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DICIEMBRE 2019
1
Índice
REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA 4
EL DNA Y LA ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENÉTICO .................................................... 8
Transformación de las bacterias por el DNA ........................................................................... 8
Modelo de Watson-Crick de la estructura del DNA................................................................... 12
DNA vírico: regla del anillo: ........................................................................................................... 13
DNA bacteriano............................................................................................................................... 14
Cromosomas eucariotas: .............................................................................................................. 15
Superenrollamiento de círculos de DNA:.................................................................................... 16
Propiedades del DNA en disolución: ........................................................................................... 16
Propiedades ácido- base:.............................................................................................................. 16
Viscosidad: ...................................................................................................................................... 17
Comportamiento de sedimentación: ............................................................................................ 17
Desnaturalización del DNA: .......................................................................................................... 17
Punto de fusión del DNA ................................................................................................................... 18
Etapas de la desnaturalización del DNA .................................................................................... 18
Trazado del mapa de la estructura cromosómica ..................................................................... 19
Naturaleza molecular de la mutación .......................................................................................... 21
Modificación y restricción del DNA .............................................................................................. 23
La técnica de hibridación: homologías secuenciales en los DNAs de distintas especies. . 24
SECUENCIAS REPETIDAS EN EL DNA DE ORGANISMOS EUCARIÓTICOS ................ 25
AISLAMIENTO DE GENES ESPECIFICOS .............................................................................. 26
SÍNTESIS QUÍMICA DE POLIDESOXIRRIBONUCLEÓTIDOS Y GENES. ......................... 27
REPLICACIÓN Y TRANSCRIPCIÓN DEL DNA ....................................................................... 28
REPLICACIÓN SEMICONSERVADORA DEL DNA: EXPERIMENTO DE MESELSON-
STAHL. ............................................................................................................................................. 28
PUNTOS DE INICIACIÓN Y DIRECCIÓN DE LA REPLICACIÓN DE LOS
CROMOSOMAS ............................................................................................................................. 30
DNA- POLIMERASA I .................................................................................................................... 32
Actividades exonucleasicas de la DNA ∼ polimerasa I enzima multifuncional. ................... 35
Papel de DNA preformado en la acción de la DNA ∼ polimerasa.......................................... 35
Fidelidad de replicación de la DNA ∼ polimerasa I ................................................................... 36
DNA ∼ ligasa ................................................................................................................................... 37
Función de las actividades exonucleasicas de la DNA∼polimerasa I.................................... 37
2
DNA∼polimerasas II, III, III* .......................................................................................................... 38
Replicación del DNA en etapas cortas........................................................................................ 38
Desenrollamiento del DNA y proteínas destorcedoras............................................................. 39
Papel del RNA en la iniciación de las cadenas del DNA. ........................................................ 41
Una hipótesis para la replicación del DNA ................................................................................. 42
Reconocimiento del punto de iniciación. .................................................................................... 42
Desenrollamiento del DNA. ........................................................................................................... 43
Cebado por el RNA ........................................................................................................................ 43
Eliminación de los RNA cebadores. ............................................................................................ 44
Unión de los fragmentos cortos de DNA. ................................................................................... 44
Especificidad de patrón e iniciación de la transcripción ........................................................... 47
Prolongación y terminación de las cadenas de RNA ................................................................ 48
Productos de la RNA-polimerasa-DNA-dirigida ......................................................................... 49
Tratamiento post-transcripción de los RNAs.............................................................................. 50
Inhibidores de la síntesis de RNA ................................................................................................ 53
Visualización del proceso de transcripción ................................................................................ 56
Replicación del RNA viral: RNA-replicasas ................................................................................ 57
Polinucleótido-fosforilasa .............................................................................................................. 59
DNA-polimerasas-RNA-dirigidas.................................................................................................. 61
(Transcriptasas inversas) .......................................................................................................... 61
Biosintesis de RNA: RNA-polimerasa-DNA dirigida ................................................................. 63
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REPLICACIÓN, TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN DE LA
INFORMACIÓN GENÉTICA
Los extraordinarios avances de nuestro conocimiento sobre las bases
moleculares de la genética han significado una revolución en biología
que muchos comparan con la iniciada por la teoría de Darwin sobre el
origen de las especies. Todos los campos de la biología han sido
profundamente influenciados por estos desarrollos, que han aportado
vigor y penetrantes conocimientos de la mayoría de los problemas
fundamentales de la estructura y función celulares, y han conducido aun
mas amplio y extenso armazón conceptual de la ciencia bioquímica. En
la cual hay que decir, literalmente, que no se puede estudiar problema
bioquímico alguno aisladamente de su contexto genético. Por otra parte,
estos conceptos han aumentado enormemente la potencialidad del
enfoque molecular de la biología a sondear con mas confianza
complejos problemas biológicos tales como la diferenciación celular, la
morfogénesis, la inmunidad y muchos otros; que hasta hace poco
tiempo fueron modo superficial.
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para la selección de mutantes raros y recombinados genéticos de
enormes poblaciones condujo a la construcción de mapas genéticos de
gran resolución. Estos mapas han revelado la secuencia de varios
genes en algunos cromosomas, y han demostrado que un determinado
gen posee un gran numero de centros en los que puede experimentar
mutación. Pero los avances mas penetrantes en el campo de la
genética, que iniciaron la confluencia de la genética con la bioquímica,
se deben a la aparición de la hipotesis de un gen~un enzima, debida al
trabajo de G. W. Beadle y E. L. Tatum comenzado en 1941, y al
descubrimiento de O. T. Avery y colaboradores en 1944, de que la
información genética esta contenida en el DNA y es transmitida por él.
5
por rayos X de la estructura tridimensional del DNA. En 1953, J. D.
Watson y F. H. C. Crick postularon la estructura en doble hélice del DNA,
la cual no solo estaba de acuerdo con la equivalencia molar de bases y
con los diagramas de rayos X característicos del DNA, sino que también
indicaba la existencia de un mecanismo sencillo por medio del cual la
información genética podía transferirse de las células progenitoras a las
hijas.
6
correspondencia lineal con la secuencia de aminoácidos de la proteína
codificada por dicho gen. Además, se ha deducido el diccionario de los
vocablos del código de los triples en el RNA mensajero,
correspondientes a los distintos aminoácidos, lo cual ha constituido una
de las mayores conquistas de la ciencia moderna.
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Los organismos eucariotas contienen mucha más información genética
que los procariotas y dicha información esta repartida entre varios o
muchos cromosomas. Las células somáticas de los organismos
eucariotas son generalmente diploides, y contienen doble numero de
cromosomas presentes que en las células germinales, que son
haploides. En una eucariota, cada gen se encuentra en dos formas, o
alelos, uno de los cuales es dominante y el otro recesivo. Los
organismos eucariotas generalmente se reproducen por conjugación
sexual, durante la cual genes de ambos padres se intercambian e
incorporan al genoma de la progenie por un proceso de recombinación.
Si bien la recombinación también tiene efecto durante la conjugación
sexual o una infección vírica, no constituye un proceso normal en su
división asexual.
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En primer lugar, la cantidad de DNA en una especie, célula u organismo
determinado es notablemente constante, y no puede ser alterado por
circunstancias ambientales ni por cambios nutricionales o del
metabolismo celular, propiedad que era de esperar tratándose de un
material genético.
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Después en el periodo comprendido entre 1949 y 1953, E. Chargaff y
sus colaboradores aplican técnicas cromatográficas cuantitativas para
la separación y análisis cuantitativo de las cuatro bases contenidas en
muestras de hidrolizados de DNA aisladas de distintos organismos.
Algunos de los datos recogidos por ellos y por otros investigadores
dedujeron conclusiones importantes:
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Modelo de Watson-Crick de la estructura del DNA
Las equivalencias de bases que se observan en el DNA de distintas
especies despertó la intrigante posibilidad de que en las moléculas del
DNA existe un nivel de organización estructural que debe ser compatible
con otras. De hecho, ya se había sospechado que el DNA tenía una
conformación tridimensional especifica. Puesto que las disoluciones de
DNA son muy viscosas, se comprendía que las moléculas de DNA
fueran largas y rígidas en vez de compactas y plegadas. Además, el
calentamiento de un DNA recientemente aislado introduce significativos
cambios en su viscosidad y en otras propiedades físicas, sin romper los
enlaces covalentes del armazón del DNA .
12
Ambas cadenas o hebras son antiparalelas, es decir, sus puentes
fosfodiéster 3´,5´~internucleotidicos van en direcciones opuestas. El
arrollamiento de ambas cadenas es tal que no pueden ser separadas
sin desenrollarlas; este tipo de arrollado se denomina plectonémico. Las
bases purinicas y pirimidínicas de cada una de las hebras están
apiladas en el interior de la duplohélice, con sus planos paralelos entre
sí, y perpendiculares al eje de la hélice doble.
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DNAS lineales de virus, tal como el fago lambda, poseen extremos
cohesivos (pegajosos). Los extremos 5´ de estos DNAs dúplex se
proyectan como hebras sencillas más allá de los extremos 3´; doce de
los nucleótidos de tales extremos son complementarios y, por lo tanto,
se aparean fácilmente para formar círculos. Otra característica singular
de varios DNAs virales consiste en que no poseen secuencias de bases
únicas, sino una población de moléculas cuyas secuencias son
permutaciones circulares de cada una de ellas.
DNA bacteriano
El cromosoma de E. Coli consiste en una sola molécula, enorme, de
DNA bifilar, con un peso molecular de 2.8 x 10*9, un grosor de 2.0 nm
y una longitud de 1.36 nm. El DNA de E. Coli contiene unos 4 millones
de pares nucleótidos. Esta molécula de DNA posee un rizo cerrado
denominado círculo. El cromosoma bacteriano está curvado de modo
firme y compacto en la zona nuclear, mantenido así por algo de RNA.
La molécula de DNA está recogida por un mínimo de 50 lazos muy
retorcidos o superarrollados.
14
Cromosomas eucariotas:
El núcleo de las células eucariotas puede contener varios o muchos
cromosomas, según las especies. Cada cromosoma contiene una
moléculas muy grande de DNA. La longitud total de todo DNA presente
en una sola célula de mamífero se ha calculado que debe ser 2m,
admitiendo que es duplohelicoidal.
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bien para cubrir o reprimir a determinados segmentos específicos
evitando la transcripción.
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de poliaminas en el surco profundo de la doble hélice estabiliza a la
molécula de DNA , haciéndola más flexible. La estabilidad de los pares
de bases unidas por puentes de hidrógeno del DNA duplohelicoidal es
una función del PH.
Viscosidad:
Debido a la rigidez de la duplohélice y ala inmensa longitud del DNA,
incluso las disoluciones muy diluidas de DNA son muy viscosas. Para
seguir el curso del proceso de desenrollamiento o desnaturalización, es
corriente utilizar las mediciones de viscosidad. El DNA únicamente
exhibe un comportamiento ideal como soluto cuando esta formando
disoluciones altamente diluidas.
Comportamiento de sedimentación:
El coeficiente de sedimentación y el peso molecular de muestras de
DNA pueden determinarse por los métodos de ultracentrifugación antes
descritos. Los pesos moleculares de las moléculas de DNA pueden
establecerse por comparación de sus velocidades de sedimentación en
un gradiente de densidad de sacarosa, con la velocidad obtenida con
una muestra de DNA de tamaño y coeficiente de sedimentación
conocidos.
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amidas, etc. La viscosidad de las disoluciones de DNA disminuye, la
absorción luminosa a 260 nm aumenta, la rotación óptica se torna más
negativa y la densidad aumenta a esto se le llama desnaturalización.
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segmento de la estructura duplohelicoideal con algunas bases
complementarias todavía en registro. Los segmentos
desenrollados de cada una de las hebras adoptan una
conformación cambiante y al azar.
2. En la segunda etapa, ambas hebras se separan por completo una
de la otra. Si en este estado se enfrían rápidamente, cada una de
las hebras liberadas se dobla sobre sí misma para formar unos
segmentos duplohelicoideales intracatenarios.
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nueva célula huésped. La partícula del virus que se transfiere es
portadora de una porción de cromosomas de una célula
bacteriana hasta el cromosoma de otra.
21
El tercer tipo de mutación de corriente de armazón, denominada así
porque la lectura normal de la secuencia de tripletes del armazón del
armazón resulta alterada y puesta fuera de registro por la mutación. Se
inducen fácilmente inserciones tratando las células por derivados de la
acridina. La acridina es una molécula heterocíclica plana. Gran parte de
los datos disponibles ugieren que debido a su estructura aromatica
plana, la acridina se inserta o intercala de modo no covalente entre dos
bases sucesivas del DNA, separándolas físicamente. Cuando esta
cadena se replica, se inserta covalentemente una base extra, en la
cadena complementaria, opuesta a la acridina intercalada. Cuando esta
cadena es después replicada a su vez, la nueva cadena
complementaria también contendrá una base extra.
22
Otra clase de mutantes es la que resulta de la supresión de segmentos
del DNA, que puede tener una longitud de varios nucleótidos. Si el
número de nucleótidos suprimidos es 3 o algún múltiplo de 3, entonces
no hay error de corrimiento del armazón más allá del punto de la
mutación, pero la proteína producida puede ser defectuosa porque uno
o más aminoácidos estén suprimidos de su secuencia.
23
inducida por los enzimas de la modificación, no permite la actuación
sobre el de los enzimas de restricción.
Los DNA’s satélites tienen valores cot muy bajos pero un DNA
homogéneo no repetitivo posee un índice cot muy elevado.
26
D.D Brown ha aislado los genes que codifican al RNA ribosómico. Tales
fragmentos de DNA aislados son funcionales y capaces de codificar los
productos genéticos característicos in vitro.
27
Una vez protegidos los grupos adecuados para formar el enlace
internucleotídico fosfodiéster, se condensa el grupo 3’ hidroxilo libre de
un nucleótido protegido con el 5’ fosfato libre del siguiente.
28
progenitor. Este proceso, denominado replicación semiconservadora,
no es el único mecanismo posible por el cual dos hebras
complementarias del DNA dúplex progenitor podrían rendir dúplex de
DNA hijos, idénticos a los del progenitor. También podemos tomar en
consideración la replicación conservadora y la dispersora.
29
DNA ligero y la del N15- DNA de las células cultivadas exclusivamente
en el medio de N15. Este resultado es el que cabía esperar en el caso
de que el DNA dúplex de las células hijas contuviera una hebra de N15
y otra del recién sintetizado N14. Después de dos generaciones en N14-
NH4Cl, el DNA aislado exhibía dos bandas, una con densidad igual a la
del DNA ligero normal, y la otra igual a la del DNA hibrido observado
después de la primera generación.
30
grano fino. La radioactividad provoco la reducción del cloruro argéntico
en la emulsión sensible produciendo unas huellas consistentes en
granos de plata metálica situados directamente bajo la molécula
radiactiva de DNA; después se fotografió a estas huellas con el
microscopio, lo que mostro un lazo sin fin cerrado. Algunos de los
cromosomas aislados mostraron un segundo lazo radiactivo.
Para permitir que tenga lugar la replicación, las dos hebras deben estar
parcialmente desenrolladas, puesto que las bases cuyas secuencias es
la portadora de la información genética, están situadas en el interior de
la doble hélice. Tal desenrollamiento generaría un impulso rotativo en el
DNA. Ademas, el desenrollamiento del DNA en las horquillas de
replicación tiene que ser muy rápido, puesto que el cromosoma
completo de E. coli se replica en un tiempo de división de solo 30
31
minutos. Unas 400 000 vueltas del cromosoma duploheliciodal tienen
que desarrollarse al ritmo de 13 000-1 minutos.
DNA- POLIMERASA I
Los mecanismos enzimáticos por los que se produce la replicación del
DNA fueron abiertos a la investigación bioquímica directa por la
importante investigación de Arthur Kornberg y sus colaboradores en
1956, con un enzima que hoy se denomina DNA- polimerasa I.
𝑀𝑔2+
𝑑𝑁𝑇𝑃 + (𝑑𝑁𝑀𝑃)𝑛 ⇔ (𝑑𝑁𝑀𝑃)𝑛+1 + 𝑃𝑃𝑖
32
El enzima se valora midiendo la incorporación del P32 de uno de los
grupos α- fosfato de uno de los nucleótidos precursores a los puentes
internucleotídicos 3’,5’- fosfodiéster de la hebra de DNA prolongada.
Como quiera que el DNA es insoluble en medio acido, se puede así
separar del precursor etiquetado. El enzima requiere específicamente a
5’-trifosfatos de los desoxirribonucleósidos como precursores; los 5’-
difosfatos y los 5’ monofosfatos son inactivos. Los 5’-trifosfatos de los
ribonucleósidos son también inactivos en ausencia de Mg2+. Han de
estar presentes los 5’-trifosfatos de los cuatro nucleósidos que
normalmente están presentes en el DNA, para que la reacción se
efectúe a una velocidad significativa.
33
La energía requerida para formar el nuevo enlace fosfodiéster viene
proporciona por la incisión del pirofosfato del dNTP, que tiene efecto
con un cambio elevado de energía libre de estándar.
34
Actividades exonucleasicas de la DNA ∼ polimerasa I enzima
multifuncional.
DNA ∼ polimerasa I la única cadena polipeptidica de la DNA ∼
polimerasa I puede escindirse en dos fragmentos por la acción de
determinados enzimas proteolíticos. La molécula de la DNA ∼
polimerasa I contiene dos enzimas, una DNA ∼ polimerasa con
actividad exonucleasica 3 '5' y la otra una exonucleasa 5' 3' ambas
unidas por un enlace peptídico.
35
3. A dicha hebra se le denomina hebra cebadora y al nucleótido 3'
terminal se le designa terminal cebador.
36
DNA ∼ ligasa
La DNA ∼ ligasa puede unir los extremos de cadenas de DNA al
catalizar la síntesis de un enlace fosfodiéster. La formación del nuevo
enlace fosfodiéster, requeridora de energía, va acoplada a la escisión
del enlace pirofosfato del NAD (+) en el caso del enzima de E. coli, o
con la del enlace α ∼ β ∼ pirofosfato del ATP en el caso de la
DNA∼ligasa inducida en E. coli por su infección con el bacteriófago T4
. E l enzima eucariótico también utiliza ATP. Este enzima necesita que
las cadenas necesitan que las cadenas que tiene que unir estén
asociados en una doble hélice con una hebra complementaria de DNA,
y que los restos que ha de enlazar estén apareados con bases
adyacentes de la otra hebra. La DNA∼ligasa puede solo formar un
enlace fosfodiéster entre los extremos de las cadenas, no siendo capaz
de replicar siquiera un corto tramo del patrón.
37
3’ de la DNA∼polimerasa I por otra parte, literalmente limpia de
obstáculos el camino para la nueva cadena formada por la polimerasa.
Hidroliza enlaces fosfodiéster comenzando por el terminal 5’ ∼fosfato
de una hebra de DNA, yendo por delante de la actividad polimerasica
con objeto de extirpar algún tramo no apareado de DNA o un segmento
que contenga nucleótidos químicamente modificados o mutados, tales
como los dímeros de timina.
38
se denominan fragmentos de Okazaki. Ello se estableció siguiendo la
incorporación de una timidina tritiada al DNA en células infectadas y
cultivadas a bajas temperaturas para disminuir el ritmo de replicación.
Todo el DNA etiquetado que se forma durante intervalos muy cortos
después de adicionada la timidina marcada, se encuentra virtualmente,
en pequeños fragmentos de 1000 a 2000 restos, con un coeficiente de
sedimentación de sólo 8S a 10S. Sin embargo, si las células se exponen
a la timidina etiquetada durante largos periodos, la radiactividad se
encuentra exclusivamente, en el DNA de elevado peso molecular. Estos
experimentos indican, por tanto, que el DNA se réplica en trozos cortos
que son rápidamente Unidos entre si, mediante enlaces covalentes.
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descubrimiento de las proteínas desenrolladoras por parte de B. Alberts
y sus colaboradores fue posibilitado por el reconocimiento de que el gen
32 del fago T4 codifica a una proteína (distinta de una DNA-polimerasa
o DNA-ligasa)que es esencial para la replicación del DNA. Está proteína
fue aislada, observándose que induce la desnaturalización del DNA a
una temperatura de 40 grados centígrados, mucho menos que las
normalmente queridas. La proteína producto del gen 32 se une
fuertemente al DNA monofilar, pero solo débilmente al DNA dúplex
intacto; por otra parte, también se une fuertemente a las regiones del
DNA dúplex que han experimentado una apertura transitoria. Tan pronto
como una molécula de la proteína se adhiere al lazo ligeramente abierto,
del DNA bifilar, el lazo se abre aún más al fijarsele otras moléculas
adicionales de la proteína desenrolladora. Tales uniones tienen un
carácter cooperativo, pues la adhesión de cada nueva molécula proteica
mejora la Unión de las subsiguiente. Alberts y colegas han aislado
proteínas desenrolladoras partiendo de células infectadas por diferentes
virus, así como a partir de células eucariotas. Los pesos moleculares de
estás proteínas varían desde 10 000 hasta 75 000. Poseen centros de
unión específicos para segmentos cortos, de unos ocho restos
nucleotidicos; previamente a la formación de la horquilla de replicación
y cierto número de moléculas de la proteína desenrolladora se fijan,
sucesivamente, sobre una hembra del DNA dúplex.
40
alacranasa. Parece que su modo de actuar consiste en provocar el
mellado de una de las hebras del DNA superarrollado liberando así la
tensión torsional, lo que permite un cierto desenrollamiento del
polinucleotido para después resoldar la mella inicialmente producida.
41
contienen unos cortos tramos de RNA en sus extremos 5', lo cual es un
indicio de que cada uno de los cortos segmentos producidos en la
síntesis por etapas del DNA comienza por un segmento de RNA. Por lo
tanto, la iniciación de la replicación del DNA sobre cebadores de RNA
tiene efecto no solamente al comienzo de una ronda de replicación, sino
también durante la formación repetida de cortos fragmentos de Okazaki.
42
Desenrollamiento del DNA.
Un anterioridad a la acción de los enzimas replicadores, moléculas
sucesivas de la proteína desenrolladora se unen a una hebra del
cromosoma y abren un lazo o u burbuja en el dúplex haciendo que
ambas hebras resulten accesibles a la replicación. Las células de E. Coli
contienen un gran número de proteínas desenrolladoras, tal vez 10 000
por celular, advirtiendo que son muchas las utilizadas en diversas
etapas del proceso de replicación.
La hebra guía o líder del juego DNA se forma en dirección 5'-3' del
cromosoma, y se cree que comienza por la adicción de restos
desoxirribonucleotidos al extremo 3' del tramo cebador de RNA gracias
a la acción del complejo pol III-copol III, que opera en presencia de ATP.
Una vez que la hebra de DNA ha Sido iniciada, la copol III despega y la
pol III efectua la replicación de la hebra patrón. Las proteínas
desenrolladoras separan las hebras dúplex del DNA progenitor por
delante de la horquilla de replicación. A medida que se sintetiza la hebra
guia de DNA en la dirección 5'-3', comienza y se realiza la síntesis de la
hebra seguidora en la dirección opuesta a la del movimiento de la
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horquilla de réplica. Se supone que para formar el RNA cebador, la
hebra seguidora es iniciada por una RNA-polimerasa-DNA-dirigida,
interviniendo a continuación el complejo pol III-copol III para replicar un
segmento de DNA. Tanto la hebra conductora como la seguidora se
construyen en forma de cortos segmentos de 1000 a 2000 restos, cada
uno de los cuales empieza con un segmento de RNA cebador. La
iniciación de estos fragmentos de Okazaki, probablemente de efectúa
gracias al auxilio de un RNA-polimerasa distinta de la implicada en la
iniciación de una tanda de replicación en el punto de origen.
Hay que resaltar que de nuevo este es solo un posible escenario bde
replicación del DNA, que puede diferir en detalles entre distintos
organismos. Por ejemplo, la síntesis enzimática del ΦX174 por la DNA-
44
polimerasa y la DNA-ligasa no requería RNAs cebadores. Es posible
que algunos oligonucleotidos, presentes como impurezas hayan
funcionado como cebadores en la síntesis del DNA ΦX174. Por otra
parte, las investigaciones recientes indican que la replicación del DNA
ΦX174 requiere un cierto número de otras proteínas específicas lo que
está claro es que hace falta mucha más investigación antes de que
podamos comprender completamente el mecanismo de replicación de
los DNAs virales y bacterianos.
Mg
45
DNA utilizada como patrón. Lo mismo que ocurre en el caso de la DNA-
polimerasa, la hidrólisis enzimática del pirofosfato favorece y asegura
en la célula la reacción marche en la dirección de síntesis. Se ha
identificado la RNA-polimerasa en muchas células bacterianas,
vegetales y animales.
46
Este hecho, junto con otras informaciones disponibles indican que la
subunidad o no interviene en la función catalítica, sino que se trata de
una subunidad reguladora.
47
fosfodiéster, por ataque nucleofilico del grupo 3'-hidroxilo de fósforo a la
purina-nucleósido-5'-trifosfato iniciador sobre el átomo de segundo
nucleósido-trifosfato, y se elimina pirofosfato inorgánico procedente del
segundo NTP.
48
La prolongación del RNA continúa a lo largo del DNA patrón hasta que
la molécula de la polimerasa núcleo llega a una señal de terminación de
la cadena. Las señales específicas de terminación son necesarias
porque el DNA que se transcribe contiene muchos genes y con
frecuencia, es circular; sin una señal de terminación, el RNA se seguirá
formando indefinidamente. Por otra parte, las diferentes clases de
RNAs, tales como los tRNAs y los rRNAs , poseen longitudes de cadena
completamente específicas. La naturaleza precisa de dichas señales e
de las señales de terminación del RNA es desconocida, si bien se sabe
que en el DNA del bacteriófago A, una señales es un tramo de restos
U. Las proteinas p y k, que son auxiliares de la RNA-polimerasa, pero
que no liberación de la cadena de RNA,forman parte de ella, participan
en la terminación y en la liberación de la cadena de RNA.
Productos de la RNA-polimerasa-DNA-dirigida
El RNA formado por la RNA-polimerasa tiene una composición en bases
complementaria de la hebra patrón de DNA; en el RNA, los restos
uracilo son complementarios de los restos adenina del DNA patrón. La
complementariedad del ADN
49
Cuando a la RNA-polimerasa de E. coli, altamente purificada, se le
presenta un patrón de DNA dúplex absolutamente intacto, sólo se
transcribe una de las dos hebras. Sin embargo, no todos los RNAs de
la célula son transcritos a partir de la misma hebra específica; algunos
RNAs son transcritos de una de las hebras del DNA, mientras que otros
lo son de la otra hebra. La selección de hebra de DNA para la
transcripción se verifica por un mecanismo hasta ahora desconocido.
50
Los RNAs 16S y 23S de E. coli están formados por una sola hebra de
RNA prolongada, que es partida en dos fragmentos, uno de los cuales
contiene RNA 16S y el otro RNA 23S. Sin embargo, cada uno de dichos
fragmentos con tiene residuos nucleotidicos sobrantes, que son
eliminados por la acción de la nucleasa, rindiendo los rRNA 16S y rRNA
23S acabados, listos para ser incorporados a los ribosomas. El rRNA
5S también se sintetiza en forma de precursor de mayor tamaño.
(fig. 32-27).
51
fig. 32-27
52
desaminación, reducción, reordenación o adición de grupos
isopentenilo o –SH.
Otro agente que se enlaza con el DNA es el bromuro de etidio (fig. 32-
28) el cual también parece que se intercala entre dos pares de bases
sucesivos. A bajas concentraciones del colorante, se une
53
preferentemente al DNA circular superenrollado, como el de las
mitocondrias (pág. 882). La aflatoxina, producida por el hongo
Aspergillus flavus, que crece sobre los cacahuetes, es un carcinógeno
muy potente capaz inducir cáncer hepático; inhibe tanto la replicación
como la transcripción del DNA, lo que también realiza el carcinoma
54
mediante unión no covalente a la subunidad β de la RNA-polimerasa de
algunas especies, y bloquea la formación del complejo de iniciación sin
afectar a la prolongación del RNA. En contraste con la rifampicina, la
estreptolidigina bloquea la elongación de la cadena del RNA. La α-
amanitina, principio tóxico del hongo venenoso Amanita phalloides,
bloquea una de las RNA-polimerasas nucleares de las células
eucarióticas pero no afecta a las RNA-polimerasas bacterianas,
mitocondriales y cloroplásticas.
fig. 32-29
DNA dirigida
55
Visualización del proceso de transcripción
En las células huevo de los anfibios, los genes codificadores de la
síntesis del RNA ribosómico están localizados en los nucléolos. En la
primera etapa del crecimiento del huevo, el
56
fig. 32-30
57
f2, el MS2, el R17 y el Qβ. Los RNAs de estos virus, que funcionan como
RNAs mensajeros en la síntesis de las proteínas virales, se replican en
la célula huésped RNA-polimerasas-RNA-dirigidas, también conocida
por RNA-replicasas. Normalmente, estos enzimas no existen en la
célula huésped, pero se producen cuando la célula es infectada por un
virus de RNA.
58
como patrones en una ulterior incubación con el enzima para rendir un
RNA QB idéntico con la hebra (+) inicial.
Se conoce gran parte de la secuencia nucleotidica del RNA del R17, así
como porciones importantes de la secuencia aminoácida de las tres
proteínas codificadas genéticamente por el mismo. Han aportado datos
importantes, relativos a varias características estructurales de los
mRNAs, acerca del código genético y sobre el uso de codones
específicos para la iniciación y la terminación de la traducción genética
Polinucleótido-fosforilasa
Este enzima, descubierto por M. Grunberg-Manago y Ochoa en 1955,
fue el primer enzima descubierto capaz de sintetizar polinucleotidos de
larga cadena, constituyó un prototipo o predecesor de las DNA y RNA-
polimerasas. La polinucleotido-fosforilasa, que según parece se
encuentra sólo en las bacterias, cataliza la siguiente reacción.
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su acción precisa de Mg. El polímero de tipo RNA formado por la
polinucleotido-fosforilasa continente enlaces 3-5-fosfodiéster que son
atacables por la ribonucleasa. La reacción es fácilmente reversible y
puede favorecerse en el sentido de la degradación del
polirribonucleotido, aumentando la concentración de fosfato.
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preocupaciones e interrogantes acerca de la seguridad y salud
humanas. Por ejemplo, la incorporación en el laboratorio de genes de
«cáncer» animales o de virus animales en la bacteria intestinal común
E. coli, podría producir una amplia transmisión de genes cancerígenos
a los seres humanos. Por otra parte, tales experimentos también hacen
suscitar es esperanzas de que las deficiencias genéticas de los
cromosomas de los animales superiores y del hombre podrán algún día
ser reparadas por trasplantes de genes «buenos procedentes de otros
organismos.
DNA-polimerasas-RNA-dirigidas
(Transcriptasas inversas)
Se conocen varios virus de RNA que producen cáncer en los animales
susceptibles. Entre ellos está el virus del sarcoma de Rous (RSV), que
produce cáncer en los pollos, el virus de la mieloblastosis avicola que
provoca leucemia en las aves, y un virus que induce cáncer de mama
en los roedores Estos virus se distinguen por producir in vitro la
transformación permanente y heredable de ciertas células normales en
células malignas cancerosas. En Los primeros años de la década de los
60, HM Temin postulo que el RNA de estos virus que contienen genes
cancerígenos tiene que ser transcrito a la forma de DNA para
incorporarse al genoma de la célula huésped como una parte del mismo,
permanente y heredable, posiblemente a la acción de una DNA-
polimerasa dirigida por el RNA del virus tumoral. Durante muchos años
esta visión fue muy poco reconocida estaba en contra del dogma de la
genética molecular, que mantenía que la información fluye del DNA al
RNA y este la proteína. Sin embargo, la hipótesis de Temin quedo,
finalmente, demostrada por descubrimiento, llevado a cabo
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simultáneamente por D. Baltimore, de que las propias partículas de los
virus tumorales de RNA contienen DNA-polimerasas-RNA-dirigidas,
también denominadas transcriptasas inversas. Estos enzimas se han
aislado y purificado a partir de diferentes virus tumorales de RNA: su
pesos moleculares van desde 70 000 a 160 000. Las transcriptasas
inversas parecen mucho a la DNA-polimerasas-DNA-dirigidas en el
hecho de que construyen DNA en la dirección 5-3 en que utilizan desoxi-
Ribonucleósido- 5-trifosfatos como precursores y en que requieren, a la
vez hebra patrón y cebadora, que debe tener un hidroxilo 3 libre
terminal. Las transcriptasas inversas son muy activas con los patrones
RNA naturales, incluidos los muy grandes RNAs presentes en las
partículas virales. Los DNAs producidos se hibridan con sus patrones
RNA. Las transcriptasas inversas pueden también utilizar patrones de
DNA, aunque estos son menos efectivos que los RNAs.
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reconocimiento de las transcriptasas inversas ha abierto por tanto, me
vas rutas a la investigación en genética bioquímica.
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