Tecnológico Nacional de México

Instituto Tecnológico de Tehuacán

Carrera: Ingeniería Bioquímica

Asignatura: Bioquímica del Nitrógeno y regulación genética

Exposición 1

Integrantes:

CRUZ GONZALEZ KAREN LIZBETH

GUZMAN ONOFRE DAYANA ABRIL

GRANJA RAMIREZ ILIANA

SANCHEZ RODRIGUEZ ERNESTO

GARCIA MELGOZA KENIA

PALAFOX LUNA SHARIM DARINKA

TENORIO ROSAS FRANCISCO MAGDIEL

Docente:

Juan Manuel Cristalinas Hinostrosa

DICIEMBRE 2019

1
Índice
REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA 4
EL DNA Y LA ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENÉTICO .................................................... 8
Transformación de las bacterias por el DNA ........................................................................... 8
Modelo de Watson-Crick de la estructura del DNA................................................................... 12
DNA vírico: regla del anillo: ........................................................................................................... 13
DNA bacteriano............................................................................................................................... 14
Cromosomas eucariotas: .............................................................................................................. 15
Superenrollamiento de círculos de DNA:.................................................................................... 16
Propiedades del DNA en disolución: ........................................................................................... 16
Propiedades ácido- base:.............................................................................................................. 16
Viscosidad: ...................................................................................................................................... 17
Comportamiento de sedimentación: ............................................................................................ 17
Desnaturalización del DNA: .......................................................................................................... 17
Punto de fusión del DNA ................................................................................................................... 18
Etapas de la desnaturalización del DNA .................................................................................... 18
Trazado del mapa de la estructura cromosómica ..................................................................... 19
Naturaleza molecular de la mutación .......................................................................................... 21
Modificación y restricción del DNA .............................................................................................. 23
La técnica de hibridación: homologías secuenciales en los DNAs de distintas especies. . 24
SECUENCIAS REPETIDAS EN EL DNA DE ORGANISMOS EUCARIÓTICOS ................ 25
AISLAMIENTO DE GENES ESPECIFICOS .............................................................................. 26
SÍNTESIS QUÍMICA DE POLIDESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS Y GENES. ......................... 27
REPLICACIÓN Y TRANSCRIPCIÓN DEL DNA ....................................................................... 28
REPLICACIÓN SEMICONSERVADORA DEL DNA: EXPERIMENTO DE MESELSON-
STAHL. ............................................................................................................................................. 28
PUNTOS DE INICIACIÓN Y DIRECCIÓN DE LA REPLICACIÓN DE LOS
CROMOSOMAS ............................................................................................................................. 30
DNA- POLIMERASA I .................................................................................................................... 32
Actividades exonucleasicas de la DNA ∼ polimerasa I enzima multifuncional. ................... 35
Papel de DNA preformado en la acción de la DNA ∼ polimerasa.......................................... 35
Fidelidad de replicación de la DNA ∼ polimerasa I ................................................................... 36
DNA ∼ ligasa ................................................................................................................................... 37
Función de las actividades exonucleasicas de la DNA∼polimerasa I.................................... 37

2
DNA∼polimerasas II, III, III* .......................................................................................................... 38
Replicación del DNA en etapas cortas........................................................................................ 38
Desenrollamiento del DNA y proteínas destorcedoras............................................................. 39
Papel del RNA en la iniciación de las cadenas del DNA. ........................................................ 41
Una hipótesis para la replicación del DNA ................................................................................. 42
Reconocimiento del punto de iniciación. .................................................................................... 42
Desenrollamiento del DNA. ........................................................................................................... 43
Cebado por el RNA ........................................................................................................................ 43
Eliminación de los RNA cebadores. ............................................................................................ 44
Unión de los fragmentos cortos de DNA. ................................................................................... 44
Especificidad de patrón e iniciación de la transcripción ........................................................... 47
Prolongación y terminación de las cadenas de RNA ................................................................ 48
Productos de la RNA-polimerasa-DNA-dirigida ......................................................................... 49
Tratamiento post-transcripción de los RNAs.............................................................................. 50
Inhibidores de la síntesis de RNA ................................................................................................ 53
Visualización del proceso de transcripción ................................................................................ 56
Replicación del RNA viral: RNA-replicasas ................................................................................ 57
Polinucleótido-fosforilasa .............................................................................................................. 59
DNA-polimerasas-RNA-dirigidas.................................................................................................. 61
(Transcriptasas inversas) .......................................................................................................... 61
Biosintesis de RNA: RNA-polimerasa-DNA dirigida ................................................................. 63

3
REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN DE LA
INFORMACIÓN GENÉTICA
Los extraordinarios avances de nuestro conocimiento sobre las bases
moleculares de la genética han significado una revolución en biología
que muchos comparan con la iniciada por la teoría de Darwin sobre el
origen de las especies. Todos los campos de la biología han sido
profundamente influenciados por estos desarrollos, que han aportado
vigor y penetrantes conocimientos de la mayoría de los problemas
fundamentales de la estructura y función celulares, y han conducido aun
mas amplio y extenso armazón conceptual de la ciencia bioquímica. En
la cual hay que decir, literalmente, que no se puede estudiar problema
bioquímico alguno aisladamente de su contexto genético. Por otra parte,
estos conceptos han aumentado enormemente la potencialidad del
enfoque molecular de la biología a sondear con mas confianza
complejos problemas biológicos tales como la diferenciación celular, la
morfogénesis, la inmunidad y muchos otros; que hasta hace poco
tiempo fueron modo superficial.

El conocimiento actual de la base molecular de la genética surgió como

consecuencia de los avances teóricos y experimentales realizados en
tres distintos campos científicos; la genética clásica, la bioquímica y la
estructura molecular.

En el de la genética el avance experimental se vio fuertemente

acelerado por el empleo de los rayos X y otros agentes mutagénicos,
que aumentan considerablemente la velocidad de mutación, así como
por la utilización de microorganismos de corto ciclo vital tales como
moho, bacterias y virus. El poder disponer de métodos mas eficaces

4
para la selección de mutantes raros y recombinados genéticos de
enormes poblaciones condujo a la construcción de mapas genéticos de
gran resolución. Estos mapas han revelado la secuencia de varios
genes en algunos cromosomas, y han demostrado que un determinado
gen posee un gran numero de centros en los que puede experimentar
mutación. Pero los avances mas penetrantes en el campo de la
genética, que iniciaron la confluencia de la genética con la bioquímica,
se deben a la aparición de la hipotesis de un gen~un enzima, debida al
trabajo de G. W. Beadle y E. L. Tatum comenzado en 1941, y al
descubrimiento de O. T. Avery y colaboradores en 1944, de que la
información genética esta contenida en el DNA y es transmitida por él.

Los nuevos métodos cromatográficos fueron los instrumentos que

permitieron establecer la composición y la estructura covalente de los
ácidos nucleicos. Uno de los descubrimientos más singulares fue el de
E. Chargaff, referente a la equivalencia molar de ciertas bases en el
DNA. La técnica de los trazadores isotópicos también desempeño un
papel principal al hacer posibles enfoques experimentales directos con
respecto a la biosíntesis de los ácidos nucleicos y de las proteínas.

Por lo que se refiere a la estructura molecular, el análisis por difracción

de rayos X sobre la conformación de las moléculas de las proteínas
fibrosas realizadas por W. Astbury y por L. Pauling, así como el de las
proteínas globulares llevadas a cabo por J. C. Kendrew y M. F. Perutz,
proporcionaron el conocimiento de que cada tipo de molécula proteica
posee una conformación especifica de dimensiones precisas que
determina sus funciones biológicas. Pero el gran acontecimiento
desencadenante del desarrollo de la genética molecular fue el análisis

5
por rayos X de la estructura tridimensional del DNA. En 1953, J. D.
Watson y F. H. C. Crick postularon la estructura en doble hélice del DNA,
la cual no solo estaba de acuerdo con la equivalencia molar de bases y
con los diagramas de rayos X característicos del DNA, sino que también
indicaba la existencia de un mecanismo sencillo por medio del cual la
información genética podía transferirse de las células progenitoras a las
hijas.

La hipotesis de Watson-Crick pronto fue desarrollada y extendida hasta

desembocar en lo que Crick denomino el dogma central de la genética
molecular, que establece que la información genética fluye del DNA al
RNA y que este a la proteína, aunque este anunciado ha tenido que ser
recientemente modificado en la forma que sigue:

DNA RNA proteína

El dogma central definió tres procesos principales de la preservación y

transmisión de la información genética. El primero de ellos, es la
replicación o copia del DNA para formar moléculas hijas idénticas. El
segundo es la transcripción, proceso mediante el cual, el mensaje
genético del DNA es transcrito en forma de RNA mensajero para ser
llevado a los ribosomas. El tercero es la traducción, proceso por el cual
el mensaje genético es descifrado en los ribosomas, donde el RNA se
utiliza como matriz dirigiendo la secuencia aminoácido especifica
durante la biosíntesis proteica. El dogma central resulto apoyado no solo
por el descubrimiento del RNA mensajero, sino también por la
demostración de que la secuencia de nucleótidos de un gen guarda una

6
correspondencia lineal con la secuencia de aminoácidos de la proteína
codificada por dicho gen. Además, se ha deducido el diccionario de los
vocablos del código de los triples en el RNA mensajero,
correspondientes a los distintos aminoácidos, lo cual ha constituido una
de las mayores conquistas de la ciencia moderna.

Se han revelado nuevos aspectos sobre la base molecular de la

transferencia de la información genética, se ha llevado a cabo con
organismos procariotas, particularmente con la bacteria Escherichia coli
y con un virus bacterianos. Los procariotas contienen un solo
cromosoma, solamente una molécula de DNA de doble hebra, y
generalmente se multiplican por un proceso asexual de división celular
según el cual las células hijas normalmente reciben un genoma idéntico
al de la célula madre. En el ciclo vital de los procariotas, la célula se
encuentra generalmente en estado haploide. Por tanto, la genética
bacteriana puede estudiarse sin las complicaciones de la dominancia y
la recesión, que son característica de los organismos diploides
eucariotas que implican los principios mendelianos. Por otra parte, los
problemas de transferencia de información genética son válidos, incluso
en los cromosomas únicos de los virus, que solo contienen unas pocas
docenas de genes en comparación con los varios millares presentes en
las bacterias. Debido a la relativa simplicidad de los virus y bacterias, y
a la rapidez y eficiencia con que los experimentos de genética pueden
realizarse con ellos, actualmente se dispone de conocimientos seguros
de muchos de los fundamentales procesos de la transferencia de
información genética que con cierta confianza puede considerarse
como biológicamente universales.

7
Los organismos eucariotas contienen mucha más información genética
que los procariotas y dicha información esta repartida entre varios o
muchos cromosomas. Las células somáticas de los organismos
eucariotas son generalmente diploides, y contienen doble numero de
cromosomas presentes que en las células germinales, que son
haploides. En una eucariota, cada gen se encuentra en dos formas, o
alelos, uno de los cuales es dominante y el otro recesivo. Los
organismos eucariotas generalmente se reproducen por conjugación
sexual, durante la cual genes de ambos padres se intercambian e
incorporan al genoma de la progenie por un proceso de recombinación.
Si bien la recombinación también tiene efecto durante la conjugación
sexual o una infección vírica, no constituye un proceso normal en su
división asexual.

EL DNA Y LA ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENÉTICO

Transformación de las bacterias por el DNA
Aunque el DNA fue descubierto en los núcleos celulares por F.
Miescher, ya en el año 1869 no se le identifico como portador directo de
la información genética hasta el año 1944, en que O. T. Avery y sus
colaboradores descubrieron, que algunas células de un cultivo de rápido
crecimiento de una cepa no virulenta de la bacteria diplococcus
pneumoniae, mas generalmente denominada neumococo, resultan
transformadas en una forma virulenta heredable, o cepa productora de
enfermedad, por la simple adición de un DNA extraído de neumococos
virulentos. Se sabe desde hace tiempo que los neumococos virulentos
cultivados en agar forman unas colonias lisas (denominadas (S) debido
a la presencia de una capsula distintiva de polisacárido. Las cepas no
virulentas o no patógenas de neumococos, en cambio, constituyen
8
colonias rugosas(R). Los investigadores más antiguos habían
observado que la inyección a ratones de células virulentas R, era letal.
De los ratones infectados, pudieron aislarse y cultivarse células S
viables, lo que indicaba que las células R vivas habían sido
transformadas en células S por un componente termoestable presentes
en las células muertas. O. T. Avery, C. M. MacLeod y M McCarty,
investigaron este efecto mas de cerca, hallando que el DNA aislado y
altamente purificado de las células S muertas por alta temperatura era
capaz de inducir una transformación al añadirlo a células no virulentas
R cultivadas in vitro. Por otra parte, muestras de DNA procedentes de
células R o de otras especies distintas del neumococo, se mostraron
incapaces de transformar a las células R inducida por el DNA es una
característica permanente y heredable, pues se observo que toda la
progenie de las células transformadas, después de varias
generaciones, eran células virulentas S. Como consecuencia, Avery y
sus colegas llegaron a la conclusión de que el DNA podía ser portador
de información genética.

Aunque el DNA es normalmente la forma primaria de almacenamiento

de la información genética, pasando de ella a las células hijas por el
proceso de replicación, se sabe ahora que, en algunos virus, el RNA
puede almacenar información genética. Es más, a veces la información
genética puede ser transferida del RNA al DNA según el proceso de
transcripción inversa, que se estudiara en otro lugar.

Datos bioquímicos del DNA como material genético

El ADN es el portador de la información genética, procedentes de otras

direcciones.

9
En primer lugar, la cantidad de DNA en una especie, célula u organismo
determinado es notablemente constante, y no puede ser alterado por
circunstancias ambientales ni por cambios nutricionales o del
metabolismo celular, propiedad que era de esperar tratándose de un
material genético.

Segundo, la cantidad de DNA por célula resulta ser proporcional a la

célula, y, por tanto, a la cantidad de información genética que esta
contiene. Las bacterias contienen aproximadamente 0,01 pg (1 pg es
igual a 1x10-12g) de DNA por célula (el 1 % aproximado de su peso
húmedo total), mientras que los tejidos de los animales superiores
contienen unos 6 pg por célula. Por otra parte, las células germinales
de los animales superiores, que son haploides y contienen un solo juego
de cromosomas, poseen solo la mitad de la cantidad de DNA presentes
en las células somáticas de la misma especie de animal superior, la
cantidad de DNA por célula diploide es mas o menos constante de uno
a otro tipo de célula.

Equivalentes de bases en el DNA

Uno de los datos más claros bioquímicamente en relación con el hecho

de que el DNA es el portador de la información genética, fue el
descubrimiento de que la composición en bases del DNA está
relacionada con la especie de origen. Antes de que se dispusiera de
métodos cromatográficos realmente fiables se creía que las 4 bases
principales halladas en el DNA (adenina, guanina, citosina y timina) se
encontraban en proporciones equimoleculares en todas las moléculas
del DNA.

10
Después en el periodo comprendido entre 1949 y 1953, E. Chargaff y
sus colaboradores aplican técnicas cromatográficas cuantitativas para
la separación y análisis cuantitativo de las cuatro bases contenidas en
muestras de hidrolizados de DNA aisladas de distintos organismos.
Algunos de los datos recogidos por ellos y por otros investigadores
dedujeron conclusiones importantes:

1. La composición en bases del DNA varia de una especie a otra.

2. Las muestras de DNA aisladas de distintos tejidos de una misma
especie tienen la misma composición de bases.
3. La composición en bases de DNA de una determinada especie no
cambia con la edad, con el estado de nutrición ni con las
variaciones del entorno.
4. En casi todos los DNAs examinados en el numero de restos de
adenina es siempre igual al numero de restos de timina, es decir
A=T, y el numero de restos de guanina es siempre igual al de
restos de citosina (G=C). Como corolario, queda claro que la suma
de restos de purina iguala a la suma de restos pirimidínicos, es
decir, que A+G=C+T.
5. Los DNAs extraídos de especies estrechamente relacionadas
poseen similares composiciones en bases, mientras que los
procedentes de especies ampliamente diferentes, es probable
que contengan muy distinta composición en bases. En verdad, la
composición en bases de sus respectivas DNAs se puede
utilizarse para clasificar a los organismos.

11
Modelo de Watson-Crick de la estructura del DNA
Las equivalencias de bases que se observan en el DNA de distintas
especies despertó la intrigante posibilidad de que en las moléculas del
DNA existe un nivel de organización estructural que debe ser compatible
con otras. De hecho, ya se había sospechado que el DNA tenía una
conformación tridimensional especifica. Puesto que las disoluciones de
DNA son muy viscosas, se comprendía que las moléculas de DNA
fueran largas y rígidas en vez de compactas y plegadas. Además, el
calentamiento de un DNA recientemente aislado introduce significativos
cambios en su viscosidad y en otras propiedades físicas, sin romper los
enlaces covalentes del armazón del DNA .

El DNA puede obtenerse en dos formas, A y B que difieren en su grado

de hidratación: la forma B es la biológicamente importante. Se descubrió
que esta forma poseía dos periodicidades, una principal de 0,34 nm, y
otra secundaria de 3,4 nm, que recordaban las periodicidades, mayor y
menor, observadas en las α-queratinas.

En 1953 J. D. Watson y F. H. C. Crick postularon un modelo preciso

para la estructura tridimensional del DNA, basándose en los datos
obtenidos mediante rayos X por Franklin y Wilkins, y en equivalencias
de bases observadas por Chargaff. Este modelo no solo explica muchas
de las observaciones sobre las propiedades físicas y químicas del DNA,
sino que también indicaba un mecanismo por medio del cual la
información genética podía replicarse con exactitud.

El modelo estructural para el DNA de Watson y Crick proponía que dos

cadenas polinucleótidas dextrógiras se hallaban arrolladas en forma de
hélice alrededor de un mismo eje, constituyendo así una doble hélice.

12
Ambas cadenas o hebras son antiparalelas, es decir, sus puentes
fosfodiéster 3´,5´~internucleotidicos van en direcciones opuestas. El
arrollamiento de ambas cadenas es tal que no pueden ser separadas
sin desenrollarlas; este tipo de arrollado se denomina plectonémico. Las
bases purinicas y pirimidínicas de cada una de las hebras están
apiladas en el interior de la duplohélice, con sus planos paralelos entre
sí, y perpendiculares al eje de la hélice doble.

DNA vírico: regla del anillo:

Durante algunos años se creyó que las moléculas de DNA tenían pesos
moleculares del orden de los 10 millones.

Las moléculas nativas del DNA de las células bacterianas y animales,

son tan grandes que no son aislables en forma intacta, puesto que se
rompen fácilmente. Basta una simple agitación o el pipeteado de las
disoluciones de DNA para provocar la fragmentación del DNA nativo en
porciones de pesos moleculares aproximados a los 10 millones.

Las moléculas de DNA de los virus bacterianos pueden obtenerse

fácilmente en sus formas nativas homogéneas. Las moléculas de los
DNAs de los pequeños bacteriófagos lambda y delta X174 de E. Coli
han sido objeto de mucha atención.

Los DNAs de virus, en la mayoría de los casos son dúplex lineales, si

bien el DNA de delta X174 es un círculo monofilar. Sin embargo, los
DNAs víricos lineales muestran algunas características estructurales
indicativas de que originalmente estaban formadas como círculos antes
de la replicación; este concepto constituye la regla del anillo, algunos

13
DNAS lineales de virus, tal como el fago lambda, poseen extremos
cohesivos (pegajosos). Los extremos 5´ de estos DNAs dúplex se
proyectan como hebras sencillas más allá de los extremos 3´; doce de
los nucleótidos de tales extremos son complementarios y, por lo tanto,
se aparean fácilmente para formar círculos. Otra característica singular
de varios DNAs virales consiste en que no poseen secuencias de bases
únicas, sino una población de moléculas cuyas secuencias son
permutaciones circulares de cada una de ellas.

DNA bacteriano
El cromosoma de E. Coli consiste en una sola molécula, enorme, de
DNA bifilar, con un peso molecular de 2.8 x 10*9, un grosor de 2.0 nm
y una longitud de 1.36 nm. El DNA de E. Coli contiene unos 4 millones
de pares nucleótidos. Esta molécula de DNA posee un rizo cerrado
denominado círculo. El cromosoma bacteriano está curvado de modo
firme y compacto en la zona nuclear, mantenido así por algo de RNA.
La molécula de DNA está recogida por un mínimo de 50 lazos muy
retorcidos o superarrollados.

Además, la mayoría de las células bacterianas contiene de 1 a 20

moléculas más pequeñas de DNA dúplex circular, denominada
plásmidos.

Sus funciones no son conocidas claramente, pero algunos de ellos,

llamados episomas, se incorporan al cromosoma de la célula huésped.
Los plásmidos pueden ser transferidos de una célula bacteriana a otra
durante la conjugación sexuada, confiriendo así nuevas características
fenotípicas a la célula recipendiaria.

14
Cromosomas eucariotas:
El núcleo de las células eucariotas puede contener varios o muchos
cromosomas, según las especies. Cada cromosoma contiene una
moléculas muy grande de DNA. La longitud total de todo DNA presente
en una sola célula de mamífero se ha calculado que debe ser 2m,
admitiendo que es duplohelicoidal.

La organización ultraestructural del DNA en el núcleo de las células

eucariotas es muy compleja, y experimenta cambios espectaculares
durante el ciclo celular. Durante la interfase, período entre la mitosis.

Las fibras de cromatina de las células somáticas tienen un diámetro de

unos 20nm. Constan de dos componentes principales, el DNA y unas
proteínas básicas denominadas histonas. Además de las histonas, la
cromatina contiene algunas proteínas ácidas, algunas proteínas
enzimáticas tales como la DNA- polimerasa, así como RNA nuclear y
algunos lípidos.

Las histonas son relativamente pequeñas y muy básicas. Existen 5

clases principales, que se diferencian en sus contenidos relativos en
lisina y arginina.

Las cargas positivas repetidas de las histonas forman asociaciones

electrostáticas con los grupos fosfato negativos del DNA. La doble
hélice del DNA, junto con las histonas asociadas, en las fibras de
cromatina, esta superarrollada y plegada varias veces hacia adeltante y
atrás. En los cromosomas eucarióticos, las historias están implicadas
en el superarrollado del DNA, sirviendo como elementos estructurales o

15
bien para cubrir o reprimir a determinados segmentos específicos
evitando la transcripción.

La replicación y la transcripción enzimática de los cromosomas

eucarióticos presenta muchos problemas topológicos y geométricos.

Las mitocondrias de las células eucariotas contienen un DNA que es

completamente diferente del hallado en el núcleo. El total de DNA
mitocondrial es mucho menos del 1% del total de DNA.

Superenrollamiento de círculos de DNA:

los DNAs dúplex circulares, frecuentemente están superenrrollados u
suprarretorcidos. El superenrollado se produce cuando el DNA contiene
más pares de bases que los normales de una doble hélice por unidad
de longitud . como consecuencia, la estructura circular completa del
DNA tiende a compensar o aliviar esa tensión torsional, retorciéndose
en sentido opuesto o negativo. Tales DNAs superenrollados pueden
relajarse mediante la rotura de una de las hebras, seguida de su
resoldadura se produce por la inserción de ciertos afentes químicos.
Tales como el bromuros de etidio.

Propiedades del DNA en disolución:

Disoluciones de moléculas nativas de DNA pueden estudiarse
fácilmente por métodos físico- químico.

Propiedades ácido- base:

Los grupos fosfato que se repiten en el DNA y constituyen los puentes
entre nucleósidos ayacentes, tienen un pK´bastante bajo y se inonizan
por completo a ph superior a 4 por lo tanto el DNA es ácido. El enlazado

16
de poliaminas en el surco profundo de la doble hélice estabiliza a la
molécula de DNA , haciéndola más flexible. La estabilidad de los pares
de bases unidas por puentes de hidrógeno del DNA duplohelicoidal es
una función del PH.

Viscosidad:
Debido a la rigidez de la duplohélice y ala inmensa longitud del DNA,
incluso las disoluciones muy diluidas de DNA son muy viscosas. Para
seguir el curso del proceso de desenrollamiento o desnaturalización, es
corriente utilizar las mediciones de viscosidad. El DNA únicamente
exhibe un comportamiento ideal como soluto cuando esta formando
disoluciones altamente diluidas.

Comportamiento de sedimentación:
El coeficiente de sedimentación y el peso molecular de muestras de
DNA pueden determinarse por los métodos de ultracentrifugación antes
descritos. Los pesos moleculares de las moléculas de DNA pueden
establecerse por comparación de sus velocidades de sedimentación en
un gradiente de densidad de sacarosa, con la velocidad obtenida con
una muestra de DNA de tamaño y coeficiente de sedimentación
conocidos.

Desnaturalización del DNA:

las disoluciones de la forma de doble hélice del DNA experimentan
cambios. Cuando se someten a 1) PH extremados, 2) temperatura, 3)
disminución de la constante dieléctrica del medio acuoso por
incorporación de alcoholes, cetonas, etc; 4) exposición a la urea,

17
amidas, etc. La viscosidad de las disoluciones de DNA disminuye, la
absorción luminosa a 260 nm aumenta, la rotación óptica se torna más
negativa y la densidad aumenta a esto se le llama desnaturalización.

Durante la desnaturalización del DNA no se rompen enlaces covalentes;

pero la estructura duplohelicoidla se desenrolla y se separa.

Punto de fusión del DNA

Generalmente, las moléculas nativas de DNA se desnaturalizan con un
pequeñísimo aumento de temperatura; la precisión de la transición
recuerda el punto de fusión de un compuesto orgánico sencillo. Por ello,
la desnaturalización térmica del DNA con frecuencia recibe el nombre
de fusión. Las muestras de DNA de distintos tipos de células poseen
distintos puntos de fusión característicos, definidos como 𝑇𝑚 o
temperatura del punto medio de su curva de fusión. La 𝑇𝑚 aumenta de
modo lineal con el contenido en pares de bases G-C, que poseen tres
enlaces de hidrogeno y son, por tanto, más estables que los pares A-T.
Cuanto más elevado es el contenido de pares G-C, más estable es la
estructura y mayor la energía térmica necesaria para provocar su
disrupción. Una determinación cuidadosa del punto de fusión de una
muestra de DNA, bajo condiciones definidas de pH y de fuerza iónica,
puede proporcionar un buen cálculo de su composición de bases.

Etapas de la desnaturalización del DNA

En la desnaturalización de la molécula del DNA dúplex se distinguen 2
etapas:

1. En la primera etapa, las dos hebras se desenrollan parcialmente

pero permanecen unidas por lo menos mediante un corto

18
 segmento de la estructura duplohelicoideal con algunas bases
complementarias todavía en registro. Los segmentos
desenrollados de cada una de las hebras adoptan una
conformación cambiante y al azar.
2. En la segunda etapa, ambas hebras se separan por completo una
de la otra. Si en este estado se enfrían rápidamente, cada una de
las hebras liberadas se dobla sobre sí misma para formar unos
segmentos duplohelicoideales intracatenarios.

La desnaturalización del DNA es fácilmente reversible si el proceso de

desenrrollamiento no ha pasado de la primera etapa. Mientras un
segmento duplohelicoideal este uniendo a las dos hebras con los pares
de bases en su sitio, los segmentos desplegados de las dos hebras
volverán a enrollarse espontáneamente reformando un dúplex completo
cuando se haga descender la temperatura. Instantáneamente se
produce un retorno a la conformación nativa, que es la máxima energía
libre. Sin embargo, si las dos hebras se han separado por completo, la
renaturalización es mucho más lenta.

Trazado del mapa de la estructura cromosómica

El trazado del mapa genético con las posiciones relativas de los genes
en los cromosomas bacterianos se ha hecho posible por el hecho de
que, en determinadas circunstancias, un segmento del cromosoma de
un determinado tipo de célula que contenga uno o más genes, puede
desprenderse y transferirse al cromosoma de un segundo tipo de célula,
al cual se incorpora mediante una unión covalente.

En el trazado de los mapas de los cromosomas bacterianos y virales

son son útiles cuatro tipos de procesos de recombinación genética:
19
1) Conjugación sexual: Consiste en la transferencia de algunos o
todos los cromosomas de una célula macho o (+), a otra célula
hembra o (-), seguramente, a través de uno de los “pili” o “fimbriae”
que sirve como tubo de conexión entre las dos células. La unión
entre células y por tanto, el proceso de conjugación, puede
interrumpirse en cualquier momento por agitación mecánica de la
suspensión celular mediante un mezclador o desintegrador. De
este modo se puede recuperar células (-) que llevan cantidades
variables de material cromosómico masculino que dependen del
momento en que se haya producido la interrupción.
2) Transformación bacteriana: Una célula bacteriana receptora
puede ser genéticamente transformada por adición de un DNA
exógeno procedente de otra cepa. Este efecto es debido a la
incorporación de uno o más de los genes del DNA donador en el
cromosoma de la célula recipiendaria. Determinando la frecuencia
con que dos o más fenotipos de las células donadoras aparecen
juntos en la progenie de la célula receptora, es posible deducir las
posiciones relativas de los genes correspondientes en el
cromosoma dador. Los pares de genes incorporados en la célula
receptora con elevada frecuencia están situados más cerca en el
cromosoma que aquellos otros pares de genes que penetran
juntos infrecuentemente.
3) Transducción: Por el cual una pequeña porción del cromosoma de
una célula bacteriana infectada por un virus se incorpora a las
moléculas del DNA de la progene virus. Cuando las partículas del
virus progenie infectan a otra célula, los genes procedentes de la
célula huésped original pueden incorporarse al cromosoma de la

20
 nueva célula huésped. La partícula del virus que se transfiere es
portadora de una porción de cromosomas de una célula
bacteriana hasta el cromosoma de otra.

Naturaleza molecular de la mutación

Se han identificado varios tipos de cambios químicos en el DNA que
pueden conducir a varios productos de genes mutantes. Las mutaciones
puntuales sencillas pueden dividirse en cuatro clases principales,
basándose en el cambio introducido en el DNA por el agete mutagenico.
En los mutantes transicionales, un par purina-pirimidina es sustituido por
otro, esto es A-T por G-C, o por G-C por A-T, de suerte que una purina
de una cadena es reemplazada por otra purina, y una pirimidina de la
otra cadena, por otra pirimidina. Estas mutaciones ocurren
espontáneamente , pero también pueden inducirse mediante análogos
de las bases, en particular por el 5-bromouracilo(BU) y ña 2-
aminopurina(AP). Como quiera que el 5-bromouracilo tiene un estrecho
parecido estructural con la timina, se inserta fácilmente en el DNA
durante la replicación precisamente en las posiciones normalmente
ocupadas por la timina. Las nutaciones transicionales son provocadas
también por por el acido nitroso; desamina a la adenina, cuyo normal es
T, formando hipoxantina, que se aparea con C.

En las mutaciones transversionales un par purina-pirimidina es

sustituido por un par pririmidina-purina. Las transversiones son
corrientes en las mutaciones espontaneas; de hecho, aproximadamente
la mitad de las mutaciones de las cadenas 𝛼 y 𝛽 de la hemoglobina
son transversiones.

21
El tercer tipo de mutación de corriente de armazón, denominada así
porque la lectura normal de la secuencia de tripletes del armazón del
armazón resulta alterada y puesta fuera de registro por la mutación. Se
inducen fácilmente inserciones tratando las células por derivados de la
acridina. La acridina es una molécula heterocíclica plana. Gran parte de
los datos disponibles ugieren que debido a su estructura aromatica
plana, la acridina se inserta o intercala de modo no covalente entre dos
bases sucesivas del DNA, separándolas físicamente. Cuando esta
cadena se replica, se inserta covalentemente una base extra, en la
cadena complementaria, opuesta a la acridina intercalada. Cuando esta
cadena es después replicada a su vez, la nueva cadena
complementaria también contendrá una base extra.

El cuarto tipo de mutación es resultado de la supresión de una o más

bases del DNA; se trata también de una mutación por corrimiento de
armazón o esqueleto. Puede producirse por la pérdida hidrolítica de una
base purinica debida a un ph o temperatura elevados, a la acción de
reactivos productores de enlaces cruzados, o a la de agentes
alquilantes o desaminantes que provocan la formación de pares que no
pueden aparearse. El compuesto denominado proflavina también
induce supresiones.

No todas las mutaciones puntuales del DNA son necesariamente

letales. Las transiciones y las transversiones son relativamente
benignas, porque provocan la sustitución de un solo aminoácido de la
cadena polipeptidica codificada; muy a menudo la proteína defectuosa
sigue siendo funcional. A esta se le denomina silenciosa.

22
Otra clase de mutantes es la que resulta de la supresión de segmentos
del DNA, que puede tener una longitud de varios nucleótidos. Si el
número de nucleótidos suprimidos es 3 o algún múltiplo de 3, entonces
no hay error de corrimiento del armazón más allá del punto de la
mutación, pero la proteína producida puede ser defectuosa porque uno
o más aminoácidos estén suprimidos de su secuencia.

Se pueden producir mutaciones por la acción de muchos otros agentes

químicos como:

1) Diamida del ácido lisérgico (LSD).

2) Cafeína.
3) Rayos X.
4) Rayos 𝛾.
5) Luz ultravioleta.
6) Exposición excesiva a la luz solar.

Modificación y restricción del DNA

Las bacterias pueden destruir a un DNA extraño o invasor procedente
de otras especies, impidiendo su replicación, su transcripción o su
incorporación al genoma de la célula huésped. Ello es posible gracias a
una ingeniosa combinación de dos procesos enzimáticos denominados
modificación y restricción. La modificación es la alteración enzimática
por la célula de su propio DNA, de un modo distintivo especifico que la
diferencia de otras especies. La restricción, es la acción de enzimas
específicos que pueden degradar a los DNAs extraños invasores, pero
que no destruyen el DNA de la célula huésped, simplemente debido a
que la alteración covalente especifica de DNA de la célula huésped,

23
inducida por los enzimas de la modificación, no permite la actuación
sobre el de los enzimas de restricción.

La modificación protectora del DNA de la célula huésped la llevan a

efectos las metilasas modificadoras, que inducen la metilación de
ciertos restos de adenina. Una vez que el DNA de la célula huésped se
ha modificado de este modo, ya no puede ser degradado por los
enzimas restrictivos de la célula.

Algunos DNAs virales se modifican para protegerse de los enzimas

restrictivos de la célula huésped por transferencia de restos de glucosilo
desde la UDP-glucosa a los restos de hidroximetil-citosina. Los enzimas
restrictivos son endonucleasas que reconocen y escinden al DNA
extraño en la misma secuencia de bases que en el DNA de la célula
huésped ha sido modificada por metilación: los grupos metilo del DNA
de la célula huésped impiden el ataque de la endonucleasa restrictiva.

La técnica de hibridación: homologías secuenciales en los DNAs de

distintas especies.
Aunque se ha establecido la composición en bases del DNA de muchas
y diferentes bacterias y animales superiores, son pocos los datos de los
que disponemos con respecto a la secuencia exacta de nucleótidos en
las moléculas intactas del DNA nativo. Mediante pruebas de hibridación
es posible determinar si dos muestras dadas de DNA poseen bloques o
segmentos con secuencias de bases complementarias, y en que
extensión. Estos ensayos de hibridación están basados en la tendencia
que muestran dos hebras de DNA a aparearse y enrollarse por sus
regiones complementarias para formar dobles hélices. Cuanto mayor es
la tendencia de un determinado par de hebras a asociarse y
24
formarduplex mayor es la extensión de complementariedad de sus
secuencias. Si poseen secuencias de bases complementarias se
asociaran formando dúplex híbridos. La extensión en que se formen
tales híbridos queda fácilmente determinada si una de las muestras de
DNA se ha marcado previamente con P32 . Por medio de una
centrifugación en gradiente de densidades se pueden separar en la
mezcla las especies monofiliares de las doble hebra, pudiéndose
determinar después de la cantidad de radiactividad de la fracción que
contiene el hibrido dúplex recién formado.

El DNA de bacterias no tiende a hibridarse fácilmente con el DNA de

animales superiores, nisiquiera con elDNA de las células de levadura.

La hibridación entre los DNAs aislados de especies de nimales

superiore4s estrechamente relacionados puede observarse también
medianre una técnica sencilla.

SECUENCIAS REPETIDAS EN EL DNA DE ORGANISMOS

EUCARIÓTICOS
Cuando el DNA de bacterias se fragmenta ben pequeñas trozos, por la
acción de fuerzas de cizalla, todos los fragmentos poseen un mismo
contenido en bases y tienen la misma densidad, según se determina por
centrifugación en gradientes de densidades. Cuando el DNA de
organismos superiores se fragmenta y somete a la centrifugación en
gradiente de densidad, se obtiene un gran pico principal y uno o varios
picos más pequeños de densidades.

El DNA presente en tales picos pequeños se denomina DNA satélite. El

DNA satélite de unas especies ha sido objeto de análisis y se ha hallado
que contiene sencillas secuencias de bases repetidas. El DNA satélite
25
del cangrejo posee la secuencia repetida A-T-A-T-A-T-A-T, el de la rata
canguro tiene la secuencia repetida G-G-A-C-A-C-A-G-C-G, y la de una
especie de mosca de vinagre es A-C-A-A-A-T-T. Tales secuencias se
presentan por bloques de unos 100 restos y pueden repetirse hasta 107
veces por célula. El DNA satélite puede representar una gran fracción
del total de DNA cromosómico; el de la rata alcanza hasta el 11% del
genoma, y el del cangrejo se acerca al 25%. Se encuentran secuencias
cortas muy repetidas en la región centrómera del cromosoma, lo que
advierte que pueden ser espaciadores carentes de información
manteniendo unidos a determinados lazos del DNA informacional.

El DNA eucariótico presenta otra clase de secuencias repetidas de

tamaño mucho mayor. Fueron descubiertas por R.J.Britten y
colaboradores midiendo la velocidad de renaturalización, es decir del
apareamiento de bases en un DNA desnaturalizado por calentamiento.
El ritmo de renaturalización viene dado por el índice de cot, que se
define como el producto de la concentración molar de restos nucleótidos
por el tiempo de renaturalizacion (en segundos)

Los DNA’s satélites tienen valores cot muy bajos pero un DNA
homogéneo no repetitivo posee un índice cot muy elevado.

AISLAMIENTO DE GENES ESPECIFICOS

A partir de muestras del DNA se han conseguido aislar genes sueltos o
conjuntos de genes. J.Beckwith y colaboradores has aislado un conjunto
de 3 genes y las regiones reguladoras del DNA implicando en el
transporte y en el metabolismo del β- galactósidos en E.coli.

26
D.D Brown ha aislado los genes que codifican al RNA ribosómico. Tales
fragmentos de DNA aislados son funcionales y capaces de codificar los
productos genéticos característicos in vitro.

SÍNTESIS QUÍMICA DE POLIDESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS

Y GENES.
La secuencia de bases en el gen que codifica al tRNA de la alanina
presente en la levadura, cuya secuencia es conocida. El tRNA de la
alanina de levadura, posee 77 restos ribonucleotídicos; por lo tanto, su
gen desnudo tiene el mismo número de restos desoxirribonuclotídicos.
Las bases minoritarias presentes en el tRNA se forman a partir de las
correspondientes bases progenitoras.

H.G. Khorana y colaboradores hicieron un trabajo brillante y fue la

síntesis del gen de tRNA de la alanina de levadura, utilizando una
combinación de técnicas químicas y enzimáticas; se trata del primer
gen sintetizado por métodos principalmente químicos. Es fundamental
en sus métodos el empleo de reactivos pretectores o bloqueadores de
aquellos grupos reactivos de los nucleósidos y de los nucleótidos que
son sensibles a los agentes condensantes empleados para formar los
puentes fosfodiéster. Entre estos grupos sensibles se hallan los
grupos 3’- y 5’- hidroxilo de la porción de desoxirribosa, los grupos
amino de las bases y el propio grupo fosfato. Algunos de los grupos
protectores utilizados por Khorana son:

27
Una vez protegidos los grupos adecuados para formar el enlace
internucleotídico fosfodiéster, se condensa el grupo 3’ hidroxilo libre de
un nucleótido protegido con el 5’ fosfato libre del siguiente.

REPLICACIÓN Y TRANSCRIPCIÓN DEL DNA

A continuación vamos a estudiar los mecanismos por los cuales el DNA
se replica formando moléculas hijas idénticas y se transcribe rindiendo
moléculas complementarias del RNA.

REPLICACIÓN SEMICONSERVADORA DEL DNA:

EXPERIMENTO DE MESELSON-STAHL.
Desde el punto de vista genético, la característica más sobresaliente de
la hipótesis de Watson-Crick es un postulado de que las dos hebras del
DNA y que la replicación de cada una de ellas para formar nuevas
hebras complementarias conduce a la formación de dos moléculas hijas
de DNA dúplex, cada una de las cuales contiene una hebra del DNA

28
progenitor. Este proceso, denominado replicación semiconservadora,
no es el único mecanismo posible por el cual dos hebras
complementarias del DNA dúplex progenitor podrían rendir dúplex de
DNA hijos, idénticos a los del progenitor. También podemos tomar en
consideración la replicación conservadora y la dispersora.

Meselson y F. W. Stahl en 1957, demostraron de modo concluyente que

en E.coli vivo e intacto, el DNA celular se replica por el mecanismo
semiconservador postulado por Watson y Crick. Cultivaron varias
generaciones de células de E.coli en un medio cuya única fuente de
nitrógeno era un cloruro amónico marcado con el isótopo pesado N15
casi puro, en vez del N14 normal.

El N15- DNA de tales células (DNA pesado) posee una densidad

significativamente mayor que el normal N14DNA; las formas pesadas y
ligera del DNA pueden separarse por centrifugación de equilibrio en un
gradiente de densidad de cloruro de cesio.

Para llevar a cabo el experimento crucial sobre el mecanismo de

replicación del DNA, se continuo el cultivo de las células de E. coli que
contenían el nitrógeno pesado N15, colocándolas en un medio ligero que
contenía el N14-NH4Cl normal como única fuente de nitrógeno.
Entonces, se dejó que las células crecieron por varias generaciones y
se recolectaron muestras a distintos intervalos. Se extrajo el DNA de
estas muestras, se determinó su densidad de flotación por
centrifugación en gradientes de densidad de CsCl. Después de la
primera generación en el medio de N14, cuando precisamente se había
duplicado el número de células, el DNA aislado mostro una sola banda
en el gradiente de densidad, intermediaria en densidad entre la del N14-

29
DNA ligero y la del N15- DNA de las células cultivadas exclusivamente
en el medio de N15. Este resultado es el que cabía esperar en el caso
de que el DNA dúplex de las células hijas contuviera una hebra de N15
y otra del recién sintetizado N14. Después de dos generaciones en N14-
NH4Cl, el DNA aislado exhibía dos bandas, una con densidad igual a la
del DNA ligero normal, y la otra igual a la del DNA hibrido observado
después de la primera generación.

El experimento de Meselson- Stahl era especialmente convincente

porque se efectuó con células intactas en división y sin la intervención
de inhibidores u otros agentes lesivos.

El hecho de que la replicación semiconservada del DNA cromosómico

también tiene lugar durante la división celular de los organismos
eucariotas, fue demostrado por J. H.Taylor y colaboradores con
experimentos similares llevados a cabo con células de las raicillas de
judías germinadas, multiplicadas en medios de cultivo para tejidos.

PUNTOS DE INICIACIÓN Y DIRECCIÓN DE LA

REPLICACIÓN DE LOS CROMOSOMAS
J. Cairns, que estudio el etiquetado radiactivo del cromosoma de las
células en crecimiento de E. coli en varias fases durante el proceso de
replicación utilizando a la autorradiografía como instrumento. Las
células de E. coli se cultivaron en un medio que contenía una timina
considerablemente tritiada. Las células la convirtieron, primeramente,
en desoxitimidina-5’-trifosfato radiactivo, precursor de los restos de
timidina radiactiva del DNA. Las células fueron recolectadas a
intervalos, y su DNA se extrajo cuidadosamente. Se extendió a las
moléculas de DNA sobre rejillas, cubriéndolas con placas fotografías de

30
grano fino. La radioactividad provoco la reducción del cloruro argéntico
en la emulsión sensible produciendo unas huellas consistentes en
granos de plata metálica situados directamente bajo la molécula
radiactiva de DNA; después se fotografió a estas huellas con el
microscopio, lo que mostro un lazo sin fin cerrado. Algunos de los
cromosomas aislados mostraron un segundo lazo radiactivo.

Una serie de experimentos genéticos y bioquímicos más complejos

efectuados con E.coli han revelado que es más probable una
explicación alternativa, esto es, que la replicación a partir del único
punto de iniciación es bidireccional en lugar de monodireccional. La
replicación comienza a los 74 minutos sobre el mapa genético de E. coli.
Asi, las dos hebras del DNA progenitor se replican simultáneamente
hasta que ambos puntos de crecimiento se encuentran, en este
momento es cuando las dos moléculas hijas del DNA se separan.
También los cromosomas eucarióticos se replican bidireccionalmente.
Los DNA’s circulares de las mitocondrias y de muchos virus, tal como el
ΦX174, se replican de modo unidireccional. Aunque la forma replicable
de los DNA’s de virus es generalmente circular, la progenie del DNA
viral es lineal.

Para permitir que tenga lugar la replicación, las dos hebras deben estar
parcialmente desenrolladas, puesto que las bases cuyas secuencias es
la portadora de la información genética, están situadas en el interior de
la doble hélice. Tal desenrollamiento generaría un impulso rotativo en el
DNA. Ademas, el desenrollamiento del DNA en las horquillas de
replicación tiene que ser muy rápido, puesto que el cromosoma
completo de E. coli se replica en un tiempo de división de solo 30

31
minutos. Unas 400 000 vueltas del cromosoma duploheliciodal tienen
que desarrollarse al ritmo de 13 000-1 minutos.

A medida que la horquilla de replicación se va moviendo a lo largo del

DNA dúplex, una de las hebras tiene que replicarse procediendo desde
su extremo 5’ al 3’, mientras que la otra lo hará desde su extremo 3’ al
5’.

DNA- POLIMERASA I
Los mecanismos enzimáticos por los que se produce la replicación del
DNA fueron abiertos a la investigación bioquímica directa por la
importante investigación de Arthur Kornberg y sus colaboradores en
1956, con un enzima que hoy se denomina DNA- polimerasa I.

Más recientemente se han aislado otras dos enzimas con propiedades

catalíticas similares, la DNA- polimerasa II y la DNA- polimerasa III.
Ahora parece ser que la DNA- polimerasa III es la enzima principal
implicada en el proceso de replicación, si bien la DNA- polimerasa I
también participa en él. La DNA- polimerasa I desempeña otro papel:
funciona en la reparación del DNA.

La DNA- polimerasa I aislada de E. Coli, cataliza la adición de restos

desoxirribonucleotídicos al extremo de una hebra de DNA a partir de
una mezcla de dATP, dGTP, dCTP y dTTP.

La reacción global de incorporación de un solo resto es:

𝑀𝑔2+
𝑑𝑁𝑇𝑃 + (𝑑𝑁𝑀𝑃)𝑛 ⇔ (𝑑𝑁𝑀𝑃)𝑛+1 + 𝑃𝑃𝑖

32
El enzima se valora midiendo la incorporación del P32 de uno de los
grupos α- fosfato de uno de los nucleótidos precursores a los puentes
internucleotídicos 3’,5’- fosfodiéster de la hebra de DNA prolongada.
Como quiera que el DNA es insoluble en medio acido, se puede así
separar del precursor etiquetado. El enzima requiere específicamente a
5’-trifosfatos de los desoxirribonucleósidos como precursores; los 5’-
difosfatos y los 5’ monofosfatos son inactivos. Los 5’-trifosfatos de los
ribonucleósidos son también inactivos en ausencia de Mg2+. Han de
estar presentes los 5’-trifosfatos de los cuatro nucleósidos que
normalmente están presentes en el DNA, para que la reacción se
efectúe a una velocidad significativa.

La DNA-polimerasa I cataliza la adición de unidades mononucleotídicas

al extremo con el hidroxilo 3’ libre de una cadena del DNA; la dirección
de la síntesis, de DNA es por tanto la 5’ a 3’.

33
La energía requerida para formar el nuevo enlace fosfodiéster viene
proporciona por la incisión del pirofosfato del dNTP, que tiene efecto
con un cambio elevado de energía libre de estándar.

La reacción de la DNA- polimerasa es impulsada a completarse porque

el pirofosfato liberado puede hidrolizarse a ortofosfato por la
pirofosfatasa inorgánica. La reacción de la DNA- polimerasa puede
invertirse provocando la pirofosforólisis del DNA, con formación de una
mezcla de 5’-trifosfatos de desoxirribonucleósidos.

La DNA- polimerasa cataliza también el intercambio de equilibrio entre

el pirofosfato P32 etiquetado con los grupos fosfato β y γ de los dNTPs,
en la que dNPPP, es un 5’-trifosfato de desoxirribonucleósido. Tanto la
pirofosforólisis del DNA como el intercambio de pirofosfato, requieren la
presencia de DNA preformado.

La DNA- polimerasa I de E. coli tiene un peso molecular de 109 000.

Posee una sola cadena polipeptídica de unos 1 000 restos de
aminoácidos. El enzima posee un grupo sulfhidrilo, también presenta un
solo grupo disulfuro intracatenario. El enzima puro contiene un átomo
de Zn en su centro de actividad, que es esencial para la misma. La
molécula enzimática parece ser más o menos esférica y tiene un
diámetro de unos 6,5 nm, en comparación con el DNA de doble hebra
cuyo diámetro es 2,0 nm. La DNA- polimerasa I pura puede incorporar
unos 1000 restos nucleotídicos por minuto y por molécula de enzima, a
37ºC.

34
Actividades exonucleasicas de la DNA ∼ polimerasa I enzima
multifuncional.
DNA ∼ polimerasa I la única cadena polipeptidica de la DNA ∼
polimerasa I puede escindirse en dos fragmentos por la acción de
determinados enzimas proteolíticos. La molécula de la DNA ∼
polimerasa I contiene dos enzimas, una DNA ∼ polimerasa con
actividad exonucleasica 3 '5' y la otra una exonucleasa 5' 3' ambas
unidas por un enlace peptídico.

La actividad DNA ∼ polimerásica se ha encontrado en otras bacterias

se ha comprobado también en células animales y vegetales. Las células
eucarióticas contienen muchas formas de DNA ∼ polimerasa de
diferentes pesos moleculares, localizadas en diferentes partes de la
célula - núcleo, citoplasma, mitocondrias. La actividad DNA -
polimerasica de las células bacterianas aumenta grandemente en el
proceso de replicación de algunos virus, tales como los fagos T2 Y T4
de E. coli.

Papel de DNA preformado en la acción de la DNA ∼

polimerasa.
La propiedad más sobresaliente y característica de la DNA ∼polimerasa
es la de que requiere la presencia de algo de DNA preexistente. En su
ausencia, el enzima purificado no producirá polímero alguno, a menos
que se den condiciones muy especiales. El DNA preformado ejerce dos
funciones en la acción de la DNA ∼ polimerasa I: Es requerido a la vez,
como patrón y como cebador. En donde el enzima requiere la presencia
de una hebra de DNA que tenga un hidroxilo 3' libre, al cual se adicionan
los nuevos restos nucleotídicos para extender la cadena en dirección 5

35
3. A dicha hebra se le denomina hebra cebadora y al nucleótido 3'
terminal se le designa terminal cebador.

Fidelidad de replicación de la DNA ∼ polimerasa I

Se denomina análisis de frecuencia de bases del vecino más próximo.

Este método permite determinar la frecuencia con que dos bases
determinadas, se encuentran situadas adyacentes o vecinas más
próximas en una cadena de DNA. Se puede esperar que el DNA de
cada especie de organismo, posee un conjunto de frecuencias de bases
vecinas más próximas distintivo y característico.

Este método determina la frecuencia de presencia de las cuatro bases

adyacentes a una base dada, introducida en una muestra de DNA ∼
polimerasa.

Experimentos realizados con otros DNAs naturales empleados como

patrón, indican que cada organismo posee un conjunto característico de
frecuencia de bases de vecino más próximo.

La DNA ∼ polimerasa puede replicar hebras patrón de DNA con un

elevado grado de fidelidad. Sin embargo, debido a que el error
experimental de la determinación de las bases es, por lo menos del 2%,
y tal vez mayor, esta clase de análisis del vecino más próximo presenta
significativas limitaciones.

También consiste en que las nuevas cadenas de DNA sintetizadas van

en dirección opuesta a la de las correspondientes cadenas patrón de
DNA, mientras que la cadena patrón y la nueva cadena exhiben
polaridad opuesta.

36
DNA ∼ ligasa
La DNA ∼ ligasa puede unir los extremos de cadenas de DNA al
catalizar la síntesis de un enlace fosfodiéster. La formación del nuevo
enlace fosfodiéster, requeridora de energía, va acoplada a la escisión
del enlace pirofosfato del NAD (+) en el caso del enzima de E. coli, o
con la del enlace α ∼ β ∼ pirofosfato del ATP en el caso de la
DNA∼ligasa inducida en E. coli por su infección con el bacteriófago T4
. E l enzima eucariótico también utiliza ATP. Este enzima necesita que
las cadenas necesitan que las cadenas que tiene que unir estén
asociados en una doble hélice con una hebra complementaria de DNA,
y que los restos que ha de enlazar estén apareados con bases
adyacentes de la otra hebra. La DNA∼ligasa puede solo formar un
enlace fosfodiéster entre los extremos de las cadenas, no siendo capaz
de replicar siquiera un corto tramo del patrón.

La DNA∼ligasa de E. coli ha sido muy purificada; consta de una sola

cadena polipeptídica de peso molecular 77000. En cada célula de E .
coli están presentes de 200 a 400 moléculas de DNA∼ligasa. El
mecanismo de reacción es exponencial. El NAD(+) es normalmente un
coenzima de reacciones oxido reducción, pero en el caso de la
DNA∼ligasa funciona como fuente de un grupo adenilo.

Función de las actividades exonucleasicas de la

DNA∼polimerasa I
Las dos actividades de exonucleasa (3'-5 y 5'-3') de la DNA∼polimerasa
son actividades auxiliares esenciales implicadas en el mantenimiento
de la fidelidad de réplica. La actividad exonucleaica 3' 5' funciona
reconociendo y eliminando por hidrolisis. La actividad exonucleasica 5

37
3’ de la DNA∼polimerasa I por otra parte, literalmente limpia de
obstáculos el camino para la nueva cadena formada por la polimerasa.
Hidroliza enlaces fosfodiéster comenzando por el terminal 5’ ∼fosfato
de una hebra de DNA, yendo por delante de la actividad polimerasica
con objeto de extirpar algún tramo no apareado de DNA o un segmento
que contenga nucleótidos químicamente modificados o mutados, tales
como los dímeros de timina.

Las dos actividades exonucleasicas de la DNA ∼polimerasa I forman,

por tanto, un equipo para la eliminación de varias clases de faltas o de
defectos de la hebra que experimenta replicación.

DNA∼polimerasas II, III, III*

La DNA∼polimerasa I no es el enzima que normalmente replica al DNA,
sino que funciona en alguna actividad auxiliar, posiblemente de
reparación de DNA.

Experimentos muy importantes enfocados a determinar si la

DNA∼polimerasa original de Kornberg es la responsable de la
replicación del DNA surgieron de una búsqueda de mutantes de E. coli
deficientes en la polimerasa de Kornberg, pero aun capaces de inducir
replicación.

La DNA∼polimerasa II y la DNA∼polimerasa III las cuales se han

obtenido a partir de celulas de E. coli de tipo salvaje y se observo que
contienen a las tres polimerasas.

Replicación del DNA en etapas cortas

R. Okazaki y sus colaboradores descubrieron que cuando el DNA recién
formado, o DNA naciente, se encuentra en forma de trozos cortos, que

38
se denominan fragmentos de Okazaki. Ello se estableció siguiendo la
incorporación de una timidina tritiada al DNA en células infectadas y
cultivadas a bajas temperaturas para disminuir el ritmo de replicación.
Todo el DNA etiquetado que se forma durante intervalos muy cortos
después de adicionada la timidina marcada, se encuentra virtualmente,
en pequeños fragmentos de 1000 a 2000 restos, con un coeficiente de
sedimentación de sólo 8S a 10S. Sin embargo, si las células se exponen
a la timidina etiquetada durante largos periodos, la radiactividad se
encuentra exclusivamente, en el DNA de elevado peso molecular. Estos
experimentos indican, por tanto, que el DNA se réplica en trozos cortos
que son rápidamente Unidos entre si, mediante enlaces covalentes.

Los fragmentos de Okazaki se han observado no solo en la replicación

de virus, sino también en la de bacterias y células eucariotas. En los
mutantes de E. Coli deficientes en DNA-ligasa que pueden unir los
extremos de hebras sencillas de DNA, se acumulan cantidades
considerables de fragmentos. Por tanto, se deduce que la DNA-ligasa
funciona enlazando los fragmentos de Okazaki.

Posteriores experimentos han demostrado que ambas hebras del DNA

dúplex replicado en E. Coli o en ratos estan integradas por cortos trozos.

La replicación del DNA en etapas cortas es un artificio que permite la

replicación de ambas hebras antiparalelas del DNA por la acción de las
polimerasas que replican solamente en la dirección 5'-3'.

Desenrollamiento del DNA y proteínas destorcedoras

El desenrollamiento del cromosoma de DNA dúplex constituye una
necesidad, si es que ambas hebras se han de replicar. El

39
descubrimiento de las proteínas desenrolladoras por parte de B. Alberts
y sus colaboradores fue posibilitado por el reconocimiento de que el gen
32 del fago T4 codifica a una proteína (distinta de una DNA-polimerasa
o DNA-ligasa)que es esencial para la replicación del DNA. Está proteína
fue aislada, observándose que induce la desnaturalización del DNA a
una temperatura de 40 grados centígrados, mucho menos que las
normalmente queridas. La proteína producto del gen 32 se une
fuertemente al DNA monofilar, pero solo débilmente al DNA dúplex
intacto; por otra parte, también se une fuertemente a las regiones del
DNA dúplex que han experimentado una apertura transitoria. Tan pronto
como una molécula de la proteína se adhiere al lazo ligeramente abierto,
del DNA bifilar, el lazo se abre aún más al fijarsele otras moléculas
adicionales de la proteína desenrolladora. Tales uniones tienen un
carácter cooperativo, pues la adhesión de cada nueva molécula proteica
mejora la Unión de las subsiguiente. Alberts y colegas han aislado
proteínas desenrolladoras partiendo de células infectadas por diferentes
virus, así como a partir de células eucariotas. Los pesos moleculares de
estás proteínas varían desde 10 000 hasta 75 000. Poseen centros de
unión específicos para segmentos cortos, de unos ocho restos
nucleotidicos; previamente a la formación de la horquilla de replicación
y cierto número de moléculas de la proteína desenrolladora se fijan,
sucesivamente, sobre una hembra del DNA dúplex.

Al producirse el desenrollamiento de un DNA dúplex circular prolongado

como el que tiene lugar durante la replicación, se origina un esfuerzo de
torsión que provoca un superdesenrollamiento subsiguiente. Se ha
podido aislar una proteína destorcedora, también denominada

40
alacranasa. Parece que su modo de actuar consiste en provocar el
mellado de una de las hebras del DNA superarrollado liberando así la
tensión torsional, lo que permite un cierto desenrollamiento del
polinucleotido para después resoldar la mella inicialmente producida.

Papel del RNA en la iniciación de las cadenas del DNA.

Ninguna de las DNA-polimerasas, incluida la DNA polimerasa III, puede
utilizar al DNA de doble hebra nativo como patrón-cebador. Y sin
embargo, en la célula intacta, la replicación debe tener efecto,
seguramente, en los cromosomas de doble hebra intactod. Por otra
parte,es sabido que el enzima RNA-polimerasa-DNA-dirigida que
participa en la transcripción del DNA formando un RNA complementario,
transcribe a partir del DNA dúplex y reconoce a los puntos de iniciación
específicos en el cromosoma. Esta curiosa diferencia entre la DNA-
polimerasa y la RNA-polimerasa ha sido explicada por el descubrimiento
hecho en los laboratorios de A. Komberg y R. Okazaki, de que la
replicación del DNA va precedida por la formación de una hebra corta
de RNA complementaria de una sección del DNA dúplex. Este RNA
cebador se firma por la acción de la RNA-polimerasa-DNA-dirigida a
partir de una mezcla de los ribonucleosido-5'-trifosfatos. Una vez
construida la hebra del RNA cebador, la DNA-polimerasa comienza a
incorporarle a su extremo 3' unidades de desoxirribonucleotidos
formadas a partir de los desoxirribonucleosido-5'-trifosfatos. Después
de que un largo tramo de DNA ha Sido replicado de este modo, la corta
hebra cebador a de RNA es escindida y separada por la acción de una
nucleasa. Por otra parte, Okazaki ha observado que los pequeños
fragmentos de DNA generados durante la replicación en E. Coli

41
contienen unos cortos tramos de RNA en sus extremos 5', lo cual es un
indicio de que cada uno de los cortos segmentos producidos en la
síntesis por etapas del DNA comienza por un segmento de RNA. Por lo
tanto, la iniciación de la replicación del DNA sobre cebadores de RNA
tiene efecto no solamente al comienzo de una ronda de replicación, sino
también durante la formación repetida de cortos fragmentos de Okazaki.

Una hipótesis para la replicación del DNA.

La replicación del DNA requiere la acción integrada de varios, o tal vez

de muchos, enzimas o proteínas, los cuales posiblemente funcionan
constituyendo un complejo. El tipo precisión y el número exacto de
enzimas requeridas indudablemente variará un poco en la replicación
del DNA de virus, de bacterias y de eucariotas.

Reconocimiento del punto de iniciación.

La replicación del cromosoma bacteriano comienza en un punto de
origen específico o punto de iniciación del DNA. Se requiere al menos
una proteína iniciadores específica para reconocer el punto de iniciación
y tal vez para dar la señar de partida a una RNA-polimerasa-DNA-
dirigifa especial para que comience a generar el RNA cebador de las
nuevas cadenas de DNA. Tenemos algunos datos experimentales
referentes a que el punto de iniciación, u otros puntos específicos del
cromosoma están anclados a la membrana celular. Este anclaje puede
que sea necesario para ayudar a hacer frente a las fuerzas de torsión
cuando el cromosoma se desarrolla.

42
Desenrollamiento del DNA.
Un anterioridad a la acción de los enzimas replicadores, moléculas
sucesivas de la proteína desenrolladora se unen a una hebra del
cromosoma y abren un lazo o u burbuja en el dúplex haciendo que
ambas hebras resulten accesibles a la replicación. Las células de E. Coli
contienen un gran número de proteínas desenrolladoras, tal vez 10 000
por celular, advirtiendo que son muchas las utilizadas en diversas
etapas del proceso de replicación.

Cebado por el RNA

En este punto se forman hebras cebadores del RNA gracias a la acción
de un RNA-polimerasa-DNA-dirigida, la cuál requiere ribonucleosido-5'-
trifosfatos como precursores de los restos de ribonucletidicos. Las
hebras cebadores de RNA son complementarias de las dos hebras del
cromosoma. Tales hebras cebadoras de RNA complementarias de la
dos hebras del cromosoma. Tales hebras cebadoras de RNA
complementario tienen una longitud que abarca de 50 a 100 restos.

La hebra guía o líder del juego DNA se forma en dirección 5'-3' del
cromosoma, y se cree que comienza por la adicción de restos
desoxirribonucleotidos al extremo 3' del tramo cebador de RNA gracias
a la acción del complejo pol III-copol III, que opera en presencia de ATP.
Una vez que la hebra de DNA ha Sido iniciada, la copol III despega y la
pol III efectua la replicación de la hebra patrón. Las proteínas
desenrolladoras separan las hebras dúplex del DNA progenitor por
delante de la horquilla de replicación. A medida que se sintetiza la hebra
guia de DNA en la dirección 5'-3', comienza y se realiza la síntesis de la
hebra seguidora en la dirección opuesta a la del movimiento de la

43
horquilla de réplica. Se supone que para formar el RNA cebador, la
hebra seguidora es iniciada por una RNA-polimerasa-DNA-dirigida,
interviniendo a continuación el complejo pol III-copol III para replicar un
segmento de DNA. Tanto la hebra conductora como la seguidora se
construyen en forma de cortos segmentos de 1000 a 2000 restos, cada
uno de los cuales empieza con un segmento de RNA cebador. La
iniciación de estos fragmentos de Okazaki, probablemente de efectúa
gracias al auxilio de un RNA-polimerasa distinta de la implicada en la
iniciación de una tanda de replicación en el punto de origen.

Eliminación de los RNA cebadores.

Una vez que se ha formado un corto tramo (fragmento de Okazaki) de
DNA, el RNA cebador es escindido y separado a partir de su extremo
5', resto a resto, al parecer por la actividad exonucleasica 5'-3', de DNA-
polimerasa O o de la ribonucleasa H.

Unión de los fragmentos cortos de DNA.

Las brechas que quedan abiertas entre los fragmentos de Okazaki se
rellenan, entonces, con restos complementarios de
desoxirribonucleotidos por la acción de la DNA-polimerasa I, y los
terminales 5' y 3' de sueldan por acción de la DNA-LIGASA.

Después de muchos de estos ciclos replicadores de etapa corta,

realizados en cada una de las dos horquillas de replicación que
proceden en direcciones opuestas, ambas horquillas se encuentran.

Hay que resaltar que de nuevo este es solo un posible escenario bde
replicación del DNA, que puede diferir en detalles entre distintos
organismos. Por ejemplo, la síntesis enzimática del ΦX174 por la DNA-

44
polimerasa y la DNA-ligasa no requería RNAs cebadores. Es posible
que algunos oligonucleotidos, presentes como impurezas hayan
funcionado como cebadores en la síntesis del DNA ΦX174. Por otra
parte, las investigaciones recientes indican que la replicación del DNA
ΦX174 requiere un cierto número de otras proteínas específicas lo que
está claro es que hace falta mucha más investigación antes de que
podamos comprender completamente el mecanismo de replicación de
los DNAs virales y bacterianos.

RNA producido era complementario del patrón DNA. Este enzima,

denominado RNA-polimerasa-DNA-dirigida, es muy similar en su acción
al DNA-polimerasa; sin embargo, no necesita cebador. El enzima
requiere Mg y rinde pirofosfato.

La RNA-polimerasa cataliza la reacción:

Mg

NTP + (NMP)n (NMP)n+1+ PPi

Para que la reacción tenga lugar se requiere DNA y los cuatro

ribonucleótido-5'-trifosfato, simultáneamente. La forma polimérica del
RNA formado posee puentes 3',5'-fosfodiéster, y es hidrolizado por la
ribonucleasa y por las fosfodiesterasas del bazo y del veneno de
serpientes (pág. 329). La polimerasa adiciona unidades
mononucleótidas a los extremos 3'-hidroxilo de la cadena de RNA y, por
tanto, forma RNA en dirección 5' -3', de forma antiparalela a la hebra de

45
DNA utilizada como patrón. Lo mismo que ocurre en el caso de la DNA-
polimerasa, la hidrólisis enzimática del pirofosfato favorece y asegura
en la célula la reacción marche en la dirección de síntesis. Se ha
identificado la RNA-polimerasa en muchas células bacterianas,
vegetales y animales.

En estas últimas existen, por lo menos, tres formas del enzima. Se

encuentran RNA-polimerasas también en las mitocondrias y en los
cloroplastos, donde participan en la transcripción delos DNAs
mitocondriales y cloroplasticos.

Se han purificado RNA-polimerasas-DNA-dirigidas de muchos orígenes

distintos. La mejor conocida es la de E. coli, que se ha obtenido en forma
homogénea por R. R. Burgess y sus colaboradores. Su peso molecular
es 490 000; contiene cuatro clases distintas de subunidades,
designadas α, β, β’, σ (sigma). La relación de las subunidades presentes
en el holoenzima intacto es α2 β β’ σ. En las condiciones intracelulares
que prevalecen en la transcripción de segmentos cromosómicos,
cooperan con la RNA-polimerasa otras proteínas, que se designan
ω(omega), ρ (rho) y κ(kappa). El holoenzima ha sido disociado en sus
subunidades, y se ha reconstituido satisfactoriamente en la forma activa
por ensamblaje según una secuencia especifica. La subunidad σ puede
eliminarse de la RNA-polimerasa sin que se observe pérdida de
actividad, produciéndose la denominada polimerasa núcleo

46
Este hecho, junto con otras informaciones disponibles indican que la
subunidad o no interviene en la función catalítica, sino que se trata de
una subunidad reguladora.

Especificidad de patrón e iniciación de la transcripción

La RNA-polimerasa es muy activa con los DNAs duplofilares nativos de
varias procedencias, pero menos activa con los DNAs monofilares o los
desnaturalizados. Los DNAs polimeros sintéticos tales como el poli-
(dT), o el copolímero alternante poli-(dTC), actúan también como
patrones, si bien con cierta pérdida de fidelidad.

En las condiciones intracelulares, la molécula de RNA-polimerasa

transcribe tan sólo una hebra del DNA dúplex. El holoenzima completo
es capaz de reconocer y de unirse al DNA en sitios de iniciación
específicos, que son estructuras de 10 o más restos, ricas en bases
pirimidinicas. Tales sitios de iniciación están muy separados en el DNA
patrón. La presencia de la subunidad sigma es necesaria para mantener
al holoenzima con la conformación adecuada para poder unirse al sitio
de iniciación en el patrón DNA. La unión de la polimerasa a su patrón
va seguida de la separación de hebras del DNA y de un cambio de
conformación del holoenzima.

El primer leósido-5'-trifosfato, o nucleósido iniciador siempre es el ATP

o el GTP, se fija a la polimerasa para formar el complejo de iniciación,
El primer enlace internucleotídico se forma después de la captación del
segundo nucleósido-5'-trifosfato, que generalmente es un nucleósido
pirimidinico (UTP O CTP). Entonces se forma el primer enlace

47
fosfodiéster, por ataque nucleofilico del grupo 3'-hidroxilo de fósforo a la
purina-nucleósido-5'-trifosfato iniciador sobre el átomo de segundo
nucleósido-trifosfato, y se elimina pirofosfato inorgánico procedente del
segundo NTP.

Obsérvese que el primer (purinico)-nucleósido-5'-trifosfato retiene su

grupo 5'-trifosfato, después de que se han incorporado el segundo y los
subsiguientes restos nucleotidicos.

Este grupo es, precisamente, el que permite reconocer al extremo de

iniciación, o 5'-terminal, de la molécula de RNA.

Prolongación y terminación de las cadenas de RNA

Una vez se han unido los dos primeros nucleótidos, la prolongación de
la cadena procede rápidamente, mientras progresa la transcripción en
dirección 5'-3', anti paralela a la hebra

3'5 del patrón DNA. Durante la prolongación, un segmento del recién

construido RNA, forma transitoriamente un hibrido dúplex
complementario RNA-DNA. Sin embargo, los dúplex hibridos RNA-DNA
son mucho menos estables que los dúplex DNA-DNA; por lo tanto, la
nueva cadena de RNA tiende a separarse del DNA en la horquilla de
transcripción. Después de la incorporación de unos 10 restos
nucleotidos, el factor σ se disocia del holoenzima rindiendo el enzima
núcleo, el cual procede a seguir replicando al DNA patrón. Entonces, el
factor σ liberado queda asequible para iniciar una nueva cadena de
RNA, operando con otra molécula de polimerasa núcleo.

48
La prolongación del RNA continúa a lo largo del DNA patrón hasta que
la molécula de la polimerasa núcleo llega a una señal de terminación de
la cadena. Las señales específicas de terminación son necesarias
porque el DNA que se transcribe contiene muchos genes y con
frecuencia, es circular; sin una señal de terminación, el RNA se seguirá
formando indefinidamente. Por otra parte, las diferentes clases de
RNAs, tales como los tRNAs y los rRNAs , poseen longitudes de cadena
completamente específicas. La naturaleza precisa de dichas señales e
de las señales de terminación del RNA es desconocida, si bien se sabe
que en el DNA del bacteriófago A, una señales es un tramo de restos
U. Las proteinas p y k, que son auxiliares de la RNA-polimerasa, pero
que no liberación de la cadena de RNA,forman parte de ella, participan
en la terminación y en la liberación de la cadena de RNA.

Productos de la RNA-polimerasa-DNA-dirigida
El RNA formado por la RNA-polimerasa tiene una composición en bases
complementaria de la hebra patrón de DNA; en el RNA, los restos
uracilo son complementarios de los restos adenina del DNA patrón. La
complementariedad del ADN

y del DNA patrón se comprueba mediante el análisis de frecuencia de

bases del vecino más próximo, el cual también muestra que la cadena
del RNA tiene una polaridad opuesta a la cadena del ADN patrón. Esta
complementariedad se ha puesto también de manifiesto mediante la
técnica de hibridación.

49
Cuando a la RNA-polimerasa de E. coli, altamente purificada, se le
presenta un patrón de DNA dúplex absolutamente intacto, sólo se
transcribe una de las dos hebras. Sin embargo, no todos los RNAs de
la célula son transcritos a partir de la misma hebra específica; algunos
RNAs son transcritos de una de las hebras del DNA, mientras que otros
lo son de la otra hebra. La selección de hebra de DNA para la
transcripción se verifica por un mecanismo hasta ahora desconocido.

La mayor parte de los datos disponibles indican que en E. coli no hay

más que una RNA-polimerasa-DNA-dirigida, que fabrica mRNAs,
tRNAs y TRNAs. Sin embargo, en los eucariotas existen, por lo menos,
tres RNA-polimerasas distintas, localizadas en el nucleolo, en el
nucleoplasma y en las mitocondrias.

Tratamiento post-transcripción de los RNAs

Los RNAs sintetizados por las RNA-polimerasas-DNA-dirigidas
requieren un tratamiento o modificación enzimática después de su
transcripción, antes de que se liberen los productos funcionales
acabados, mRNAs y tRNAs. Esto es especialmente cierto en las células
eucarióticas, en las que tienen lugar complejos procesos de maduración
del RNA.

Uno de los tipos de proceso post-transcripción en los eucariotas, implica

la incorporación de bloques de poli-A, con 200 o más restos AMP, al
extremo 3' de los RNAs mensajeros, reacción que tiene lugar en el
núcleo. Se cree que la «cola de poli-A ayuda a la transferencia del RNA
del núcleo al citoplasma; a continuación, dicha cola es eliminada.

50
Los RNAs 16S y 23S de E. coli están formados por una sola hebra de
RNA prolongada, que es partida en dos fragmentos, uno de los cuales
contiene RNA 16S y el otro RNA 23S. Sin embargo, cada uno de dichos
fragmentos con tiene residuos nucleotidicos sobrantes, que son
eliminados por la acción de la nucleasa, rindiendo los rRNA 16S y rRNA
23S acabados, listos para ser incorporados a los ribosomas. El rRNA
5S también se sintetiza en forma de precursor de mayor tamaño.

En las células eucarióticas, los RNAs ribosómicos se producen en forma

de una sola gran hebra de RNA 45S, ligada a una proteína en el
nucléolo. El RNA precursor 45S es escindido y rinde RNAS 5S y 41S:
este último, a su vez, se rompe en RNA 20S y RNA 32S. Estos últimos
son los precursores de los rRNA 18S y rRNA 28S finales, que se
encuentran en los ribosomas citoplasmáticos de los eucariotas

(fig. 32-27).

51
 fig. 32-27

Maduración de los RNAs

ribosómicos de las células eucariotas

Los RNAs de transferencia también se producen a partir de RNAs

precursores de mayor peso molecular, tanto en las células procariotas
como en las eucarióticas Por ejemplo, el precursor del RNA de la
tirosina posee 41 restos nucleótidicos adicionales en el extremo 5', y
tres restos en el extremo 3'; en esta forma, ninguna de las bases está
metilada. Los residuos nucleotidicos sobrantes son eliminados
enzimáticamente de los extremos, y entonces ciertas bases especificas
de la molécula de tRNA son modificadas por enzimas según una
variedad de reacciones, esto es, por metilación, acetilación,

52
desaminación, reducción, reordenación o adición de grupos
isopentenilo o –SH.

Inhibidores de la síntesis de RNA

Se conocen muchos compuestos distintos que inhiben la transcripción
del DNA por la RNA-polimerasa. Algunos de ellos han sido muy útiles
para identificar las distintas etapas de la transcripción antes descritas.
Una clase de inhibidores la integran los que interfieren con la
transcripción porque se unen al patrón DNA y modifican su estructura:
los del otro tipo

Se enlazan a la RNA-polimerasa e impiden su actividad. Todos los

inhibidores específicos para el DNA forman complejos no covalentes
con él, y dificultan su función como patrón. El más importante de tales
agentes es la actinomicina D, antibiótico producido por la especie
Streptomyces (fig. 32-28), cuyo anillo de fenoxazona se intercala (o
inserta) entre dos pares de bases G-C, mientras que sus cadenas
laterales pentapéptidicas se unen mediante enlaces de hidrógeno a
restos G, y se proyectan en el surco superficial del DNA dúplex. La
actinomicina D no ejerce efecto alguno sobre la unión de la RNA-
polimerasa con el DNA, pero bloquea, preferentemente, la prolongación
de la cadena. Penetra en las células intactas, en las cuales puede inhibir
la transcripción sin afectar a otros aspectos del metabolismo celular. La
replicación del DNA es mucho menos sensible a la actinomicina D que
la transcripción.

Otro agente que se enlaza con el DNA es el bromuro de etidio (fig. 32-
28) el cual también parece que se intercala entre dos pares de bases
sucesivos. A bajas concentraciones del colorante, se une

53
preferentemente al DNA circular superenrollado, como el de las
mitocondrias (pág. 882). La aflatoxina, producida por el hongo
Aspergillus flavus, que crece sobre los cacahuetes, es un carcinógeno
muy potente capaz inducir cáncer hepático; inhibe tanto la replicación
como la transcripción del DNA, lo que también realiza el carcinoma

génico sintético 2-acetilaminofluoreno.

Entre los agentes que actúan inhibiendo a la propia RNA-polimerasa

(fig. 32-29) hay un grupo de antibióticos bacterianos denominados
rifamicinas, son inhibidores poderosos de las RNA-polimerasas
bacterianas, pero algunas RNA-polimeasas la mayoría de las RNA-
polimerasas nucleares eucarióticas no son afectadas por ellas. El más
utilizado de esta clase de compuestos es la rifampicina, que es un
derivado sintético de la rifamicina natural. La rifampicina se liga

54
mediante unión no covalente a la subunidad β de la RNA-polimerasa de
algunas especies, y bloquea la formación del complejo de iniciación sin
afectar a la prolongación del RNA. En contraste con la rifampicina, la
estreptolidigina bloquea la elongación de la cadena del RNA. La α-
amanitina, principio tóxico del hongo venenoso Amanita phalloides,
bloquea una de las RNA-polimerasas nucleares de las células
eucarióticas pero no afecta a las RNA-polimerasas bacterianas,
mitocondriales y cloroplásticas.

fig. 32-29

Inhibidores del RNA-polimerasa

DNA dirigida

55
Visualización del proceso de transcripción
En las células huevo de los anfibios, los genes codificadores de la
síntesis del RNA ribosómico están localizados en los nucléolos. En la
primera etapa del crecimiento del huevo, el

RNA ribosómico se sintetiza en grandes cantidades. La microscopia

electrónica de los nucléolos aislados de tales células muestra que
contiene unas largas fibras delgadas, de unos

10 a 20 nm de diámetro, las cuales, a intervalos periódicos, se hallan

recubiertas de una matriz de fibrillas radiales como cabellos; estas
fibrillas aumentan de longitud gradualmente (fig. 32-30). El núcleo
fibrilar, que se prolonga de modo continuado a través de dichas
estructuras, consiste en un filamento de DNA tapizado de proteína. Las
largas fibrillas, parecidas a cabellos, de las cuales hay unas cien en
cada segmento, son hebras de RNA probablemente también
recubiertas de proteína. Cada segmento de DNA, recubierto de un
plumaje de fibrillas de RNA, es un gen del rRNA que experimenta
transcripción. Muchas cadenas de RNA se forman simultáneamente con
un solo gen, cada una de las cuales es producida por una molécula de
RNA-polimerasa que se traslada a lo largo del gen a medida que crece
la cadena del RNA, La longitud del segmento de DNA tapizado de
fibrillas de RNA, es de unos 2 a 3 pm, que es, aproximadamente, la
longitud de DNA requerida para codificar al precursor del RNA 18S y
28S ribosómicos de los eucariotas. Los segmentos de la fibra núcleo
que no se transcriben son de un DNA espaciador o regulador.

56
 fig. 32-30

Radiografía electrónica de genes neonucleares de un huevo de anfibio.

Estos genes, que están en el RNA ribosómico, se repiten a lo largo del
DNA. Se identifican porque cada uno de ellos experimenta transcripción
en rRNA, formando unas 100 hebras de este simultáneamente y a
medida que las moléculas de la DNA-polimerasa se deslizan a lo largo del
gen.

Replicación del RNA viral: RNA-replicasas

En los primeros años de la década de los 60. N. Zinder descubrió unos
bacteriófagos de RNA específicos de E. coli; actualmente han llegado a
ser importantes instrumentos para el estudio de la estructura y de la
función del RNA mensajero. Los fagos de RNA bien conocidos son el

57
f2, el MS2, el R17 y el Qβ. Los RNAs de estos virus, que funcionan como
RNAs mensajeros en la síntesis de las proteínas virales, se replican en
la célula huésped RNA-polimerasas-RNA-dirigidas, también conocida
por RNA-replicasas. Normalmente, estos enzimas no existen en la
célula huésped, pero se producen cuando la célula es infectada por un
virus de RNA.

La RNA-replicasa aislada de células de E. Coli infectadas por el virus

Qβ, cataliza la formación de RNA a partir de los ribonucleótido-5'-
trifosfatos con eliminación de pirofosfato: la reacción es formalmente
similar a la de la RNA-polimerasa-DNA-dirigida. La síntesis del RNA
procede en la dirección 5' 3'. La RNA-replicasa requiere RNA como
patrón y no funciona con DNA. Sin embargo, en contraste con la DNA y
la RNA-polimerasas,s las RNA-replicasas exhiben especifidad de
patrón. La RNA-replicasa inducida por el virus Qβ puede utilizar como
patrón solamente al RNA del propio virus: no replica a los RNAS de la
célula huésped. Este hecho ex plica perfectamente por qué los virus de
RNA se replican preferentemente en una célula huésped que posea
muchos otros tipos de RNAs. Además, la Qβ-replicasa requiere a la
molécula intacta de RNA QB y no replica a fragmentos de ella como
patrones; asi es como evita formar RNAs virales incompletos o
defectuosos.

La QB-RNA-replicasa purificada puede llevar a cabo la síntesis neta de

nuevas moléculas de RNA QB biológicamente activas. Partiendo de la
hebra (+) del RNA Q:B como patrón, la replicasa puede construir hebras
(-) de RNA QB complementarias. Estas pueden, entonces, ser utilizadas

58
como patrones en una ulterior incubación con el enzima para rendir un
RNA QB idéntico con la hebra (+) inicial.

El RNA QB (+) enzimáticamente sintetizado se halló que era infeccioso.

S. Spiegelman y sus colegas repitieron esos ciclos varias veces, hasta
que el patrón natural original fue diluido a una concentración negligible.
No obstante, el poder infeccioso del RNA en cada etapa de replicación,
estaba en proporción exacta con la cantidad de nuevo RNA formado por
el enzima. Estos experimentos representaron la primera síntesis de un
ácido nucleico biológicamente activo efectuado con un enzima
altamente purificado

Se conoce gran parte de la secuencia nucleotidica del RNA del R17, así
como porciones importantes de la secuencia aminoácida de las tres
proteínas codificadas genéticamente por el mismo. Han aportado datos
importantes, relativos a varias características estructurales de los
mRNAs, acerca del código genético y sobre el uso de codones
específicos para la iniciación y la terminación de la traducción genética

Polinucleótido-fosforilasa
Este enzima, descubierto por M. Grunberg-Manago y Ochoa en 1955,
fue el primer enzima descubierto capaz de sintetizar polinucleotidos de
larga cadena, constituyó un prototipo o predecesor de las DNA y RNA-
polimerasas. La polinucleotido-fosforilasa, que según parece se
encuentra sólo en las bacterias, cataliza la siguiente reacción.

NDP + (NMP)n (NMP)n+1+Pi.

Requiere a los 5 difosfatos de Ribonucleótidos y no puede actuar con

sus homólogos 5-trifosfatos ni con los desoxirribosido-5-trifosfatos. Para

59
su acción precisa de Mg. El polímero de tipo RNA formado por la
polinucleotido-fosforilasa continente enlaces 3-5-fosfodiéster que son
atacables por la ribonucleasa. La reacción es fácilmente reversible y
puede favorecerse en el sentido de la degradación del
polirribonucleotido, aumentando la concentración de fosfato.

La reacción de la polinucleótido-fosforilasa no utiliza patrón alguno y por

lo tanto, no forma ningún polímero con ninguna secuencia de bases
específicas. Requiere una hebra cebadora de RNA que meramente
aporte un 3-hidroxilo libre terminal, al cual puedan adicionarse ulteriores
restos. La reacción tiene lugar mismo con una sola especie de
monómero que con los cuatro. En general, la composición en bases del
mecanismo de la recombinación, que emplean los enzimas que ya se
han descrito, tales como las endonucleasas, la DNA-ligasa y la DNA-
polimerasa 1. Dos de esos modelos posibles de procesos de
recombinación se muestran en la figura 32-26. Tales reacciones se han
empleado recientemente in vitro para la incorporación de ciertos genes
del bacteriófago o del cromosoma de E. coli en el cromosoma de un
virus animal, el virus SV40 de los simios, que puede provocar la
transformación de células animales normales en células cancerosas.

Inversamente, una parte de un cromosoma eucariótico (del Xenopus

laevis) que codifica al RNA ribosómico, ha sido incorporada con éxito a
plásmidos aislados de E. coli, los cuales fueron después incorporados
a células intactas de E. coli. Las células receptoras replican y
transcribieron muchas veces los genes del Xenopus introducidos. Por
tanto, se pueden transferir cromosomas experimentalmente entre
animales y bacterias, posibilidad que ha suscitado algunas

60
preocupaciones e interrogantes acerca de la seguridad y salud
humanas. Por ejemplo, la incorporación en el laboratorio de genes de
«cáncer» animales o de virus animales en la bacteria intestinal común
E. coli, podría producir una amplia transmisión de genes cancerígenos
a los seres humanos. Por otra parte, tales experimentos también hacen
suscitar es esperanzas de que las deficiencias genéticas de los
cromosomas de los animales superiores y del hombre podrán algún día
ser reparadas por trasplantes de genes «buenos procedentes de otros
organismos.

DNA-polimerasas-RNA-dirigidas
(Transcriptasas inversas)
Se conocen varios virus de RNA que producen cáncer en los animales
susceptibles. Entre ellos está el virus del sarcoma de Rous (RSV), que
produce cáncer en los pollos, el virus de la mieloblastosis avicola que
provoca leucemia en las aves, y un virus que induce cáncer de mama
en los roedores Estos virus se distinguen por producir in vitro la
transformación permanente y heredable de ciertas células normales en
células malignas cancerosas. En Los primeros años de la década de los
60, HM Temin postulo que el RNA de estos virus que contienen genes
cancerígenos tiene que ser transcrito a la forma de DNA para
incorporarse al genoma de la célula huésped como una parte del mismo,
permanente y heredable, posiblemente a la acción de una DNA-
polimerasa dirigida por el RNA del virus tumoral. Durante muchos años
esta visión fue muy poco reconocida estaba en contra del dogma de la
genética molecular, que mantenía que la información fluye del DNA al
RNA y este la proteína. Sin embargo, la hipótesis de Temin quedo,
finalmente, demostrada por descubrimiento, llevado a cabo
61
simultáneamente por D. Baltimore, de que las propias partículas de los
virus tumorales de RNA contienen DNA-polimerasas-RNA-dirigidas,
también denominadas transcriptasas inversas. Estos enzimas se han
aislado y purificado a partir de diferentes virus tumorales de RNA: su
pesos moleculares van desde 70 000 a 160 000. Las transcriptasas
inversas parecen mucho a la DNA-polimerasas-DNA-dirigidas en el
hecho de que construyen DNA en la dirección 5-3 en que utilizan desoxi-
Ribonucleósido- 5-trifosfatos como precursores y en que requieren, a la
vez hebra patrón y cebadora, que debe tener un hidroxilo 3 libre
terminal. Las transcriptasas inversas son muy activas con los patrones
RNA naturales, incluidos los muy grandes RNAs presentes en las
partículas virales. Los DNAs producidos se hibridan con sus patrones
RNA. Las transcriptasas inversas pueden también utilizar patrones de
DNA, aunque estos son menos efectivos que los RNAs.

Se han aislado transcriptasas inversas a partir de células malignas de

algunos animales asi como de pacientes humanos afectados de
leucemia: se parecen mucho a la transcriptasa inversa de algunos virus
tumorales de RNA.

Sin embargo, se han encontrado también transcriptasas inversas en

células de animales y de hombres considerados como normales y no
infectados por virus tumorales; también se han hallado en E coli de tipo
salvaje. Tales transcriptasas pueden utilizar RNA o DNA como patrones,
indistintamente. La función de las DNA polimerasas-RNA-dirigidas en
las celulas normales no se comprende; su presencia sugiere que la
transcripción de mensajes del RNA a DNA es un proceso normal por
ejemplo en la síntesis de copias múltiples de ciertos gentes. El

62
reconocimiento de las transcriptasas inversas ha abierto por tanto, me
vas rutas a la investigación en genética bioquímica.

Biosintesis de RNA: RNA-polimerasa-DNA dirigida

EL descubrimiento de la DNA-polimerasa y su dependencia de un
patrón dio comienzo a una activa localización de los enzimas
participantes en la transcripción. Esto es en la formación de una RNA
complementario de una hebra del DNA cromosómico. En 1959, tres
investigadores, S. B. Weiss, J. Hurwitz y A. Stevens descubrieron cada
uno por su cuenta un enzima que dependía del DNA y era capaz de
formar a partir de ribonucleosido-5-trifosfatos; el polímero formado por
el enzima, es un reflejo de las concentraciones relativas en el medio de
los 5'-difosfatos precursores. Por todas estas razones, no es probable
que la polinucleótido-fosforilasa funcione, normalmente, formando RNA
en la célula intacta. Se ha indicado que puede desempeñar un papel en
la degradación del RNA mensajero en las bacterias. Sin embargo, la
polinucleótido-fosforilasa ha desempeñado un importante papel en
biología molecular, puesto que puede utilizarse para la preparación en
el laboratorio de muy diferentes tipos de polímeros de RNA, con
distintas secuencias y frecuencias de bases. Tales polímeros sintéticos
fueron vitales para la deducción de los vocablos del código genético de
los aminoácidos.

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