379 Sistema microvascular 381 Arteriolas 381 Capilares 381 Vénulas 384 Endotelio e intercambio de sustancias 385 Venas 388 Venas pequefias y medianas 388 Grandes venas 389 Valvas venosas 389 rganos y estructuras vasculares especiales 390 Sistemas de vasos porta 390 Anastomosis arteriovenosa 390 Glomo carotideo y glomo adrtico 390 Corazén 391 Endocardio 392 Miocardio 392 Epicardio 392 Estructuras de tejido conectivo en el corazén 393 Sistema de conduccidén de la excitaci6n cardiaca 394 Irrigacién sanguinea, vasos linfa- ticos y nervios del corazén 395 Sistema de vias linfaticas 395 Estructura de las vias linfaticas 396 Histogénesis del aparato circula- torio 397 16 Sistema inmunolégico, y tejidos y 6rganos linfoides 401 SISTEMA INMUNOLOGICO 401 Inmunidad 402 Tipos de linfocitos 405 Vigilancia inmunoldgica y recirculacién de linfocitos 411 Respuestas inmunoldgicas primaria y secundaria 413 TIMO 421 Caracteristicas histolégicas del timo i 421 Irrigaci6én e inervacién 423 Histogénesis 424 Involuci6n 425 Histofisiologia 425 GANGLIOS LINFATICOS 427 Caracteristicas histolégicas de los ganglios linfaticos 427 Senos linfaticos 431 Irrigaci6n sanguinea 431 AIT Histofisiologia 432 Filtraci6n y fagocitosis 432 Funciones inmunoldgicas 432 BAZO 434 Caracteristicas histolégicas del bazo 435 Circulacién del bazo 436 Pulpa blanca 436 Pulpa roja 438 Circulacién intermedia del bazo 438 Histogénesis 439 Histofisiologia 440 Funcion filtrante 440 Funciones inmunolégicas 440 TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO A MUCOSAS (MALT) 441 TEJIDO LINFOIDE ASOCIADO CON LA PIEL (SALT) 442 17 Piel 445 Epidermis 445 Queratinocitos 447 Melanocitos 451 Células de Langerhans y linfo- citos 453 Células de Merkel 455 Dermis 455 Pelo 455 Crecimiento del pelo 457 Unas 458 Glandulas cutaneas 460 Glandulas sebaceas 460 Glandulas sudoriparas apocrinas 461 Glandulas sudoriparas ecrinas 461 Irrigacién sanguinea 463 Vias linfaticas 463 Nervios 464 Histogénesis 464 18 Aparato digestivo 465 Estructura general del tracto digestivo 466 BOCA 466 Cavidad oral 466 Labios y mejillas 466 Encias 467 Paladar 467 Lengua 468 Glandulas salivales 472 Caracteristicas histolégicas de las glandulas salivales 473 Grandes glandulas salivales pares 475 Dientes 475 Histogénesis y caracteristicas histolégicas de los dientes 477 Faringe 482 igdalas 483 Amigdalas palatinas 483 i MD i @ FFAmigdala lingual Amigdala faringea Funcion TRACTO ESOFAGOGASTRO- INTESTINAL Eséfago Caracteristicas histolégicas Histofisiologia Est6mago Tiinica mucosa Tuinica submucosa, ttinica muscular y tunica serosa Sistema enteroendocrino Intestino delgado Tuinica mucosa Tunica submucosa Intestino grueso Apéndice vermiforme j Irrigacién sanguinea, vias linfa- ticas e inervacién del tracto esofagogastrointestinal Irrigaci6n sanguinea Vias linfaticas Nervios GLANDULAS DIGESTIVAS ANEXAS Pancreas Pancreas exocrino Pancreas endocrino Regeneracién Higado Caracteristicas histolégicas del higado Vias biliares Vesicula biliar Regeneracién Funciones del higado 19 Aparato respiratorio Fosas nasales y senos paranasales Region respiratoria Region olfatoria Senos paranasales Nasofaringe Laringe Caracteristicas histolégicas de la laringe Traquea Caracterfsticas histolégicas de la traquea Bronquios principales Pulmones Arbol bronquial Regi6én respiratoria Caracteristicas histolégicas de la pared alveolar Pleura 20 Aparato urinario Rifiones Nefrén 484 484 485 485 486 486 486 488 489 496 496 498 499 504 505 507 508 508 508 509 510 510 Bell 511 517 518 518 524 526 528 529 535 535 535 536 537 537 538 538 539 539 541 542 543 546 547 552 555 555 556 Tubos colectores 570 Aparato yuxtaglomerular 572 Tejido intersticial ane Irrigacién sanguinea 573 Vias linfaticas 575 Inervacién 575 Vias urinarias 575 Caracteristicas histolégicas de las vias urinarias excretoras 575 Uretra 577 21 Sistema endocrino 581 Hip6fisis 581 Histogénesis 582 Pars distalis 583 Pars intermedia 586 Pars tuberalis 587 Irrigaci6n sanguinea de la hip6fisis 587 Neurohipofisis 588 Glandula pineal 590 Caracteristicas histoldgicas de la glandula pineal 590 Inervacién 592 Histofisiologia 593 Glandula tiroides 595 Caracteristicas histolégicas de la glandula tiroides 596 Glandulas paratiroides 600 Caracteristicas histolégicas de las glandulas paratiroides 600 Glandulas suprarrenales 602 Caracteristicas histol6gicas de la corteza suprarrenal 602 Caracteristicas histolégicas de la médula suprarrenal 606 Irrigacién sanguinea 609 Inervacién 609 Histogénesis 609 Sistema neuroendocrino difuso 609 22 Organos de la reproducci6n . 613 ORGANOS REPRODUCTORES FEMENINOS 614 Ovarios 615 Foliculos ovdricos 615 Ovulacién 623 Atresia 623 Formacién del cuerpo hiteo 625 Células intersticiales y células del hilio 626 Trompas uterinas 627 Utero 629 Endometrio 630 Modificaciones ciclicas del endometrio 632 Miometrio 634 Perimetrio 635 Vagina 635 Organos sexuales externos femeninos 637 ALTORGANOS REPRODUCTORES MASCULINOS Testiculos Tubulos seminiferos Duracién de la espermatogénesis 638 639 640 647 Tejido intersticial 647 Sistema de conductos excretores testiculares 652 Tuibulos rectos y rete testis 652 Conductillos eferentes 652 Conducto del epididimo 653 Conducto deferente 655 Conducto eyaculador 655 Glandulas sexuales masculinas accesorias 656 Vesiculas seminales 656 Préstata 657 Glandulas bulbouretrales 659 Pene 660 Irrigacién sanguinea 662 PLACENTA 663 Desarrollo de la placenta 663 Fertilizacién, escisié6n y forma- cién del blastocisto 663 Implantacién y desarrollo temprano de la placenta 665 Caracteristicas histoldgicas de la placenta 669 Membrana placentaria 671 Circulacién placentaria 672 Funciones de la placenta 672 Metabolismo placentario 672 Intercambio de sustancias en la placenta 672 Produccién hormonal de la placenta 674 23 Glandulas mamarias 679 Histogénesis 679 Papila y aréola mamaria 679 Caracteristicas histologicas AIV 680 24 El ojo Caracteristicas generales del ojo Tunica fibrosa del ojo Cérnea Esclerética Limbo Tunica vascular del ojo Coroides Cuerpo ciliar Tris Tunica interna del ojo Medios 6pticos de difraccién Cristalino Cuerpo vitreo Anexos del ojo Parpados Conjuntiva Aparato lagrimal 25 El oido Caracteristicas generales del ofdo Oido externo Pabellén auricular Conducto auditivo externo Oido medio Cavidad timpdnica Membrana del timpano Huesecillos del oido Antro mastoideo y celdas mastoideas Trompa de Eustaquio Oido interno Laberinto 6seo Laberinto membranoso Laberinto vestibular Laberinto coclear Inervacién del oido interno Irrigacién sanguinea del ofdo interno 687 687 689 689 692 693 696 696 698 701 704 719 719 721 nee 722 724 725 729” 729 730 730 730 730 730 731 731 ion fae 732 732 735 735 740 foe 752 Referencias de ilustraciones reproducidas de otras publicaciones Indice analitico 755 761 hi DL e1 Introducci6én “Cuando se es muy joven y se sabe un poco, las montafias son montafias, el agua es agua y los drboles son drboles. Cuando se ha estudiado y se es leido, las montafias ya no son montanas, el agua ya no es agua y los drboles ya no son drboles. Cuando se es sabio, nuevamente las montafas son montafias, el agua es agua y los drboles son drboles.” {Qué es la histologia? De acuerdo con la traduccién literal, la palabra histologia significa “el estudio del tejido” y se refiere al andlisis de la compo- sicién microscépica y la respectiva funcién del material biolégico. Las primeras inves- tigaciones histolédgicas fueron posibles a partir del afio 1600, cuando se incorporé el recientemente inventado microscopio a los estudios anat6micos. La anatomia, que es el estudio de la forma y la estructura de los organismos vivos, comienza entonces a di- vidirse de manera gradual en anatomia ma- croscépica, que comprende las estructuras observables a simple vista, y anatomia mi- croscépica, que requiere el uso de auxilia- res Opticos. Marcello Malpighi es el fundador de la histologia y su nombre atin esta ligado a va- rias estructuras histolégicas. En 1665, Hoo- ke descubre que el tejido vegetal esta com- puesto por pequefias cémaras, a las que de- nomina células (lat. cella, pequefia habita- cién o cémara), mientras que el mticleo ce- lular o miicleo (lat. original nuculeus, semi- lla de una nuez pequefia, la niicula; gr. kar- yon) recién se descubre poco después de la introduccién de microscopios compuestos mejorados, alrededor del afio 1830. Este adelanto técnico pronto conduce a la gene- ralizacién mas bdsica de la ciencia biolégi- ca, la teoria celular, desarrollada en 1838 por Schleiden para el reino vegetal, y en 1839 por Schwann para el reino animal. Es el reconocimiento de que la célula es el ele- mento fundamental del organismo, al que, en ultima instancia, se deben trasladar to- dos los procesos vitales, y que las plantas y los animales son agrupaciones de estas uni- dades vivas potencialmente independien- tes. En consecuencia, a partir de entonces el estudio de la célula o citologia (gr. kytos, es- pacio hueco o celda) pronto se transformé en una importante rama de la investigaci6n microscépica. Pocos afios después se des- cubrié que las células siempre se forman por divisién de otras células y que el proce- so se origina en el nticleo. Virchow confir- m6 este hallazgo en la famosa teoria omnis cellula e cellula (toda célula se origina de otra célula). Casi en la misma época se arri- Antiguo refran del budismo Zen. bé a la importante conclusién, atin actual, de que s6lo existen 4 tejidos fundamenta- les, es decir tejido epitelial, tejido conecti- vo, tejido muscular y tejido nervioso. De acuerdo con lo expuesto, gradual- mente qued6 claro que la célula es el ele- mento fundamental de los organismos vi- vos. E] tejido se forma por la agrupacién de células con la misma funcién. Los érganos son unidades funcionales mayores, com- puestas por distintos tipos de tejido, por ejemplo, el higado y el bazo. Los sistemas de érganos comprenden varios 6rganos con funciones relacionadas, por ejemplo, el aparato respiratorio, formado por la nariz, la laringe, la trdquea, los bronquios y los pulmones. Por ultimo, los sistemas difusos definen grupos celulares con funciones re- lacionadas, localizadas en varios Organos distintos, por ejemplo, el sistema inmune. Si bien por su etimologia la palabra histolo- gia significa estudio de los tejidos, la asig- natura histologia incluye, ademas, la estruc- tura de las células y de los érganos, es de- cir, el estudio de las células o citologia, el estudio de los tejidos o histologia propia- mente dicha y el estudio de la estructura de los érganos o histologia especializada. Distintos adelantos técnicos han permiti- do un desarrollo casi explosivo de la inves- tigacién histoldégica. En el préximo capitulo se verdn algunos de ellos, por ejemplo, la microscopia electrénica, la radioautografia, el fraccionamiento celular, la inmunohisto- quimica y la reciente tecnologia genética con hibridacién in situ. Aqui sélo se desta- card que su aplicacién ha revolucionado por completo los conocimientos y la com- prensién de la estructura y la funcién mas minuciosas, a nivel molecular. Mientras que se puede considerar que la palabra cito- logia se refiere con preferencia a la estruc- tura celular, las muchas técnicas recientes, y en especial las aplicaciones combinadas, crean una nueva asignatura interdisciplina- ria, la biologia celular, que integran la es- tructura, la bioquimica, la fisiologfa y la ge- nética a nivel celular. En gran parte debido a este reciente de- sarrollo a nivel de investigacién, la histolo- gia ocupa un lugar central en la educacién y la investigaci6n médicas. Al explicar las INTRODUCCION |. 1Plasmalema Citoplasma Nucleolema Nucleo Fig. 1-1. Dibujo esquematico de una célula. interrelaciones entre las células, los tejidos y la estructura y la composicién molecular de los 6rganos, la histologia representa el nexo de union entre la bioquimica, la fisio- logia y la genética, por un lado, y los pro- cesos patolégicos y la clinica, por el otro. 2Qué es una célula? A continuacién se intentarén explicar brevemente las propiedades bioldgicas y es- tructurales generales de las células, antes de analizarlas con mayor detalle en los pré- ximos capitulos. La sustancia viva presente en los vegeta- les y los animales se denomina protoplas- ma (gr. protos, primero; plasma lo forma- do), por lo tanto, la célula es la minima por- cién de protoplasma que posee existencia independiente. Los organismos animales mas simples, los protozoos (gr. zoon, ani- Mitocondrias Cromatina 2 INTRODUCCION mal), estan formados por una tinica célula, pero todos los animales superiores pertene- cen a los organismos multicelulares o meta- zoos (gr. meta, posterior; los metazoos apa- recieron con posterioridad a los protozoos, en la evolucién), que se pueden considerar como un “estado” de células individuales. La sustancia viva de la célula o proto- plasma incluye el nticleo, compuesto por nucleoplasma, y el protoplasma circundan- te o citoplasma (fig. 1-1). Toda la célula es- td rodeada por una membrana muy delgada de protoplasma especializado, la membra- na celular o plasmalema (gr. Jemma, mem- brana), que determina los limites de la célu- la como unidad estructural. Del mismo mo- do, el nucleoplasma se mantiene separado del citoplasma por medio de una membra- na de protoplasma especializado, la mem- brana nuclear o nucleolema. El niicleo y el citoplasma contienen va- rias estructuras identificables con el mi- croscopio 6ptico, denominadas organelas e inclusiones. Se considera a las organelas como los é6rganos internos pequefios de la célula. Son unidades de protoplasma espe- cializado, con funciones celulares especifi- cas. Algunos ejemplos de organelas cito- plasmaticas son las mitocondrias (produc- cién de energia), el ergastoplasma (sintesis de proteinas) y el aparato de Golgi (depdsi- to de sustancias de secrecién), mientras que el nucléolo (cuerpo nuclear) es una or- ganela nuclear (fig. 1-2). Las inclusiones son prescindibles y a menudo componen- tes celulares temporarios, que sintetiza la misma célula o son captados del medio cir- cundante, por ejemplo, depésitos de nu- trientes y pigmentos. El resto del citoplasma, que rodea las organelas y las inclusiones, aparece poco Fig. 1-2. Ejemplos de or- ganelas e inclusiones. a es un fibroblasto (célula de tejido conectivo) y b es una célula secretora pancreatica. (Seguin Gie- se.) Nucléolo Ergastoplasma Gotas de grasa Granulo de secrecian Aparato de Golgi G Ace oT WIL sO 1Células procariotas Si bien los temas tratados en el resto del libro se refieren a células nucleadas o eucariotas (gr. eu, bueno, verdadero; karyon, semilla), cabe destacar que las células anucleadas o procariotas (gr. protos, primero) han desempefiado un papel muy importante en la investiga- cién de la biologfa molecular celular. Las células procariotas incluyen las bacte- rias y cianobacterias (antes denomina- das algas verdeazuladas), que son célu- estructurado con el microscopio 6ptico y se denomina citosol. Forma y tama de las células Los mamiferos estén formados por gran cantidad de distintos tipos celulares, cada uno con funciones especfficas. La espe- cializacién funcional causa las correspon- dientes diferencias de aspecto, que permi- ten identificar los distintos tipos celulares mediante el microscopio, segin se vera mds adelante. Aqui s6lo se presentan las variaciones de forma y de tamafio. Forma. La relacién entre forma y fun- cién se observa con mayor claridad en las células nerviosas, que poseen largas pro- longaciones (en algunos casos, con longi- < las pequefias, mds primitivas, que care- cen de ntcleo celular. El DNA esta com- puesto por una unica molécula circular, sin proteina histona asociada. Se en- cuentra en contacto directo con el resto del protoplasma, que carece de organelas limitadas por membrana, tales como mi- tocondrias o aparato de Golgi. E] nombre procariota se debe a que este tipo celular aparecié antes que las eucariotas en la historia de la evolucién. tud superior a un metro) con las cuales lo- gran hacer contacto con células muy aleja- das, a las que afectan a pesar de la aprecia- ble distancia que las separa. Otro ejemplo son las células musculares, muy alargadas, que cuando se contraen permiten un nota- ble acortamiento longitudinal (fig. 1-3). Sin embargo, la forma de las células no esta condicionada sdlo por su funcién. En un medio liquido, muchas células adoptan una forma redondeada o esférica. Cuando las células se encuentran en masas com- pactas, por ejemplo, en los epitelios o el te- jido adiposo, su forma aparece afectada por la presién ejercida por las células circun- dantes, igual que en las burbujas de jabén. En consecuencia, adoptan la forma polié- drica, es decir, con muchas caras. Algunas células no presentan una forma constante, sino que la modifican con frecuencia, por ejemplo, algunos de los leucocitos. Tamajio. También el tamafio de las dis- tintas células es muy variable (fig. 1-3). El tamafio promedio de la mayoria de las cé- lulas varia entre 10-60 um (1 um = 1/1.000 mm, véanse cuadro 1-1 y fig. 1-4), si bien las mds pequefias (eucariotas) tie- nen un didmetro de 4 um. Algunos grupos animales poseen células de mayor tamano que otros, por ejemplo, los anfibios pre- sentan células grandes, mientras que los mamfferos tienen células relativamente pequefias. No existe relacién entre el ta- mano de un animal y el tamario de las cé- lulas que lo componen. Fig. 1-3. Dibujo esquematico que ilustra la va- riacién de las células en cuanto a forma y ta- manio. Todas las células estan dibujadas con el mismo aumento (x900). La circunferencia exte- rior corresponde al tamafio de un oacito humano maduro. Dentro del circulo se distinguen: a, un espermatozoide; b, un adipocito; ¢, un fibroblas- to; d, un eritrocito; e, un leucocito; f, una célula de musculo liso; g, una neurona; h, una célula de sostén del tejido conectivo. (Segun Windle.) INTRODUCCION 3Caracteristicas fisiol6gicas de las células Las células poseen propiedades funda- mentales, denominadas vitales (lat. vita, vi- da), porque precisamente son expresién de que las células son cosas vivas, no inanima- das. A continuacién se verén algunas gene- ralidades sobre estas propiedades fisioldgi- cas (es decir, funcionales normales) o “ex- presiones vitales”. En un organismo animal pluricelular (se considera que el hombre, por ejemplo, esta compuesto por alrededor de 10 células) la considerable especializa- cién de los distintos tipos celulares implica que no todas estas propiedades estén pre- sentes en la totalidad de las células. Por lo tanto, el elevado nivel de desarrollo de una funcién en un determinado tipo celular a menudo se produce en detrimento de otras propiedades. Absorcién. Representa la capacidad ce- lular de captar sustancias del medio circun- dante. Secreci6n. Ciertas células estén capacita- das para transformar las moléculas absorbi- das en un producto especifico, que luego es eliminado bajo la forma de secrecién. Excrecién. Las células pueden descartar los productos de desecho formados por sus procesos metabdlicos. Respiracién. Las células producen ener- gia mediante la utilizacién del oxfgeno ab- sorbido en la oxidacién de los nutrientes. Esta degradacion de los alimentos, que con- sume oxigeno, se denomina respiracién ce- lular. Irritabilidad. Es la capacidad de la célu- la de reaccionar ante un estimulo, por ejemplo la luz, o una accién mecanica o quimica. Todas las células son irritables, pero esta propiedad esté mas exacerbada en las células nerviosas. Conductividad. Una de las posibles reac- ciones ante un estimulo irritante es la for- macién de una onda excitatoria o impulso, que se extiende desde el punto de irritacién hacia toda la superficie de la célula. La ca- pacidad de transmitir un impulso se deno- mina conductividad. La irritabilidad y la conductividad son las principales propie- dades fisiolégicas de las células nerviosas. Contractilidad. Se designa asf la capa- cidad de la célula de acortarse en una di- reccién determinada, como reaccién ante un estimulo. La contractilidad es una ca- 4 INTRODUCCION cA _ Hipéfisis Vellosidad x10 intestinal x100 ! x1.000 Eritrocito 1 Coes. Longitudes 10.000 de onda AP visibles 100.000 Virus 1.000.000 Soe y lamentosas x10.000.000 rats benceno x100.000.000 promo e racteristica especial de las células muscu- lares. Reproduccién. Las células poseen la ca- pacidad de renovarse por crecimiento y division. El crecimiento celular esta limi- tado por la sintesis de una mayor cantidad Fig. 1-4. Este dibujo es- quematico orienta al lec- tor sobre la relacion de los tamafos en biologia. (Seguin Garven.) Cuadro 1-1.Unidades histolégicas de medicion. Ge aee iT U LO amPiTuLo 1 de sustancia celular, mientras que median- te la divisién celular se generan células nuevas, por particién de las ya existentes. Componentes quimicos de las células En ultima instancia, las propiedades de las células vivas estan limitadas por las ca- racteristicas de las moléculas que las com- ponen. Por lo tanto, como conclusién de este capitulo de introduccién, se analiza- ran brevemente las propiedades quimicas basicas de la célula, para lograr la necesa- ria comprensién de las relaciones bioldégi- cas celulares y moleculares mas complejas, que se verdn mas adelante. Los componentes quimicos de la célula se pueden dividir en inorganicos (agua y sales) y orgdnicos (proteinas, hidratos de carbono, lipidos y dcidos nucleicos). La mayor parte de la célula esta compuesta por agua (70-80%), mientras que casi la to- talidad del resto esta formado por com- puestos orgdnicos (sdlo alrededor del 1% es material inorgdnico). Agua. Como ya se mencion6, la mayor parte de la célula es agua. Es indispensa- ble, dado que casi todas las reacciones qui- micas y, en consecuencia, las actividades celulares, se producen en medio acuosa. Esto se debe a una de las propiedades mas importantes y bdsicas del agua, la capaci- dad para actuar como solvente de sustan- cias con carga y polares, lo cual, a su vez, se relaciona con el pequefio tamario de la molécula de agua y su fuerte polaridad. La polaridad de la molécula de agua per- mite que penetre entre los iones u otras moléculas polares de las sustancias sélidas y se forme una cubierta en la superficie de las demas moléculas o iones, por lo que se produce una fuerte disminucién de la atraccién entre estos Ultimos. De esta ma- nera se separan y se disuelven. La polari- dad de las moléculas de agua contribuye también a que se formen miltiples enlaces de hidrégeno con las moléculas de agua ve- cinas (entre los dtomos de oxigeno, con carga relativamente negativa, y los 4tomos de hidrégeno, relativamente positivos, de las moléculas adyacentes). De este modo, en todo momento, cada molécula de agua forma 3 enlaces de hidrégeno con las molé- culas vecinas de agua en estado liquido, lo que crea un reticulado tridimensional de moléculas de agua, con uniones muy fuer- tes. En consecuencia, las sustancias no po- lares, que carecen de sitios con carga, no se pueden adosar al reticulado de las molécu- las de agua, por lo que no se disuelven. Si, por el contrario, las moléculas que intentan penetrar en el reticulado de moléculas de agua poseen sitos polares o con carga, com- petirdn*en atraccién con las moléculas de agua, por ende, el reticulado se puede abrir y formar un espacio alrededor de la molé- cula polar. Los compuestos con enlaces so- lubles en agua, como por ejemplo las sus- tancias polares, también se denominan hi- dréfilos (gr. hydro, agua; filein, amor), mientras que las sustancias no polares, no solubles en agua, se denominan hidréfobas (gr. fobos, temor). Si gran cantidad de sus- tancias no polares, hidrdéfobas, se colocan en agua, las moléculas presionadas intenta- ran unirse y formar esferas para disminuir la superficie que esta en contacto con el agua. Este fen6dmeno se denomina atrac- cién hidréfoba 0 no polar. Se observa con facilidad si se intenta mezclar, por ejem- plo, aceite con agua por agitacién en una botella. El aceite no es soluble en agua y se agrupa en gotas redondas. Este tipo de mezcla inestable de dos liquidos no misci- bles, también se denomina emulsidn. Si se deja en reposo la botella, después de la agi- tacién, se unen las gotas y muy pronto se separa el agua del aceite, para formar dos capas, la superior de aceite debido a su me- nor densidad. También contribuye con fuerza a las propiedades del agua como sol- vente la capacidad de las moléculas de agua para formar con facilidad enlaces hi- drégeno con otras sustancias. Como se ve- raé mas adelante, estas relaciones entre agua y moléculas polares y no polares tie- nen gran importancia para Ja estructura de las células, en especial para las propieda- des de la membrana. La gran fuerza de atraccién entre las mo- léculas de agua es causal de la gran capaci- dad de acumular calor que tiene el agua, dado que el calor entregado primero debe romper los enlaces hidrégeno, antes de que aumente la temperatura. Este proceso es muy importante para la estabilizacion de la temperatura de las células. La gran tensi6n superficial del agua también se debe a la unién entre las moléculas. Por ultimo, no se debe olvidar que las moléculas de agua intervienen directamente como reactantes en numerosas reacciones enzimaticas. Sales. Los iones de las sales minerales tienen gran importancia en el manteni- miento de la presién osmética dentro de Ja célula. Las concentraciones intracelula- res difieren de las del liquido extracelular. Es especialmente caracteristico que la cé- lula posee una elevada concentracién de K+ y Mg**, mientras que Nat, Cat+ y Cl aparecen sobre todo en el liquido extrace- lular. La mayor concentracién de aniones celulares corresponde al fosfato. Ciertos iones inorgdnicos son cofactores impres- cindibles de procesos enzimaticos, por ejemplo, los iones de calcio. Proteinas. Las proteinas (gr. proteios, de primer orden) tienen importancia fun- damental en la estructura y la funcién de las células y del organismo como unidad. INTRODUCCION 56 Enlaces quimicos y polaridad Se denomina enlace quimico a las fuerzas que mantienen unidos los dto- mos de Jas moléculas. Las uniones electrostaticas (también denominadas enlaces ionégenos) se pro- ducen cuando un ion o un grupo de io- nes son atrafdos por un ion o un grupo de iones con carga opuesta. Se forma un ion cuando un 4tomo libera o capta elec- trones y se forma asi una carga eléctrica. Si el 4tomo libera uno o mas electrones se forma un catidn con carga positiva, por ejemplo Na*, debido al exceso de protones con carga positiva en el nticleo respecto a la cantidad de electrones con carga negativa que rodean el micleo. Por el contrario, si un dtomo capta uno o mas electrones, se forma un anidn con carga negativa, por ejemplo, Cl, en este caso debido al exceso de electrones negativos respecto a los protones positivos. Por ejemplo, en condiciones adecuadas, un ion sodio cede con facilidad un tnico electr6n a un dtomo de cloro, para for- mar los iones Na* y Cl. La carga opuesta de los dos iones produce una atraccion, un enlace electrostdtico o ionégeno, que los mantiene unidos para dar NaCl en es- tado sélido. Las uniones electrostaticas son los enlaces quimicos mas fuertes. Se requieren alrededor de 320 kilojoule (kJ) por mol para romper el enlace entre los iones formados en sustancias sélidas o cristales. Si hay otras moléculas carga- das presentes, éstas son atrafdas por las cargas opuestas y se forma una cubierta protectora alrededor de los iones. La atraccién entre los iones se debilita debi- do a esta cubierta, lo cual facilita la sepa- racién. Este proceso es muy notable en las moléculas de agua, debido a sus pro- piedades polares (véase mas adelante), y s6lo se requieren alrededor de 8 kJ/mol para romper los enlaces electrostdticos cuando los iones estén recubiertos por una capa superficial de moléculas de agua. Esto explica por qué los iones se se- paran con facilidad en un medio acuoso y se disuelven para formar iones libres. Enlaces covalentes. Como se vio antes, al formarse las uniones electrostaticas se ceden y se captan electrones. Para crear los enlaces covalentes, los 4tomos com- parten electrones. El ejemplo més simple lo representa la formacién del hidrégeno molecular, H,, a partir de dos 4tomos del elemento. Si dos dtomos de hidrégeno se acercan lo suficiente, el resultado puede ser que los dos electrones provenientes de los 4tomos de hidrégeno en conjunto completen la érbita electrénica, que pasa INTRODUCCION a rodear ambos dtomos. Cuando ésta Grbi- ta electrénica interna se completa, se es- tabiliza, desde el punto de vista energéti- co, por lo que los d4tomos de hidrégeno quedan unidos, es decir, se produce un enlace covalente. La fuerza de los enlaces covalentes es muy variable, pero, por lo general, son relativamente estables (se re- quieren alrededor de 200-450 kJ/mol pa- ra romper un enlace covalente). Los elec- trones siempre se comparten de a pares en este tipo de enlace. Si se comparte un par de electrones se produce un enlace simple; si se comparten dos electrones, se forma un enlace doble. Un enlace co- valente se indica con dos puntos (H:H) o con un guién entre los simbolos de los dtomos (H-H). Desde el punto de vista bioldgico tiene especial importancia la capacidad del dtomo de carbono de for- mar distintos enlaces covalentes (como tiene 4 electrones no apareados en la 6r- bita electrénica externa, puede comple- tarla hasta alcanzar un nivel de energia estable y formar cuatro enlaces covalen- “tes). En consecuencia, los 4tomos de car- bono se pueden unir en cadenas 0 en es- tructuras ramificadas, que forman la “co lumna vertebral” de infinidad de molé- culas bioldgicas. En estas moléculas sue- len aparecer 4tomos de hidrégeno, oxige- no, nitrégeno y azufre, con gran capaci- dad para formar enlaces covalentes; asf, es tipico un compuesto que presenta dos enlaces con hidrégeno, tres con nitrége- no y dos con azufre. Se produce polaridad cuando los electrones de un enlace covalente no se comparten de modo equivalente entre los dos Gtomos involucrados. Esto impli- ca que, en su movimiento orbital, los pa- res de electrones compartidos son atraf- dos con mayor fuerza por uno de los nu- cleos atémicos y, por lo tanto, permane- cen mas tiempo cerca de éste. Este hecho produce una carga negativa sobre el dto- mo en cuestién, mientras que, en con- traste, el dtomo que debe prescindir de los electrones durante periodos mas pro- longados adquiere una carga ligeramente positiva. En consecuencia, toda la molé- cula compuesta por los 4tomos presenta, de acuerdo con la posicién de éstos, ex- tremos con positividad y negatividad re- lativas. Este tipo de moléculas se deno- minan polares, mientras que las molécu- las sin cargas relativas positiva y negati- va se denominan no polares o apolares. Como se verd mas adelante, la apari- cién de enlaces polares y no polares jue- ga un papel esencial en el contexto bio- 1 CA I FU LaBaAP/TULO légico. Por ejemplo, las importantes pro- piedades del agua se deben a que sus moléculas son muy polares. En todo mo- mento, los electrones compartidos de la molécula de agua se encontrarén mas cerca del nticleo de oxigeno, por lo que éste adquiere una carga relativa negativa y, en contraste, los dtomos de hidrégeno adquieren carga relativa positiva. Dado que, al mismo tiempo, los d4tomos de hi- drégeno son asimétricos respecto del Atomo de oxigeno, es decir, estén locali- zado hacia un lado de este ultimo, la to- talidad de la molécula de agua presenta un extremo positivo y uno negativo. También se observa un desequilibrio en los pares de electrones compartidos en los enlaces covalentes entre d4tomos de hidrégeno y d4tomos de oxigeno, nitrage- no y azufre. Las zonas que rodean una molécula de mayor tamaiio, en la que se encuentran grupos -OH, -NH 0 -SH, con- tribuyen a la aparicién de polaridad. Por el contrario, las zonas con enlaces C-H se caracterizan por ser no polares, debido a que los d4tomos de carbono e hidrégeno comparten equilibradamente los pares de electrones cuando forman enlaces co- valentes. Esto se observa con frecuencia en las largas cadenas hidrocarbonadas de los dcidos grasos. Los grupos carboni- lo (C=O) tienen sdélo una leve polaridad, dado que los electrones del doble enlace covalente entre el carbono y el oxigeno se comparten de modo apenas desigual. Los enlaces de hidrégeno se producen cuando dtomos de hidrégeno con positi- vidad relativa (como consecuencia de compartir electrones en forma no equita- tiva y ser polares en un enlace covalente con oxigeno, nitré6geno o azufre) son atraidos por otros dtomos, con negativi- dad relativa como consecuencia de otra desigualdad al compartir electrones. Es- to se muestra en las f6rmulas de los com- puestos mediante una linea de puntos: H+ | — O- — H+: N- — l Noétese que la formacién de un enlace de hidrégeno no implica intercambio de electrones (como en las uniones elec- trostaticas) ni que se compartan pares de electrones (como en los enlaces co- valentes). Los enlaces de hidrégeno son débiles (se requieren s6lo 8-20 kJ/mol para rom- perlos), pero a menudo se forman mu- chos enlaces de hidrégeno dentro de una tinica molécula o entre moléculas distin- tas y, asi, la fuerza conjunta de los enla- ces de hidrégeno es capaz de estabilizar la estructura tridimensional de compli- cadas moléculas como protefnas y 4ci- dos nucleicos. Los enlaces de hidrégeno se rompen con mayor facilidad que los enlaces covalentes, debido a su fuerza mucho menor, en especial cuando hay aumento de la temperatura. A tan sélo 50-60°C se separan los enlaces hidrégeno de la mayor parte de las moléculas biol6é- gicas, y desaparecen casi por completo a 100°G. La principal causa de la desnatu- ralizacién de las protefnas con el calen- tamiento y la consiguiente pérdida de sus propiedades bioldgicas (p. ej., la inactivaci6n de las enzimas) es precisa- mente la ruptura de los enlaces de hidré- geno, al igual que la desnaturalizacion del DNA (es decir, la separacién de la molécula bicatenaria de DNA en dos he- bras individuales). Las fuerzas de van der Waals pueden ser de atraccién o de repulsién y se de- ben a que se crean desequilibrios transi- torios y aleatorios cuando se comparten los electrones de un enlace covalente (esto es independiente de la distribuci6n equitativa o no del par de electrones en el enlace covalente). En consecuencia, se producen variaciones muy raépidas en sentido positivo o negativo en los ato- mos ubicados en los extremos del enlace covalente y, a continuacién, modifica- ciones opuestas en las cargas de los enla- ces covalentes cercanos. Por lo tanto, se crea una leve atraccién entre los 4tomos, que crece gradualmente en intensidad a medida que se acercan los 4tomos entre s{. La atraccién se transforma en repul- sién cuando la distancia disminuye has- ta producir la superposici6n de las 6rbi- tas electrénicas externas. Esta repulsién entre los atomos es relativamente fuerte. El resultado conjunto de las fuerzas de van der Waals (atraccién y repulsion) se manifiesta en una tendencia a que los dtomos de una molécula, o de moléculas diferentes, adopten posiciones que per- mitan el maximo acercamiento posible, debido a la atraccién, pero, al mismo tiempo, mantengan los requerimientos minimos de espacio para cada atomo in- dividual, como consecuencia de las fuer- zas de repulsién. Si bien la atraccién de van der Waals, con distancia 6ptima entre dos 4tomos, es débil (sdlo se requieren 4 kJ/mol para romperla), de todos modos el efecto con- junto de las fuerzas de van der Waals tie- ne gran importancia, unido a las demas formas de union, para la estabilizacién de la conformacién tridimensional de una molécula. INTRODUCCION 7Forman parte de las moléculas estructura- les celulares y contribuyen a la fuerza de traccién (como fibras de coldgeno) en es- tructuras extracelulares, por ejemplo, del tejido conectivo y los huesos. Algunas proteinas son secretadas como enzimas di- gestivas o anticuerpos, otras actian como sustancias sefal, por ejemplo, como hor- monas. Las proteinas tienen especial im- portancia en el metabolismo celular (gr. metabole, transformacién) compuesto por todas las reacciones quimicas de la célula. Algunas reacciones metab6licas son degra- dativas, por ejemplo, la degradacién de las protefnas, y se denominan catabdlicas (gr. kata, hacia abajo; balein, arrojar). En otras se produce la formacién o sintesis de membranas, por ejemplo, y se denominan anabélicas (gr. ana, hacia arriba). El espe- cial papel que desempefian las protefnas en el metabolismo celular se debe a que casi todas las reacciones quimicas involu- cradas son catalizadas por enzimas (gr. en, en; zyme, fermento o levadura) y a que ca- si todas las enzimas conocidas son protei- nas. Las enzimas pueden aparecer en solu- cion (en el citosol o dentro de las organe- las) o estar localizadas sobre las membra- nas, donde catalizan las reacciones que se producen en la superficie limite entre las membranas y el medio circundante. Las proteinas se presentan como molé- culas de gran tamafio, o macromoléculas, con pesos moleculares entre 6 kd (kilodal- ton; una proteina de peso molecular 6.000 posee una masa de 6.000 dalton, o 6 kd) y muchos millones. Todas las proteinas, de todas las especies, desde las bacterianas hasta el hombre, estén formadas por los mismos 20 aminodcidos diferentes. Las plantas son capaces de sintetizar aminoaci- dos a partir de agua, diéxido de carbono y nitrégeno inorgénico. Por el contrario, los organismos animales no pueden sintetizar todos los aminodcidos a partir de las sus- tancias fundamentales, por lo que necesi- tan ingresarlos a través de la alimentaci6n, como protefnas. Estas son degradadas en el tracto digestivo a aminodcidos libres, que se absorben y llegan a las células de todo el organismo por via hematégena. Entonces son utilizados en la sintesis de distintas proteinas, segtin el tipo celular. Los ami- nodcidos libres de la célula también pue- den provenir de la degradacién de protei- nas celulares. En conjunto, los aminodaci- dos libres forman el denominado pool de aminodcidos, que suministra aminodcidos para la sintesis de nuevas proteinas. Todos los aminodcidos se caracterizan por contener un grupo amino (NH,) y un grupo carboxilo (COOH), por lo que las proteinas poseen nitrégeno (todas las pro- teinas contienen carbono, hidrégeno, oxi- geno y nitrégeno; algunos poseen ademas 8 INTRODUCCION azufre, fésforo y hierro). Cada aminoacido tambén presenta una cadena lateral de- signada R (fig. 1-5), que varia de un ami- nodcido a otro y es especifico para cada uno. Los aminodcidos en solucién a pH neutro se encuentran, sobre todo, como iones dipolares (zwitteriones), es decir, con protones en el grupo amino y el gru- po carboxilo disociado (fig. 1-5). Sin em- bargo, el estado de ionizacién varia con el pH del medio (fig. 1-6). El 4tomo de carbo- no central de las figuras 1-5 y 1-6 también se denomina dtomo de carbono alfa. Los aminodcidos de una proteina estan unidos formando largas cadenas, a través de los denominados enlaces peptidicos que se crean entre el grupo amino y el gru- po carboxilo de dos aminodcidos (fig. 1-7). Si la molécula formada sélo contiene dos aminodcidos, se denomina dipéptido, si contiene 3, tripéptido, y si posee mas de 3, polipéptido. Una proteina se compone de una o mds cadenas polipeptidicas, cada una de las cuales puede contener desde unos pocos aminodcidos hasta miles de es- tos compuestos. Por lo general, una cade- na polipeptidica presenta un grupo amino libre en un extremo, que se designa termi- nal amino o terminal N, y un grupo COOH libre en el otro extremo, denominado ter- minal carboxilo o terminal C. Por conven- cidn se establecié que una cadena polipep- tidica comienza en la terminal amino, por lo que la secuencia de aminoacidos se es- cribe a partir de este punto. Cabe destacar entonces que el tripéptido glicina-alanina- tirosina es diferente del tripéptido tirosi- na-alanina-glicina. Las cadenas polipepti- dicas pueden contener cadenas Jaterales de aminodcidos anidénicas o catiénicas, ya que algunos aminodcidos poseen 2 grupos carboxilo o amino. Dado que el estado de carga de un aminodcido depende del pH del medio, toda la molécula proteica se comportaré como anién o cation, segtin la suma algebraica de las cargas positivas y negativas a determinado pH. Se dice que la proteina es anfétera y el pH en el cual la proteina es neutra, desde el punto de vista eléctrico, se denomina punto isoeléctrico. La secuencia de aminodcidos es especi- fica para cada proteina y esta determina- da genéticamente, dado que depende del Acido desoxirribonucleico (DNA) del ni- cleo celular (véase mas adelante). La se- cuencia de aminodcidos también determi- na la estructura primaria de la proteina y establece la forma tridimensional o con- formacién. Es caracteristico que las pro- tefnas presenten una estructura tridimen- sional o conformacién bien definida, fun- damental para la funcion. Por el contrario, una cadena polipeptidica extendida o dis- puesta en forma aleatoria no posee activi- dad biolédgica. Aunque la secuencia de GA i TUL 1Fig. 1-5. Estructura ge- neral de un aminoacido en su forma no ionizada y como zwitterién. Fig. 1-6. El estado de jonizacién de un ami- noacido depende del pH del medio. Fig. 1-7. Formacién de un enlace peptidico. : waz | H— 6 — 600 | R No ionizado lon dipolar (Zwitterién) NH,* NH, =— — Cc— = A—Cc— a ff | at | 1eO6#, R R pH=1 pH =7 pH=11 H H 6 H H see aia 9 oe ee ‘H,N-C— + a rae == +H,N-C cons +H,O R, Re Me R, R, ri aminodcidos o la estructura primaria esta- blecen la conformaci6n, en algunos casos pueden aparecer diferencias menores en la secuencia sin que se altere la funcién proteica de la protefna. Un ejemplo carac- teristico lo constituye la molécula de in- sulina, cuya secuencia de aminodcidos di- fiere en varios sitios para el ser humano, el buey, el perro y el ratén, pero todas es- tas moléculas igual funcionan como insu- lina. Sin embargo, es muy importante sa- ber en cuales localizaciones exactas se producen las sustituciones. Esto se ilustra en la patologia anemia de células falcifor- mes, donde sélo un aminodcido de una de las cadenas polipeptidicas de la molécula de hemoglobina (el pigmento rojo sangui- neo portador del oxigeno) difiere de la se- cuencia de aminodcidos de la hemoglobi- na normal. Esto causa la forma falciforme de los eritrocitos, lo cual, a su vez, produ- ce la obstruccién de los pequefios vasos. Ademas, se produce anemia (carencia de sangre) como consecuencia de la ruptura de los glébulos rojos anormales. La enfer- medad puede causar la muerte en la in- fancia. La estructura tridimensional o confor- macidn se divide a su vez en estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria. Estas Enlace peptidico se producen debido al plegamiento de la cadena polipeptidica, segin caracteristi- cas determinadas por la secuencia de ami- nodcidos. La estructura secundaria puede pre- sentar forma espiralada, denominada héli- ce alfa o de lamina, designada lamina be- ta (fig. 1-8). Ambas estructuras se produ- cen por la formacién de enlaces de hidr6- geno. En la hélice alfa se estabiliza la forma espiralada por la creacién de enlaces de hidrégeno entre los grupos CO y NH de la cadena principal del polipéptido. Todos los grupos CO y NH estén unidos por puentes de hidrégeno, dado que el grupo CO de un aminodcido se liga al grupo NH del aminodcido ubicado cuatro sitios mas adelante en la secuencia lineal. Se puede considerar a la hélice alfa como una es- tructura en forma de bastén, donde la ca- dena principal espiralada representa la parte central del bastén, mientras que las cadenas laterales se orientan hacia afuera. En las laminas beta se forman enlaces de hidrégeno entre grupos CO y NH que se encuentran en dos sitios diferentes de la misma cadena polipeptidica (que se pliega sobre si misma) o de cadenas poli- peptidicas diferentes. En ambos casos, las INTRODUCCION 9Enlace le hidrégeno Hélice alfa cadenas polipeptidicas involucradas se denominan fibras beta; en conjunto los haces paralelos de fibras, unidos por enla- ces de hidrégeno, forman una estructura laminar de considerable rigidez. Si las fi- bras beta transcurren en la misma direc- cién (considerado desde el terminal N hasta el terminal C), la estructura se deno- mina lamina beta paralela, mientras que se emplea la designacién lamina beta an- tiparalela cuando las dos fibras transcu- rren en direccié6n opuesta (cuando una tinica cadena polipeptidica se pliega so- bre si misma). Es frecuente que en las pro- teinas se encuentren cantidades variables de hélices alfa y de laminas beta, y en la actualidad se ha establecido por conven- cién que, para dibujar las moléculas pro- teicas, se indiquen las zonas de hélice al- fa con espirales o cilindros, las laminas beta como flechas planas con el extremo hacia el terminal G, mientras que, por til- timo, se sefalen las uniones entre las hé- lices alfa y las laminas beta mediante del- gados cordones (fig. 1-9). Se ha demostrado que ciertos motivos (ing. motifs) se repiten en distintas molé- culas proteicas, de los cuales los mas fre- cuentes son los denominados lazada en hebilla (ing. hairpin-loops), beta-alfa-beta y hélice-giro-hélice. A menudo estos mo- tivos tienen la misma funci6n en las dis- tintas proteinas en que aparecen. En casos aislados una proteina se compone exclu- Fig. 1-9. Dibujo esquematico de una molécula proteica de acuerdo con la convencion aho- ra aceptada, donde las hélices alfa se presen- tan como cilindros y las laminas beta como fle- chas planas con la punta orientada hacia la ter- minal C. Los enlaces se dibujan como cordones delgados. 10 INTRODUCCION Enlace de hidrégeno Lamina beta sivamente de hélices alfa o laminas beta. Esto ocurre, por ejemplo, en la proteina alfa queratina, que se encuentra en la epi- dermis, el cabello y las ufias. Del mismo modo, la proteina de la seda fibroina esta compuesta s6lo por laminas beta. Estos dos tipos de protefnas son ejemplos de las denominadas fibroproteinas, que se ca- racterizan por formar largas fibras, en las que predomina un tipo determinado de estructura secundaria. No obstante, la mayoria de las proteinas no son fibroproteinas, y presentan estruc- tura terciaria (fig. 1-10), debido a que la cadena polipeptidica sufre plegamientos y crea una estructura compacta globular Fig. 1-8. Dibujo esque- matico de la estructura secundaria de las pro- teinas, que muestra la formacién de una hélice alfa y una lamina beta mediante enlaces de hi- drdogeno. Terminal N Terminal C CAPITULO 1AP/ITULO Hélice alfa HN 9 I O=G | Hoa - c-o Lamina beta | HN > Estructura Estructura Estructura primaria ae terciaria cuaternaria Fig. 1-10. Dibujo esquematico de una estruc- tura proteica. La estructura primaria esta for- mada por la secuencia de aminoacidos de la cadena polipeptidica, cuyos plegamientos con- ducen a la formacié6n de hélices alfa o laminas beta, es decir, |a estructura secundaria. Ple- gamientos ulteriores crean la estructura tercia- ria globular (esférica). Por ultimo, aparece la estructura cuaternaria cuando varias cadenas polipeptidicas se pliegan en conjunto y se unen entre si para formar una proteina con varias su- bunidades (la proteina presentada contiene 2 cadenas polipeptidicas o subunidades). (redondeada). En consecuencia, estas pro- tefnas se denominan proteinas globulares y presentan sitios caracteristicos, o domi- nios, en los cuales el plegamiento local es especialmente compacto. Los dominios pueden estar compuestos sélo por hélices alfa, laminas beta o incluso por una com- binacién de ambos. Por lo general, sélo se encuentra un tinico dominio en las protei- nas pequefias, mientras que las grandes pueden tener mas de 20. A menudo cada dominio representa una funcién especia- lizada. Muchos tipos distintos de fuerzas de unién contribuyen al plegamiento y el mantenimiento de la estructura globular, entre ellos uniones electrostdticas, enla- ces disulfuro (enlace covalente represen- tado por -S-S-, que se forma entre dos gru- pos SH que provienen de dos aminoaci- dos cistina diferentes), enlaces de hidré- geno y fuerzas de van der Waals. Ademas intervienen atracciones hidréfobas, dado que los aminodcidos con cadenas laterales hidréfobas tienden a alejarse del agua del medio por el plegamiento globular, que les permite “esconderse” en el interior globular de la molécula proteica. Por. ultimo, la estructura cuaternaria (fig. 1-10) se forma debido a que algunas protefnas estan compuestas por varias ca- denas polipeptidicas que se pliegan en con- junto, donde los distintos polipéptidos se unen entre si con los mismos tipos de fuer- zas que unen una tinica cadena polipeptidi- ca en la formacion de la estructura terciaria. Gada cadena polipeptidica se denomina subunidad y toda la protefna se designa proteina multisubunitaria. La conformaci6én determina la funcién de una proteina, dado que acciones que afectan las fuerzas de unién, como por ejemplo, urea (rompe los enlaces de hidré- geno), sales (interfiere en los enlaces elec- trostéticos) o el aumento moderado de la temperatura (rompe todas las uniones dé- biles) alteran la conformacién normal con pérdida simultdénea de las funciones nor- males. Esta modificaci6n se denomina desnaturalizacién y a veces es reversible, ya que la proteina retoma su conformacién normal esponténeamente, una vez inte- rrumpida la accién, y recobra sus funcio- nes. Ante acciones mds poderosas (p. ¢j., el calentamiento fuerte) la desnaturaliza- cién es irreversible (es lo que ocurre con la clara al hervir un huevo). Como se vera mas adelante, tiene especial importancia la transformacién que producen la fosfori- lacién y la acetilacién en la conformacién de las proteinas, con modificacién de la funcién, que permite que la proteina alter- ne entre estados activos e inactivos. Lipidos. Los lipidos (gr. Jipos, grasa) re- presentan un grupo heterogéneo de sus- tancias con la caracteristica comtn fun- damental de ser poco solubles en agua, pero muy solubles en solventes organicos (p. ej., éter, xileno y benceno). Nuevamen- te esto se debe a que los lipidos estan compuestos en su totalidad, o en gran par- te, por grupos no polares (cabe recordar la no polaridad del enlace entre carbono e INTRODUCCION 11o=6 O-c Oc Poe Fee ja eH peat fee ogeeene foe heey oes on le, eee u—G—H et uob_u ey ee ee H—G—H H—b—4H pees doce woabala mEteH ee “HoG—H en lo olor diy Be bey ben n—é=u H—-¢—H teach Hobo uw ye er u—é—H H—-¢—H CR n—é—4 plik Seu a, eres prod H i Fig. 1-11. Dibujo esquematico de la estructura de los triacilgliceroles. hidrégeno, C-H). Los lipidos se encuen- tran en las células como reserva energéti- ca y como componente estructural, bajo la forma de membranas. Triacilgliceroles. También se denomi- nan triglicéridos y su funcién principal es de depdésito de energia concentrada, dado que se acumulan en las células como go- tas de tamafio variable. Los triacilglicero- les son ésteres de dcidos grasos y glicerol (fig. 1-11) y se pueden hidrolizar para dar los componentes, tras lo cual los dcidos grasos se oxidan (queman) para producir energia. Desde el punto de vista quimico, los 4cidos grasos son largas cadenas hi- drocarbonadas con un grupo carboxilo en un extremo; la mayor parte de los dcidos 12 INTRODUCCION grasos de importancia biolégica tienen cantidades pares de dtomos de carbono. Los dcidos grasos saturados no contienen dobles enlaces, mientras que los dcidos grasos insaturados tienen un enlace do- ble, por lo menos. Fosfolipidos. Estos compuestos son im- portantes componentes de la membrana celular, debido a que presentan la notable propiedad de tener un extremo hidréfobo, que rechaza el agua, y un extremo hidrdéfi- Jo, que la atrae. En consecuencia, son par- cialmente solubles en agua y en grasas, Ca- racteristica denominada anfipatia (anfifi- lia), que contribuye a la capacidad de la membrana de actuar como barrera entre regiones (en fase acuosa) con funciones diversas. Desde el punto de vista quimico, el tipo de fosfolipido mas frecuente se compone de glicerol esterificado con aci- dos grasos (el enlace éster se forma entre un acido y un alcohol, con eliminaci6n de una molécula de agua) en los d4tomos de carbono 1 y 2, mientras que el carbono 3 se une a un grupo fosfato (fig. 1-12). Este ultimo es responsable de conferir a los Fig. 1-12. Dibujo esquematico de un fosfolipi- do, que muestra la localizacion de los grupos que lo componen (figura de la izquierda) y la forma habitual de representar los fosfolipi- dos, por ejemplo en las membranas celula- res (figura de la derecha), con una porcion hi- dréfoba no polar y una porcion polar hidréfila. Sie ee Fosfato Porcion polar Cadena de Acido graso Cadena de acido graso (PASe Hoh LO 7Fig. 1-13. Ejemplos de compuestos organicos que se encuentran con frecuencia en los fosfo- lipidos. 1-14. Representacio- Ss graficas del sistema del fenantreno y Colina fosfolipidos sus propiedades hidrosolu- bles. El otro extremo del grupo fosfato es- té unido a un alcohol nitrogenado u otro compuesto orgénico, por ejemplo un ami- nodcido serina o treonina (fig. 1-13). En el capitulo 3 se verén con mayor detalle los distintos tipos de fosfolfpidos que confor- man la membrana celular. Esteroides. Estos compuestos derivan del fenantreno y contienen 4 sistemas cfcli- cos de carbono (fig. 1-14). Uno de los prin- cipales esteroides es el colesterol, que com- pone las membranas celulares y también interviene en la formacién de distintas hor- monas, entre ellas, las hormonas sexuales. Glucolipidos. Son compuestos que con- tienen un grupo hidrocarbonado en lugar de un grupo fosfato; también son anfipati- cos, debido a la solubilidad del grupo hi- drocarbonado. Al igual que los fosfolipi- dos y el colesterol, los glucolipidos inter- vienen en la construccién de las membra- nas celulares. Hidratos de carbono. Los azticares o hi- dratos de carbono, al igual que los lfpidos, tienen funcidn de fuente de energia y de componente estructural para la célula. Se dividen en monosacdridos, disacdridos y polisacaéridos, de los cuales los dos prime- ros a menudo se denominan aztcares. Es- OH Colesterol Treonina HOH HO OH H H OH | H Etanolamina Serina Inositol tos ultimos son muy hidrosolubles, crista- lizan y atraviesan con facilidad las mem- branas de didlisis (membranas de colodién o celofaén que son atravesadas con facilidad por iones pequefios y moléculas de escaso tamafio), mientras que los polisacdridos no cristalizan ni atraviesan estas membranas. Las pentosas son monosacaridos impor- tantes (con 5 4tomos de carbono) ribosa y desoxirribosa, que componen los dcidos nucleicos (véase mas adelante), y la hexo- sa (con 6 dtomos de carbono) glucosa, que es la fuente de energia mas importante de la célula (fig. 1-15). También son hexosas importantes la galactosa, que forma parte del disacdrido lactosa, y la fructosa, com- ponente de la sacarosa. Tanto las pentosas como las hexosas se pueden encontrar en forma lineal o ciclica; en este iiltimo caso adoptan dos configuraciones (alfa y beta), que para el caso de la glucosa se denomi- nan alfa glucosa y beta glucosa (fig. 1-16). Las dos formas se encuentran en equilibrio en una solucién acuosa, pero predomina la estructura ciclica. Los disacaridos se forman por unién de dos monosacdridos, con eliminacién de una molécula de agua. Los disacdridos mds importantes son el azticar comtin o sacarosa, que se acumula en las células vegetales, y el azticar de la leche o lacto- sa, que se sintetiza y secreta por las célu- las de las glandulas mamarias. Los polisacdéridos se forman por la unio6n de muchas moléculas de monosa- cdridos (con la correspondiente elimina- cién de moléculas de agua). Por ejemplo, se acumula glucosa bajo la forma del poli- sacdrido glucégeno (en las células vegeta- les, el polisacdérido equivalente es el almi- dén), donde las moléculas de alfa glucosa se unen mediante el denominado enlace glucosidico alfa{1—4). Este tipo de enlace se produce entre el 4tomo de carbono 1 de una molécula de alfa glucosa y el dtomo de carbono 4 de la molécula de alfa gluco- sa vecina. La cadena puede presentar eventuales ramificaciones, cuando se en- cuentran ocasionales enlaces glucosidicos alfa(1—6). Ante una necesidad energéti- ca, el glucégeno se hidroliza y produce moléculas de glucosa, que luego se degra- dan con liberacién simultdnea de energia. INTRODUCCION 13La formacién de glucégeno mediante unidades de glucosa encadenadas es un ejemplo de un patrén biolégico muy fre- cuente, denominado polimerizacién. Sig- nifica que una cantidad importante de subunidades iguales o muy semejantes, los monémeros, se encadenan para formar un polimero. Este principio se presenta tam- bién en muchos casos para la formacién de importantes estructuras celulares y extra- celulares, como se verd mas adelante. Los polisacdéridos pueden formar com- puestos combinados con lipidos (los ya nombrados glucolipidos) y con proteinas, denominados entonces polisacdridos complejos, Los compuestos de proteina y polisacdridos son muy importantes y se estudiardn mds adelante. Se dardn como ejemplos las glucoproteinas, que forman parte de las membranas celulares y son componentes de las secreciones de mu- chas células, y los glucosaminoglucanos, componentes esenciales del tejido conec- tivo. A diferencia del glucégeno, los glu- cosaminoglucanos incluyen mas de un ti- po de monosacarido en el polisacarido. Acidos nucleicos. Existen dos tipos de Acidos nucleicos en las células, denomi- nados acido desoxirribonucleico 0 DNA (ing. acid) y acido ribonucleico 0 RNA. Los dcidos nucleicos son macromoléculas con importancia biolégica esencial, dado que las caracteristicas hereditarias tienen su base quimica en el DNA: un gen es un segmento de una molécula de DNA muy larga. El DNA se encuentra casi con exclu- sividad en el nucleo celular, mientras que el RNA es sintetizado allf y luego trans- portado al citoplasma. En la sintesis del RNA, el DNA entrega su informacién a las moléculas de RNA a través de un proceso denominado transcripeién (lat. transcrip- tio, transcripcién). Las moléculas de RNA intervienen en forma determinante en la sintesis proteica citoplasmatica, por lo que la informacién se transfiere mediante un proceso denominado traducci6n: transcripci6n traduccion DNA > RNA — proteina Composicién quimica. E] DNA y el RNA se componen de cadenas de acido fosféri- co y moléculas de pentosa, a las cuales se adosan bases nitrogenadas (fig. 1-17). La pentosa del DNA es la desoxirribosa, mientras que la del RNA es la ribosa. Las bases son las purinas adenina (A) y guani- na (G), y las pirimidinas citosima (C) y ti- mina (T), si bien en el RNA la timina es reemplazada por uracilo (U). Las macromoléculas de dcido nucleico estan formadas por nucle6tidos, cada uno compuesto por una base nitrogenda + pentosa + dcido fosférico. Por ejemplo, el 14 INTRODUCCION CH,OH CH.OH Fig. 1-15. Dibujo que muestra las estructuras O HO © OH de algunos monosacari- dos importantes. HO OH OH OH Glucosa Galactosa CH,OH 4 OOH H,c— ie N coo- | °O HO OH OH Manosa Acido silico CH,OH CH,OH HO OH © OH oO ae Oo Y — C—CH, N77 C—CH, Acetilgalactosamina N-Acetilglucosamina Hexosas 2 OH OH Ribosa Desoxirribosa Pentosas Fig. 1-16. Las pentosas y hexosas pueden presentar forma lineal o ciclica. Se muestra como ejemplo la hexosa glucosa, que en su for- ma ciclica puede aparecer como alfa glucosa o como beta glucosa. H O M17 GH.OH e GH.OH 2 H C H H= c= OH H Cc. OH Cc = HO] C= Hie Cc | HO) aor ee H-4+C—OH et. H OH l H OH H*C—OH | °CH.OH Alfa glucosa Glucosa Beta glucosa (forma ciclica) (forma lineal) (forma ciclica) Sage Ti Ok.Fig. 1-17. Seccion de una hipotética cadena de acidos nucleicos. Se observan 4 nucledtidos y el encadenamiento carac- teristico mediante enlaces fosfato-diéster entre las ° moléculas alternantes de fosfato y pentosas. (Se- gun De Robertis, Saez y De Robertis.) Adenina Citosina Guanina Timina Y=H Uracilo Y =CH, Ribosa X= OH Desoxirribosa nucleétido monofosfato de adenosina (AMP) esta formado por adenina + pento- sa + fosfato. En conjunto, la base + la pen- tosa componen una unidad denominada nucleésido, cuyo nombre depende de la base en-cuestién. Asi, la adenosina contie- ne adenina y ribosa. Si ademas se adosa una molécula de fosfato, se emplea la de- signacién difosfato de adenosina (ADP); de modo similar, el trifosfato de adenosina (ATP) es un compuesto que contiene 3 mo- léculas de fosfato en hilera. Denominacio- nes semejantes se aplican a los demas nu- cleésidos, por ejemplo GTP. Si la pentosa que interviene es la desoxirribosa, de agrega una d mintiscula adelante, dATP. Los dcidos nucleicos son polimeros li- neales de nucledtidos, unidos mediante enlaces fosfato-diéster (fig. 1-17) entre el grupo fosfato del 4tomo de carbono 5’ de una molécula de pentosa y el grupo hidro- xilo del 4tomo de carbono 3’ de una molé- cula de pentosa adyacente. Asif, la cadena de polinuclestidos tiene una direccién definida, dado que un extremo de la cade- na se denomina extremo 5’, con un grupo fosfato libre adosado al d4tomo de carbono 5’, mientras que el otro extremo de la ca- dena se denomina extremo 3’, con un gru- po OH libre adosado al dtomo de carbono 3’. Se. puede considerar que la molécula de dcido nucleico tiene una columna ver- tebral de moléculas de fosfato y pentosa alternadas, en la que las bases nitrogena- das se adosan a las moléculas de pentosa de la columna. Toda Ja informacién genética del orga- nismo estd codificada en la secuencia li- neal de las cuatro bases. Un alfabeto de cuatro letras (A, T, C, G) codifica la estruc- tura primaria de todas las proteinas, es de- cir, la secuencia en que se deben encade- nar los 21 aminodcidos que la componen. El esclarecimiento de este cédigo genético comenz6 después de que se descubriera la estructura del DNA. A continuacién se presenta someramente la estructura del DNA y la relacién con la sintesis proteica, si bien esto se analizara con mayor detalle en los capitulos 3 y 4. Estructura del DNA. El] DNA se compo- ne de moléculas muy largas, por lo que tie- nen un peso molecular muy elevado. Las colibacterias poseen una tinica molécula circular de DNA, de 1,4 mm de largo, con peso molecular aproximado de 2,6 x 10°. La cantidad de DNA en las células euca- riotas, puede ser varios miles de veces ma- yor y en una tinica célula humana, el con- tenido de DNA presenta una longitud total de alrededor de 1 m. En 1953, Watson y Crick propusieron una hipétesis para la estructura del DNA, que a la vez explicaba sus propiedades quimicas y bioldgicas. En la actualidad, este modelo de Watson-Crick es aceptado universalmente y presenta la siguiente es- tructura para el DNA (fig. 1-18): la molé- cula de DNA es una espiral bicatenaria, una doble hélice, como una escalera de caracol. Los parantes de la escalera son los dos cordones, cada uno formado por INTRODUCCION 15una cadena de polinucleétidos, enrolla- dos entre si en sentido dextrégiro. Los es- calones de la escalera se componen de las bases nitrogenadas, apareadas de manera tal, que una base purinica siempre se una a una base pirimidinica, es decir, A-T 0 C-G. Las dos cadenas de nucledtidos se mantienen entonces unidas mediante los pares de bases que, a su vez, se unen a tra- vés de enlaces de hidrégeno, de los que se forman dos entre A y T y tres entre C y G. Un giro completo de la doble espiral co- rresponde a 10 monémeros de nucledéti- dos y los 10 pares de bases se disponen en sentido perpendicular a la columna de pentosas y dcido fosférico, con una dis- tancia de 0,34 nm entre cada par de bases y ur'total de 3,4 nm por cada giro comple- to de la espiral. Sobre la base de los mode- los espaciales del DNA se puede estable- cer que la doble espiral tiene un didmetro promedio de 2,0 nm. Ademas, se forman dos surcos, uno mayor y mas profundo, y otro menor y mas aplanado. Es importante destacar que las dos do- bles hélices de DNA transcurren en direc- ciones opuestas, son antiparalelas, es de- cir, una presenta sentido 5’'-3’, mientras que la otra tiene sentido 3’-5’. La secuencia de bases de una de las ca- denas de nucledtidos puede variar, pero en la cadena opuesta la secuencia debe ser complementaria, dado que, como se vio antes, el apareamiento de las bases es complementario (AT o CG). Esta complementariedad tiene gran im- portancia para el mecanismo por el cual la molécula de DNA se duplica 0 replica. Es- te proceso se produce antes de la divisién celular, dado que las dos células creadas 16 INTRODUCCION 2,0 nm reciben exactamente el mismo contenido de DNA y, en consecuencia, de genes, que Ja célula madre. En la replicacién se sepa- ran las dos hebras de DNA a lo largo, ya que se abren los enlaces de hidrégeno y cada hebra forma una nueva pareja (me- diante complejos procesos enzimaticos que se verdn mas adelante) a partir de ba- ses complementarias presentes en el ma- terial circundante (fig. 1-19). Por lo tanto, la replicacién es semiconservadora, es de- cir, la mitad de la molécula original (una hebra) se conserva en cada molécula hija. Estructura del RNA. A diferencia del DNA, las moléculas de RNA son monoca- tenarias, dado que s6lo en casos excepcio- nales (véase RNA de transferencia, mas adelante) se forman pares de enlaces de hi- drégeno entre las bases nitrogenadas, co- mo consecuencia de la creacién de asas en la hebra de nucledtidos (pares AU o CG). Existen 3 tipos principales de RNA: el RNA mensajero, o mRNA, el RNA de transporte o de transferencia, o tRNA, y el RNA ribosémico o rRNA. Los tres in- tervienen en la sintesis de protefnas en el citoplasma celular; esto se vera con mayor detalle en el capitulo 3. Los tres tipos de RNA se sintetizan en el nticleo celular a través de un proceso denominado transcripcién, como se vio antes. De modo semejante a la replicaci6n del DNA se separan las dos hebras de DNA y ahora se sintetiza, sobre la base de una hebra de DNA como molde, una tini- ca hebra larga de RNA, segtin el principio de apareamiento de bases complementa- rias y, en consecuencia, la hebra sintetiza- da es complementaria a la hebra de DNA. En realidad esto significa que la secuencia Fig. 1-18. El modelo de Watson y Crick para la es- tructura del DNA. A = adeni- na; C = citosina; G = guani- na; T = timina; P = fosfato; S = desoxirribosa. (Segun Har- per.) Cate haLio A a4g. 1-19. Representa- aon esquematica del ecanismo de replica- i6n del DNA. Las dos adenas recién formadas 2 edtidos se indican n linea gruesa en la fe inferior de la figura. Seguin Kornberg.) peruio. 1 de nuclestidos de la hebra de RNA sinte- tizada es idéntica a la secuencia de la he- bra de DNA no transcripta (si se deja de lado que en la hebra de RNA aparece U en lugar de T, dado que el RNA contiene la base uracilo en lugar de timina). Ademas, el RNA transcripto y la hebra singular idéntica de DNA no transcripta presentan el mismo sentido 5’-3’. En consecuencia, por convencién, se ha establecido definir la secuencia de nucledtidos de un gen de una doble hebra de DNA como aquella que se encuentra en la hebra singular de DNA no transcripta. Por lo tanto, ésta se denomina hebra codificadora, mientras que la hebra transcripta se denomina he- bra patrén. El cédigo genético. Como se vio antes, la informacién genética del DNA esta co- dificada de acuerdo con las variaciones de la secuencia de las 4 bases, bajo la for- ma de un alfabeto de cuatro letras (A, C, G, T). Este alfabeto se emplea para escri- bir palabras de sélo tres letras, dado que una serie de tres nucleétidos a lo largo de la hebra de DNA, o grupo de tres bases, triplete (ing. “triplet”) o codén, codifica un aminodcido determinado para una proteina (p. ej., GGA para el aminodcido glicina). Asi, a lo largo de la hebra de DNA se suceden los grupos de tres bases, que codifican aminodcido tras aminodci- dos en secuencia. Este cédigo genético se copia en el proceso de transcripci6n, da- do que la molécula de mRNA formada, que recibe la informacién sobre la se- cuencia de aminodcidos, presentaré una secuencia complementaria de grupos de tres bases, complementaria a la hebra pa- trén del DNA y sera, por lo tanto, idénti- ca a la hebra codificadora. En consecuen- cia, los grupos de tres bases de la molécu- la de mRNA contendrén la misma se- cuencia de codones que la hebra codifica- dora. Esta secuencia se “traduce” en el proceso de traduccién de la sintesis pro- teica en el citoplasma, como se vera en el capitulo 3. De lo anterior se comprende que un gen es una parte de la molécula de DNA, que codifica una molécula funcional de RNA. La molécula de RNA puede codificar la INTRODUCCION 17sintesis de una determinada cadena poli- cula de tRNA, rRNA, snRNA o scRNA peptidica (mRNA), en cto caso el gen se (snRNA y scRNA_ son pequenias moléculas denomina gen estructural, o ser una molé- de RNA que se estudian en el capitulo 4). Cuestionario sobre generalidades de la célula . ;Qué expresa la teoria celular? 2. ;Cémo se denominan los cuatro teji- dos fundamentales? 3. gQué se entiende por organelas? 4. ;Cudl es la principal diferencia en- tre células procariotas y eucariotas? 5. sDentro de qué intervalo (en um) se ubica el tamafio de la mayorfa de las células? 6. Las células se pueden caracterizar como organismos vivos, en gran parte, debido sus propiedades fisio- légicas. ;Por ejemplo, cudles? 7. j3Qué propiedades de la molécula de agua le permiten ser un solvente éptimo para distintas sustancias bioldgicas? 8. «Como se denominan los acidos que componen las proteinas? g. jCudles son las caracteristicas de los aminodcidos? 10. ;Cémo se denomina el enlace qui- mico que une a los aminodcidos BB Lecturas adicionales sugeridas ~ Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Ro- berts K, Watson JD. Molecular Bio-_ logy of the Cell, 3° ed. Garland Pu- ~ blishing, Inc., Nueva York y Londres, . 1994. Alberts B, Bray D, Johnson A, Lewis J, — Raff M, Roberts K, Walter P. Essential ~ Cell Biology. An Introduction to the Molecular Biology of the Cell, Gar- land Publishing, Inc. Nueva York y Londres, 1998. 1 = Ford BJ. The earliest views. Sci Amer. Abril 1998:42-45. ‘ Godtfredsen E. Medicinens Historie, 3° ed. Nyt Nordisk Forlag Arnold Busk, Copenhague, 1973. Norby S. Aminosyrer og nomenklatur- igen igen. Ugeskr Laeger. 1998;160: 4435. hen soe 18 INTRODUCCION para formar largas cadenas protei- cas? 11. ;Qué se entiende por estructura pri- maria de una proteina?. 12. ;Qué determina la conformaci6n de una proteina? 13. ;Qué enlaces quimicos estabilizan la conformaci6n de una proteina? 14. ,Cudl es la propiedad comin a to- dos los lipidos? 15. ;Qué tipos de lfpidos intervienen como componentes esenciales de las membranas celulares? 16. ;Qué dos pentosas tienen gran im- portancia biolégica? 17. jCémo se denominan las cuatro ba- ses nitrogenadas que componen el DNA y el RNA? 18. ;Cémo se denominan las dos hebras de una molécula de DNA que se transcriben en la transcripcién? 19. ;Qué se entiende por cod6n? 20. ;Cémo se puede definir un gen? Rehfeld JF. Molekulaerbiologi. Ugeskr Laeger. 1994;156:5096-97. Rennie J. DNA’s new twists. Sci Amer. Marzo 1993;88-96. Robertson MP, Ellington AD. How to make a nucleotide. Nature. 1998;395: af 224-225; Suhr-Jessen P, Rasmussen L. Basisbog i Gellebiologi, 2* ed. Gad, Copenhague, “1905. . Thomas PJ, Qu B-H, Pedersen PL. De- fective protein folding as a basis of human disease. TIBS. 1995;20:456- 459. Welch GR: T.H. Huxley and the “Proto- plasmic theory of life”: 100 years la~ ter. TIBS. 1995;20:481-85. GAP TY Bo 12-1. Dibujo esque- 5 Que muestra un eeruL.o 2 Métodos histolégicos “E] arte y la ciencia tienen su punto de encuentro en el método.” La totalidad del conocimiento actual re- ferido-a la estructura y la fiincién de los or- ganismos bioldgicos tiene su fundamento en los métodos necesarios para la investi- gacion de las células y los tejidos. En algu- nos casos, los grandes avances en la com- prensién y el conocimiento fueron conse- cuencia directa del desarrollo de una nue- va técnica. La creacién de la microscopia electrénica, los métodos de fracciona- miento celular, la inmunohistoquimica y la tecnologia del DNA son ejemplos claros. Es necesario contar con ciertos conoci- mientos respecto de los principios funda- mentales de.los métodos aplicados con mayor frecuencia, para que el estudio de la histologia no sea tan s6lo un aprendizaje de determinados hechos, sino que ademas permita adoptar una postura critica frente a ellos. En consecuencia, se comenzara el estudio de la histologia con un breve ana- lisis de las generalidades de los métodos histolégicos, si bien a menudo sera de gran utilidad revisar algunos de estos métodos, * Ojo Ocular Tubo Prisma Estativo Tornillo macrometrico ____ Tornillo micrométrico Colector Lampara Bulwer relacionados con el estudio especifico de las células y los tejidos. En general, los métados histolégicos se clasifican en dos grupos: los que se basan en la observacién directa de células y teji- dos vives, y los que analizan material muerto o inanimado. En un lugar interme- dio se ubican las técnicas de aislamiento de los componentes de células vivas me- diante métodos de centrifugacién. En to- dos los casos se comienza con el anélisis microscépico, de importancia fundamen- tal para todos los métodos histoldégicos. Analisis microsc6épico El microscopio es el instrumento mas importante en la histologia, debido al pe- quefio tamafio de las estructuras analiza- das. Cabe destacar que cuando en este texto se alude al término “microscopio” siempre se refiere al microscopio Gptico, a menos que se especifique otra cosa. Revolver Objetivo Platina Condensador Tornillo de centrado Filtro de luz diurna Brazo del condensador Diafragma Espejo METODOS HISTOLOGICOS 79Cuando la luz atraviesa un material bio- légico, por ejemplo un preparado histolé- gico, cambian sus caracteristicas, y estas modificaciones se hacen visibles median- te los sistemas de lentes. El ojo puede di- ferenciar variaciones de intensidad de la luz (contraste entre luz y sombras) y de color (distintas longitudes de onda). En consecuencia, es necesario modificar la luz, para que el preparado se observe co- mo formado por elementos mas oscuros y mas claros o de distintos colores. Las cé- lulas y los tejidos no coloreados se suelen captar con el microscopio como carentes de color y transparentes, porque no pre- sentan suficiente contraste. Con la ayuda de tinciones histolégicas se logra una ab- sorcién diferencial de la luz, de modo que se visualizan las distintas estructuras. Poder de resolucién y aumento, Estos das conceptos se emplean para determi- nar la utilidad de un microscopio y se de- ben diferenciar con claridad entre si. Es Apertura numérica y poder de resolucién La capacidad de refraccién oindice de refraccién de un medio se define como la_relacién entre la velocidad de la luz _en el vacio y en el medio en cuestiGn. Por lo tanto, el indice de refraccién es una medida de la velocidad de dispersién de una onda luminosa a través del medio. La luz se refracta al atravesar un objeto. El dngulo de refraccién sera tanto mayor cuanto mas finos sean los detalles. La apertura numérica (NA) es una me- dida de Ia capacidad del microscopio de agrupar las refracciones de la luz produ-_ cida los deta jeto, da- do que expresa el tamafio del haz de luz que es captado por el objetivo después de Fig. 2-2. Este dibujo esquematico muestra la mitad del angulo maximo (u) del haz de luz captado por el objetivo. 20 METODOS HISTOLOGICOS mucho mas importante el poder de reso- lucién d, que se define comoderdtstancia minima que debe existir entre dos puntos del objeto para Ta- dos. La calidad de una imagen (claridad y riqueza de detalles) depende del poder de resolucién de un microscopio. (El aumento se define como_la relacion entre el tamario de la imagen y del objeto, en valores lineales. EI aumento no depen- de del poder de resolucion, pero se tiene en cuenta esta propiedad al elegir el au- mento. En cuanto todos los detalles re- sueltos se visualizan con facilidad, todo aumento ulterior sé6lo hace-mas borrosa la imagen, porque no se incrementa el poder de resolucién. La imagen no adquiere mas detalles y se habla de aumento vacio. Microscopio 6ptico El microscopio 6ptico esté compuesto por partes mecdnicas y 6pticas. Los com- haber atravesado el objeto. Se expresa co- mo NA = n x sen u, donde n es el indice _de refraccién del medio que separa el cu- breobjeto del preparado de la lente fron- tal del objetivo, y u es la mitad del angu- lo superior del haz de luz (fig. 2-2). Como se vio antes, el poder de resolu- cién es funcién de la apertura numérica y de la longitud de onda de la luz utili- zada, A (lambda). El poder de resolucién (d) se puede expresar segtin la siguiente formula: 0,61 «A NA donde d es la menor distancia entre dos puntos que permite visualizarlos separa- dos. Nétese que cuanto menor sea d, tan- to mayor sera el poder de resolucion. Da- do que u no puede superar 90°, el seno de u debe ser inferior a 1. En consecuen- cia, el NA mdximo serd de alrededor de 1,4, puesto que el indice de refraccién a lo sumo se puede acercar a 1,5 si se reemplaza el aire que separa el cubreob- jeto y el objetivo con aceite (denominada técnica con aceite de inmersién, para la que se emplean objetivos de inmersién especiales). La longitud de onda de la luz empleada suele ser de alrededor de 0,500 um, que corresponde a la luz ama- rillo-verdosa, para la cual el ojo humano tiene especial sensibilidad. De este mo- do, se obtiene un poder de resolucién de aproximadamente 0,25 jum. e-AtP fry LsO 2ponentes 6pticos constan de tres sistemas _de lentes: condensador,objetivo y_ocular_. (fig. 2-1). El condensador pr e un haz _ de luz que ilumina el objeto estudiado. El objetivo aumenta el objeto _y proyecta la, imagen sobre el ocular, E] ocular aumenta aun mas la imagen y la_proyecta-sobrela— retina del ojo del observador. ; ~ El] aumento total resultante se determi- na mediante el producto del aumento del objetivo por el aumento del ocular (even- tualmente se debe multiplicar por un fac- tor que depende del tubo). El poder de resolucién depende de la longitud de onda de la luz utilizada y de las aperturas numéricas del objetivo y el condensador (el ocular sélo actia aumen- tando la imagen del objetivo, no mejora el poder de resoluci6én). El mdximo poder de resoluciGdn que se_ puede obtener es de 0,2 um, pero con los preparados de rutina habituales rara vez ex- cede de 0,5 um. Como se vio antes, los detalles resueltos se deben aumentar lo suficiente para poder ser observados sin esfuerzo, lo cual se lo- gra con el aumento adicional del ocular. Para obtener el mdximo poder de resolu- cién, de alrededor de 0,2 um, se requiere un aumento de unas 1.000-1.400 veces, da- do que el poder de resoluci6n del ojo, a la distancia normal de observacién (25 cm), es de aproximadamente 0,2 mm. Como re- gla mnemotécnica vale que, para evitar el aumento vacio nunca se debe emplear ma- yor aumento que 1.000 veces la apertura numérica del objetivo. Por lo general, en el objetivo estén grabados el aumento y el valor de la apertura numérica. Ademas, se suele especificar la longitud del tubo y el espesor de cubreobjetos (en mm) para el cual esta corregido el objetivo. Sobre la base del microscopio 6é6ptico comin se han desarrollado varios micros- copios especiales, cada uno de los cuales presenta ventajas y limitaciones especifi- cas, segtin veremos a continuacioén. Microscopio de campo oscuro _El microscopio de campo oscuro se uti- liza para analizar particulas pequefias, que presentan muy escaso contraste con _ _ la microscopia 6ptica o que se encuentran en el limite del poder de resolucién o por debajo de éste. Para la microscopia de campo oscuro se emplea un condensador especial, el cual impide que llegue luz di- recta al objetivo, de manera que s6élo inci- de en esta lente la luz desviada o esparci- da por las pequefias particulas que se de- sea investigar. Estas se observan lumino- sas sobre un fondo oscuro (del mismo mo- do que las particulas de polvo se visuali- zan por la dispersi6n que realizan de la luz de un rayo de sol). En histologfa se utiliza a menudo el campo oscuro para el andlisis de prepara- _ ‘dos radioautogrdficos (véase mas adelan- te), mientras que es una importante aplica- cion clinica la determinacién de la espiro- queta de Ja sifilis, el Treponema pallidum. /Micrescopio de contraste de fase | Los tejidos no coloreados producen muy escaso contraste, dado que no _absorben ‘cantidades importantes de luz. Sin embar- ~go, producen cierto retardo-en las longitu- des de onda, de acuerdo con la “densidad 6ptica” variable de los tejidos, es decir, los distintos indices de refraccion. Este retraso variable de las ondas sinusales produce cierto desfasamiento entre ellas. Mediante el microscopio de contraste de fase es posi- ble transformar estas diferencias pies no visibles, en diferencias de amplitud, es ~ decir, que las diferencias de refraccién en- tre los componentes del tejido se transfor- man en diferencias de intensidad, que pue- den ser captadas por el ojo humano. De es- ta manera es posible transformar en visibles componentes de las células vivas que, de otra manera, s6lo se observan en tejidos muertos y tefiidos (fig. 2-3). Fig. 2-3. Se observan dos fotomicrografias (A y B) de las mismas células vivas (fibroblastos de cultivo de tejido), A obtenida con un mi- croscopio optico comun y B captada con un microscopio de contraste de fase. En la imagen de contraste de fase se observan con claridad el limite entre las células (fechas), el nucleo (N), los nucléolos (Nu), mitocondrias alargadas (M), lisosomas redondos (L) y otros detalles que apenas se distinguen con el microscopio é6ptico comin. (Segun Novikoff y Holtzman.) METODOS HISTOLOGICOS 21/ ! i ! -Microscopio-de_interferencia El microscopio de interferencia esta construido sobre la base de principios si- milares al microscopio de contraste de fa- se, dado que también en este caso se utili- zan las diferencias de fase producidas por la luz que atraviesa el objeto. Mientras que el microscopio de contraste de fase sdlo es un instrumento cualitativo, mediante el microscopio de interferencia es posible obtener datos cuantitativos. Esto se logra al dividir la luz de una tinica fuente en dos haces luminosos, de los cuales uno se en- via a través del objeto y el otro no se alte- ra, por lo que acttia como haz de referen- cia. Después se vuelven a unir ambos ha- ces, que interfieren entre si del mismo mo- do que en el microscopio de contraste de fase. El haz que atraves6 el objeto sufre un retraso respecto al haz de referencia, es de- cir, sufre una modificacién de fase. Dado que el retraso es funcién del indice de re- fraccién y del espesor, el valor del retraso se puede emplear para determinar la masa por unidad de superficie del preparado y, en consecuencia, la masa de los elementos celulares individuales. Una_variante especial del _microscopio. _de interferencia es el microscopio de con- traste por interferencia diferencial (tam- ~pién denominado microscopio de interfe-_ —zencia de Nomarski)} en el cual los dos ha- ces luminosos separados tienen polaridad opuesta, por lo que se aumenta el contras- te y se obtiene una imagen dejaspecto tridi- mensional del objeto investigado'(fig-2-4)- Microscopio de luz polarizada Los componentes cristalinos y fibrosos del material biolégico poseen una orienta- cién caracteristica de las moléculas. En consecuencia, cuando se ilumina el obje- to con luz polarizada plana (luz que_sdlo- vibra en un p ‘ji divi dos. componentes con distinta velocidad, es tructuras birrefringentes o anisétropas (gr. an, SS Heaton aunt th contraste, se denomina estructuras isotro- pas a'las que no dividen la luz polarizada, por lo que el indice de refraccién es igual en todas direcciones. Se obtienen datos referidos a la anisotro- pia del objeto mediante el microscopio de luz polarizada, que se diferencia del mi- croscopio éptico comun por tener dos fil- tros polarizantes. Uno de ellos, el polariza- dor, se encuentra antes del preparado y el otro, el analizador, esté ubicado por detras. El polarizador transforma la luz en una po- larizada plana (al filtrar la luz que vibra en otros planos) antes de llegar al objeto, mien- tras que el analizador se utiliza para regis- 22 METODOS HISTOLOGICOS trar las modificaciones de la polarizacién de la luz que ha atravesado el preparado. La birrefringencia de un objeto depen- de de una estructura regular determinada. En las células y los tejidos puede ser una decir, destasados entre sto s habla de-es— disposicién asimétrica regular de molécu- las o iones, por ejemplo, en ciertas inclu- siones celulares, birrefringencia cristali- na, o una distribucién regular de unida- des submicroscépicas asimétricas, por ejemplo, en las fibras musculares, birre- fingencia de forma. En consecuencia, me- diante el microscopio de luz polarizada es posible obtener informacién respecto a la estructura a nivel molecular. Ademas, el microscopio de luz-polarizada_se puede - 7]: . a utilizar para el estudio de células Vivas.\ Microscopio de fluorescencia _Determinadas sustancias fluorescen, es decir, tie | particularidad de irradiar parti luz de otra longitud de-onda (color) al ser Fig. 2-4. Fotomicrografia de una célula pilosa del oido interno captada con microscopio de interfe- rencia diferencial (o mi- croscopio de interferen- cia de Nomarski). Obsér- vese el notable efecto tri- dimensional. x625 (Seguin Marup Jorgensen.) GAcP fh OL OR BeSubmicrosc6pico Por submicroscépico se entiende lo que “esta por debajo de la resolucién del microscopio”. La denominaci6n esta mal definida y se aplica ocasionalmente con respecto a las estructuras demasiado pe- quefias para ser reconocidas incluso con iluminadas. La luz irradiada siempre pre- senta una longitud de onda mas_larga que la original.jAlgunos componentes bioldgi- cos (p. ej., la vitamina_A) tienen fluores- ceneia_natural_y_se denominan autofluo- el microscopio electrénico. Sin embargo, su uso mas frecuente se aplica a estruc- turas demasiado pequefias para ser de- tectadas con el microscopio dptico (la palabra comenzé a utilizarse antes de la era del microscopio electrénica). Microscopio de barrido confocal Una limitaci6n de la microscopia de fluorescencia radica en la necesidad de que todo el espesor del preparado emita rescentes, mientras que otros adquieren la__fluorescencia, pero s6lo es posible enfocar fluorescencia después-de_un_ tratamiento con_determinades-colorantes fluorescen- tes, por ejemplo fluoresceina, que emite “una intensa fluorescencia verdosa al ser irradiada con luz azul. En el microscopio de fluorescencia se ilumina el preparado con intensa luz de la longitud de onda capaz de activar el colo- rante fluorescente empleado. Esto se lleva a cabo mediante un filtro del color ade- cuado que se coloca por debajo del con- densador: asi se filtra la luz antes de que incida en el preparado. Ademas, se coloca un filtro por encima del objetivo con un color correspondiente a la longitud de on- da de la luz que emite el colorante utiliza- do cuando fluoresce. De esta manera se lo- gra que la imagen se forme sélo debido a la emisién de la luz fluorescente. Las es- tructuras fluorescentes se destacan enton- ces-en color sobre fondo oscuro (véase fig. 2-14), como fuentes Juminosas, por lo que es posible visualizar estructuras de di- mensiones mucho més pequefias que el poder de resolucién del microscopio. En los tiltimos afios se ha observado un notable incremento en el empleo de la mi- croscopia de fluorescencia, debido funda- mentalmente a la aplicacién de colorantes fluorescentes que se ligan a anticuerpos especificos, que reaccionan con determi- nados componentes tisulares (véase mds adelante en este capitulo). Fig. 2-5. Imagen de las células productoras de insulina en los islotes de Langerhans del pan- creas, captada con microscopio de barrido confocal. Se distinguen granulos citoplasmati- cos que contienen insulina mediante reacci6n con un anticuerpo fluorescente azul contra insuli- na, se determina la presencia de una molécula li- gada a la membrana celular (denominada trans- portadora de glucosa) con un anticuerpo fluores- cente rojo y se observa una molécula localizada sobre el nucleo celular (llamada factor de trans- cripcién para insulina) mediante un anticuerpo fluorescente verde. (Cedida por L.-|. Larsson.) el objetivo en un plano del corte a la vez. En consecuencia, la luz emitida por fluo- rescencia desde zonas del preparado ubi- cadas por encima y por debajo del plano focal puede restar nitidez a la imagen. Me- diante el microscopio de barrido confocal se impide esta tendencia, dado que se ex- cluye la luz no emitida por el plano focal. El preparado se ilumina por un rayo laser que barre todos los puntos del plano focal, mientras que la luz emitida por el prepa- rado atraviesa una hendidura muy estre- cha que detiene la luz emitida por otras niveles, distintos del plano focal. De esta manera se logra obtener la informacién necesaria para formar una imagen bidi- mensional (fig. 2-5) que se registra sobre una pantalla de televisién. Al recoger con una computadora una serie de imagenes de distintos planos focales es posible re- construir una imagen tridimensional del objeto. METODOS HISTOLOGICOS 23Microscopio de luz ultravioleta Con el empleo de luz ultravioleta con longitud de onda de alrededor de 250 nm, es decir, casi la mitad de la luz visible que se utiliza habitualmente en el microsco- pio 6ptico, en principio es posible dupli- car el poder de resolucién (disminuir d a la mitad). El microscopio de luz ultravio- leta, cuyo sistema 6ptico suele estar cons- truido en cuarzo, permite el paso de la luz ultravioleta, que es invisible. En conse- cuencia, la formacién de la imagen se re- gistra en una pelicula fotografica. Aunque se logra un ligero aumento del poder de resolucién mediante esta técnica, la principal importancia del mi- croscopio de luz ultravioleta es que los dcidos nucleicos absorben la luz ultra- violeta de determinada longitud de onda (260 nm), por lo que se pueden detectar con facilidad. Microscopio electrénico La construccién del microscopio elec- trénico representa un verdadero logro en cuanto a incrementos del aumento y del poder de resolucién. En principio se debe a que se reemplaza la luz visible, de lon- gitud de onda de alrededor de 500 nm, por un haz de electrones de longitud de onda del orden de 0,005 nm. Dado que d (poder de resolucién) es directamente proporcional a A (véase pag. 20), en teoria la aplicacién de un haz de electrones per- mite obtener un poder de resolucién muy elevado. Como los electrones no pueden atravesar las lentes de vidrio, es necesario reemplazarlas por bobinas electromagné- ticas (denominadas lentes electromagnéti- cas), en cuyos campos electromagnéticos o electrostaticos se modifica el trayecto del haz de electrones, de modo similar a como se refracta el haz de la luz visible en una lente de cristal. El esquema de construccién del mi- croscopio electrénico de transmision (MET) se presenta en la figura 2-6 (la pa- labra transmisién se refiere a que los elec- trones atraviesan el objeto). Se calienta un cAtodo filamentoso del metal tungsteno (denominado filamento) en una atmésfera de vacio, por lo que emite electrones que son acelerados hacia el 4nodo debido a una diferencia de potencial de alrededor de 50-100 kV. El dnodo tiene la forma de una placa metdlica con un orificio (deno- minado apertura) en el centro, a través del cual pasan algunos de los electrones, para formar un flujo constante o haz de electro- nes. El haz de electrones se enfoca me- diante la lente del condensador en el pla- no del objeto, y la lente del objetivo forma la imagen del objeto. La imagen obtenida 24 METODOS HISTOLOGICOS Catodo Anodo . Lente condensadora Objeto Lente objetivo Lente proyectora Imagen se aumenta por una lente proyectora, que corresponde al ocular del microscopio 6p- tico. Dado que el haz de electrones es in- visible, la imagen formada se registra por proyeccion sobre una pantalla fluorescen- te o una pelfcula fotogréfica. Debido a la escasa movilidad de los electrones en el aire, todo el sistema debe estar en una al- mésfera de vacio. La formacién de Ja imagen en el mi- croscopio electrénico se debe, principal- mente, a la dispersién de los electrones. Asi se dispersan los electrones que coli- sionan con los nticleos at6micos y con sus electrones en el objeto, a menudo de ma- nera tal que inciden por fuera de la lente objetivo. En.consecuencia, la imagen so- bre la pantalla se forma por la ausencia de estos electrones, como “imagen en som- bra”. La dispersién de los electrones de- pende del espesor del objeto y de su den- sidad molecular. En especial depende del numero atémico de los 4tomos presentes en el objeto, dado que la dispersién obte- nida es mayor, cuanto mas elevado sea el ntimero atémico. La mayorfa de los Ato- mos de las estructuras biolégicas tienen ntimero atémico bastante bajo y contribu- yen muy poco a la formacién de la ima- gen, por lo que se adicionan atomos pesa- dos al preparar los materiales (véase mas adelante). Como se vio antes, el valor del microsco- pio electrénico radica en el gran poder de resolucién que se puede obtener, de unos 0,2 nm, No obstante, es importante diferen- ciar entre el denominado poder de resolu- cién del instrumento, que es del orden mencionado y se puede lograr al analizar, por ejemplo, polvo metalico, y el denomi- nado poder de resolucién del objeto. Este ultimo es el poder de resoluci6n que se Fig. 2-6. Dibujo esque- matico de un microsco- pio electronico. CARP Ii TUL? 2. Dibujo esque- so de un microsco- Stectronico de barri- Be Hearle, Sparrow Valor del poder de resolucién Nétese que el poder de resolucién a simple vista, a distancia normal de lec- tura, es de alrededor de 0,2 mm, para los mejores microscopios 6pticos, de- aproximadamente 0,2 um, y para los mejores microscopios electrénicos, de unos 0,2 nm. F : puede lograr en la investigacién de prepa- rados bioldgicos y es del orden de 2 nm, da- do que depende en gran parte de los proce- dimientos de preparacién (véase mas ade- lante). Con el poder de resolucién practico que se puede obtener es posible lograr au- mentos titiles superiores a 500.000 veces. El microscopio electrénico esta limita- do por el escaso poder de penetracién del haz de electrones. Esto implica la necesi- dad de utilizar cortes de tejido muy delga- dos (de alrededor de 50 nm). Esta limita- cidn se puede superar en parte mediante el uso del denominado microscopio elec- trénico de alto voltaje, cuyo haz de elec- trones es alrededor de 10 veces mas rico en energfa que el que se utiliza en los mi- croscopios electrénicos comunes. El mi- croscopio estereoelectr6énico permite cor- - tes de tejido mas gruesos, ya que el mismo preparado es fotografiado desde dos angu- los algo diferentes. Si después se analizan las fotograffas mediante un estereoscopio se obtiene un notable efecto tridimensio- nal, en el cual la profundidad es mayor, cuanto mas grueso es el corte de tejido. Otra limitacién es el requerimiento de utilizar alto vacfo, lo cual descarta inves- tigaciones en células vivas. Microscopio electrénico de barrido Hasta aqui se analiz6é el microscopio electrénico estandar que, como se men- cion6é, se denomina microscopio electré- Detector Pantalla de TV Amplificador Fig. 2-8. Imagen de cilias de la traquea cap- tada con microscopio electrénico de barri- do. (Cedida por B. Holma.) ¥ nico de transmisién (MET). Su contrapar- tida es el microscopio electrénico de ba- rrido (MEB) que, en principio y utilidad, es totalmente diferente de los microsco- pios 6ptico y electrénico de transmisi6n, pero que representa un importante suple- mento del MET. En el microscopio de ba- trido los electrones no atraviesan el obje- to, la imagen se forma indirectamente, a través de la captacién puntual de detalles en la superficie del preparado. El prepara- do se recubre de una delgada capa de un metal pesado y se bombardea con un haz de electrones muy estrecho (de alrededor de 10 nm de didmetro), que “barre” sobre el objeto en un patrén lineal y lo copia (fig. 2-7). Desde cada punto se emiten electrones secundarios, de modo tal que la intensidad de la emisién secundaria va- rfa segtin el 4ngulo con que incide el haz de electrones sobre la superficie. Este 4n- gulo depende de las irregularidades del contorno de la superficie. La emisién se- cundaria se mide con un detector ubicado cerca del preparado y adaptado a una pan- talla de televisién, cuyos rayos catédicos barren en forma coordinada con el haz de electrones “que iluminan”. La imagen ob- tenida se visualiza directamente sobre la pantalla y se puede registrar en una foto- erafia o en forma digital. é El MEB formaslaimagen de upertfi- cie-y-no_es necesario utilizar cortes ulffra- jfinos} dado que el haz de electrones no atraviesa el preparado. El poder de resolu- cidn con la microscopia electrénica de ba- rrido sdlo es de alrededor de 10 nm pero, en contrapartida, la nitidez de la imagen en profundidad es de hasta 10 veces la METODOS HISTOLOGICOS 25OEE EEE &«_—- que se obtiene con el microscopio 6ptico. En consecuencia, se puede lograr una imagen tridimensional definida de la su- perficie (fig. 2-8). Microscopio de tunel de barrido (MTB) Con este instrumento es posible captar la estructura de la superficie de un pre- parado hasta el nivel atémico. El princi- pio se basa en colocar una sonda delgada a una distancia de hasta 1 nm, por deba- jo de la superficie del preparado. Se apli- ca luego un contacto eléctrico en el ex- tremo de la sonda, que al mismo tiempo barre por sobre la superficie del prepara- do. De este modo se crea un “tunel” de electrones a través de la hendidura for- mada entre el preparado y la sonda. Mientras que ésta se desplaza por sobre el preparado, se mantiene constante la corriente debido al movimiento automa- tico de la sonda hacia arriba y hacia aba- jo por las irregularidades de la superficie del preparado. La informacién obtenida durante estos movimientos se registra en una computadora, la cual produce una “imagen” de la superficie del preparado. La microscopia de tinel de barrido per- mite, entre otros adelantos, obtener una imagen de las dos hebras de la molécula de DNA. La microscopia de tunel de barrido esta limitada por la necesidad de que el prepa- rado sea un conductor eléctrico. Difraccién de rayos X La difraccién de rayos X es un paso adi- cional en direccién a la resolucién de de- talles cada vez mas pequefios mediante la aplicacién de rayos de longitud de onda mas corta. Los rayos X parecerfan ser es- pecialmente adecuados para el andlisis microscépico, dado que se puede aumen- tar el poder de resolucién, pero no existen lentes capaces de enfocar y sacar prove- cho de estas longitudes de onda tan cor- tas. En lugar de lentes se debe aplicar el andlisis matemdtico, lo cual limita la uti- lidad. El principio se basa en enviar un estre- cho haz de rayos X a través de la muestra que se desea analizar (fig. 2-9). El haz se separa y se dispersa en un patron de di- fracci6n (lat. fractum, rotura) que se regis- tra en una pelicula fotografica ubicada por debajo de la muestra. En la practica sélo es posible utilizar la difraccién de rayos X en la investigacién de estructuras muy or- denadas de naturaleza cristalina 0 semi- cristalina (de alli que, en ocasiones, se de- nomina cristalografia de rayos X) dado que, en los demas casos, el patrén de di- 26 METODOS HISTOLOGICOS Pelicula fotografica Haz de rayos X Cristal de NaCl fraccién obtenido es casi imposible de descifrar. Incluso en las estructuras orde- nadas la falta de imagen formada hace que se pierda informacion referida a las rela- ciones entre las fases y los rayos secunda- rios, por lo que el patrén de difraccién no se corresponde con exactitud con el obje- to investigado. En consecuencia se debe trabajar con aproximaciones e interpreta- ciones, que sdlo presentan la estructura mds probable. Sin embargo, la difraccién de rayos X ha tenido importancia fundamental en el desarrollo de la biologfa molecular y ha permitido obtener informacién esencial respecto a mds de 300 macromoléculas, entre ellas la mioglobina, la hemoglobina y el DNA. Métodos de observacién directa de células y tejidos vivos Si bien el objetivo de la histologia es la descripcién y la comprensién de la es- tructura de las células y de los tejidos vi- vos, lamentablemente, por motivos técni- cos, a menudo ha sido necesario seguir el camino de la investigacién de tejidos muertos y preservados. Los procedimien- tos utilizados implican muchas posibili- dades de modificacién del aspecto de las estructuras debidas a causas técnicas y dejan sin respuesta numerosas incégnitas referidas a los procesos celulares vitales. Ademas, es imposible lograr un control mas directo sobre el medio que circunda a la célula y crear modificaciones experi- mentales del mismo. En consecuencia, existen claras venta- jas en el estudio de células y tejidos vivos; a continuacién se verdn algunos de los métodos disponibles. Fig. 2-9. Dibujo esque- matico del principio de difracci6n de rayos X. (Segin Amberson y Smith.) CAPITULO 242-10. Dibujos de z o de tejido conec- fo embrionario. Ena = observa el explantado 9 una masa central a, rodeada del creci- ento mas claro. by c an el desarrollo a ios crecientes. in Leonhardt.) Paw lo Cultivo de tejido El cultivo de tejido es un importante método para el estudio de poblaciones ce- lulares vivas fuera del organismo. El] mé- todo se menciona a menudo como cultivo in vitro, dado que se refiere a frascos de reactivo o de vidrio (lat. vitro, vidrio), a diferencia de in vivo, es decir, en el orga- nismo vivo. En la actualidad, el cultivo de tejido se clasifica en tres categorias: 1) El] cultivo de células comprende el cultivo de células aisladas, ya no organizadas en un tejido. Las células se pueden transportar a otro frasco con medio de cultivo, a medida que crece su mimero. 2) El cultivo de tejido por lo general comprende la transferencia de un trozo de tejido embrionario (gr. embryon, feto) 0 explantado a un medio de cultivo. Durante el cultivo crecen ex- crecencias celulares, que suelen ser de ti- po conectivo (fig. 2-10), mientras que las células especializadas del 6rgano perma- necen en el explantado, donde mantienen algunas de sus funciones caracteristicas. 3) El cultivo de 6rganos comprende el ex- plantado de é6rganos embrionarios o ma- duros (totalmente desarrollados), como o6rganos completos o partes de ellos. Se in- Inicios del cultivo de tejido El cultivo de células eucariotas co- menzo6 a principios de este siglo, como parte de la investigacién tendiente a de- terminar si los filamentos nerviosos cre- cfan desde el cuerpo de la célula nervio- sa hacia el exterior o se formaban por fu- sién de una serie de secciones preforma- das del filamento. Ross Harrison colocé partes de médula espinal del sistema nervioso no desarrollado de una rana en un codgulo linfdtico y observé, con el microscopio, la clara formacion directa de filamentos nerviosos, como prolonga- ciones del cuerpo celular. Otro pionero tenta mantener la estructura del 6rgano y sus funciones normales, ademas de su po- sible evolucién ulterior. Las primeras células de mamiferos que se observaron en estado vivo fuera del or- ganismo fueron las células sanguineas. Eran de facil acceso y se podian analizar al colocar una gota sobre un portaobjeto, cubierta por un cubreobjeto, y sellar los bordes para evitar la evaporacién. Si se calentaba a temperatura del cuerpo la pla- tina del microscopio se lograban condi- ciones muy cercanas a las del organismo vivo. De esta manera se descubrieron los distintos tipos de glébulos blancos y sus propiedades de movimiento independien- te y de captacién de particulas (véase cap. 3). En la actualidad estos cultivos a corto plazo de glébulos blancos tienen amplia aplicaci6n como el método mds simple para estudiar los cromosomas humanos (mds detalles en el cap. 4). Los estudios mds prolongados y la in- vestigacion de las células en los tejidos or- ganizados u 6rganos recién fueron posi- bles después de la incorporacién de los cultivos de tejido. Para los estudios de cultivo de tejido se toma la muestra y se mantiene estéril (libre de microorganis- mos vivos), porque los factores de creci- fue Alexis Carrel, quien demostré, entre otros descubrimientos, que los extractos de fetos de pollo estimulaban el creci- miento y la divisién celular. Esto condu- jo al establecimiento de lfineas celulares permanentes y estimul6 el interés en la investigacién del crecimiento, la diferen- ciacién y la divisién de las células me- diante el cultivo de tejidos. : Esta técnica clésica de explantado in- cluido en un coégulo ha experimentado numerosas mejoras técnicas que incre- mentaron mucho las posibilidades de aplicacién. METODOS HISTOLOGICOS 27miento también favorecen la formacién de bacterias y hongos. Después de obtener la muestra se debe mantener el tejido en una solucié6n de composici6én similar a la de los liquidos tisulares. Mediante el trata- miento cuidadoso con enzimas digestivas como tripsina y colagenasa, que degradan el material extracelular tendiente a man- tener unidas las células, se liberan las uniones entre ellas. El proceso se facilita con el-agregado de sustancias que captan calcio, dado que los iones calcio son nece- sarias para la adhesién intercelular. Ade- mas se efecttia una separaci6n mecdanica. De esta manera, el tejido obtenido se divi- de en células individuales. Después del agregado de medio nutriti- vo se pueden mantener las células en un cultivo en suspensién, en el que flotan, 0 se pueden transferir a una superficie de vidrio o de plastico, al que se adhieren. Sobre esta superficie crecen las células y forman una capa tinica, denominada mo- nocapa. La composicién del medio nutritivo es de importancia critica para el exito del cultivo de tejido. La meta ideal buscada ha sido obtener medios sintéticos con compo- sicié6n quimica totalmente definida y sin el agregado de sustancias orgdnicas naturales como, por ejemplo, plasma sanguineo. Es- te tipo de medio representa las mejores condiciones para la investigacién de la in- fluencia de distintas sustancias sobre el crecimiento y la funcién de las células es- tudiadas, por ejemplo, factores de creci- miento bien definidos. Hasta el momento, los medios sintéticos desarrollados sélo satisfacen los requerimientos de creci- miento de muy pocos tipos celulares, dado que la mayorfa de las células y tejidos so- lamente se pueden mantener vivos duran- te corto tiempo sin el agregado de suero al medio. En estos tiltimos casos se habla de medios naturales. Un paso importante ha sido la posibilidad de agregar antibidticos y disminuir asi en gran parte el problema de las infecciones bacterianas en los me- dios de cultivo. La temperatura 6ptima pa- ra el cultivo de células es de alrededor de 37,5°C para las células de los mamiferos (si bien varia en parte para distintos teji- dos), pero para mantener una poblacién celular durante un periodo mds prolonga- do es necesario recurrir al congelamento. En condiciones normales, las células mue- ren debido a la formacién de cristales de hielo si se las enfria por debajo del punto de congelacién pero, si se toman algunas precauciones, es posible controlar la for- macién de cristales y entonces se pueden congelar y preservar en nitrégeno liquido a—196°C durante meses 0 afios. Si después se descongelan, estardn en condiciones de continuar su crecimiento, 28 METODOS HISTOLOGICOS Mediante el cultivo de tejidos es posi- ble aislar clones celulares. Un clon celu- lar (gr. kKlon, rama, brote) es una poblacién de células idénticas, originadas de la mis- ma célula por mitosis (divisién celular). El establecimiento de un clon celular, de- nominado clonacién, se efectuia, en prin- cipio, a través del aislamiento de células individuales, que después generan el clon por cultivo, A-su vez, el clon da origen a una linea celular pura, es decir, un culti- vo compuesto por un tnico tipo celular. Para muchas de las investigaciones que se realizan mediante cultivos de tejido es ne- cesario el empleo de lineas celulares pu- ras. También es posible aislar el tipo celular que se desea investigar a partir de una suspensién mixta, que contenga distintos tipos celulares. Un método especialmente efectivo para este fin es la seleccién celu- lar activada mediante fluorescencia (FACS). Se utilizan anticuerpos que se fi- jan exclusivamente al tipo celular que se desea aislar. A las moléculas de anticuer- po se le adiciona un colorante fluorescen- te (véanse mas detalles mas adelante) y se agrega la mezcla a la suspensién mixta de células. El anticuerpo fluorescente se fija exclusivamente al tipo celular que se de- sea aislar. A continuacién se separan las células fluorescentes mediante un cito- fluorémetro de flujo. En el cultivo de tejido es importante di- ferenciar entre /ineas celulares primarias y lineas celulares establecidas. Una linea celular primaria aparece en el primer cul- tivo del tejido, denominado cultivo prima- rio, inmediatamente después de la obten- cién de la muestra, y se caracteriza por ser un tejido vital al principio, cuando hay es- casas células en relacién con el espacio disponible. Después de cierto tiempo las células pierden la capacidad de dividirse, por lo general, después de unas 50 divisio- nes celulares para las células humanas, y la mayor parte de las células mueren. Por el contrario, las lineas celulares es- tablecidas pueden crecer en cultivos con elevada densidad de poblacién. Una linea celular establecida puede aparecer espon- tdneamente, es decir, sin causa conocida, debido a que algunas células del cultivo primario retoma el crecimiento, tras lo cual suele continuar de esa manera. Si es- te tipo de linea celular se transfiere unas 70 veces de un frasco de cultivo a otro, se considera establecido. Se dice que las cé- lulas que dan origen esponténeamente a una linea celular establecida han sufrido una modificacién o transformacién es- pontdnea, donde las células transformadas tienen capacidad para formarse casi sin in- hibiciones. Sin embargo, las células tam- bién se pueden transformar si se las expo- GAP LEY EO 2Virus Sendai Heterocarion Célula hibrida (sincarion) Fig. 2-11. Dibujo esquematico de hibridacion celular. Se induce la fusién celular por agrega- do de virus Sendai, que favorece la formacion de un heterocarion y de células hibridas cuando éste se divide. ne a acciones cancerigenas como irradia- ciones, agentes quimicos o infecciones por virus cancerfgenos. Se obtene una linea celular establecida de este tipo de células transformadas a partir de un tejido tumo- ~ ral o de un cultivo primario, después que este ultimo ha sido expuesto a una accién cancerigena. Se puede entonces establecer un cultivo homogéneo de linea pura por clonacién del cultivo primario. Las lineas celulares transformadas de crecimiento ra- pido y supervivencia ilimitada (ing. im- mortal cell lines) representan un material especialmente importante para las investi- gaciones experimentales. Por ultimo se vera el fenémeno de hibri- dacién celular, de gran importancia en la investigacién de células cultivadas. Las cé- lulas hibridas se forman por fusién celular, es decir, la unién de dos o mas células. La fusién celular se puede producir en forma espontdnea, por ejemplo en la fecundacién, cuando se unen las células sexuales mascu- linas y femeninas, pero también se demos- tré, alrededor del afio 1960, que ocurre en la formacion de células hfbridas en cultivos celulares. Sin embargo, recién cuando poco después se descubrié que era posible indu- cir la fusién celular en los cultivos celula- res, mediante el agregado de ciertos virus (el mds usado es el denominado virus Sen- dai, que incrementa la tendencia a la fusi6n de las membranas celulares), cobré real im- portancia la técnica de la hibridacién. Me- diante la fusién de dos células diferentes desde el punto de vista genético, la célula formada contiene dos nticleos con distinto contenido genético, lo que se denomina he- terocarion (fig. 2-11). Algunas de las célu- las formadas tendrén capacidad para divi- dirse y los dos nticleos comienzan la divi- sién al mismo tiempo. A su vez, esto a ve- ces también da lugar a la formacién de dos células, cada una de las cuales contiene un nticleo. Este nvicleo (en cada una de las dos células hibridas neoformadas) contiene una copia de los cromosomas de ambas células; este tipo celular se denomina sincarion. Entre otras aplicaciones, la hibridacion celular ha contribuido a las investigacio- nes sobre el crecimiento de células tumo- rales, donde se han fusionado células nor- males con células cancerosas. La técnica también se ha utilizado para demostrar que las protefnas de las membranas celu- lares tienen capacidad para desplazarse dentro de estas tiltimas, como se vera con mayor detalle en el capitulo 3. Una aplica- cién muy especial es el desarrollo de an- ticuerpos monoclonales, cuya utilizaci6n tiene gran importancia en las investiga- ciones inmunohistoquimicas (véase mds adelante en este capitulo). > Para terminar con el tema de cultivo de tejido se puede decir que, si bien no es una alternativa, representa una posibili- dad para realizar trabajos experimentales sobre tejidos humanos sin chocar con pro- blemas éticos. Manipulacién experimental de células vivas Ademas de las posibilidades experimen- tales de actuar sobre células y tejidos a tra- vés de las modificaciones del medio circun- nn nee aEnrEnTIE EEE EEEEEEEETIREREEEREERREER RnR EnE ane ea eee METODOS HISTOLOGICOS 29Macréfagos que contienen carmin de litio Fig. 2-12. Tincién supravital de macréfagos de tejido conectivo, por agregado de carmin de litio a un preparado de tejido vivo. Las parti- culas rojas de carmin de litio han sido fagocita- das por los macréfagos. x440. dante relacionadas con el cultivo de tejido, existen varios métodos para la manipula- cién mds o menos directa de células vivas. Tinciones vital y supravital. Algunos colorantes relativamente inocuos son cap- tados en forma selectiva por determinadas células vivas. En consecuencia, la locali- zacion del colorante se puede utilizar pa- ra detectar estas células o determinadas organelas, a las que se une el colorante después de ser captado. De esta manaera también se pueden identificar algunas sustancias intercelulares. Para la tincién vital se inyecta el colo- rante en el animal vivo. Para la tinci6n su- pravitalse agrega el colorante a las célu- las.o-el tejido-vivo-después de su-extrac- cién del organisma. El azul tripdn y ? componen de particulas fi ae y han teni- do importancia definitiva para el estudio de la fagocitosis, es decir, la forma en que determinadas células captan particulas del medio (fig. 2-12). El rojo neutro y el verde Jano,se utilizan para 6] éstiidio de los glébulos blancos/ El verde Jano;tifie selectivamente las mitecon- dri 7eF rojo neutro_para—identificar_los distintos subtipos de leucocitas. La alizarina se une a la matriz 6sea neo- formada y le confiere coloracién roja. La tincién vital con alizarina ha sido muy 30 METODOS HISTOLOGICOS importante en los trabajos sobre el meca- nismo de crecimiento 6seo, Micromanipulaci6n mecanica. Nume- rosas técnicas, agrupadas bajo‘la denomi- nacién micromanipulacién o microciru- gia, se han desarrollado sobre la base del micromanipulador. Este instrumento se compone de un microscopio, en el que el preparado a estudiar se encuentra en una camara huimeda de operacién, sobre la platina. En el micromanipulador se mon- tan agujas finas, ganchos o pipetas de vi- drio, cuyos extremos aparecen en el cam- po visual y que se pueden desplazar con tanta precisién, que se pueden disecar las células individuales con gran aumento. Este método de diseccién ha incrementa- do el conocimiento de la naturaleza fisica de las células. Se ha demostrado que el pro- toplasma es viscoso y se han desplazado las organelas dentro de la células. También se puede empujar el nticleo celular dentro del citoplasma y ha demostrado ser una vesicu- la deformable llena de liquido. Asi, se pue- den hacer muescas en él al presionar con una aguja. Con la microdiseccién también se demostr6 muy pronto la existencia de una membrana celular (fig. 2-13). Fig. 2-13. Fotomicrografias (a campo oscuro) de células huevo de rana vivas, que demuestran cémo se procede en la micromanipulacion mecanica. En a se observan dos invaginacio- nes en la membrana celular producidas por pre- sidn con dos microelectrodos. En b se visuali- zan los microelectrodos después de atravesar la membrana celular hacia el interior del citoplas- ma. La medida incluida representa 100 um. (Se- gun Kanno y Loewenstein.) CAP{TuLto raFig. 2-14. Fotomicrogra- fia de una neurona de la retina captada con mi- croscopio de fluorescen- cia. Mediante un microin- yector se inyecto el colo- fante fluorescente amari- ®o Lucifer directamente @n la neurona viva. Luego $2 sacrificd el animal y se =fectu6 un preparado his- Mlsgico de la retina. (Ce- ida por J. Zimmer.) SemeriTuLo 2 Los microelectrodos son pipetas muy finas que contienen soluciones salinas concentradas. Mediante la micromanipu- lacién se inyectan éstas en las células, y después se puede medir la diferencia de Fig. 2-15 Fotomicrografia de una célula viva cap- tada con microscopio de contraste de fase. La cé- lula se encuentra en la etapa denominada metafa- se de una division celular, por lo que se observan claramente los cromosomas. La linea clara an- gosta entre las dos flechas se forma por irradia- cién con un haz de luz ultravioleta de 3 um de ancho, que parece haber “desplazado” un corto segmento de una hilera de cromosomas parale- los. Esto se confirma al demostrar que los seg- mentos claros de cromosomas ya no contienen DNA (mediante investigacién histoquimica, segun el método de Feulgen). x900. (Seguin Bloom y Ozarslan.) potencial eléctrico entre el interior de la célula y el medio (fig. 2-13), De esta mane- ra es posible investigar los potenciales de membrana variables de los tejidos nervio- soy muscular. Los microinyectores son una variante especial de microelectrodos y se pueden emplear para la inyecci6én de cantidades microsc6picas (picolitros) de sustancias dentro de las células. Una aplicacién es- pecial es la inyeccién de un colorante que difunde en las distintas partes del cito- plasma y que se hace fluorescente con el microscopio 6ptico. Con esta técnica es posible dibujar el contorno de cada célula individual en tejidos con estructuras muy complicadas, por ejemplo, del sistema nervioso central (fig. 2-14). Utilizacién de haces de rayos angostos y de alta energia. Mediante aparatos es- peciales es posible concentrar protones en un haz de rayos con un didmetro de 2,5 um, y con irradiacién ultravioleta se pueden lograr didmetros de alrededor de 1 um. Este microrrayo es tan angosto que puede incidir y, en consecuencia, destruir los componentes individuales del nucleo celular, por ejemplo, parte de un cromoso- ma (fig. 2-15). En el ultimo tiempo se han utilizado especialmente los rayos laser con este propésito. Microcinematografia. Si bien esta téc- nica no implica en si misma una manipu- lacién directa de células vivas, representa un método importante para su observa- cién. La microcinematografia (gr. kinema, movimiento) es una técnica que registra en una pelicula (como imagenes vivas) lo que se observa a través del objetivo de un microscopio, mediante una camara de vi- deo. Tiene especial importancia para el andlisis de movimientos cuando son de- masiado répidos o lentos para poder ser considerados directamente. Por ejemplo, con una aceleracién de cien veces es posi- ble observar la divisién celular y, ademas, se puede observar cémo se desplazan. las mitocondrias dentro de la célula viva. Por el proceso inverso (frenando los movimientos muy rdépidos) es posible analizar, por ejemplo, los movimientos de las cilias. Métodos de fraccionamiento celular Mediante los métodos de fracciona- miento celular es posible separar los dis- tintos componentes celulares y mantener, al mismo tiempo, sus funciones. Por lo tanto, los métodas de fraccionamiento ce- lular han jugado un importante papel en la resolucién de la organizacién funcional de la célula. METODOS HISTOLOGICOS 31> ck Rn RE Centrifugaci6n diferencial (centrifuga- cién dinamica). Este es el método mas uti- lizado para la separaci6n de organelas ce- lulares. Antes de la centrifugacién se efec- taa una homogenizacién. Se colocan pe- quefios trozos de tejido en una solucién adecuada (p. ej., de sacarosa) que contri- buye a mantener intactas las organelas y se opone a su tendencia a agruparse. Des- pués se coloca la solucién con los trozos de tejido en un homogenizador, que pue- de tener la forma de un cilindro de vidrio, en el cual rota a gran velocidad una vari- lla de teflén (fig. 2-16). Los trozos de teji- do son aplastados por la friccién de la va- rilla contra las paredes del cilindro. Asi se rompen las membranas celulares y que- dan libres en la solucién las organelas y las inclusiones. Se pueden utilizar otros métodos para la homogenizacion de las células y los tejidos, por ejemplo ultraso- nido. Después de unos minutos de reposo se centrifuga el sobrenadante (lat. super- natant, flotante) con velocidad moderada y temperatura apenas superior a 0°C. Des- -pués de la sedimentacion de las particulas mas pesadas se puede hacer sedimentar las particulas con masa menor, mediante centrifugaciones con velocidades crecien- tes. La identificacién de una fraccién y la evaluacién de su grado de pureza, en el caso de los nticleos celulares, se puede efectuar por microscopia de contraste de fase. Las particulas mds pequefias (es de- cir, la mayoria) deben ser identificadas mediante microscopia electrénica de los cortes ultrafinos del sedimento sdélido ob- tenido por centrifugacién, el denominado “pellet”. De esta manera se tiene la seguri- dad de que las fracciones no contienen mezclas de distintos tipos de organelas. Centrifugacién por gradientes de den- sidad (centrifugacién equilibrada). Con este método es posible obtener mayor cantidad de fracciones mds limpias que con la centrifugacién diferencial. Se ob- tiene el homogenizado como en el caso anterior y se agrega una solucién de, por ejemplo, sacarosa, que contiene concen- traciones crecientes de sacarosa a medida que se acerca al fondo, es decir, con den- sidad creciente. La centrifugacién prolon- gada a gran velocidad hace que las parti- culas sedimenten en el sitio que les per- mite su densidad (se detienen cuando al- canzan una “profundidad” equivalente a su propia densidad). De esta manera se logra obtener fraccio- nes casi puras de nticleos, elementos nu- cleares, mitocondrias, lisosomas, riboso- mas, reticulo endoplasmatico y granulos de secrecién. Estos homogenados celula- res fraccionados, en los cuales los compo- nentes mantienen su funcién bioldgica, se denominan sistemas libres de células. El 32 METODOS HISTOLOGICOS _jaci6n, para detener los procesos Cé estudio de estos sistemas libres de células ha contribuido con gran parte del conoci- miento actual sobre la biologia molecular de la célula, por ejemplo respecto a la re- plicacién y la transcripcién del DNA y a la sintesis de proteinas. En afios recientes, los métodos de frac- cionamiento celular han sido suplementa- dos con varias técnicas para la investiga- cién de macromoléculas, entre ellas dis- tintas formas de cromatografia y de elec- troforesis. Sin embargo, estas técnicas pertenecen mas a la parte bioquimica de la biologfa celular y no se las incluira en esta presentacién general (se refiere al lec- tor a textos de biologia molecular y bio- quimica), si bien es obvio que se hard re- ferencia a ellas en relaciones relevantes de los préximos capitulos. Preparacion e investigacién de tejidos muertos El estudio directo de células y tejidos vivos sélo tiene aplicaciones limitadas. Es dificil diferenciar los distintos componen- tes entre si con la microscopia de transmi- sién, dado que tienen igual grado de re- fraccién de la luz. Ademas, por lo general el tejido presenta un espesor tal que la pe- netracién de la luz es demasiado escasa. En consecuencia, se utiliza con mucha mayor frecuencia el tejido muerto, que se mantiene mediante acciones quimicas in- mediatamente después de extrafdo y en- tonces se corta en secciones muy delga- das, denominadas cortes histolégicos. Después de la tincién con distintos colo- rantes se observan los cortes con el mi- croscopio 6ptico, dado que el mayor con- traste entre los componentes tisulares per- mite diferenciarlos. Es obvio que al prepa- rar los cortes histolégicos se debe procu- rar mantener, en lo posible, el aspecto de las estructuras en el organismo vivo. Preparacién de tejidos para microscopia 6ptica _Fijacién. La jas se matan con la fi- rapidez posible y dindmicos.con's Tay ‘ Toa ificaciones posibles. Esto se logra con la insolubilizaci6n de los componentes estructurales de la célula y la formacién de enlaces cruzados, por la accién de dis- tintos agentes quimicos, los fijadores. En el proceso de fijacién jse_estabilizan_las _proteinas, porque los fijadores favorecen la formacién de enlaces cruzados entre las moléculas proteicas. De esta manera se tmantienen todas las relaciones entre las estructuras como en la célula viva. Las GASRE Tr Oro 2Fig. 2-16. Dibujo esque- matico del procedimiento de fraccionamiento ce- lular (véase el texto para los detalles). Homogeneizaci6n fe Restos de tejido conectivo Centrifugaci6én 1.000 g, 10 min Sobrenadante Centrifugaci6én 10.000 g, 20 min Sobrenadante Centrifugaci6n 100.000 g, 1 hora Sobrenadante } Centrifugacion 200.000 g, 1 hora } proteinas solubles se unen a las estructu- rales y se transforman asf en insolubles. Al mismo tiempo se alcanza cierta fuerza mecdénica, que posibilita los pasos si- guientes del proceso de preparacién. Al-. Sobrenadante “Microsomas” Complejo de Golgi _gunos fijadores como, por ejemplo, el for-_. maldehido y, en especial, el glutaraldeht-__ Célula intacta / Reposo unos 15 min } Nucleos celulares Mitocondrias te Hiposomeas eee _do son especialmente efectivos en lo refe- rido a la formacién de enlaces transversa- les. Estos dos fijadores, junto con el _tetré- xido de osmio, que también forma enlaces ansversales, son algunos de los agentes mas efectivos. Mantienen el aspecto de la célula en condiciones muy similares a las METODOS HISTOLOGICOS 33at que se observan con el microscopio de contraste de fase, como control de la es- tructura de las células vivas. La fijacién también | praduce la inactiva- cién-de- algutias de Tas enzimas_ celulares, las cuales de otro modo iniciarfan la auto- digestién o autélisis y conducirian a la degeneracién post mortem (lat. mors. muerte). Ademas, se eliminan bacterias y muchos otros microorganismos, que po- drian destruir el tejido. En la practica, la fijacién se lleva a ca- bo por inmersién de un pequefio trozo de tejido en el fijador, apenas se haya to- mado la muestra. Es conveniente reali- zar la extracciédn del tejido mediante pinzas y una cuchilla afilada, y procurar no dajfiar el tejido. Para los tejidos huma- nos, esto se puede efectuar durante pro- cedimientos quirtirgicos o por biopsia (gr. bios, vida; opsis, sin), es decir, una muestra de tejido extraida del organismo vivo. De los tejidos accesibles directos, como la piel, se puede tomar la muestra por corte con cuchillo, pero también es posible tomar muestras de 6rganos inter- nos como, por ejemplo, el higado o el ri- fién, mediante cdnulas especiales. Las biopsias también se pueden extraer du- rante procedimientos como endoscopias (gr. endon, dentro; skopein, ver), es decir estudios internos de cavidades mediante un instrumento munido de una fuente luminosa, el endoscopio. Después de la extracci6n del tejido se lo sumerge ere! fijador, en la fijacién por inmersion, a diferencia de la fijacién por perfusion, que se puede aplicar a animales de expe- rimentacién. En este caso se inyecta el fijador en el torrente sanguineo del ani- mal vivo anestesiado y el fijador llega por via hematégena rapidamente a todo el tejido. De esta manera se logra matar todas las células de un 6rgano completo en forma casi instantanea después de in- terrumpir la administracién de oxigeno, y se obtiene una fijaci6n mds raépida y uniforme. El método se aplica en traba- jos muy exigentes, por ejemplo prepara- dos para microscopia electrénica, en los que se destacan con nitidez incluso las pequefias modificaciones estructurales post mortem. Inclusi6n y corte-E] tejido fijado se cor- ta en secciones delgadas, que permiten-el _paso-de_la luz./La mayoria de los prepara- dos para microscopia 6ptica tienen un es- pesor de alrededor.de 5-10 pum) para lo que se requiere un micrétomo, instrumen- to similar, en principio, a una cortadora de fetas. Para obtener la consistencia ne- cesaria para poder cortar secciones tan delgadas_es_necesario-incluir antes el teji- do en un material que, al secarse, le con- fiera suficiente dureza. Las sustancias 34. METODOS HISTOLOGICOS _y penetra asi en el t lidifica la-parafina y forma, junto con el Fig. 2-17. La ilustraci6n muestra el corte de tejidos incluidos en un micrdtomo de parafi- na. Tras el corte se retinen los trozos en serie sobre una pequefa “cinta transportadora” y se colocan en el bafo de agua caliente de la dere- cha para que se estiren. A continuaci6én se montan sobre portaobjetos y se procesan. So- bre la mesa se ven 7 bloques de parafina, en los que se distinguen los trozos de tejido inclui- dos. Cada bloque esta fijado a un pequefno cu- bo de madera que se ajusta al micrétomo du- rante el corte del bloque. adecuadas para este fin, los medios de in- clusién, son tipos de cera insolubles en agua, por lo general_parafina. En conse- cuencia, antes de la inclusidn, es necesa- rio deshidratar el tejido. Para ello se _pasa el tejido por una serie de soluciones.acuo- sas de efano/] en concentracioes crecien- tes, hasta llegar al anhidro. E] tejido se su- merge entonces en-un-Ifquido miscible en etanol y parafina, por ejemplo|xi/eno, pro- ceso denominade “aclaramiento”. Des- pués del aclaramiento se coloca el tejido en parafina, liquida, que disuelve el xileno jido.,Al enfriar, se so- tejido incluido, un bloque sdlido o “taco”, que es lo que se secciona (fig. 2-17). A pesar de los cuidados, se producen ciertas modificaciones al procesar el taco. El alcohol y el xileno extraen grasas y el calentamiento de la inclusién inactiva muchas enzimas; ademas, a menudo el te- jido se contrae de modo perceptible. Para evitar estos problemas, a veces se efectua un corte por congelamiento de tejido fija- do ono, Un taco de tejido congelado tiene consistencia”suficiente para ser cortado en un-cridéstato (véase fig. 2-33, pag. 43). La técnica de congelacién es tan répida que se pueden obtener secciones en pocos minutos. Se utiliza, por ejemplo, para de- terminar si el material de una biopsia ex- traida en un acto quirtirgico es benigno o maligno. E] resultado de la biopsia se ob- tiene mientras el paciente permanece CAPT Ute 2Acino Islote de Langerhans mee iruLto 2 anestesiado, por lo que el cirujano puede decidir en el momento el alcance del pro- cedimiento quirtirgico. Método de congelacién-desecacidén. Con este método se intenta lograr que la variaciGn estructural y la extraccién qui- mica sean las minimas posibles, para conservar la actividad enzimdtica. Se congela rapidamente el trozo de tejido y se lo coloca en una cdmara de vacfo a ba- ja temperatura, después se seca (se deshi- drata) por evaporacién lenta (sublima- cién) del agua. En la congelacién-sustitucién se efec- tia primero una fijaci6m moderada y un tratamiento con sacarosa, después una congelacién rapida del tejido y a conti- nuacién una deshidratacié6n a —85°C en metanol puro. Una vez eliminada el agua se transfiere el tejido a un medio de inclu- sidn pldstico adecuado, que se infiltra mientras se incrementa gradualmente la temperatura hasta alrededor de —20°C. Por ultimo se polimeriza por irradiacién con luz ultravioleta el medio de inclusién, que se seca, y ya se puede cortar el taco terminado. Fig. 2-18. Fotomicrografia que muestra las ga- mas de color del método de tincién histolégica de uso mas frecuente, la coloracién con he- matoxilina-eosina (HE). E| corte de tejido es de pancreas, por lo que se distingue un islote de Langerhans, con células cuyo citoplasma se tifie de color rosa claro con la eosina, y nume- rosos acinos, con células cuyo citoplasma se ti- fe de azul lilaceo con la hematoxilina en la zo- na basal y de rosa con la eosina, en la porcién apical. x660. ‘Tas estructuras EI método es muy poco agresivo con el tejido y es apropiado para muchos proce- dimientos inmunohistoquimicos (véase mas adelante). Coloraci6én. Los cortes de tejido se sue- len montar sobre portaobjetos y se colo- rean. La mayorfa de los colorantes histol6- gicos se utilizan en solucién acuosa, por to que los cortes incluidos en parafina de- ben ser “desparafinados”, mediante un tratamiento con xileno, y rehidratados por pasajes por concentraciones decrecientes _de alcohol en agua, antes de ser tefiidos. Los cortes por congelacién se pueden tra- tar con las soluciones acuosas inmediata- mente después de seccionados. La mayor parte de los métodos de tin- cién histolédgicos se desarrollaron en fun- ci6n de su capacidad para tefiir selectiva- mente los distintos componentes tisula- res. E] método de tincién mas utilizado es la combinacién de hematoxilina y eosina (HE),-que-tifie los componentes nu de azul violdceo, mientras si todas 1 smaticas una tonalidad rosada (fig. 2- a secuencia, la tincién con HE muestra con nitidez la forma y la estructura del mi- cleo, ademas de la forma y la extensi6n de la célula. Cabe destacar, sin embargo, que la tincién histol6gica es un procedi- miento quimico y que se ha producido un gran desarrollo en los métodos que in- forman sobre la composicién quimica de las células y los tejidos. Esto se vera con mayor detalle en la seccidn sobre histo- quimica. Después de la tincién, por lo general se deshidrata y se aclara nuevamente la muestra de tejido y entonces se monta, es decir, se cubre con una gota de medio de montaje transparente (Depex, Eukitt). Por ultimo se coloca un cubreobjeto para pro- teger el preparado. Algunos medios de montaje son miscibles en agua, por lo que se puede montar inmediatamente, sin ne- cesidad de deshidratacién y aclaramiento. Preparacién de tejidos para microscopia electronica Debido al poder de resolucién mucho mayor del microscopio electrénico, en es- te caso se agudizan las exigencias de man- tener las estructuras originales del tejido. Para la fijacién se suele utilizar glutaral- dehido. También se puede emplear tefrd- xido de osmio que, ademas de fijar el teji- do, se une con las membranas lipoprotei- cas y asi logra mayor contraste en la ima- gen del microscopio electrénico. Esto se debe al aumento de la dispersién de elec- trones por la membrana, a causa del eleva- do niimero atémico del osmio. En conse- cuencia, se habla de “tincién” 0 contras- METODOS HISTOLOGICOS 35' ¥ r e ' > Granulos de la matriz Plasmalema Membrana Ribosomas Componentes de la matriz citoplasmatica CITOPLASMA 51tosol posee caracteristicas de sol, es decir, tiene consistencia mds fluida. Contiene la mayor parte de las organelas y las inclu- siones. En las células vivas, en esta zona se detectan corrientes citoplasmdticas, por las que algunas organelas citoplasmé- ticas se desplazan dentro de la célula. Inmediatamente por debajo del plasma- lema el citosol vuelve a adquirir las carac- teristicas de gel. Esta zona se denomina ectoplasma. En los preparados para microscopia 6p- tica el citosol parece contener escasas es- tructuras pero, en realidad, posee un en- tretejido reticulado formado por finos fila- mentos que acttia como un esqueleto celu- lar y forma el denominado citoesqueleto, junto con los microtibulos. Las caracte- risticas de gel del ectoplasma se deben a una importante densidad de filamentos en esta zona, respecto al endoplasma, mas fluido. En algunos casos, el citoplasma puede sufrir la modificacién de sol a gel (y a la inversa), denominada transforma- cidn sol-gel. De este modo, el gel ectoplas- matico se degrada localmente en las célu- las méviles (lat. movere), que se despla- zan mediante la formacion de sacos de en- doplasma, denominados pseudépodos (gr. pseudes, falso; podes, pies). Ademas del citoesqueleto, en el citosol se encuentran disueltas varias sustancias, entre ellas iones inorgdnicos, aminodci- dos, glucosa y macromoléculas como, por ejemplo, enzimas, tRNA y mRNA, y mu- chas moléculas precursoras. En el citosol también tienen lugar gran parte de los procesos metabdlicos de la célula. Organelas citoplasmaticas Las organelas mds conocidas (mitocon- drias, ergastoplasma, aparato de Golgi) fueron descritas mediante el microscopio 6ptico como granulos (lat. granulum, gra- no pequefio), filamentos (lat. filum, hilo), laminillas (lat. dim. de Jamina), etc., dado que se suponia que eran macizos. En la mayoria de los casos, después de la incor- poracién de la microscopia electrénica se demostr6 que estas organelas cidsicas y las descubiertas con posterioridad eran es- tructuras huecas, rodeadas por delgadas membranas (fig. 3-1). La organizacién es- tructural del citoplasma en cavidades se- paradas (ing. compartments), compuestas por organelas limitadas por membranas, tiene importancia en muchos aspectos. Los procesos bioquimicos celulares suelen tener lugar en las membranas o las super- ficies de las membranas y, en consecuen- cia, muchas de las enzimas que catalizan las reacciones quimicas estan localizadas alli. Si bien la membrana celular y las 52 CITOPLASMA membranas de las distintas organelas pre- ‘sentan, en esencia, el mismo aspecto ul- traestructural, en realidad son muy distin- tas desde el punto de vista bioquimico, ca- da una con sus propias moléculas especia- lizadas y sistemas enzimaticos caracteris- ticos. La divisién del citoplasma en orga- nelas limitadas por membrana permiten, ademas, mantener separadas las enzimas de sus sustratos, por lo que la célula pue- de ejercer control sobre los procesos meta- bélicos y mantener notables diferencias de concentracién (gradientes electroquimi- cos) en el citoplasma. Como se vera més adelante, existe un importante transporte de moléculas especificas entre las organe- las, lo cual contribuye al funcionamiento coordinado de la célula como un todo. Membrana celular (plasmalema) Una delgada membrana, denominada plasmalema (gr. Jemma, continuacién 16- gica de algo), limita la célula de su entor- no, El plasmalema es demasiado delgado para poder ser detectado mediante el mi- croscopio 6ptico pero, sin embargo, a me- nudo una linea oscura marca el limite ce- lular, como consecuencia de que la direc- cién del corte es diagonal respecto al plas- malema o porque éste forma pliegues muy cercanos entre si (fig. 3-2). La presencia de la membrana celular se demostr6 muy pronto mediante técnicas de micromani- pulacién, que permiten observar como la ruptura de la membrana causa el flujo del citoplasma hacia el exterior. La inmersi6n de la célula en soluciones hipoténicas o hiperténicas produce un aumento o una disminucién del tamafo celular, respecti- vamente, como expresién de que esta ro- deada por una membrana con permeabili- dad selectiva. Después del desarrollo de la microscopia electrénica se demostré final- mente la presencia de la membrana super- ficial. Se visualiza como una linea densa Limite celular Fig. 3-2. Fotomicrografia de células adyacentes en el epitelio plano estratifi- cado del esdfago. En este caso se observan con cla- ridad los limites celula- res. Corte coloreado con Van Gieson. x660. i 2ASP SESE CUAL FO 3Fig. 3-3. Imagen de una membrana plasmatica, _ ebtenida con microscopio _ electrénico. La imagen fue _ ¢aptada con mucho au- mento y se observa con laridad que la membrana celular esta compuesta por dos capas densas, se- ‘Paradas por una capa mas ara. x170.000. (Cedida por A.B. Maunsbach.) 3 de alrededor de 8 nm de espesor que, con mayor aumento aparece compuesta por dos capas densas de unos 2,5 nm de espe- sor, separadas por una capa mds clara de alrededor de 3 nm de ancho (fig. 3-3). Esta estructura trilaminar se vuelve a encontrar en las membranas que rodean las organe- las citoplasmdticas. Sin embargo, como ya se vio, estas ultimas membranas difieren en su composicién bioquimica. Composicién molecular de la membra- na celular. La teorfa generalmente aceptada sobre la estructura molecular de la membra- na celular es el denominado modelo de mo- saico fluido. Segtin este modelo, la mem- brana celular se compone de una capa bi- molecular de lipidos, en la cual a determi- nados intervalos se incluyen unidades pro- teicas que forman un mosaico con la doble capa lipidica (fig. 3-4). La doble capa lipidi- ca es relativamente impermeable a la mayo- ria de las moléculas hidrosolubles y repre- senta la estructura bdsica de la membrana. Las moléculas de proteina llevan a cabo las funciones mids especializadas de la mem- Fig. 3-4. Dibujo esquematico del modelo de mosaico fluido para la estructura molecular de la membrana plasmatica. (Segun Krstic.) Capa lipidica bimolecular Porcién hidréfoba de los lipidos brana y se consideran disueltas en la bicapa lipfdica. A continuacién se analizard este modelo con mayor detalle. ital Alrededor de la mitad de los lipidos de la membrana celular son fosfolipidos (los mds importantes son fosfatidilcolina [le- citina], fosfatidiletanolamina, fosfatidil- serina y esfingomielina). Son anfipdticas con un extremo hidréfilo muy polar (la “cabeza”) y un extremo hidréfobo no po- lar, compuesto por dos largas cadenas de dcidos grasos (la “cola”) (véase ademas la fig. 1-12). Los extremos no polares forman, en conjunto, el interior hidréfobo de la membrana, mientras que los extremos muy polares se orientan hacia la superfi- cie. La doble capa fosfolipidica es fluida, tiene caracteristicas de liquido, y las molé- culas de lipido de cada monocapa se en- cuentran en constante movimiento, donde se intercambian los lugares con las molé- culas vecinas. La viscosidad de la capa de- pende, en parte, de la composicidn lipidi- ca y, por ejemplo, una de-las cadenas de dcidos grasos de la cola de las moléculas de fosfolipido contiene, por lo general, uno o mas dobles enlaces (es decir, son no saturados), Esto causa un pequefio cambio de direccién de la cola, por lo que las mo- léculas de lipido presentan un empaqueta- miento menos denso y la capa es mas flui- da. La otra mitad de las moléculas lipidi- cas de la membrana esta compuesta por colesterol, que contribuye a que la doble capa lipidica sea menos fluida. Esto se de- be al rigido sistema ciclico esteroide de las moléculas de colesterol, que se interpone entre las mitades éxternas de las colas de los fosfolfpidos. Las moléculas de coleste- rol también impiden que la viscosidad dis- minuya al descender la:temperatura, dado que no permite el empaquetamiento denso (la cristalizacién) de las cadenas de acidos Oligosacaridos | Proteinas Porcién hidréfila de los lipidas CITOPLASMA 53grasos, a temperaturas inferiores al punto de fusién de los dcidos grasos. En conjun- to, el colesterol y las demas moléculas es- teroides de la membrana tienen un efecto estabilizador sobre la viscosidad. A menudo las moléculas de fosfolfpido estan densamente agrupadas alrededor de las moléculas proteicas y, en algunos ca- sos, contribuyen al anclaje de estas ulti- mas a la membrana celular. Como se vio antes, las moléculas lipidi- cas de la doble capa se pueden desplazar sobre la superficie en cada capa, lo cual se denomina difusién lateral. Durante es- te desplazamiento las moléculas lipidicas mantienen siempre la misma orientacién, con las cabezas hidréfilas dirigidas hacia la superficie de la membrana y las colas que protruyen hacia el interior. La difu- sién lateral se produce con gran rapidez, por lo que cada molécula lipidica se pue- de mover de un extremo de la célula al otro en escasos segundos. Por el contrario, el desplazamiento de las moléculas de fosfolfpidos desde una mitad de la bicapa hacia la otra, denominada flip-flop (ing. flip-flop, inversién repentina de la direc- cién), se produce sélo con intervalos de horas (o quizds incluso de dias o sema- nas), en consecuencia es en extremo limi- tado el desplazamiento total de las molé- culas de fosfolipidos desde una mitad de la membrana hacia la otra. Como se vera mas adelante, el] movimiento flip-flop de los fosfolipidos se puede producir con gran velocidad en las membranas del reti- culo endoplasmatico liso, cuando se lleva a cabo la sintesis de nuevo material de membrana, dado que, en este caso, el des- plazamiento es catalizado por enzimas denominadas translocadoras de fosfolipi- dos o flipasas. La capacidad de estas fli- pasas de desplazar determinadas molécu- las de fosfolfpidos desde una mitad de la membrana hacia la otra, en relacién con la sintesis de la membrana celular en el retf- culo endoplasmatico liso, es esencial para una importante propiedad de la membra- na celular, su. composicién bioquimica asimétrica. De esta manera, los fosfolipi- dos de la mitad externa de la membrana se componen casi con exclusividad de fosfa- 54 CITOPLASMA tidilcolina y esfingomielina (es decir, mo- léculas lipidicas con colina en el extremo polar), mientras que la mitad interna de la membrana contiene una proporcién mu- cho mayor de los fosfolipidos fosfatidile- tanolamina y fosfatidilserina. Estos ulti- mos poseen carga negativa, lo cual produ- ce una notable diferencia de carga eléctri- ca entre las dos caras de la doble capa li- pidica. La composicién asimétrica de la doble capa lipidica también tiene impor- tancia funcional en otro aspecto, dado que la fosfatidilserina y otro fosfolipido rela- cionado con la mitad interna de la mem- brana, el fosfatidilinositol, intervienen en la transmisién de determinadas sefiales desde el plasmalema hacia el interior de la célula. La composicién asimétrica del plasmalema se refuerza atin mds por la presencia de glucolipidos que, en lugar de grupos fosfato tienen cortas cadenas hi- drocarbonadas, u oligosacdridos, unidos a los lipidos. Sélo se encuentran glucolipi- Fig. 3-5. Este dibujo esquematico muestra una membrana celular, separada por la parte me- dia de la doble capa lipidica mediante la téc- nica de congelacion y fractura. Tras la division, las particulas de alrededor de 8 nm de tamano en el interior de la membrana permanecen uni- das, en su mayor parte, a la cara denominada P (protoplasmatica), es decir, la superficie que mira hacia el exterior de la mitad interna de la mem- brana. En la cara denominada E (extracelular), es decir, la superficie que mira hacia el interior de la mitad externa de la membrana, se obser- van sobre todo oquedades. (Seguin Krstic.) Particulas Oquedades de 8nm Lamina densa externa Lamina densa interna ~ Parte media de la doble capa ‘lipidica CAPT? ULSO 3Fig. 3-6. Imagenes de uma réplica de un prepa- ‘tado obtenido mediante la ‘técnica de congelacion ¥ fractura, captadas con Microscopio electrénico. as imagenes muestran ©! aspecto de las caras P VE. respectivamente, de ‘uma membrana celular. *37.000. (Cedida por B. Wan Deurs.) 3-7. Dibujo esque- o de los distintos ti- s de proteinas de brana. MPiTULO Proteina transmembrana dos en la mitad externa de la bicapa de la membrana, donde sus grupos hidrocarbo- nados protruyen sobre la superficie celu- lar. Como se verd mas adelante, alli inter- vienen (junto con otras moléculas hidro- carbonadas ligadas a las proteinas de la membrana celular) en el denominado glu- cocaliz y cumplen importantes funciones en los procesos de senalamiento y de re- conocimiento entre las células. Las proteinas de la membrana se en- cuentran incluidas o disueltas en la doble capa lipidica de la membrana celular, y protruyen en diverso grado sobre las su- perficies interna o externa de la membra- na celular, o de ambas (fig. 3-4). Mediante la técnica de congelacién y fractura se han obtenido importantes evidencias respecto a la presencia de proteinas como un mo- saico incluido dentro de la membrana. En los sitios donde la superficie de la mem- brana transcurre paralela al plano de frac- tura, gran parte de la membrana se escin- ESPACIO EXTRACELULAR Proteina de paso multiple é paso unico OOO COO OU ONO OG UO COU COO OOOO ONO OVO OM OO OhG) DOC OOO CO UOOC UO OOOOOOOtO transmembrana de de a lo largo de la mitad de la doble capa lipidica, por lo que es posible estudiar la estructura interna de las membranas me- diante microscopia electrénica. Se obser- van entonces particulas de alrededor de 8 nm de didmetro, que posiblemente estén compuestas por proteina (figs. 3-5 y 3-6). Mientras que la composicién basica, bastante uniforme, del plasmalema y del. resto de las membranas celulares se debe a la presencia de la doble capa lipidica, Ja cantidad y el tipo de proteinas es muy va- riable en los distintos tipos de membrana, lo cual les confiere sus identidades fun- cionales especiales. Se han demostrado cientos de distintas protefnas de membra- na, que desempefian determinadas fun- ciones de membrana especificas, por ejemplo, protefnas de transporte, recepto- res, sitios de anclaje para componentes extracelulares o intracelulares, o cataliza- dores (enzimas) (mas adelante se estudia- ran con mayor detalle las funciones de la membrana). Alrededor del 50% del plas- malema se compone de proteina (el resto esta formado por lipidos), pero la canti- dad de moléculas proteicas es mucho me- nor que la cantidad de moléculas lipidi- cas, debido al menor tamafio de estas ulti- mas. Por su parte, la cantidad de proteina presenta notables variaciones, precisa- mente debido a que estos compuestos es- tan relacionadas con las funciones espe- ciales de cada membrana en particular. En general, las protefnas de membrana se clasifican en proteinas integrales de Proteina periférica CITOPLASMA 55membrana, protetnas de membrana perifé- ricas y proteinas unidas a lipidos (fig. 3-7). Las proteinas integrales de membrana son moléculas anfipaticas con zonas hidré- fobas no cargadas, que se extienden a tra- vés de la totalidad de la doble capa lipidi- ca, y zonas hidréfilas con carga, localiza- das en las superficies externa e interna de la membrana, donde se encuentran en un medio acuoso. Las proteinas integrales es- tén ancladas a la membrana a través de los aminodcidos de la porcién hidréfoba, que se ecuentran en estrecho contacto con las cadenas hidréfobas de los dcidos grasos de la bicapa lipidica. En consecuencia, se las considera integrales en el sentido de que sélo se las puede extraer mediante méto- dos que disuelven la doble capa lipidica de la membrana (como, por ejemplo, la extrac- cién con solventes orgdénicos). Como se describié antes, las proteinas integrales de membrana son transmembrana y represen- tan la base estructural de la mayor parte de los mecanismos de transporte especificos y de los receptores relacionados con la mem- brana. Algunas se extienden sélo una vez a través de la doble capa lipidica y se deno- minan proteinas transmembrana de paso tinico, mientras que la cadena polipeptidi- ca de otras atraviesa varias veces la bicapa lipidica, en cuyo caso se denominan pro- teinas transmembrana de paso multiple. Las porciones hidrdéfobas de las moléculas proteicas que atraviesan la doble capa lipi- dica presentan la forma de hélice alfa. Las proteinas de membrana periféricas son moléculas hidrdfilas cuyas cadenas polipeptidicas se localizan por fuera de la doble capa lipfdica, sobre las superficies externa o interna de la membrana. Estén unidas mediante enlaces no covalentes a otras proteinas de membrana o a los gru- pos de las cabezas de los fosfolipidos, por lo que se pueden extraer mediante la apli- cacién de procedimientos menos agresi- vos (p. ej., soluciones de elevada concen- tracién idnica, de pH muy diferente, o la eliminacién de Ca* del medio circundan- te, por tratamiento con EDTA). Las proteinas unidas a lipidos se pueden caracterizar como intermedias entre las proteinas integrales y periféricas. Al igual que estas viltimas se localizan por fuera de la doble capa lipidica, sobre las superficies externa o interna de la membrana, pero pre- sentan enlaces covalentes con las molécu- las lipfdicas de la bicapa (fig. 3-7). Los enla- ces se producen entre una cadena lateral de un aminodcido, en el extremo N-terminal de la protefna, y un grupo de anclaje, que puede ser una cadena de adcido graso o un fosfolipido. Por ejemplo, algunas proteinas quedan ancladas sobre la superficie externa de célula a través del denominado anclaje glucosilfosfatidilinositol (GP). 56 CITOPLASMA Muchas de las moléculas proteicas de la membrana celular presentan uniones con cadenas hidrocarbonadas, tales como oli- gosacdridos, sobre la superficie externa, para formar glucoproteinas. Junto con las moléculas hidrocarbonadas de los glucoli- pidos de la membrana, las glucoproteinas constituyen parte del glucocéliz. También contribuye otro tipo de hidrato de carbono de membrana, los proteoglucanos de la membrana, moléculas compuestas por una columna vertebral proteica a la que se unen largas cadenas de polisacdridos (los proteoglucanos se encuentran, casi con ex- clusividad, en la matriz extracelular; se ve- rén con mayor detalle en el capitulo 8, re- ferido a tejido conectivo). Los proteogluca- nos de la membrana celular son moléculas integrales de membrana, y la columna ver- tebral proteica se puede extender a través de la doble capa lipidica o estar adosada a la superficie externa, mediante anclaje GPI. Algunas de las proteina de membrana tienen capacidad para desplazarse libre- mente en la membrana celular por difu- sidn Jateral aunque, debido al gran tama- fio de las moléculas proteicas, la veloci- dad de desplazamiento es mucho menor que para los fosfolfpidos, Se ha demostra- do la difusién lateral de las proteinas me- diante experimentos de fusi6n celular, en- tre otros, en los que se marcaron dos tipos celulares que poseian distintos antigenos de superficie con anticuerpos adecuados, a los que se les habian adosado un colo- rante fluorescente verde y otro rojo, res- pectivamente. Poco después de la fusién celular se observ6 que la superficie estaba dividida en dos mitades, una fluorescente roja y otra verde, pero después de 40 mi- nutos de incubacién a 37°C se observaron sectores rojos y verdes diseminados por toda la superficie celular. La disminucién de la temperatura a niveles que desecan la doble capa lipidica causé una importante inhibicién del desplazamiento. No obstante, muchas proteinas de mem- brana sélo presentan difusién lateral dentro de una zona limitada de la membrana celu- lar, que parece estar compuesta por domi- nios de membrana separados. Asi, se pue- den mantener estos dominios cuando las células forman barreras proteicas debido a contactos celulares, lo cual ocurre en cier- tas células epiteliales, como es el caso del intestino delgado (los contactos celulares se verdn con mayor detalle en el cap. 6). Las proteinas de la porcién apical de las células epiteliales no se pueden desplazar hacia la parte basolateral del plasmalema, debido a la presencia de las denominadas zonulae occludentes anulares, que crean estrechas uniones entre las membranas de células ve- cinas. Este contacto forma una bien defini- fa barrera a la difusién entre los dos domi- ia GC ACP YT RL On @Fig. 3-8. Imagen de una membrana plasmatica y Su correspondiente glu- cocaliz, captada con mi- -croscopio electrénico con aumento. x170.000. (Cedida por A.B. Mauns- h.) 3 Glucocaliz nios. En este caso, las moléculas. lipidicas de la membrana tampoco pueden atravesar los complejos de contacto, en lo que respec- ta a la mitad externa de la membrana. Las proteinas también se pueden unir a determinados sitios de la membrana, por anclaje de las proteinas de membrana a ciertos elementos del citoesqueleto del ci- toplasma o a estructuras extracelulares. Glucocaliz. Todas las células eucariotas poseen una delgada cubierta externa de material rico en hidratos de carbono, la de- nominada “cubierta celular” o glucocaliz (fig. 3-8). Se puede demostrar su existen- cia mediante el método de PAS o por la unién con moléculas de lectina marcadas. Como se describi6 antes, las moléculas de hidratos de carbono que intervienen son parte de los glucolipidos de la membrana y (especialmente) glucoproteinas y proteo- glucanos, por lo que el glucocdliz es una parte integrada de la membrana celular, que desempefia un papel importante en distintas formas de interacci6n celular, por ejemplo, procesos de adhesién celular, cir- culacién de linfocitos y otros procesos de sefialamiento o de reconocimiento, dado que a menudo el glucocaliz interviene en la formacién de receptores sobre la super- ficie celular. Ua receptor es un sitio de unién —compuesto por una proteina, una glucoproteina 0 un polisacdrido— en cual- quier sitio sobre la superficie o dentro de una célula, al que se une especificamente una sustancia, por ejemplo, una hormona, un neurotransmisor, un metabolito, un agente farmacolégico 0 un virus, para en- tonces dar lugar a la formacién de una res- puesta especifica. La sustancia que se une a un receptor se suele denominar ligando (lat. ligare, ligar). La especificidad de la unién entre el receptor y el ligando se de- be a que estas uiltimas poseen complemen- tariedad estereoquimica, por lo que pre- sentan configuraciones tridimensionales que coinciden exactamente en el sitio de uni6én, como una “llave con la cerradura”. Por su parte, los hidratos de carbono son buenos antigenos e intervienen, por ejem- plo, en los antigenos de superficie de los glébulos tojos de la sangre que determinan el grupo sanguineo de un individuo. Funcion del plasmalema. En la seccién anterior se describieron brevemente algu- nas de las funciones de la membrana celu- lar, por ejemplo en relacién con la media- cién de sefiales y en los procesos de adhe- sién celular, funciones que se analizaran con mayor detalle en los capitulos 6 y 7. Aqui, para terminar, se presentaran algu- nas nociones adicionales referidas al transporte de distintas sustancias a través de la membrana celular. El transporte a través del plasmalema es fundamental para que la célula lleve a cabo el intercambio de sustancias con el medio circundante, La capacidad de las moléculas de atravesar el plasmalema de- pende en parte de la bicapa lipidica, que en principio funciona como barrera per- meable (lo que permite la separacién de las cavidades con distinta composicién quimica) y en parte de las proteinas de membrana, que facilitan el pasaje de mo- léculas de mayor tamafio. Para que una molécula atraviese la bica- pa lipidica tienen importancia el tamafio y la liposolubilidad (es decir, si es hidréfoba o no polar); a menor tamafio y mayor solu- bilidad, mayor facilidad de pasaje. Asif, pe- quefias moléculas no polares como, por ejemplo, oxfgeno, nitrégeno y didxido de carbono y, posiblemente, lipidos sin gru- pos polares atraviesan con facilidad la membrana celular por difusién simple, es decir por gradiente de concentracién (de mayor a menor concentracién) sin nigtin tipo de asistencia (véase mas adelante), dado que se disuelven con facilidad en la doble capa lipidica. Las moléculas polares muy pequefias y sin carga como, por ejem- plo, agua y etanol también pasan con rapi- dez por difusi6n simple; se cree que por su tamafio se pueden deslizar entre las molé- culas lipfdicas. A medida que aumenta el peso molecular de estas moléculas polares no cargadas disminuye la velocidad de pa- saje por difusi6n simple; por ejemplo, pa- ra la glucosa, de peso molecular 180 D, es cercana a 0. Lo mismo vale para todas las moléculas cargadas (es decir, iones), sin importar el tamafio (incluso para iones tan pequefios como Na* y K*, la permeabilidad es 10° veces menor que para el agua). Estas moléculas, que atraviesan con gran difi- cultad la doble capa lipidica, o que no la atraviesan en absoluto, son transportadas a través del plasmalema con la asistencia de proteinas especiales de la membrana, de- nominadas proteinas de transporte de membrana. Son todas proteinas integrales de transmembrana del tipo de pasaje mul- tiple, por lo cual se cree que les permite fa- cilitar el pasaje de sustancias hidréfilas a través del plasmalema, sin que éstas en- tren en contacto directo con el interior hi- dréfobo de la doble capa lipidica. CITOPLASMA 57Fibrosis quistica La fibrosis quistica es una enfermedad hereditaria grave caracterizada por la pro- duccién de una secrecién de densidad anormalmente elevada en varias glandu- las exocrinas, entre ellas, el pancreas y las gldndulas secretoras de mucus de las vias aéreas y el tubo digestivo. Esto causa dis- minuci6én del pasaje u obstruccién de los conductos de excrecién en las glandulas afectadas y retencidén de mucus espeso en Jas vias aéreas, con tendencia a la apari- cién de infecciones bacterianas. En conse- cuencia, la causa mas frecuente de muer- te, en esta patologia, son las infecciones recurrentes de las vias aéreas. Se ha demostrado que la fibrosis quisti- ca se debe a un defecto de los canales iéni- Las proteinas de transporte de membra- na se clasifican en proteinas de canal y transportadoras. Mientras que la difusién simple a través de la bicapa lipidica sélo presenta cierta selectividad gruesa frente a las sustancias que la atraviesan, las pro- tefnas de transporte de membrana son muy especificas respecto a las moléculas, cuyo pasaje facilitan. Las proteinas de canal forman poros o canales hidréfilos a través de la doble capa lipidica, que permiten el pasaje de determi- nadas sustancias disueltas (por lo general iones inorgénicos), cuando los poros estén abiertos. El pasaje siempre es pasivo (a fa- vor del gradiente de concentracién) y se de- nomina difusién facilitada. Al igual que en el caso de la difusién simple, la fuerza mo- tora es la diferencia de concentraci6n entre ambas caras de la membrana y, cuando la sustancia transportada posee carga, tam- bién contribuye la diferencia de potencial eléctrico; en conjunto se crea un gradiente electroquimico. La diferencia entre la difu- sién simple y la difusién facilitada radica Alosterismo Muchas proteinas presentan alosteris- mo, es decir que la unién de una molé- cula a un sitio determinado de Ia protei- na, el sitio alostérico, causa una varia- cién de la conformacién que se transmi- te a otro sitio de la proteina y modifica las propiedades de este segundo sitio. A menudo, este ultimo es un sitio de unién con otra molécula y, al producirse el en- lace, la proteina desarrolla su actividad, que puede ser conformar el sitio de fija- cién del sustrato de una enzima. De esta 58 CITOPLASMA cos para los iones cloro de las’células epi- teliales. También se demostré la localiza- cién del gen de la fibrosis quistica en el brazo largo del cromasoma 7 y se estable- cié la secuencia de nucledtidos. Se cree que el gen codifica una proteina denomina- da regulador de la conductancia trans- membrana de la fibrosis quistica (RCFQ), pero se desconoce atin si este factor es la proteina que forma el canal para los iones cloro, o si regula la funcién de otros cana- les para estos iones, De todos modos, el co- nocimiento del gen y de la secuencia de aminodcidos del RTFQ permite abrigar la esperanza de la posibilidad de realizar el diagndéstico prenatal y de corregir el defec- to mediante tratamiento con terapia génica. en que esta ultima se lleva a cabo mediante la asistencia de la molécula de proteina de canal, por lo que la velocidad de difusion para la sustancia en cuestién serd mucho mayor que en el caso de la difusién simple. Las proteinas de canal especificas for- man canales iénicos y en la membrana existen canales para importantes iones ce- lulares como Nat, K+, Ca**+ y Cl. La difu- sién a través de los canales iénicos no re- quiere un cambio de conformacién de la proteina de canal y, en consecuencia, la velocidad es notablemente superior a la del pasaje facilitado por transportadores (véase mds adelante). Por lo tanto, los ca- nales i6nicos no se deben considerar como simples orificios de la membrana, dado que en parte pueden discriminar entre los distintos iones (son selectivos), y en parte suelen poseer portales (ing. gates) que se cierran y se abren en respuesta a estimulos adecuados. Estos pueden ser variaciones de los potenciales de membrana, en cuyo caso se denominan canales dirigidos por potenciales, o la unién de una molécula manera, la interacci6n de una molécula con el sitio alostérico regula la actividad de la enzima, dado que puede actuar co- mo estimulante o inhibidor de la unién con el sustrato. Este proceso se denomi- na regulacién alostérica de la enzima. La proteina capaz de presentar alosteris- mo se denomina proteina alostérica y la modificacién de la conformacién, reac- cién alostérica. Es dificil estimar la im- portancia de las reacciones alostéricas en los procesos biolégicos celulares. CAP/TULO 3Molécula de glucosa glucosa 3-9. Dibujo esque- sStico del transportador glucosa. 3-10. Dibujo esque- co de la bomba de Transportador de — ATPasa Na+-K conformacién CITOSOL sefal (un neurotransmisor) a la protefna de canal, en cuyo caso se denominan ca- nales dirigidos por transmisores (véase con mayor detalle en caps. 7 y 14). Los transportadores funcionan de ma- nera diferente a las proteinas de canal, da- do que fijan la sustancia que se debe transportar a un sitio de unid6n especifico o receptor, Este proceso produce variacio- nes de conformacién alostéricas en la pro- teina de transporte, que favorecen el des- plazamiento de la sustancia a través de la membrana. La velocidad de transporte que se logra mediante este mecanismo es bas- tante menor que la del transporte a través de las proteinas de canal que, como se vio antes, no fija la sustancia transportada a través de cambios de conformacién. Mu- chos transportadores funcionan por difu- sion facilitada, es decir, transporte pasivo “a favor” del gradiente electroquimico (al ESPACIO EXTRACELULAR (S) Ki Fosforilacién seguido de cambio de la — conformaci6n — ESPACIO EXTRACELULAR Cambio de conformacién ‘ igual que lo que ocurre con las proteinas de canal), pero otras, poseen capacidad para bombear las sustancias a través de la membrana contra el gradiente electroqui- mico, proceso denominado transporte ac- tivo. Este tipo de transportadores también se denomina bombas; el proceso tiene una direccién determinada y debe estar cerca de una fuente de energia, ya sea ATP (se verdé mds sobre ATP como donante de energia al estudiar las mitocondrias) 0 un gradiente idnico, Un ejemplo de transportador que acttia por difusién facilitada es el denominado transportador de glucosa (fig. 3-9). Posee un unico sitio de unién para glucosa, ca- paz de dirigirse alternativamente hacia una y otra cara de la membrana, en corres- pondencia con las dos conformaciones al- ternativas de la proteina de transporte. En consecuencia, la modificacién de la con- Pia uido de cambio de la conformacion — CITOPLASMA 59formacién de la proteina relacionada con la unién a la molécula de glucosa causa el desplazamiento de la glucosa de un lado a otro de la membrana. La denominada bomba Na+-K- (fig. 3-10) es un ejemplo que se encuentra en el plas- malema de casi todas las células animales. En realidad, en este caso la proteina de transporte es una ATPasa (enzima que es- cinde la molécula de ATP), denominada ATPasa Na*-K+. La bomba Na*-K* trans- porta en forma activa el Na* hacia el exte- rior de la célula y el K* hacia el interior; en ambos casos, el proceso se lleva a cabo en contra del gradiente de concentracién electroquimico; la energfa es provista por la escisi6n de ATP dentro de la célula, ca- talizado por la bomba (es decir, la ATPasa). Por cada molécula de ATP que se degrada salen, por proceso activo, 3 Na* e ingresan 2. K+. Esto ocurre porque se fijan 3 Na* a los sitios de unién de la bomba Na*-K*, que se encuentran en la cara citoplasmatica del plasmalema. La unién de los 3 Na* causa la fosforilacién de la bomba Na*-K-, con degradacién simulténea del ATP; a conti- nuacién, esta fosforilaci6m produce una modificaci6n de la conformacién, que traslada los sitios de unién para el sodio hacia la superficie exterior de la célula y hace que pierdan la tendencia a unirse con el Na*. En cambio, ahora se fijan 2 K+ a los sitios de unién, orientados hacia la super- ficie externa de la membrana celular; esta unién produce la desfosforilacién de la bomba Na*-K* que causa una modificacién de la conformacién de la proteina, por lo que los sitios de union para el K* (y el Na*) nuevamente adquieren una direccién ha- cia la superficie citoplasmatica del plas- malema y, al mismo tiempo, pierden su afinidad por el K+. En consecuencia, el re- sultado neto es el tralado de 3 Na* hacia el exterior de la célula y de 2 K+ hacia el in- terior, mientras que la bomba Na*-K* alter- _na entre las dos conformaciones. Como se verd mas adelante, la fosforilacién de las proteinas es un mecanismo frecuente para causar modificaciones de las conformacio- nes, Ademas de la bomba Na*-K*, numero- sos otros transportadores estan compues- tos por proteinas con caracteristicas de en- zimas; muchos autores consideran que to- das las proteinas transportadoras de mem- brana de este tipo tienen caracteristicas de enzimas, Algunos transportadores sélo trasladan una tinica sustancia de un lado a otro de la membrana y se denominan uniporta- dores. Un ejemplo lo constituye la capta- cién celular de glucosa desde el liquido extracelular mediante el transportador de glucosa, En otros casos, estan acoplados los transportes de dos sustancias; éstos se denominan simportadores, si ambas sus- 60 CITOPLASMA tancias se trasladan en la misma direc- cién, lo que ocurre por ejemplo en la cap- tacién de glucosa del contenido intestinal por las células epiteliales intestinales, que se realiza por bombeo activo con sim- porte de Na’. Por tltimo, los antiportado- res transportan dos sustancias en direc- ci6n opuesta, como es el caso de la bom- ba Nat-K-. Si bien las moléculas de agua atraviesan la doble capa lipidica, algunos tipos celu- lares, por ejemplo, las células tubulares re- nales, poseen un sistema especializado pa- ra el transporte de agua. En determinadas zonas del plasmalema de estas células se encuentran “canales de agua” especiales, que son proteinas transportadoras de membrana y se denominan acuaporinas. Por ultimo, cabe destacar que las célu- las también tienen la capacidad de captar material del espacio extracelular por inva- ginacién del plasmalema, con desprendi- miento de una vesicula que contiene li- quido y posibles moléculas disueltas o particulas sélidas. El proceso se denomi- na endocitosis y se verd con mayor detalle en el capitulo 4. Reticulo endoplasmatico granular (rugoso) Muchos tipos celulares contienen en el citoplasma una sustancia que adquiere un intenso color con los colorantes basi- cos. En algunas células este componente celular confiere una difusa basofilia al ci- toplasma (fig. 2-18), mientras que en otras, se forman zonas baséfilas aisladas (fig. 2-23). Este material baséfilo se deno- mina ergastoplasma (gr. ergon, trabajo) o, en las células nerviosas, sustancia de Nissl (por su descubridor). Después de su descubrimiento, e¢] material baséfilo_del citoplasma se identificé posteriormente con un dcido ribonucleico, dado que se demostré que absorbe la luz ultravioleta de longitud de onda 260 nm y que se eli- mina mediante el tratamiento con la enzi- ma ribonucleasa, lo cual no ocurre con la desoxirribonucleasa. Con la microscopia electrénica se en- cuentra ergastoplasma o sustancia de Nissl] en los sitios que corresponden a un sistema de sacos limitados por membrana; se lo denomin6 reticulo endoplasmatico (dim del lat. rete, red, es decir, redecilla). Los sacos forman una red anastomosada_ (gr. anastomosis, abertura, unién_abierta) de tibulos o bolsas aplanadas ramifica-. dos, denominados cisternas. Por lo gene- ‘ral, las cisternas tienen una disposicién_ en_paralelo (fig. 3-11); no obstante, pue- den estar aisladas. Parte del reticulo endo- plasmatico puede adoptar la forma de ve- siculas aisladas de menor tamafio. ; CAP fh U 120 3Fig. 3-11. Imagen del re- ticulo endoplasmatico rugoso de una célula glandular exocrina del Pancreas, captada con microscopio electrénico. Las cisternas muy agru- _Padas, de disposicién pa- falela, estan densamente -cubiertas por ribosomas en la superficie externa ‘citoplasmatica), al igual Que la membrana externa nucleo. x32.000. (Ce- ‘Gida por J.P. Kroustrup.) 3 Nucleo Nucleolema (membrana externa) Cisternas Ribosomas La basofilia caracteristica se debe a la presencia de gran cantidad de pequefias particulas de ribonucleoproteina (RNP), Fig. 3-12. Dibujo esquematico de los aspectos al microscopio electrénico de a, una célula que sintetiza gran cantidad de proteina que per- manece en la célula, por ejemplo células em- brionarias y estados inmaduros de eritrocitos, sintetizadores de hemoglobina (con muchos ribo- somas libres en el citoplasma) y b, una célula que sintetiza gran cantidad de proteina excre- tada por la célula, por ejemplo, una célula exo- crina del pancreas (con gran cantidad de riboso- mas unidos a membrana, que dan lugar a la for- macién de reticulo endoplasmatico rugoso). lenomir s-ribosomas,, que se adosan a ~ la superficie externa de las membranas (fig. 3-11); de alli, la designacién reticulo endo- plasmatico granuloso o rugoso (RER). Los ribosomas miden alrededor de 25 nm y son asiento de la sintesis celular de proteinas., Al igual que el plasmalema, las mem- branas del reticulo endoplasmatico son de tipo trilaminar. La cavidad-del-RER se observa como una estrecha hendidura en-_ “tre las dos membramas, muy cercanas en- _tre si, Con mayor frecuencia se observa una cavidad definida que, en las células con proceso de sintesis activo, suele estar distendida debido al contenido de mate- rial electrondenso dentro de las cisternas. brana nuclear externa, dade que la cister- na perinuclear se puede considerar como _una parte del RER (véase con mayor deta- lle en el cap. 4). En mayor o menor grado, el RER puede estar relacionado con el re- ticulo endoplasmatico agranular (liso) (véase mds adelante). Los ribosomas no estén todos unidos a las membranas, también aparecertibres‘en el citosol. Se éncuentran ribosomas libres en todas las células, excepto los eritrocitos maduros, pero, por lo general, en cantidad demasiado escasa como para poder desa- trollar basofilia visible. Los ribosomas li- bres son el asiento de la sinfesis de las pro- teinas que se encuentran en el citosol y el Tmicleo celular, ademds de determinadas proteinas mitocondriales. Se encuentra una cantidad muy importante de riboso- mas libres en las células que sufren fre- cuentes divisiones; por ejemplo, las células embrionarias (y cancerosas) y las células que sintetizan una proteina especifica, que permanece en la célula (fig. 3-12); por ejemplo, los estadios iniciales de los eritro- citos, durante los cuales se sintetiza la he- moglobina. En consecuencia, estas células presentan basofilia intensa con distribu- cién difusa del colorante. CITOPLASMA 61 _E] RER es una continuacién de Ja mem-—_—_—_——_—-----—— oO Ue wg See _Los ribosomas ligados a membrana son el asiento de la sintesis de proteinas secre- toras, es decir, proteinas que son secreta- 2 das por la célula, o de proteinas Jumina- les, que permanecen localizadas en la luz “de las organelas citoplasmaticas, por ejem= plo, el reticulo endoplasmatico, el aparato de Golgi, los lisosomas y otras vesiculas citoplasmaticas. Ademas, los ribosomas li- gados a membrana son asiento de la sinte- sis de proteinas integrales de membrana, que permanecen localizadas en Ja doble capa lipidica de la membrana del reticulo endoplasmatico, una vez finalizada la sin- tesis proteica. Asf, se sintetiza la mayor parte de las proteinas integrales de mem- brana de la célula, lo cual también vale pa- ra el plasmalema (el “transporte” de las membranas se describe mas adelante). Con la sintesis de las protefnas dentro de la luz del RER se logra la separacién de estos productos del resto del citoplasma, debido a la presencia de las membranas. Esto implica que se mantienen aisladas las enzimas capaces de degradar el citoplas- ma si se encontraran libres en el citosol. Por lo general, los ribosomas libres y li- gados a membrana se encuentran en cade-_ nas denominadas polirribosomas, que contienén, de-unos pocos, hasta mds de 30 ribosomas, y forman circulos, espirales, o rosetas. ,Los_polirribosomas se_mantie- nen unidos por una hebra delgada de 1- 1,5 nm de didmetro (fig. 3-13), compuesta _ por RNA mensajero (mRNA). Los riboso- mas estén formados por dos subunidades de distinto tamafio. La subunidad mds— grande esté en contacto con la membrana cuando los polirribosomas estan ligados a la membrana (fig. 3-14). La hebra de mR- NA transcurre paralela a la membrana por una hendidura ubicada entre ambas uni- dades (un poco mas adentro de la mas pe- quena). Fig. 3-13. Imagen de un polirribosoma (de re- ticulocitos) captada con microscopio electroni- co. Se distingue con claridad que los 5 riboso- mas del polirribosoma estan unidos mediante un filamento delgado, compuesto por RNA mensajero. x280.000. (Seguin Slayter, Warner, Rich y Hall.) 62 CITOPLASMA Sintesis de proteinas. Los conocimien- tos sobre los procesos moleculares rela- cionados con la sintesis proteica provie- nen de investigaciones realizadas en siste- mas libres de células obtenidos de homo- geneizados logrados después de una cen- trifugacién diferencial (véase fracciona- miento celular en la pag. 31). Una de las fracciones, compuesta por particulas sub- microscépicas y denominada fraccién mi- crosomal, es muy rica en RNA. Los deno- _minados “microsomas” son trozos peque-. “fos de RER, limitados por membrana, que SG: forman ¢ durante el proceso de homoge-. neizacién. Después de la solubilizaci6én de las membranas, y de una posterior cen- trifugacién diferencial, es posible aislar los ribosomas y, en la década de 1950, se demostré que estas suspensiones de ribo- somas aislados tratados con aminodcidos con marcas radiactivas tenian la capaci- dad de sintetizar proteinas, siempre que se agregaran los cofactores necesarios. Los, tres s tipos de RNA intervienen en eica es decir mRNA (RNA mensajero), tRNA (RNA de trans- porte) y rRNA (RNA ribosomal). Los tres son sintetizados en el nucleo celular por _transcripcién del DNA y luego exporta- “dos al citoplasma, después de sufrir un tratamiento ulterior, como se veré con mayor detalle en el capitulo 4. Después del pasaje al citoplasma, cada molécula de mRNA tiene el esquema de produc- cién para determinado polipéptido, bajo la forma de una secuencia de grupos de tres bases, cada uno de los cuales se de- signa codén y codifica un _aminodcido _ especifico. EL tRNA interviene en la sin- tesis proteica al buscar los correspon- dientes_aminodcidos_en—el_citoplasma_. (existe-por lo menos un tRNA para cada uno de los 21 aminodcidos que forman las proteinas) y transportarlos hasta el Fig. 3-14. Dibujo esquematico de ribosomas unidos a membrana. La subunidad mayor esta en contacto con la membrana de la cisterna, mientras que el filamento de RNA mensajero se desplaza por una hendidura entre ambas subuni- dades. La proteina recién sintetizada (flecha) atraviesa la membrana hacia la luz de la cisterna. CAP LEU LO 3Fig. 3-15. Dibujo esque- 2 matico que muestra el ini- cio de la sintesis protei- ca en el citoplasma y la continuacién de la sin- tesis en el RER (véase el texto para mas detalles). LC haa LO Wu OO OO _ Citosol SS OA AA "I WV mRNA. Secuencia sefal de pioine. AAD Péstide’sintetivade es Tn AWW TT MAN AANA) sau SMAI rtibosoma. El rRNA se incluye en rere cleo celular oe a fo cleo- ellas se exporta al eae por sepa- rado, donde permanecen aisladas hasta que se incorporam al proceso de sintesis proteica. g La sintesis proteica comienza con la de- nominada \fase de iniciacion, en la cual una molécula del mRNA que codifica la _proteina a sintetizar se fija por el extremo anterior (ol ‘extrema 5 £ a la subunidad menor de un ribosoma (fig. 3-15). Durante la Lene se ubica el cod codén de i inicio del. grupo de sake AUG, (también es el codén correspondiente al aminodcido me- tionina) y representa una sefial de co- mienzo para la sintesis de la proteina, ubi- cada cerca del extremo 5’ del mRNA. Des- pués de Ja fijacién del mRNA se adosa_ urepalaniititet ribosomal mayor, con lo que el ribosoma esta en condiciones de _comenzar la sintesis proteica, es decir, fi- naliza la fase de iniciacién. /Si la protefna en cuestién debe ser sintetizada por los ri- bosomas ligados a membrana, _el mRNA tiene en su extremo 5’ una secuencia de ‘bases adicional, que codifica la denomi-. nada secuencia sefial (compuesta por al-. rededor de 20 aminodcidos). La secuencia sefial es sintetizada primero y Representa una prolongacién N-terminal de la “ver- dadera proteina” a sintetizar. Una vez pro- ducida la secuencia sefial, un complejo RNA-proteina especifico, denominado (SRP) (ing. signal recognition particle) se fijaa a la secuencia senal (en la SRP se en- cuentra una scRNP, véase mds sobre pe- quejias particulas citoplasmaticas de RNP en el capitulo 4, en la seccién de trans- cripci6n de genes) y detiene momenté- neamente_la_sintesis proteica. La SRP _ tiene gran afinidad_ con un compejo_ pro- -teico denominado receptor SRP, una pro-~ tefna integral de membrana ubicada sobre “da superficie externa del RER. El receptor _ “SRP también se denomina “proteina de .anclaje”. En cuanto la SRP se fija a la se- cuencia senal, se adosa también Con el re- ceptor SRP y une asi al ribosoma con la superficie externa na _de la membrana | del RER. El SRP se separa de la secuencia se- fial eee ey diado), seuomie canal ees de proteina, que atraviesa la membrana ‘del RER. Se restablece entonces la sintesis proteica, con formacién de la verdadera proteina a continuacién de la secuencia CITOPLASMA 63seal. Durante la formacién, la cadena peptidica atraviesa el camal hacia la luz del reticulo endoplasmatico y, en cuanto pasa la totalidad de la secuencia sefial, és- ta se separa por accién de una enzima li- gada a la membrana, una sefialpeptidasa. Cuando finaliza la sintesis de la verdade- ra cadena polipeptidica, ésta se libera a la luz del reticulo o permanece unida a la doble capa lipidica de la membrana del _RER, si se trata de una proteina integral de membrana. En este ultimo caso, la cadena polipeptidica contiene, en algtin sitio, una secuencia de alrededor de 20 aminoa- cidos hidréfobos, correspondientes a la porcién transmembrana de la proteina, que actia como. secuencia de detencién .de transferencia; su funcién es detener la transferencia de la cadena polipeptidica a través del canal de proteinas y se cree que Ta cadena peptidica abandona el canal por- difusi6én lateral y penetra en la doble capa _ _lipidica..La secuencia peptidica hidréfoba pasa a ser la porcién transmembrana per- manente de la proteina de membrana y el sitio de anclaje durante la sintesis final de la proteina. Una vez finalizada, ya se trate de una proteina luminal o una proteina de membrana, se cierra el canal de protefnas en la membrana del RER, que s6lo se vuel- ve a abrir con la fijaci6n de una nueva se- cuencia sefial. Algunas_proteinas no-se_sintetizan en_ los ribosomas ligados a membrana, sino en ribosomas libres en_el citosol. En este caso, la sintesis esta determinada por la ausencia de la secuencia de bases de ini- cio en el extremo 5’, codificador del pép- tido sefial, en la molécula de mRNA que codifica la proteina. Entonces el ribosoma completo permanece en el-citosol y pro- duce alli la proteina. La proteina ya sinte- tizada puede permanecer en el citosol o ser transportada a las mitocondrias, los peroxisomas o incluso al niicleo celular. En consecuencia, el mRNA determina el tipo de proteina producido por los .riboso- _mas y su destino final. Los ribosomas son idénticos desde el punto de vista funcio- nal y el mismo ribosoma puede intervenir en algunos casos en la produccién de una protefna con secuencia sejial, es decir, es- tar ligado a la membrana, y en otro mo- mento actuar como ribosoma libre y sinte- tizar proteinas para el citosol o el niicleo celular. Una vez finalizada la sintesis de _una protefna se separan las dos subunida-~ “des ribosomales, que sdlo se vuelven a ‘unir para sintetizar una nueva proteina. A menudo se denomina preproteinas a jas proteinas que poseen una secuencia _sefial inicial. Hasta este momento se han analizado los procesos de la sintesis proteica segtin se producen para un tinico ribosoma pero, 64 CITOPLASMA Sitio de union de aminoacidos a Anticod6n como ya se describid, los ribosomas que sintetizan proteinas se encuentran bajo la_ forma de polirribosomas unidos a una he- ‘bra de mRNA, sin importar si se trata de ribosomas ligados a membrana 0 aislados. Durante la sintesis de la proteina_el ribo- soma_se desplaza respecto a la hebra de mRNA, por lo que se lee un codén tras otro, como se verd con mayor detalle mas adelante. Esto se repite hasta finalizar la cadena peptidica, es decir, cada ribosoma sintetiza una copia de la misma cadena polipeptidica, que se prolonga en direc- ci6n perpendicular a la hebra de mRNA. Por lo general, la cantidad de ribosomas de un polirribosoma es proporcional a la longitud de la hebra de MRNA, a su vez proporcional a la longitud de la cadena polipeptidica formada, Cuanto mas larga es la hebra de mRNA, mas lugar habré pa- ra mayor cantidad de ribosomas. Asi, los polirribosomas de los estadios iniciales de los eritrocitos estan constituidos por 5 ribosomas, dado que los polipéptidos for- mados, que componen la hemoglobina, contienen alrededor de 150 aminodacidos. Las células musculares embrionarias pro- ducen la protefna miosina; en este caso, intervienen 56 ribosomas en cada polirri- bosoma, dado que la cadena polipeptidica contiene mas de 1.800 aminodcidos. A continuaci6én se estudiaré con mayor detalle la sintesis de una proteina dentro del ribosoma. Después de la fase de inicia- cién, es decir, la unién del ribosoma y la Fig. 3-16. Dibujo esque- matico de la estructura de una molécula de tRNA (RNA de transporte), (en el caso presentado, para la transferencia del ami- noacido fenilalanina). Las bases especiales D (dihi- drouridina) y ‘Y (seudouri- dina) son derivados de la base uracilo (U). eA fn uckion 2fijaci6n del extremo 5° de la hebra de mRNA a la subunidad menor en posicién lista para la lectura del codén de inicio como introduccién al proceso de traduc- ciédn, comienza la denominada_fase de _prolongaci6n, en la cual se encadenan-tos- _aminodcidos mediante enlaces peptidicos en la progresién especificada por la se- cuencia de codones de la hebra de mRNA. Los aminodcidos necesarios_para_cons-_ truir Ia protefna se buscan en el citoplas- ‘ma, mediante el RNA de transporte (tR- NA), Como ya se describid, hay por lo me- nos un tRNA para cada uno de los 21 ami- nodcidos utilizados. Cada molécula de tR- NA se.compane de une una cadena de,alrede- dor de}80 nuclesétidos, que ‘adoptan la for- ma de un trébol por apareamiento de las bases de distintas porciones de la molécu- la (fig. 3-16). Las dos “hojas laterales” del trébol estan formadas por dos asas latera- les, mientras que en el extremo del “tallo” se encuentra ,un_ sitio _de—unién—para—el aminodcido especffico de la molécula de tRNA en cuestién. La porcién final del ta- llo esta formada por el « extremo 3’ de la “molécula 1 bases | _iemmnina con la “secuencia de ficidad porque a cada tRNA le correspon- de una aminoacil-tRNA-sintetasa especi- fica, que fija el aminodcido correcto a la molécula de tRNA correspondiente. Se denomina aminoacil-tRNA al tRNA uni- do al aminodcido. En la porcién corres- pondiente a la “hoja media” del trébol, es decir, opuesta al extremo-del tallo, se en- cuentra un grupo de tres bases, denomina- “do anticod6én, que es complementario al grupo de tres bases correspondiente 0 co- dén de la hebra de mRNA.|El primer ami- _nodcido_transportadocomo—aminoacil- _tRNA hasta el_codén de inicio del riboso- -ma_es la metionina, dado que el codén de inicio (AUG)) también es el codén de la metionina. En realidad, existen dos tipos de tRNA para la metionina, debido a que uno se especializa como codon de inicio, y el consecuente comienzo de la sintesis proteica, mientras que el otro reconoce codones AUG. “internos”, es decir, dife- rentes del cod6én de inicio. |La unién del _extremo 5’ del mRNA con la subunidad menor del ribosoma se _asegura mediante la modificacién de-este extremo del mR- NA por metilacién para formar el denomi- _nado casquete 5’. Después de la fijacién, la hebra de mRNA se desplaza sobre la su- perficie del ribosoma hasta la aparicién del primer codén AUG, es decir, el codén de inicio, y comienza la traduccidén de la verdadera secuencia de nucledtidos cadi- ficadora. En realidad, la ubicacién en el ribosoma del aminoacil-tRNA para la me- tionina ya se produce en la fase de inicia- T cién, por lo que el primer aminodcido que es transportado al ribosoma por su tRNA correspondiente es el segundo aminoaci- do de la cadena peptidica. El tRNA con la metionina también se denomina RNA ini- ciador y se fija al ribosoma en el denomi- nado sitio peptidilo o sitio P, mientras que el segundo aminodcido se fija al sitio aminoacilo o sitio A (fig. 3-17). Como ya se vio, la unién de las molécu- las de tRNA se produce por apareamiento de bases entre el codén y el anticodén de la hebra de mRNA y de la molécula de tR- NA, respectivamente. De este modo, los dos aminodcidos estan enfrentados en: el extremo opuesto de las moléculas de tR- NA y se forma entonces un enlace pepti- dico entre ellos, proceso catalizado por una peptidiltransferasa. Estudios recien- tes demuestran que la actividad de catali- zador de esta enzima esta asentada en la subunidad mayor del ribosoma, bajo la forma de una de las moléculas de rRNA que la componen; también se utiliza la de- signacién ribozima. Una vez formados los enlaces peptidicos el tRNA para la metio- __-nina, es decir, correspondiente al sitio P, queda separado de la metionina y abando- na el ribosoma. A continuacidén, el riboso- ma se desplaza la distancia de un codén sobre la molécula de mRNA y, al mismo tiempo, en el tRNA correspondiente al se- gundo aminodcido pasa del sitio A al sitio P, ahora desocupado. Entonces un nuevo tRNA, con el tercer aminodcido adosado se puede fijar al sitio A vacio, y la sintesis proteica continua con la formacién de un nuevo enlace peptidico entre el segundo aminodcido y el tercero. El proceso se re- pite con la consiguiente prolongacidn de la cadena peptidica, hasta que 4 al sitio A llega un codén de detencién, sobre la he- bra de mRNA. Son codones que no codifi- can ningtin aminodcido (existen 3 codo- nes de detencién, UAG, UAA y UGA). Aqui se detiene la sintesis, porque no existe ninguna molécula de tRNA con un anticodén capaz de aparear sus bases con el grupo de tres bases de un codén de de- tencién. En el sitio A se fija un factor de _ liberacién_al-cod6n de-detencién y causa la separacion de la uni6én entre la cadena polipeptidica y la tltima molécula de tR- NA, por lo que el polipéptido se libera. De este modo comienza la fase de termina- cién, en la cual las dos subunidades ribo- ~somales se separan entre si y de la molé- _cula de tRNA_y abandonan_la hebra de “mRNA; més tarde pueden intervenir en un nuevo ciclo de sintesis proteica. Las proteinas sintetizadas en los riboso- mas ligados a membrana sufren varias modificaciones en el RER durante su for- macién y después. Durante el proceso de sintesis a la mayoria de las proteinas se CITOPLASMA 65les adosa un oligosacérido (compuesto por N-actilglucosamina, manosa y gluco- sa) a los grupos amino libres del aminoa- cido asparagina (cuando se encuentra en una secuencia determinada dentro de la proteina). El proceso se denomina gluco- silacién ligada a N y es catalizada por glu- cosiltransferasas relacionadas con la por- cidén luminal de la membrana del RER. En a aprdeincs sintetizadas en el RER son_glucoprotei- See A GaBERIAG Toe peptide vecién ie dos también sufren escisiones, con forma- cién de fragmentos mds pequefios o la ex- tirpacién de secuencias de aminodcidos adicionales de los extremos del péptido. Ademas, la proteina sufre plegamientos hasta adquirir la forma tridimensional fi- nal o conformacién, que esta determina- da, segtin se describié en el capitulo 1, por la secuencia de aminodcidos; por otra par- te, el plegamiento correcto se ve favoreci- do por distintas proteinas. Asi, uma enzi- _ ma cataliza la formacién de enlaces disul- furo entre moléculas de cistefma ubicadas en distintos sitios de la cadena peptidica, por lo que el plegamiento se produce con mayor rapidez, si bien no afecta la confor- macién final. Ademas,/el plegamiento es. estimulado por los denominados chape- rones (fr. chaperon, dama de compania) que estabilizan los pasos intermedios del mto. Las plegamiento. chaperones _pertenecen. a las denominadas proteinas de shock tér- mico o_ 35 ue su _sintesis aumenta con el incremento de la ‘temperatura u otras acciones causantes de estrés (la mayorfa de protefnas de este ti- po son esenciales para la vitalidad de las células, incluso en condiciones normales, por lo que también se producen sin la in- fluencia de estrés). Las proteinas com- puestas por varias subunidades adquieren la conformacién correcta por uni6én de las subunidades en la luz del RER. Como ya se vio,(s6lo los péptidos con _ secuencia sefial correspondiente al N-ter- Zainal son —ditighdos” hacks sl BER pars Ja i y. en la mayoria de los casos, son transportados al aparato de Golgi para recibir el tratamiento final y ser distribui- das hacia los destinos determinados (se verd con mayor detalle al estudiar el apa- rato de Golgi). Esta direccién objetiva (ing. targeting) de las proteinas dentro de la célula comienza, entonces, desde la ini- ciacién de la sintesis (presencia 0 ausen- cia de la secuencia sefial) y continua des- pués en el RER y el complejo de GolgiyLas sin Si rt zadas e i dado quejel ribosoma permanece allf durante la sintesis ma- yoria de estas pr e citosol, por ejemplo, como proteinas di-_ _ sueltas (p.ej., enzimas)” 0 como compo- 66 CITOPLASMA Polipéptido recién formado Fis 3-17. Dibujo esquematico del transcurso de la sintesis proteica dentro del ribosoma (véase el texto para los detalles). GAR. EOE ORSmer fru. o 3 una corta_secuencia no ——s __secuencia de localizaci6n nuclear (NLS). estructurales (p. ej., filamentos pertenecientes al citoesqueleto), pero al- gunas son dirigidas hacia el nticleo celu- lar, las mitocondrias o los peroxisomas. La direccién objetiva se produce para las _proteinas nucleares por la presencia de a aminodcidos, la _que es reconocida por las proteinas fija- _doras de-NLS._Estas se unen-a_la NLS _y i s la proteina a un_poro de la membrana nuclear (véase con mayor detalle en el cap. 4) para ser captadas por el nticleo. La mayoria de las proteinas de las mito- condrias se sintetizan por los ribosomas citoplasmaticos (un pequefio porcentaje se sintetiza en las mitocondrias, como se verd mas adelante) y son dirigidos hacia las mitocondrias de modo similar a las nucleares, por tener sefiales directoras pa- ra distintas porciones de la organela. Las. (p. ej., la enzima catalasa) tiene como se- cuencia sefial a un tripéptido C-terminal, que determina su transporte hacia la or- ganela. : La regulacién de la sintesis proteica tie- ne lugar en varios pasos. Como se vera en el capitulo 4, la regulaci6n comienza ya en el nticleo celular, en parte por influen- cia de moléculas de RNA funcionales so- bre la transcripcién, en parte por la accién posterior de las moléculas de RNA y la ex- portacién final al citoplasma (fig. 4-10). La expresién de un gen implica que el gen permite el desarrollo de una propiedad observable (rasgo fenotipico), por lo gene- ral por la sintesis de una proteina funcio- nal. En algunos casos se aplica el término s6lo al proceso de transcripci6n pero, en su sentido mds amplio, incluye a la trans- cripcién y la traduccién. La regulacién de la traduccién de la sintesis proteica en el citoplasma puede tener lugar, por ejemplo, cuando protef- nas citoplasmaticas especificas se fijan a la molécula de mRNA e impiden asi la tra- ducci6én. Las variaciones de la vida media del mRNA también influyen sobre la can- tidad de proteina sintetizada por traduc- cién de ese mRNA. La vida media de las moléculas de mRNA varia entre varias ho- ras y algunos dfas, y se prolonga por la ac- cién de la hormona del crecimiento, entre otros factores. El proceso de traduccién también pue- de verse afectado por otras acciones, ade- mas de la influencia directa sobre la molé- cula de mRNA. Asi, la fosforilacién de las proteinas necesarias para el proceso de traduccién puede estimular o inhibir la velocidad de reaccién. Por ejemplo, en al- gunos casos la fosforilacién de los deno- minados factores de iniciacidn (requeri- * das para que se produzea la reacciGn entre el mRNA, el tRNA y la subunidad riboso-: mal menor en la iniciacién de la sintesis proteica) conduce a la inhibicion de la tra- duccién por inactivacién, en otros casos a la estimulacién del proceso de traduccién _ por activacién. Por ultimo, ciertas investi- ‘gaciones sugieren la-posibilidad de que la composicién y la cantidad variables de las moléculas de tRNA en los distintos tipos celulares pueden influir sobre la veloci- dad del proceso de traduccién. Las modificaciones postraduccionales en la estructura y la conformacién de la proteina sintetizada contribuyen a regular la actividad biolégica de la proteina y, en consecuencia, determinan si el gen corres- pondiente se expresard en la célula. Como se vio antes, a menudo se produce la esci- sién del péptido sintetizado en cadenas mas pequejias, o la extirpacion de secuen- cias peptidicas excedentes terminales, ademds de distintos plegamientos que conducen a la conformacién funcional fi- nal de la proteina. La actividad bioldgica de las proteinas también puede ser regula- da por la asociacién y la disociacién de unidades polipeptidicas y, por ejemplo, por el proceso de fosforilacién. La mayoria de estas reacciones son reversibles, por lo que permiten la regulacién de la actividad biol6gica de las moléculas proteicas de la célula mediante distintos mecanismos. Es obvio que la degradacién de una proteina’ contribuye en el mismo grado “que la sintesis a determinar la cantidad de_ la protefna en cuestién presente en la cé- lula y, en consecuencia, el grado de expre- sién del gen correspondiente. La vida me- dia de las proteinas varia entre unos po- cos minutos y varias semanas. Las protei- nas seleccionadas para ser degradadas son marcadas por la célula por la fijacién de una pequefia proteina denominada ubi- cuitina (lat. ubiquitarius, ubicua). A con- “ tinuacién, la proteina es dirigida hacia los proteasomas (grandes complejos protei- cos que catalizan la degradacién de nume- rosas proteinas marcadas con ubicuitina que se verd con mayor detalle mas adelan- te), donde son degradadas. Otro mecanismo de degradacién de las proteina, por lo general menos selectivo, es la capatacién por los lisosomas, Las ‘protemas son degradadas por las enzimas isosémicas a través de un proceso deno- “minado microautofagia, que se verd al es- tudiar los lisosomas. La degradaci6n pro- teica lisosé6mica puede ser selectiva cuan- do se relaciona con acciones estresantes sobre la célula, en cuyo caso las proteinas que contienen determinadas secuencias de aminodcidos, lo cual constituye una marca, son captadas selectivamente y de- gradadas en los lisosomas. CITOPLASMA 67oil Reticulo endoplasmAatico agranular (liso) El reticulo endoplasmatico se encuentra en muchas células bajo la forma de tibulos limitados por membranas a las que no se adosan ribosomas, por lo que se denomina reticulo endoplasmatico agranular o liso (REL). Es acidGfilo y se tine con colorantes como la eosina, en consecuencia no se dis- tingue del citosol circundante en los prepa- rados para microscopia 6ptica, por lo que recién se detecta después de la incorpora- cién de la microscopia electrénica. A menudo los_reticulos endoplasmati- cos rugoso y liso se contindan uno con otro, pero la diferencia no radica sélo en la presencia de ribosomas. Por lo general, el reticulo liso forma un denso reticulado de tibulos anastomosados (fig. 3-18), mientras que rara vez se observan cister- nas. Ademds, en algunos tipos celulares aparece casi con exclusividad uno de los tipos de reticulo. En las células glandula- res secretoras de proteinas, casi la totali- dad es reticulo rugoso. En cambio, en las células secretoras de hormonas esperoi- des predomina la forma lisa. Las células hepaticas representan una excepcién, da- do que se encuentran cantidades impor- tantes de ambos tipos como expresién de las numerosas y variadas actividades de estas células (fig. 3-18). En la actualidad se conocen las funcio- nes del reticulo endoplasmatico liso en varios tipos celulares, como se verd con mayor detalle en préximos capitulos, da- do que aqui sélo se verdn resumidas. En los hepatocitos a menudo se encuentran particulas de glucdégeno en estrecha rela- cién con el REL, cuyas membranas contie- nen varias enzimas importantes para el metabolismo del glucdgeno, en especial glucosa-6-fosfatasa. Esta enzima cataliza el ultimo paso de la degradacién del glu- cégeno para dar glucosa libre, que des- pués es transportada hacia el exterior de los hepatocitos, a la sangre. El REL hepatico también esta relaciona- do con la detoxicacién de distintos com- -ponentes endégenos (formados dentro del organismo) y exégenos (incorporados des- de el exterior), entre ellos algunos pestici- das y faérmacos. Por ejemplo, si se admi- nistra un barbittirico a animales de expe- rimentaci6n, se observa un gran aumento de la cantidad de REL en los hepatocitos y las membranas del reticulo liso aislado de estas células muestra un aumento de la actividad de las enzimas detoxificadoras (pero no de la actividad p. ej., de la gluco- sa-6-fosfatasa). En la mayoria de los casos la detoxificacién se lleva a cabo por con- version de los grupos hidréfobos a hidré- filos, por acoplamiento con grupos muy hidréfilos (-OH y -COOH). 68 CITOPLASMA Glucégeno _El reticulo endoplasmatico liso tam-_ bién interviene en la sintesis de Ifpidos. _ Se sintetizan colesterol y lipoproteinas, en el higado mientras que en las células epiteliales absortivas de la superficie del intestino delgado se lleva a cabo la sinte- sis de triacilgliceroles (entre otros com- puestos) a partir de los componentes nu- tricios absorbidos, En las células endocri- nas (productoras de hormonas) que sinte- tizan hormonas esteroides, por ejemplo, en los testiculos, los ovarios y la corteza suprarrenal, el REL esta muy desarrolla- do, dado que interviene en la sintesis de hormonas esteroides a partir del coleste- rol. El REL también-sintetiza fosfolipidos para la construcci6n de las membranas _celulares, tanto alrededor de las organe- las como del plasmalema. Las moléculas de fosfolfpido se sintetizan primero como parte de la doble capa lipidica del REL, donde se incluyen en la mitad interna Fig. 3-18. Imagen de re- ticulo endoplasmatico liso de un hepatocito cap- tada con microscopio electronico. Frente a la flecha se observa la tran- sicién entre los reticulos endoplasmaticos liso y ru- goso. Ademas, es carac- teristica la estrecha rela- cién que existe con nu- merosas particulas de glucdgeno. x52.000. (Ce- dida por A.B. Mauns- bach.) Fig. 3-19. Dibujo esque- matico del aspecto del aparato de Golgi al mi- croscopio 6ptico en una célula glandular (a) y en una célula nerviosa (b), de acuerdo con la deter- minacién por el métedo original de Golgi. (Segun Le Gros Clark.) GIA cP of aL OK 8Fig. 3-20. Fotomicrogra- fia del tejido conectivo la- xo de la mucosa del in- testino delgado. Se ob- servan varias células plasmaticas con la de- nominada imagen nega- tiva de Golgi. Corte colo- reado con hematoxilina- eosina. x660. Fig. 3-21. Dibujo esque- matico tridimensional que muestra la conformacion _ultraestructural del apa- rato de Golgi en una cé- lula secretora. (Seguin Ham.) mari rTruLto. 3 (orientada hacia el citosol) de la bicapa li- pidica. Las enzimas que intervienen pre- sentan su porcion catalitica orientada ha- cia el citosol, donde se encuentran los componentes requeridos para la sintesis. La mitad interna de la doble capa lipidi- ca se forma por desplazamiento de algu- nos fosfolipides desde una mitad hacia la otra, proceso catalizado por flipasas espe- cificas para determinados fosfolipidos, lo que causa la distribucién asimétrica de estos ultimos en las dos mitades de la membrana. En consecuencia, se forma nuevo material de membrana por amplia- cién de la ya existente en el REL. Mas tar- de se incorpora el material de membranas recién formado a las membranas de otras organelas o al plasmalema, como se vera en las secciones siguientes. bn las-células-del misculo estriado hay -REL, que aqui se denomina reticulo sarco- “plasmatico (gr. sarx, carne), relacionado_ a cién_y recaptacién de jones Vacuolas de condensacion Cisterna Vesiculas de transporte 7 fibras musculares. En stachos