Antecedentes

El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla compleja
de proteínas. Estas existen en una combinación con carbohidratos o lípidos, que puede
ser física o química. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido protéico
total de los alimentos son de naturaleza empírica. Un método absoluto es el aislamiento
y pesado directo de la proteína pero dicho método se utiliza sólo a veces en
investigaciones bioquímicas debido a que es dificultoso y poco práctico

En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el método más usado en la

actualidad para el análisis de proteínas (método Kjeldahl) mediante la determinación del
nitrógeno orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes
orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de
catalizadores. El nitrógeno orgánico total se convierte mediante esta digestión en sulfato
de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente. El
destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones del borato así formado
se titulan con HCl (o H2SO4) estandarizado para determinar el nitrógeno contenido en
la muestra.

El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de proteína cruda del
alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no proteicos.

El método Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utilizó

permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación (digestión), sin
embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se
descartó. En 1885 Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión utilizando ácido
sulfúrico y añadiendo un catalizador. Gunning en 1889 propuso añadir sulfato de
potasio que eleva el punto de ebullición del ácido sulfúrico utilizado en la digestión para
disminuir el tiempo de la reacción.

En la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre penta hidratrado

CuSO4.5H2O como catalizador.

REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHL

DIGESTIÓN
catalizadores→

(1) n - C -NH2 + mH2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2

proteína calor→

NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN

(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH → 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O

(3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico) → NH4 + H2BO3- (ión borato)

TITULACIÓN

El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCl (o H2SO4)

estandarizado:
 →
(4) H2BO3- + H+ H3BO3

El método Kjeldahl se utiliza en química analítica para la determinación del contenido

de nitrógeno en muestras orgánicas lo cual es de gran interés en ámbitos de tanta
transcendencia hoy en día como son el alimentario y el medioambiental.

APLICACIONES
Desde 1883 en que John Kjeldahl presentó sus trabajos, su método ha ganado una gran
aceptación y se aplica en una amplia variedad de trabajos para los análisis de alimentos,
bebidas, piensos, grano, carnes, aguas residuales, suelos para cultivos y otros. Hoy por
hoy es el método más usado para el análisis de proteínas y se efectúa mediante la
determinación de nitrógeno orgánico. Esto es así porque los diferentes tipos de proteínas
coinciden todas ellas en una proporción similar de dicho nitrógeno orgánico. En la
mayoría de los casos de utiliza el factor de cálculo siguiente:

Contenido de proteínas = Contenido de nitrógeno orgánico x 6.25

En esta técnica se digieren las proteínas y otros compuestos orgánicos de los alimentos
en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico
total se convierte en sulfato de amonio mediante la digestión. La mezcla resultante se
neutraliza con una base y se destila. El destilado se recoge en una solución de ácido
bórico. Los aniones de borato así formado se titulan con HCL estandarizado para
determinar el nitrógeno contenido en la muestra.

En general, el método Kjeldahl tiene la ventaja de poderse ejecutar mediante equipos no

muy sofisticados y puede ser realizado por técnicos poco experimentados.

RECONOCIMIENTOS

El método Kjeldahl ha sido reconocido oficialmente por un gran número de entidades

oficiales y asociaciones como por ejemplo: la AOAC Internacional, EPA, AACC, AOCS,
ISO, USDA y otras.

PROCEDIMIENTO

El método consta de tres etapas: DIGESTIÓN – DESTILACIÓN – TITULACIÓN.

En la DIGESTIÓN se produce la descomposición del nitrógeno que contienen las

muestras orgánicas utilizando una solución de ácido concentrado. Esto se obtiene
haciendo hervir la muestra en una concentración de ácido sulfúrico. El resultado es una
solución de sulfato de amonio.

En la etapa de DESTILACIÓN se libera amoniaco, el cual es retenido en una solución

con una cantidad conocida de ácido bórico. Inicialmente se realiza una destilación con
vapor por el método de arrastre de vapor de agua, mediante la cual acelera la obtención
del destilado.
Al final, se utiliza la TITULACIÓN para valorar finalmente la cantidad de amonio
presente en la muestra destilada.

REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHL

DIGESTIÓN

catalizadores→
(1) n - C -NH2 + mH2SO4 → CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2
proteína calor→

NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN

(2) (NH4)2SO4 + 2 NaOH → 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O

(3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico) → NH4 + H2BO3- (ión borato)

TITULACIÓN

El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCl (o

H2SO4) estandarizado:

(4) H2BO3- + H+ → H3BO3

EQUIPOS DE LABORATORIO

Desde hace unos años, se vienen desarrollando nuevos equipos y perfeccionado las
tecnologías para ejecutar estas técnicas analíticas.

J.P. Selecta, consciente de estas necesidades de los laboratorios ha dedicado un

considerable esfuerzo en poner en el mercado una renovada gama de equipos lo más
completa posible con el fin de facilitar la labor de desarrollar el método Kjeldahl con la
rapidez, la precisión y la reproducibilidad de resultados.

Los equipos para la determinación del nitrógeno orgánico están compuestos por tres
elementos básicos:

- Unidad de digestión Bloc-Digest.

- Útiles de manipulación (Macro o Micro).
- El destilador Pro-Nitro M, “Pro-Nitro S” (semiautomático) Y “Pro-Nitro A”
(automático)

Recientemente se ha incorporado el sistema automático Auto Digest 20 el cual optimiza

la rapidez y la fiabilidad a los profesionales de laboratorio.

PROCESO DE DIGESTIÓN

Una serie de condiciones interrelacionadas en el proceso de digestión determinan la

velocidad de la reacción y de la descomposición de nitrógeno en sulfato de amonio, como
son la cantidad de calor transferida, la cantidad de sales para elevar la temperatura de
ebullición del ácido, el catalizador empleado y el tiempo de la digestión. El ajuste de
cualquiera de estos parámetros tiene influencia sobre el resto. Hay estudios que
determinan los parámetros para obtener las condiciones óptimas dependiendo de la matriz
de las muestras. Por ejemplo, la cantidad de ácido necesario varía dependiendo de la grasa
que contiene la muestra. A más grasa, más ácido se requiere. También varía con el tiempo
de la digestión. A mayor tiempo, más ácido perdido por evaporación.

El tiempo de digestión debe determinarse dependiendo de la cantidad de recuperación

mediante la utilización de muestras de matriz conocida.

La adición de sales es útil para elevar la temperatura de ebullición del H2SO4.

Dependiendo del tipo de sales empleadas, la temperatura puede pasar de ser de 330ºC
estando el ácido sulfúrico sólo, a una de 400ºC, con lo que se acelera el ritmo de la
descomposición y se acorta el tiempo de la digestión de forma considerable.

Para realizar la digestión, suele utilizarse un bloque calefactor construido en aluminio,

rodeado de una gruesa capa de aislante térmico y montado en una estructura de acero
inoxidable. Hay distintos tamaños de bloque para 6, 12 y 20 muestras. El elemento
calefactor es una resistencia eléctrica de alta potencia la cual se controla desde un equipo
electrónico que incorpora un microprocesador el cual permite al usuario elegir y
memorizar varios programas de trabajo con rampas y tiempos totalmente programables.
Dicha capacidad de programación consigue optimizar las digestiones de acuerdo con el
material empleado.

LA DIGESTIÓN SE REALIZA EN TRES PASOS

1. En función del contenido de agua de la muestra, empezar la digestión

evaporando agua a 150ºC entre 15 y 30 minutos.
2. Realizar un segundo paso entre 270 y 300ºC con una duración de entre 15 y 30
minutos con el fin de reducir la producción de humos blancos.
3. Continuar la digestión a 400ºC entre 60 y 90 minutos.