OBJETIVO GENERAL

Describir y analizar los procedimientos que se realizan para la generación de ratones

transgénicos en sus diferentes etapas y los métodos que se utilizan para efectuarlos.
MARCO TEORICO

Breve Reseña

Los ratones llevan más de un siglo contribuyendo al avance de la medicina y a descubrimientos

que han desempeñado un papel fundamental para tratar distintas enfermedades. Conozca la
historia de algunos de los roedores más famosos de la ciencia.
El ratón de Mendel
Fue en 1902 cuando el primer roedor entró en el laboratorio a participar en una investigación.
De la mano de William Ernest Castle, un biólogo nacido en una granja de Ohio y formado en
Harvard, los ratones se utilizaron por primera vez para comprobar si las leyes de Mendel sobre
la herencia servían para predecir el color del pelo en estos animales.
Tan importantes eran los ratones para los estudios genéticos de Castle que en 1908, cuando el
científico se trasladó a la Institución para Biología Aplicada, a pocos kilómetros de Cambridge,
cedió un gran espacio para que sus animales estuvieran a gusto.
C57BL, el más utilizado
Un discípulo de Castle, Clarence Cook Little, siguió su senda investigadora y tras una década
cruzando ratones para crear una variedad específica, en 1921 llegó al ratón C57BL. Desde
entonces es uno de los más utilizados por los científicos en sus experimentos genéticos y se
considera el primer ratón moderno de laboratorio.
El código que lo identifica proviene de la madre de este ratón, que estaba etiquetada como C57,
mientras que las letras BL hacen referencia a su color negro. Se trata de una variante fácil de
manipular genéticamente y la que más respuestas ha dado en el campo de la oncología.
El primer transgénico
La década de los 80 ocupa un capítulo fundamental de la historia de estos roedores. La
colaboración de dos investigadores en Estados Unidos, Richard Palmiter, del Instituto Médico
Howard Hughes, en la Universidad de Washington en Seattle, y Ralph Brinster, de la Universidad
de Pensilvania, dio como resultado el nacimiento del primer ratón transgénico en 1982.
Para llegar a él, según explican en el Instituto Howard Hughes, el equipo inyectó un gen
modificado de la hormona del crecimiento de rata en un huevo fertilizado de ratón.
Después de un proceso en el que los investigadores cambiaron la expresión del gen, se implantó
el huevo en una madre adoptiva de ratón. Ésta dio a luz a un roedor aparentemente normal
pero que creció a un ritmo inusual hasta hacerse gigante. Este experimento mostró algunas
claves de un trastorno genético, conocido como enanismo.
Los 'knockout'
Ya en 1989, Mario Capecchi, Olivier Smithies y Sir Martin Evans -galardonados con el Premio
Nobel de Medicina 2007- crean el primer ratón 'knockout'. Se trata de un modelo animal al que,
durante la fase embrionaria, se ha modificado el funcionamiento de uno de sus genes.
Gracias a esta técnica, que permite elegir el gen sobre el que actuar y su forma de alteración, se
sabe mucho más sobre las funciones de los genes en los roedores y se ha podido crear varios
modelos de enfermedades (cáncer, ateroesclerosis, hipertensión...). Por estos avances, sus
principales autores han sido galardonados en varias ocasiones (además del Nobel, también
ganaron el premio Lasker).
Ocho años después del roedor 'knockout', llegaría Cumulina, el primer ratón clonado. Nacida el
3 de octubre de 1987, el nombre de esta hembra hace honor a la técnica de clonación que le dio
la vida. Se extrajo el núcleo de las células del cumulus, que rodean los óvulos de las ratonas, y se
inyectó en otros óvulos sin núcleo.
Fue el único roedor obtenido por este proceso al que sus creadores, procedentes de la
universidad de Hawai, bautizaron con un nombre y no con un código numérico.
Antes de morir, por causas naturales, Cumulina tuvo descendencia y sufrió un tumor en la piel
que se le extirpó con éxito. Falleció mientras dormía. Tenía dos años y siete meses, una edad
muy longeva si se tiene en cuenta los dos años de media que suelen vivir los roedores.
Durante el siglo XX se documentaron las mutaciones espontáneas que permitieron identificar
los genes responsables de la obesidad, el cáncer y la aterosclerosis.
 1982. Richard Palmiter y Martin Evans crean el primer ratón transgénico.”” Los
científicos implantaron un gen de rata a un ratón. El gen implantado tiene la información
para la hormona del crecimiento. Para hacerlo, los investigadores multiplicaron el gen en
el laboratorio, luego lo acoplaron al genoma del ratón y se procedió a inyectar el
combinado genético en 170 [[óvulos fecundados de ratón, que finalmente se
implantaron en seis ratonas. Estas hembras dieron a luz a 21 crías, seis de ellas fueron
ratones que crecían con mayor rapidez alcanzando un tamaño un 50% mayor del de sus
hermanos.
 1986. Allan Bradley y Elizabeth Robertson generan un ratón transgénico
utilizando células troncales embrionarias (ES).”” Bradley y Robertson demostraron que
era posible extraer células particulares de un embrión de ratón —conocidas como
células troncales embrionarias, o ES (por sus siglas en inglés), alterarlas genéticamente y
reimplantarlas. Estas células modificadas, darían origen a un ratón manipulado
genéticamente. Robertson y Bradley utilizaron un retrovirus como vector para
incorporar en las ES los genes que deseaban.
 1987. Mario Capecchi crea el primer ratón knock-out””. El investigador italiano,
colaborador del HHMI (Instituto Médico Howard Hughes), desarrolló una técnica capaz
de insertar o eliminar un gen determinado en las células ES del ratón. Los ratones de
laboratorio a los que se ha eliminado selectivamente la expresión de un gen recibieron el
nombre de ratones “knock-out” (KO). Por este trabajo Capecci recibió el Premio
Nobel en Fisiología o Medicina en 2007 junto con Oliver Smithies y Martin Evans.
 1998. Ruyzo Yanahimachi y otros investigadores consiguen clonar el primer ratón:
“Cumulina”.”” Estos investigadores de la Universidad de Hawaii lograron clonar por
segunda vez un mamífero, después de la famosa oveja Dolly. La ratona recibió este
nombre porque para su clonación se utilizaron células inactivas de división celular
del ovario que rodean y mantienen al óvulo en formación denominadas cúmulos. Para
obtener la Cumulina se requirieron no menos de 84 intentos. La eficacia de la técnica
estuvo entre el 2% y el 2.8%.
 1999. El Laboratorio Jackson alcanza la cifra de más de mil mutaciones descubiertas en
el genoma murino.”” Este centro también informó que a esta fecha se había alcanzado a
secuenciar 128 mutaciones y que el 45% de ellas tienen mutaciones homólogas en los
humanos relacionadas con enfermedades.
 1999. Se forma el Consorcio de Secuenciación del Genoma del Ratón formado por con
tres grandes institutos de Estados Unidos y Gran Bretaña.
 2001. La firma privada Celera Genomics empieza a vender su secuencia genética del
ratón obtenida por la técnica shotgun, que se extrajo de cuatro cepas de ratón.
 2002—Mayo. La revista Science publica la secuencia del cromosoma 16 del ratón, que
tiene gran similitud con el cromosoma 21 humano.
  2002—Agosto. Un consorcio internacional facilita el marco para la determinación total
del genoma del ratón, gracias a la creación de un mapa físico del genoma.
2002—Diciembre. ””El Consorcio de la Secuenciación del Genoma del Ratón publica la secuencia
del genoma y el análisis genético de la cepa C57BL/6J””. La doctora Shirley Tilghman calificó al
genoma del ratón como la “piedra de Rosetta” que ayudará a comprender el genoma humano.
El genoma del ratón
El nuevo siglo trajo consigo otro avance fundamental: la secuenciación del genoma completo
del ratón. Los resultados aparecían publicados en la revista 'Nature', en 2002, y el ratón se
convertía en el primer mamífero no humano del que se conocía con detalle su código genético.
Las investigaciones se basaron en el modelo C57BL, creado en 1921.
Los datos obtenidos mostraron la enorme similitud entre el genoma humano (secuenciado en
2001) y el de los roedores: ambos cuentan con unos 30.000 genes y la composición del ADN es
prácticamente idéntica. Gracias a este descubrimiento, cada vez se conoce más sobre los
mecanismos que dan forma a las enfermedades y la eficacia de los distintos tratamientos.
RATÓN DE LABORATORIO
Un ratón de laboratorio es un roedor, usualmente de la especie Mus musculus, que se utiliza
para la investigación científica. Su cariotipo está compuesto por cuarenta cromosomas y suelen
ser albinos.
Para cada experimento se escogen ratones de laboratorio que pertenezcan a una
misma cepa pura o endogámica. Los individuos de una misma cepa poseen genes idénticos, lo
cual permite la comparación de los efectos de los diferentes tratamientos experimentales
(fármacos, entorno físico, etc.), sin que se produzca confusión debido a las diferencias
genéticas. La cepa más utilizada ha sido la BALB/c (ratón albino), aunque existen otras
disponibles (ej.C57BL/6), especialmente desde el desarrollo de técnicas de manipulación de
genes que han provisto una gran cantidad de cepas con modificaciones genéticas particulares.
Algunas investigaciones particulares pueden requerir de una especie de ratón diferente a Mus
musculus. Por ejemplo, en 2004, investigadores de la Universidad de Emory utilizaron ratones
de las praderas (Microtus ochrogaster) y ratones de los pantanos (Microtus pennsylvanicus) para
estudiar un gen relacionado con el comportamiento monógamo.
Las características que han hecho del ratón de laboratorio el modelo biológico y biomédico más
utilizado en las investigaciones científicas son:
 Su fácil manejo.
 Su tamaño apropiado para la crianza y manipulación.
 No requieren demasiados cuidados.
 Tienen un sistema inmune similar al de los seres humanos.
 Tienen un alto número de crías.
 Poseen un breve período de gestación (19-21 días), y su destete es rápido.
 Las hembras producen un gran número de óvulos, los cuales al ser fecundados son muy
resistentes.
 Al ser mamíferos euterios, poseen un genoma muy similar al de los seres humanos.
En la actualidad se utilizan ratones que se han manipulado genéticamente. Los modelos de
ratón transgénico y knock-out son particularmente útiles para estudiar problemas biológicos
complejos, ya que se puede analizar la acción de un gen o una proteína en particular.
Contexto genético y evolutivo
Los seres humanos y los ratones de laboratorio (ambos mamíferos euterios) compartieron un
último antepasado común hace sesenta millones de años aproximadamente.
La evolución del genoma de los mamíferos es relativamente conservadora. Si bien los humanos
poseen antepasados comunes con todos los seres vivos, el hecho que los humanos y los ratones
sean mamíferos euterios hace que tengan más genes en común que los que se podrían
encontrar entre los humanos y animales no euterios.
Los ratones tienen un genoma agrupado en veinte pares de cromosomas, mientras que los seres
humanos tienen veintitrés. Los genomas de los humanos y los ratones de laboratorio son muy
similares; el genoma de los humanos posee dos mil novecientos millones de pares de bases,
mientras que el del ratón contiene alrededor de dos mil seiscientos millones.
El mapeo genético ha puesto en evidencia que algunos genes que se encuentran en un
mismo cromosoma humano están ubicados en diferentes cromosomas en los ratones. Por
ejemplo, en el cromosoma 12 de los seres humanos se encuentran agrupados los genes GADP,
TPI, LDHB, KRAS2, INT1, GL1 y LALB, mientras que en el ratón estos genes se encuentran
repartidos en los cromosomas 6, 15, 10 y 4. Estos mismos genes se encuentran en un mismo
cromosoma en los gatos (cromosoma B4) y en las vacas (cromosoma 5), lo que indica que los
antepasados de los ratones divergieron del linaje que desembocaría en el hombre antes que los
linajes de los artiodáctilos (grupo al que pertenece la vaca) y el de los carnívoros (grupo al que
pertenece el gato). El cromosoma 7 humano posee homologías en siete cromosomas diferentes
de Mus musculus. El cromosoma 11 del ratón tiene homologías en al menos seis cromosomas
humanos.
El parecido genético entre las dos especies permite comparar los genes casi directamente, y
permite a los científicos encontrar los mismos genes en humanos para decodificar las rutas y
mecanismos de las enfermedades humanas, porque los ratones también pueden desarrollarlas.
Por ejemplo, la mutación murina relacionada con la obesidad (Magohany) es homóloga
al gen attractrin, el cual guarda información para hacer una glicoproteína y se relaciona con
la obesidad en los seres humanos.
También es posible inducir en los ratones un gran número de enfermedades humanas
manipulando sus genes por medio de técnicas de ingeniería genética.
Sólo de esta manera se pueden hacer investigaciones más fiables, puesto que la investigación
con humanos estaría por fuera de las normas bioéticas.
Ratón transgénico

Pasos para la creación de un ratón transgénico.

Un ratón transgénico es un ratón que porta un fragmento de ADN ajeno a su genoma. Para
obtenerlos, es necesario construir un plásmido de ADN (un plásmido es un elemento genético
extracromosomal cuya cadena de ADN es circular) e introducir luego el nuevo gen en
la célula blanco para que se inserte al azar en el genoma celular con técnicas
de ADN recombinante y de micromanipulación o transfección. El gen añadido recibe el nombre
de transgen, y el animal que lo porta, el de animal transgénico. Los ratones transgénicos se
utilizan para conocer los mecanismos de la expresión génica de un gen o de un fragmento de
este.
La obtención de un ratón transgénico se lleva a cabo de la siguiente manera:
 Se obtienen óvulos fecundados, en los que aún no se han fusionado los pronúcleos
masculino y femenino, de un ratón hembra al que previamente se le aplicó una
inyección de estro y luego fue apareado.
 Los óvulos fertilizados se remueven del oviducto utilizando una solución salina.
 Por medio de una pipeta de vidrio ultrafina se inyecta al pronúcleo masculino cerca de 2
a 5 picolitros de ADN, en el que hay cientos de copias del transgen.
 El paso anterior se realiza en cerca de 10 a 20 huevos.
 Los huevos microinyectados se implantan en una madre adoptiva
(denominada pseudopreñada, pues fue apareada previamente con un macho estéril).
 19 – 21 días después nacen las crías, de las cuales aproximadamente entre el 10 y el 40
por ciento tendrán el transgen integrado en su genoma.
 Se toma una muestra de tejido de su cola para averiguar qué individuos portan el
transgen.
 Se aíslan los ratones transgénicos obtenidos de un huevo microinyectado,
denominados transgénicos fundadores.
 Se cruzan ratones transgénicos fundadores para obtener una línea de ratones
transgénicos.
El número de copias del transgen puede variar entre diferentes ratones transgénicos
fundadores; de igual manera, el transgen puede integrarse en diferentes partes dentro del
genoma murino. Algunos ratones transgénicos pueden expresar un nuevo fenotipo debido a la
inactivación de otro gen debido al lugar de inserción del transgen, lo cual es una desventaja de
la técnica. En general, los modelos generados permiten estudiar la ganancia de una función.
Un gen tiene dos regiones principales: la región reguladora (promotor) y la región codificadora
de la proteína. En la construcción de ratones transgénicos, se pueden usar promotores
generales que permiten una expresión continua y generalizada del transgen, o bien un
promotor tejido-específico que producirá un patrón de expresión más restringido.
Ratón knock-out
Un ratón knock-out (KO) es un organismo genéticamente modificado (OGM) que carece de la
expresión de un gen en particular. Los ratones KO son un modelo para estudiar la acción de un
gen particular en la bioquímica y fisiología de un organismo. Los ratones knock-out son muy
útiles en el estudio del cáncer y de otras enfermedades complejas.

Ratón KO.
La obtención de un ratón KO se lleva a cabo de la siguiente manera:
1. Se extrae el gen de interés.
2. Se propaga el gen en una bacteria.
3. Se diseñan modificaciones genéticas para inactivar la función normal del gen.
4. Durante la activación se añade un gen que genera resistencia a un antibiótico. Con
frecuencia se utiliza el gen Neo, el cual da resistencia a la neomicina. Este gen marcador
generará una “selección positiva” (sólo las células que lo porten sobrevivirán).
5. Se añade también otro gen de selección negativa (las células que lo porten morirán) a los
extremos del gen que se pretende modificar. Usualmente el gen de selección negativa es
el gen timidina quinasa del herpes virus (tk). Este gen debe ser eliminado por la
maquinaria celular durante el proceso de recombinación homóloga.
6. Se prepara in vitro un vector de ADN. Usualmente el vector es un retrovirus.
7. Se pone el vector en contacto con células ES en suspensión. Las células ES provienen de
ratonas preñadas a las que se les extrajeron los embriones en el estado de blastocisto,
en el tercer día de desarrollo.
8. Se aplica un choque eléctrico (electroporación) que crea un poro en la membrana de las
células ES, con lo que se facilita la entrada del vector.
9. El gen normal es reemplazado con el gen modificado, a través de un proceso
llamado recombinación homóloga.
10. Se aplica el antibiótico de selección (generalmente neomicina) al cultivo de células
embrionarias.
 11. Mueren aquellas células que por azar hayan incluido el gen de selección negativa
(usualmente el tk) en los extremos del gen. Las células que quedan en el cultivo se
denominan recombinantes.
12. Se microinyectan entre 10 y 12 células troncales embrionarias (stem cells, SC por sus
siglas en inglés) recombinantes en embriones de ratón.
13. Se implantan los embriones en una ratona pseudopreñada.
14. Nacen los ratones provenientes de estos embriones. Como los embriones modificados
estaban formados por dos tipos de células, se dice que estos organismos son quimeras.
15. Se realizan cruces para generar una cepa de ratón con un determinado gen modificado.
Se tiene en cuenta que solo un 50 por ciento de las crías de las quimeras serán
recombinantes.
Entre las desventajas que tiene la investigación con ratones noqueados se pueden mencionar
las siguientes: la posible mortalidad de los embriones o de los recién nacidos, en algunos casos,
lo que impide el estudio de la función de ese gen particular en los animales adultos; la
modificación está presente en todas las células, lo cual no se da en el desarrollo de algunos tipos
de cáncer; la modificación está presente desde la fecundación, de forma tal que en algunos
casos la plasticidad durante el desarrollo embrionario puede conducir a una interpretación
confusa de los resultados por fenómenos de compensación.
A pesar de las anteriores limitaciones, el conocimiento de la genética médica ha crecido
enormemente gracias a los ratones KO.
Ratones de experimentación en Internet
Como el ratón de laboratorio se convirtió en un modelo esencial para la investigación sobre
patologías humanas, se han generado ratones transgénicos de varios tipos (KO – “total”, KO –
condicional o con genes mutados). Por tal razón, surgió la necesidad de agrupar y catalogar de
alguna manera, los datos sobre la multitud de ratones generados. Hoy en día, existen múltiples
páginas de Internet dedicadas a los ratones de investigación. En la Tabla 1 están presentadas
algunas de las más importantes (Tabla 1). Además, se están realizando varios proyectos
colaborativos internacionales a nivel mundial enfocados al agrupamiento tanto de datos como
de muestras biológicas de ratones transgénicos. Uno de ellos, “Internacional Knock-Out Mouse
Consortium” (IKMC) tiene como objetivo principal la creación del banco mundial de ratones KO
de todos los genes del genoma murino, para ofrecer en el futuro la posibilidad de estudiar cada
gen, en cualquier momento del desarrollo mediante el sistema Cre-loxP, utilizando la expresión
específica e inducible del gen de la recombinasa Cre. El IKMC lo componen 4 proyectos
colaborativos:
KOMP - “Knock-Out Mouse Project”, EEUU, con el objetivo de generar los ratones KO para cada
gen endógeno.
EUCOMM - “European Conditional Mouse Mutagenesis Program”, UE, con el objetivo de
desarrollar las células embrionarias ES, en las que cada gen se marcará con secuencias loxP
creando así el banco de animales KO condicionales.
NorCOMM – “North American Conditional Mouse Mutagenesis Project”, Canada. TIGM – “Texas
Institute for Genomic Medicine”, EEUU.
Tabla 1 Bases de Datos sobre Genética de Ratón a nivel mundial