PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DEL ECUADOR

FACULTAD DE MEDICINA
CARRERA DE BIOQUÍMICA CLÍNICA
Biología Molecular

Integrantes: Mishell Aguilar, Tania Pinargote

Fecha de entrega: lunes, 27 de octubre del 2019

Variantes de la PCR

La versatilidad de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha dado lugar a una gran cantidad
de variantes de PCR.

PCR Assembly

Fundamento

esencialmente implica PCR 'unir las dos piezas por separado con cebadores que tienen una
superposición de 20 pb y luego hacer un paso de PCR adicional usando los dos productos como
plantilla.

aplicaciones

Assembly PCR se puede utilizar para ensamblar dos piezas de ADN del tamaño de un gen en una
sola pieza para facilitar la clonación de genes / partes de fusión.

ventajas

Esto es esencialmente solo para facilitar la clonación. En lugar de intentar PCR o cortar de un
vector dos piezas separadas y luego ensamblarlas por digestión y ligadura con endonucleasa
(también conocida como ligadura de 3 vías), puede ser más fácil simplemente PCRizar la primera
pieza con un cebador inverso que se superpone con el cebador directo de la segunda pieza, y
luego use el producto de las primeras reacciones de PCR como plantilla para la reacción de
ensamblaje.

Los méritos de esta técnica son que es posiblemente más rápido que el ensamblaje de ligadura
de 3 vías estándar (porque necesita ADN de buena calidad para que funcione bien, lo que
generalmente significa subclonar cada pieza, en mi experiencia), y es más confiable ( la calidad
del producto es muy buena, por lo que puede clonarlo directamente en el vector deseado; en
mis manos, el ensamblaje de PCR ha funcionado cada vez que lo he probado (~ 8 veces)).

(Moser, 2009)

Características

En este método, cada avance El oligonucleótido TFBS tiene una secuencia de recocido que es
complementaria al oligonucleótido inverso TFBS (o espaciador).
Los oligonucleótidos de "parada" contienen un 30 secuencia de recocido, que hibrida a los 30
secuencias de recocido de los oligonucleótidos TFBS para detener el ensamblaje adicional en la
primera reacción (ensamblaje 10 ciclos) y un 50 sitio de enzimas de restricción para la clonación
aguas abajo.

Los oligonucleótidos de "parada" también sirven como cebadores en el segundo reacción

(amplificación 25 ciclos) y se utilizan para amplificar la secuencia promotora de longitud
completa, que posteriormente se digiere y clonado en el vector de expresión apropiado.

(Mohamed, 2017)

Hot Start PCR

Fundamento

es una técnica que reduce la amplificación no específica y ofrece la conveniencia de configurar

la reacción a temperatura ambiente.

Aplicaciones

La PCR de arranque en caliente es especialmente útil cuando la amplificación inespecífica es un

problema porque hay muy poco ADN de plantilla, el ADN de plantilla es complejo o se usan
varios pares de cebadores (PCR multiplex).

Principales características

Los productos de amplificación generados en la primera reacción de PCR se usan como plantilla
para una segunda reacción de PCR, en la que se usan cebadores que son internos, o anidados,
dentro del primer par de cebadores.

Ventajas

evita la polimerización de ADN nuevo durante la fase inicial de la reacción cuando puede ocurrir
una unión inespecífica entre cebadores y dianas de ADN inespecíficas

La PCR anidada puede aumentar tanto la sensibilidad como la especificidad de la amplificación

Un protocolo de PCR de arranque en caliente puede optimizar el rendimiento al tiempo que

limita la probabilidad de amplificación inespecífica.

(W.B. Coleman, 2017) (A., 2019)

PCR multiplex

Fundamento

es la detección simultánea de múltiples objetivos en un solo pozo de reacción, con un par

diferente de cebadores para cada objetivo. Esta técnica requiere dos o más sondas que se
pueden distinguir entre sí y detectar simultáneamente. Existe una gama de diferentes
tecnologías de sonda disponibles, todas con fluoróforos.
Aplicaciones

La PCR multiplex se utiliza en investigaciones de ciencias biológicas, diagnósticos clínicos y

laboratorios forenses. El desarrollo de sistemas de detección por PCR con detección simultánea
de objetivos múltiples y los avances en la química de las sondas han hecho que los análisis
comparativos sean estándar en muchas áreas de investigación y pruebas. Los usos más comunes
de la PCR multiplex incluyen:

SNP genotipado

Detección de patógenos

Detección de OMG (organismo genéticamente modificado)

Estudios forenses

Análisis de alimentos

Análisis de mutaciones y polimorfismos.

Análisis de eliminación de genes

Cuantificación de plantilla

Análisis de enlaces

Detección de ARN

Principales características

Una consideración importante para la implementación exitosa de los ensayos de PCR multiplex
es el tiempo y el costo de la optimización y validación, que pueden compensar los ahorros de un
mayor rendimiento con la multiplexación. Por lo tanto, el diseño y las pruebas de los ensayos de
PCR multiplex representan una inversión. Si un laboratorio analiza repetidamente los mismos
objetivos, las ventajas superan con creces la inversión inicial. Hasta hace poco, tener una
plantilla suficiente para la optimización podría ser un problema para las muestras con
disponibilidad limitada. Sin embargo, la llegada de los kits de preamplificación ha aliviado en
gran medida el problema del tamaño restringido de la muestra.

El diseño del cebador para algunos objetivos multiplexados puede ser complejo. Los cebadores
deben tener temperaturas de fusión similares, cada par debe ser específico para su objetivo, y
ninguno de los cebadores debe formar dímeros de cebadores. Además, los pares de cebadores
deberían dar como resultado la amplificación de productos de tamaño similar. El rango habitual
es de 50-150 pb. Los productos más largos a menudo se amplificarán de manera menos eficiente
y quedarán subrepresentados. La mayoría de los investigadores aprovechan las herramientas de
diseño in silico para simplificar la tarea de diseño de cebadores y selección de objetivos; Varias
de estas herramientas están disponibles como software gratuito de código abierto.
Algún conocimiento previo de las cantidades relativas de las secuencias objetivo es ventajoso
para obtener resultados precisos. Si un objetivo es mucho más abundante que otro objetivo,
entonces el objetivo más abundante puede agotar los dNTP y superar efectivamente al objetivo
de baja abundancia. Esta limitación se puede superar limitando la concentración del cebador del
objetivo muy abundante que conduce al agotamiento del cebador y a una meseta anterior. En
una muestra con abundancias desconocidas, puede ser necesario optimizar protocolos
probando concentraciones limitantes de cebadores para cada objetivo.

Aunque la PCR multiplex implica optimización y validación, esta inversión inicial se ve

recompensada por la capacidad de analizar más de un objetivo en un solo pozo o tubo y la mayor
precisión del análisis comparativo y la cuantificación en investigación, análisis forense y
diagnóstico.

Ventajas

En cualquier laboratorio donde haya análisis repetidos con tipos similares de muestras y los
mismos objetivos, los beneficios de la PCR multiplex pueden ser sustanciales. Las ventajas de
usar PCR multiplex incluyen:

Más información con menos muestra.

Mayor rendimiento

Rentable: menos dNTP, enzimas y otros consumibles

Ahorrar tiempo

Se requiere menos material de entrada

Más datos de materiales de partida limitados

Mayor precisión de la normalización de datos.

Menos errores de pipeteo

Bio-Rad ha desarrollado una gama de productos diseñados para optimizar sus ensayos de PCR
en tiempo real, incluidos instrumentos, reactivos patentados, cebadores personalizados y
prediseñados, y sondas fluorescentes:

Sistemas de detección de PCR en tiempo real con funciones avanzadas de hardware y software.

Supermezclas para PCR y RT-qPCR con formulaciones avanzadas de tampón y polimerasa de

fusión Ssod7 patentada

Imprimaciones validadas en laboratorio húmedo garantizadas para funcionar de acuerdo con las
pautas MIQE

(Bio-Rad , 2019)

Touchdown polymerase chain reaction (PCR)

Fundamento

al disminuir secuencialmente la temperatura de recocido durante cada ciclo de PCR, se puede

reducir la posibilidad de la unión no específica".

Aplicaciones

El uso de la PCR de contacto es esencial cuando el la secuencia del cebador puede no coincidir
con la del objetivo, por ejemplo, si la secuencia del cebador tiene

se dedujo de las secuencias de aminoácidos, cuando la plantilla de ADN puede contener varios
estrechamente relacionados

objetivos, o cuando el ADN objetivo es de una especie diferente de la utilizada para diseñar los
cebadores.

principales características

los cebadores pueden unirse solo a su secuencia específica y complementaria.

La belleza detrás de la técnica es que incluso si estamos disminuyendo la temperatura, no se

forman enlaces inespecíficos después de la amplificación de la primera plantilla.

Una vez que la secuencia de ADN de nuestro interés se amplifica con éxito, ese ADN amplificado
funciona como plantilla para los ciclos de PCR adicionales.

Touchdown PCR es también una de las mejores modificaciones del método de PCR convencional.
El método es la mejor opción para la secuencia de ADN repetitiva PCR. El objetivo final de
cualquier modificación de PCR es aumentar el rendimiento y la precisión de los resultados, TD-
PCR proporciona ambos.

Touchdown PCR es uno de los mejores métodos para aumentar la especificidad en la reacción
de PCR.

ventajas

facilita la alta especificidad en cualquier reacción de PCR, se logra la alta especificidad de

amplificación al reducir la amplificación no deseada al disminuir secuencialmente la
temperatura de recocido después de cada ciclo de PCR.

La PCR de toma de contacto reduce la capacidad de formación de cebador-dímero de los

cebadores.

También proporcionará una mayor especificidad al reducir las uniones no específicas y no

deseadas del cebador al ADN molde.

La técnica es extremadamente útil en las plantillas que tienen contenidos GC más altos.

También ahorra el tiempo de la reacción.

(Genetic Education, 2019)

COLD-PCR

Fundamento

se basa en la observación de que hay es una temperatura crítica de desnaturalización (Tc) para
cada secuencia de ADN eso es más bajo que su temperatura de fusión (Tm).

Aplicaciones

quí usamos la detección de mutaciones KRAS como un ejemplo para demostrar el diseño de un
ensayo de PCR FRÍO para aplicaciones clínicas.

Una consideración clave en el diseño de un ensayo de PCR-FRÍO que selectivamente

amplifica los alelos mutantes minoritarios es determinar un nuevo reducido

temperatura de desnaturalización para la reacción. Idealmente, esto reduce

La temperatura de desnaturalización permite que los heteroduplexes sean principalmente

desnaturalizado y amplificado, y deja dobles los homo-duplex

varados y no amplificados de manera eficiente. Utilizamos los mismos cebadores que

utilizado en nuestro ensayo de PCR convencional, que produce un amplicón de

98 pb con 41.8% de contenido de GC y una Tm de 70.9 ° C. Utilizando la

Algoritmo de Polonia, trazamos perfiles de Tm de la secuencia de tipo salvaje

junto con los de secuencias no coincidentes en cada par de bases dentro

Principales características

ES más sensible,

dependiendo del ADN específico involucrado, que la PCR estándar para

detectar cambios genéticos Este método utiliza una temperatura crítica de desnaturalización
para enriquecer mutaciones desconocidas en cualquier posición en

la secuencia, durante la amplificación. La temperatura crítica de desnaturalización (Tc) es más

baja que las temperaturas de desnaturalización estándar,

y el método generalmente se aplica para amplicones de menos de ~ 200 pb

en longitud; por lo tanto, en algunos casos, más de un amplicón debe ser

utilizado para cubrir la región objetivo completa

COLD-PCR se puede utilizar en cualquiera de los dos formatos, COLDPCR completo o COLD-PCR
rápido, dependiendo de si es importante
Ventajas

El método COD-PCR aprovecha esta característica de la amplificación por PCR para enriquecer
selectivamente los alelos minoritarios

que difieren en uno o más nucleótidos en cualquier posición de un determinado

secuencia.

Es una nueva forma de PCR que enriquece preferentemente

"Alelos minoritarios" de mezclas de secuencias que contienen mutaciones y de tipo salvaje,

independientemente de dónde se conoce o se desconoce

La mutación está presente en la secuencia de ADN que se está interrogando [

(Zuo Z, 2016)

BIBLIOGRAFÍA

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Reaction: Providing a Revolutionary Method for All Biologists

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