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Breve Reseña
Ratón KO.
La obtención de un ratón KO se lleva a cabo de la siguiente manera:
1. Se extrae el gen de interés.
2. Se propaga el gen en una bacteria.
3. Se diseñan modificaciones genéticas para inactivar la función normal del gen.
4. Durante la activación se añade un gen que genera resistencia a un antibiótico. Con
frecuencia se utiliza el gen Neo, el cual da resistencia a la neomicina. Este gen marcador
generará una “selección positiva” (sólo las células que lo porten sobrevivirán).
5. Se añade también otro gen de selección negativa (las células que lo porten morirán) a los
extremos del gen que se pretende modificar. Usualmente el gen de selección negativa es
el gen timidina quinasa del herpes virus (tk). Este gen debe ser eliminado por la
maquinaria celular durante el proceso de recombinación homóloga.
6. Se prepara in vitro un vector de ADN. Usualmente el vector es un retrovirus.
7. Se pone el vector en contacto con células ES en suspensión. Las células ES provienen de
ratonas preñadas a las que se les extrajeron los embriones en el estado de blastocisto,
en el tercer día de desarrollo.
8. Se aplica un choque eléctrico (electroporación) que crea un poro en la membrana de las
células ES, con lo que se facilita la entrada del vector.
9. El gen normal es reemplazado con el gen modificado, a través de un proceso
llamado recombinación homóloga.
10. Se aplica el antibiótico de selección (generalmente neomicina) al cultivo de células
embrionarias.
11. Mueren aquellas células que por azar hayan incluido el gen de selección negativa
(usualmente el tk) en los extremos del gen. Las células que quedan en el cultivo se
denominan recombinantes.
12. Se microinyectan entre 10 y 12 células troncales embrionarias (stem cells, SC por sus
siglas en inglés) recombinantes en embriones de ratón.
13. Se implantan los embriones en una ratona pseudopreñada.
14. Nacen los ratones provenientes de estos embriones. Como los embriones modificados
estaban formados por dos tipos de células, se dice que estos organismos son quimeras.
15. Se realizan cruces para generar una cepa de ratón con un determinado gen modificado.
Se tiene en cuenta que solo un 50 por ciento de las crías de las quimeras serán
recombinantes.
Entre las desventajas que tiene la investigación con ratones noqueados se pueden mencionar
las siguientes: la posible mortalidad de los embriones o de los recién nacidos, en algunos casos,
lo que impide el estudio de la función de ese gen particular en los animales adultos; la
modificación está presente en todas las células, lo cual no se da en el desarrollo de algunos tipos
de cáncer; la modificación está presente desde la fecundación, de forma tal que en algunos
casos la plasticidad durante el desarrollo embrionario puede conducir a una interpretación
confusa de los resultados por fenómenos de compensación.
A pesar de las anteriores limitaciones, el conocimiento de la genética médica ha crecido
enormemente gracias a los ratones KO.
Ratones de experimentación en Internet
Como el ratón de laboratorio se convirtió en un modelo esencial para la investigación sobre
patologías humanas, se han generado ratones transgénicos de varios tipos (KO – “total”, KO –
condicional o con genes mutados). Por tal razón, surgió la necesidad de agrupar y catalogar de
alguna manera, los datos sobre la multitud de ratones generados. Hoy en día, existen múltiples
páginas de Internet dedicadas a los ratones de investigación. En la Tabla 1 están presentadas
algunas de las más importantes (Tabla 1). Además, se están realizando varios proyectos
colaborativos internacionales a nivel mundial enfocados al agrupamiento tanto de datos como
de muestras biológicas de ratones transgénicos. Uno de ellos, “Internacional Knock-Out Mouse
Consortium” (IKMC) tiene como objetivo principal la creación del banco mundial de ratones KO
de todos los genes del genoma murino, para ofrecer en el futuro la posibilidad de estudiar cada
gen, en cualquier momento del desarrollo mediante el sistema Cre-loxP, utilizando la expresión
específica e inducible del gen de la recombinasa Cre. El IKMC lo componen 4 proyectos
colaborativos:
KOMP - “Knock-Out Mouse Project”, EEUU, con el objetivo de generar los ratones KO para cada
gen endógeno.
EUCOMM - “European Conditional Mouse Mutagenesis Program”, UE, con el objetivo de
desarrollar las células embrionarias ES, en las que cada gen se marcará con secuencias loxP
creando así el banco de animales KO condicionales.
NorCOMM – “North American Conditional Mouse Mutagenesis Project”, Canada. TIGM – “Texas
Institute for Genomic Medicine”, EEUU.
Tabla 1 Bases de Datos sobre Genética de Ratón a nivel mundial