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ARTÍCULO ESPECIAL

Evaluación nacional del diagnóstico


de la resistencia a la proteína C activada
Coordinadores:
Guadalupe Montiel-Manzano,1 Aurora de la Peña-Díaz,2 Abraham Majluf-Cruz3

Participantes:
Gabriela Cesarman-Maus,4 Norma Corona-de la Peña,3 Donají Cruz-Cruz,5 Elizabeth Gaminio,6
Carlos Martínez-Murillo,7 Teresa Mayagoitia,8 Enrique Miranda-Peralta,6 Teresita Poblete,9
Sandra Quintana-Martínez,7 Raúl Ramírez,10 Daniel Razo,11 Adriana Ruiz de Chávez-Ochoa,3
Aurelia Virginia Reyes-Núñez,5 Rosario Salazar,8 Guadalupe Virginia Vicencio-Santiago,12 Rosario Villa4
1
Laboratorio de Coagulación Especial, Hospital de Especialidades, CMN SXXI, IMSS, México, D. F.
2 Laboratorio de Farmacología, INCICh, México, D. F.
3 Unidad de Investigación Médica en Trombosis, Hemostasis y Aterogénesis, HGR Gabriel Mancera, IMSS, México, D.F.
4 Departamento de Hemato-Oncología. INCMNSZ, México, D. F. 5 Laboratorios Clínicos de Puebla, Puebla, Pue.
6 Laboratorio de Hematología. HGM, México, D. F. 7 Banco Central de Sangre, CMN SXXI, IMSS, México, D. F.
8 Laboratorio de Hematología. HU UANL, Monterrey, N. L. 9 Laboratorio de Coagulación. HC CMN SXXI, IMSS, México, D. F.
10 Laboratorio de coagulación, Laboratorios Carpermor, México, D. F. 11 Laboratorio de Coagulación, Hospital ABC, México, D. F.
12 Hospital de Enfermedades del Corazón y del Tórax No. 34, IMSS, Monterrey, N. L.

Por el Comité Mexicano de Trombosis y Hemostasia. Agrupación Mexicana para el Estudio de la Hematología, A. C.

National evaluation about the RESUMEN


diagnosis of activated protein C resistance
La trombofilia o estado protrombótico aparece cuando la acti-
ABSTRACT vación de los mecanismos hemostáticos supera la capacidad
anticoagulante fisiológica, favoreciendo la aparición de trom-
Thrombophilia or prothrombotic state appears when activa- bosis. La trombosis es la causa de muerte más común a nivel
tion of blood hemostatic mechanisms overcomes the physio- mundial y debido a su gran morbimortalidad asociada, debe
logical anticoagulant capacity allowing a thrombotic event. insistirse en la identificación oportuna de un estado trombofí-
Thrombosis is the leading worldwide mortality cause and lico. El estudio de la trombofilia permite identificar individuos
due to its high associated morbidity and mortality, it should con riesgo para sufrir una trombosis. Esta reunión se conci-
be insisted in the opportune identification of a thrombo- bió con la intención de analizar el estado actual del diagnósti-
philic state. The study of thrombophilia identifies individu- co de la trombofilia en México y para sentar las bases para un
als at high risk for thrombosis. This meeting was conceived consenso nacional acerca del diagnóstico de trombofilia, así
first to analyze the current status of the diagnosis of throm- como para establecer un centro de referencia y control de cali-
bophilia in Mexico and second to create the base for a na- dad de problemas trombofílicos. Ya que la búsqueda intencio-
tional consensus for thrombophilia screening and for the es- nada de la resistencia a la proteína C activada (RPCA) y de
tablishment of a national center for laboratory reference and la mutación Leiden del FV, parece ser una prioridad tanto en la
quality control for thrombophilia. Since searching of acti- atención clínica como en los programas de salud pública en
vated protein C resistance (APCR) and FV Leiden seem to nuestro país, se decidió abordar inicialmente estos dos pro-
have priority either in the clinical setting and in public blemas como modelo para analizar el estado actual del diag-
health services, it was decided to start with these two abnor- nóstico de la trombofilia en el laboratorio clínico. Aunque se
malities as a model to analyze the current status of thrombo- conocen en la actualidad múltiples anormalidades trombofíli-
philia diagnosis in the clinical laboratory. At this time, se- cas, sin duda, la más importante es la RPCA, la cual se en-

358 de Investigación
Revista Clínica
Montiel-Manzano G, et/ al.
Vol.Evaluación
55, Núm. nacional
3 / Mayo-Junio, 2003 / deppla358-369
del diagnóstico resistencia a la proteína C activada. Rev Invest Clin 2003; 55 (3): 358-369
Versión completa de este artículo disponible en internet: www.imbiomed.com.mx
veral thrombophilic abnormalities have been described ho- cuentra en 20% a 60% de las trombosis venosas. La RPCA
wever, APCR remains the most important cause of thrombo- aparece como consecuencia de que el FV activado (FVa) es re-
philia, accounting for as much as 20% to 60% of all venous sistente a la degradación por la PC activada. La actividad pro-
thrombosis. APCR is a consequence of the resistance of acti- coagulante del FVa incrementa el riesgo de trombosis. La
vated FV to be inactivated by activated protein C. Procoagu- RPCA hereditaria aparece, casi siempre, por una mutación
lant activity of activated FV increases the risk of thrombosis. puntual que cambia una adenina por guanina en el nucleótido
Hereditary APCR is almost always due to a point mutation 1691 en el gen del FV, lo que ocasiona que una Arg sea reem-
at the nucleotide 1691 of the FV gen inducing an Arg506Glu plazada por Glu en el aminoácido de la posición 506, mutación
substitution in FV molecule. This mutation is better known conocida como FV Leiden. El riesgo trombótico para los por-
as FV Leiden. Heterocygous carriers of FV Leiden have a tadores heterocigotos de esta mutación es 5-10 veces mayor
thrombotic risk 5 to 10 times higher than general population que en la población normal; el riesgo en sujetos homocigotos
while the risk for the homocygote state is increased 50 to se incrementa en 50 a 100 veces. Cuando se agrega PCA al
100-fold. When activated PC is added to plasma from pa- plasma de pacientes con el FV Leiden, éste resiste el efecto de
tients with FV Leiden, this last resists the anticoagulant ef- la PCA y la producción de trombina no disminuye. Esto es la
fect of activated PC. Therefore, thrombin production is not RPCA. La prueba funcional para medirla evalúa el tiempo de
inhibited. This phenomenon is called APCR. The functional tromboplastina parcialmente activada (TTPa) en una muestra
test evaluates the partially activated thromboplastin time antes y después de agregar PCA y se informa como un índice
(aPTT) in a plasma sample before and after adding activa- de sensibilidad estandarizado: TTPa post-PCA/TTPa pre-
ted PC. The result is reported as a standardized sensibility PCA. Los acuerdos de esta reunión pretenden lograr la optimi-
index: aPTT post-activated PC / aPTT pre-activated PC. zación del recurso disponible en nuestro país para un diagnós-
The conclusions of this national reunion pretend to opti- tico más amplio y económico de los pacientes con trombosis.
mize the available resources in our country in order to allow
a wide and less-expensive diagnosis of patients with throm-
bosis.

Key words. Thrombosis. Thrombophilia. Activated protein Palabras clave. Trombofilia. Trombosis. Resistencia a la
C resistance. FV Leiden. Protein C. proteína C activada (RPCA). FV Leiden. Proteína C.

INTRODUCCIÓN nosa.2 En este mismo país se describen anualmente


1.500,000 casos de infarto agudo de miocardio
Impacto de la trombofilia en la medicina moderna. (750,000 son fatales y, de éstos, 125,000 mueren du-
Un trombo es la formación de un coágulo en el lu- rante la primera hora del evento agudo), y otros
gar y tiempo inadecuados. Aunque el mecanismo de 250,000 fallecen en menos de cinco años. 3 En ese
generación es exactamente el mismo, la formación mismo país, anualmente se presentan 300,000 casos
del coágulo es una respuesta homeostática de altísi- de enfermedad vascular cerebral isquémica y 350,000
mo valor biológico, mientras que la formación del casos de tromboembolia pulmonar. La incidencia de
trombo es siempre un fenómeno patológico.1 La trombosis venosa profunda es de 159/100,000 habi-
trombosis constituye un grave problema de salud tantes,2 mientras que la de tromboembolia pulmonar
por su morbimortalidad asociada y costos de todos es de 139/100,000 habitantes. Cerca de 70% de estos
tipos que de ella derivan. casos son fatales y en 30% de los afectados se en-
La trombofilia o estado protrombótico aparece cuentra una trombofilia primaria. Por otra parte, la
cuando la activación de los mecanismos hemostáti- tromboembolia en los pacientes hospitalizados alcan-
cos supera la capacidad anticoagulante fisiológica, za una incidencia de hasta 33% con una mortalidad
condicionando un incremento de la generación in- cercana a 10%.4,5 Veintiséis por ciento de los pacien-
travascular de trombina y favoreciendo la aparición tes hospitalizados sin profilaxis antitrombótica desa-
de trombosis. La trombofilia puede ser primaria o rrollan trombosis o tromboembolia grave.6
secundaria, hereditaria o adquirida, aguda o cróni- En México, las trombosis son tan frecuentes y de-
ca. La primaria aparece cuando los mecanismos an- vastadoras como en otros países y aunque carece-
ticoagulantes naturales del organismo fallan. En el mos de estadísticas tan precisas con respecto a su
laboratorio, la detección de trombofilia antes o des- frecuencia y mortalidad, tenemos algunos datos rele-
pués de una trombosis permite identificar a pacien- vantes que nos permiten conjeturar acerca de su im-
tes que tienen un incremento del riesgo trombótico pacto. Así, la enfermedad coronaria isquémica es la
y que pueden beneficiarse de una profilaxis oportu- primera causa de muerte con 66,000 casos anuales.
na. Por otra parte, solamente en el Instituto Mexicano
La trombosis es la causa de muerte mundial más del Seguro Social y de acuerdo con los diagnósticos
común. Por ejemplo, se calcula que en los Estados más frecuentes durante 1994,7 se registraron 2,088
Unidos de Norteamérica mueren anualmente casi un nuevos casos bajo los rubros “enfermedades cere-
millón de personas debido a trombosis arterial o ve- brovasculares” e “infarto cerebral” (excluyendo los

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apartados “hemorragia intracerebral y otras hemo- leculares de la trombomodulina y del inhibidor de la
rragias intracraneales”), con una letalidad inmedia- vía del factor tisular. Por otra parte, se han descrito
ta de 17.32%. Quince por ciento de los casos ocurrie- mutaciones en los genes de la AT-III, PC, PS, pro-
ron en individuos menores de 54 años, es decir, en trombina y fibrinógeno que inducen trombofilia pri-
edad productiva. Por esta patología, se registraron maria y que producen un número importante de
8,130 hospitalizaciones que representan 11,173 días/ trombosis. Existe cada vez más evidencia que indica
cama con un costo cercano a 26 millones de pesos,7 que la presencia de una sola anomalía genética como
sin tomar en cuenta gastos por incapacidad laboral factor responsable de la trombofilia es poco proba-
temporal y permanente, medicamentos, fisioterapia, ble, ya que para que la trombofilia tenga una expre-
métodos auxiliares de diagnóstico, etc. Éstos son sión clínica, deben estar presentes múltiples factores
sólo datos de un año, en una institución y de un tipo trombofílicos, simultáneamente.
de trombosis (eventos vasculares cerebrales), pero
existen muchas otras condiciones asociadas con Resistencia a la
trombosis con el mismo impacto. PC activada (RPCA) y F-V Leiden

Efectos de la trombofilia La PC es una proteína de 56 KDa dependiente de


la vitamina K. Es un anticoagulante que por hidróli-
Ante la alta frecuencia y morbimortalidad de la sis inactiva al F-Va y al F-VIIIa. A su vez, la PC es
trombosis, se insiste en la identificación oportuna activada por trombina y trombomodulina. La PS ac-
de un estado trombofílico y el establecimiento de túa como su cofactor. La PCA y la PS se unen a fos-
criterios clínicos, métodos diagnósticos y decisiones folípidos de membrana y forman un complejo que de-
terapéuticas que permitan establecer un tratamien- grada al F-Va y al F-VIIIa, mucho más eficientemente
to antitrombótico adecuado, disminuir las recu- que cuando no están unidas a la membrana. En el
rrencias, establecer el tiempo de tratamiento anti- vaso intacto, la trombina tiene una función anticoa-
trombótico que evite eventos recurrentes y estudiar gulante al activar a la PC. La transición de la trom-
a la familia del paciente.2 bina de anticoagulante a procoagulante resulta de su
El estudio de la trombofilia primaria permite iden- unión a la trombomodulina en la membrana endote-
tificar a individuos con riesgo genético para sufrir lial. La trombina pierde su capacidad de romper fibri-
una trombosis. El sistema de la coagulación sanguí- nógeno, activar al F-V y al F-VIII y plaquetas y se
nea tiene un papel central en múltiples enfermeda- convierte en el activador de la PC.
des. Sus mecanismos reguladores son la fibrinólisis El fenómeno denominado RPCA,12 se encuentra
y los sistemas anticoagulantes naturales. El sistema en 20% a 60% de los casos con trombosis veno-
de la proteína C (PC) es uno de los principales siste- sa.13,14 La RPCA aparece como consecuencia de que
mas anticoagulantes en el ser humano a la par con el F-V activado (F-Va) es resistente a la inhibición
el sistema de la antitrombina III (AT-III). El sistema por la PC activada.15 La actividad procoagulante del
de la PC depende de una proteasa anticoagulante, la F-Va incrementa el riesgo de trombosis. El riesgo
PC activada (PCA), la cual inhibe a los cofactores de trombótico para los portadores heterocigotos de la
la coagulación Va y VIIIa.8 Los defectos en las pro- mutación Leiden del F-V es 5-10 veces mayor que en
teínas anticoagulantes plasmáticas, PC, proteína S la población normal; el riesgo en sujetos homocigo-
(PS) y AT-III se identifican en 10% a 15% de los pa- tos se incrementa en 50-100 veces.
cientes trombofílicos.9,10 El tromboembolismo venoso Existen dos tipos de RPCA: hereditaria y adquiri-
se desarrolla en 60% a 80% de los pacientes con defi- da. Esta última aparece en relación con algunos es-
ciencia de AT-III, PC y PS y con más frecuencia en tados especiales como la ingesta de anovulatorios
los menores de 45 años. Casi 50% de los pacientes orales, embarazo, infecciones, etc. La RPCA heredi-
sufre eventos recurrentes. Estas trombosis se aso- taria aparece, casi siempre, por una mutación pun-
cian con factores de riesgo circunstanciales (cirugía, tual adenina por guanina en el nucleótido 1691 en el
embarazo, inmovilización). En la deficiencia de AT- gen del F-V, lo que ocasiona que Arg sea reemplaza-
III, la frecuencia de trombosis durante el embarazo y da por Glu en el aminoácido de la posición 506, mu-
puerperio es entre 31% y 44%.11 Existen otras cau- tación conocida como F-V Leiden. El F-V Leiden es
sas de trombofilia como la deficiencia congénita del responsable de más de 90% de los casos de RPCA.16
cofactor II de la heparina o de F-XII, incremento en En caucásicos existe un polimorfismo del F-V con
la concentración plasmática del F-VIII y del fibrinó- frecuencias alélicas de 1% a 8.5%.13,17,18 La frecuen-
geno, alteraciones fibrinolíticas y anormalidades mo- cia de F-V Leiden en caucásicos americanos es de

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5.3%, mientras que es menor en otros grupos étni-
cos: 2.2% en hispanoamericanos, 1.2% en afroameri-
canos, 0.45% en asiáticos americanos, 1.2% en nati-
vos americanos.19 En un estudio europeo se encontró
que la frecuencia de portadores es de 4.4%, con 4% de
portadores homocigotos para F-V Leiden.19 En el mis-
mo estudio europeo se encontró una amplia variación sencilla
en la distribución entre grupos étnicos, desde 0%
para un subgrupo de italianos a un índice de portado-
res de 14% en población griega.19
Cuando se agrega PCA al plasma de pacientes con
F-V Leiden, éste resiste el efecto de la PCA y la pro-
ducción de trombina no disminuye. Esto es la RPCA.
La prueba funcional para medirla evalúa el tiempo
de tromboplastina parcialmente activada (TTPa) en
una muestra antes y después de agregar PCA y se
informa como un índice de sensibilidad estandariza-
do: TTPa post-PCA / TTPa pre-PCA. Dependiendo
de la estandarización de cada laboratorio, se acepta
que un índice menor de 2.1 indica RPCA. La adición
de PCA preformada sustituye la PC endógena, de tal Figura 1. Los tres pasos que componen un ciclo de PCR.
manera que la deficiencia de PC no afecta la prueba.
La comparación entre la prueba funcional para
RPCA y la mutación Leiden del F-V, muestran que para amplificar un segmento de ADN que se encuen-
la prueba funcional tiene una sensibilidad de 95%, tra entre dos secuencias conocidas. Como se muestra
pero su especificidad es de sólo 74%. La disminución en la figura 1, dos oligonucleótidos sintéticos son
del límite de corte a un índice de 2.0 mantiene la sen- usados como primers o iniciadores para una serie de
sibilidad en 95%, pero la especificidad se incrementa reacciones catalizadas por la enzima Taq ADN poli-
a 87%.20 La prueba funcional para la determinación merasa. Estos oligonucleótidos son secuencias com-
de RPCA puede utilizarse para el escrutinio de los plementarias a la región específica del ADN
pacientes y la prueba molecular para confirmar la blanco que se desea amplificar.
enfermedad debido al alto índice de falsos positivos
de la prueba funcional. Procedimiento general
Se ha diseñado una prueba funcional basada en el
tiempo de veneno de víbora de Rusell que tiene mejor El primer paso es obtener el ADN mediante su ex-
sensibilidad y especificidad que la prueba basada en tracción y purificación a partir de células (sangre,
el TTPa.21 Además del problema con falsos positi- biopsia, etc.). Para obtener el ADN a partir de san-
vos, la prueba funcional no puede utilizarse para pa- gre anticoagulada las membranas plasmáticas de las
cientes con terapia anticoagulante oral.22,23 La prue- células hemáticas se desintegran con soluciones hi-
ba basada en factor tisular con fosfolípidos-sílica potónicas y detergentes. Después, las proteínas aso-
jul, que compara los índices de tiempos de coagula- ciadas al ADN se degradan con proteinasa K. Final-
ción con y sin la adición de PCA, no la afectan los mente, por medio de extracción con solventes
anticoagulantes orales.24 Adicionalmente, el aumen- orgánicos (fenol/cloroformo) a pH neutro se separan
to en la concentración de F-VIII con un genotipo las proteínas (fase orgánica) del ADN (fase acuosa).
normal se asocia con una seudo-RPCA si se evalúa El ADN se precipita con etanol y se disuelve con
por la prueba funcional.25 TE.27 El ADN purificado (ADN molde) es el que se
utiliza para la PCR. Esta prueba consta de tres pa-
INTRODUCCIÓN A LA PCR sos. En el primero, el ADN molde se desnaturaliza
calentándolo a 94 ºC. En el segundo, la mezcla de re-
Entre las técnicas de biología molecular, la reac- acción que contiene los dos oligonucleótidos hasta la
ción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus si- temperatura de hibridación óptima (por ejemplo
glas en inglés), es una de las que mayor aplicación 55 °C), permitiendo la hibridización de los oligonu-
ha encontrado en la medicina.26 La PCR se utiliza cleótidos con sus secuencias complementarias en el

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Cuadro 1. Características de las variantes de la PCR.

Variante Ventaja Desventaja

RT-PCR Permite evaluar la expresión de genes (ARN). Requiere de muestras frescas o


en buen estado de conservación.
PCR Nidada Altamente específica. Más costosa.
PCR Múltiple Permite analizar varias secuencias en una reacción (económica). No siempre es posible realizarla.
PCR Cuantitativa Permite estimar la carga tumoral o viral. Es complicada y costosa.
RT-PCR in situ Permite estudiar la expresión de genes en cortes de tejido. Requiere muestras bien conservadas.
PCR Secuenciación Permite conocer la secuencia de bases de un ADN determinado. Complicada y costosa.

ADN molde. En el último paso, la enzima Taq ADN Cuadro 2. Algunos genes trombofílicos analizados mediante PCR.
sintetiza el ADN a 72 ºC como una extensión de los
oligonucleótidos (que actúan como iniciadores), me- Gen Padecimiento
diante la incorporación de los cuatro desoxirribonu-
FII Tromboembolismo venoso
cleótidos trifosfato (dNTPs: dATP, dGTP, dCTP y
Infarto agudo de miocardio
dTTP). El ciclo, formado por los tres pasos anterio- AT-III Trombosis
res, desnaturalización-hibridización-extensión se re- PC Tromboembolismo venoso
pite 30 a 35 veces, aproximadamente. Debido a que FV Tromboembolismo venoso
los productos de un ciclo de amplificación sirven
como molde para el siguiente, en cada ciclo sucesivo
se duplica exponencialmente la cantidad del ADN
blanco.28 El análisis del producto de la PCR se reali- clínicas;29 en la identificación genética de muestras
za en electroforesis en gel de poliacrilamida o agaro- forenses incluyendo el DNA extraído a partir de ca-
sa, teñido con bromuro de etidio y se observa en un bello o esperma;30,31 y el análisis de mutaciones en
transiluminador de luz UV de onda corta. oncogenes y genes supresores de tumores.28

Variantes de la PCR Aplicaciones de la PCR en el


estudio de genes involucrados en trombofilia
La PCR es una técnica de alta sensibilidad, ya que
permite la detección de una célula blanco (por ejem- Diversas mutaciones de las proteínas del sistema
plo, tumoral) entre alrededor de un millón de células de coagulación se han descrito como inductoras de
normales (como punto de referencia, mediante cito- trombofilia. Mutaciones específicas en los genes
logía se puede detectar hasta una célula tumoral en- de la protrombina, AT-III, PC o en el F-V, se han es-
tre un máximo de 100 células normales). Se han de- tudiado mediante PCR. En algunas de estas pruebas
sarrollado variantes de la PCR que tienen ventajas y se requiere adicionalmente de un análisis de RFLPs
desventajas (Cuadro 1). Entre las más usadas está (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de
la RT-PCR, en donde se parte del ARN para conver- restricción), el cual permite detectar fácilmente mu-
tirlo en cADN con ayuda de la enzima reversotrans- taciones puntuales de estos genes mediante una am-
criptasa; y la PCR-nidada la cual, debido a una doble plificación seguida por un análisis de restricción
reacción de PCR, permite aumentar la especificidad (Cuadro 2).
y sensibilidad de la prueba. La PCR cuantitativa es
de gran utilidad ya que puede estimar la carga tu- Principios de la detección de la
moral o viral en un paciente. mutación Leiden del F-V por RFLP-PCR

Aplicaciones de la PCR La mutación Leiden del F-V está asociada a la


forma hereditaria de la RPCA y consiste en una mu-
La PCR tiene una aplicación extensa en el diag- tación en punto que altera el codón 506 cambiando
nóstico de mutaciones y desórdenes genéticos, por una Arg por Glu. Para su detección se amplifica con
ejemplo, de los genes que codifican para factores de dos oligos el exón 10 del F-V. La mutación afecta un
la coagulación;25 en la detección de ácidos nucleicos sitio de restricción de la enzima Mnl I. Por medio de
procedentes de organismos patógenos en nuestras una digestión del producto amplificado con esta enzi-

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ma se pueden distinguir el estado homocigoto nor- El análisis del patrón de digestión se realiza por co-
mal, el heterocigoto y el homocigoto para la muta- rrimiento en geles de 4.5% de poliacrilamida y tinción
ción.32 En el estado homocigoto normal, la enzima con bromuro de etidio. Se utilizan dos iniciadores:
Mnl I reconoce el sitio de restricción y corta la se-
cuencia de ambos alelos normales. En el estado hete- E10: 5’ ggg CTA ATA ggA CTA CTT CTA ATC 3’
rocigoto, la enzima sólo corta al alelo normal, ya I11: 5’ TCT CTT gAA ggA AAT gCC CCA TTA 3’
que el alelo mutado (modificado en el sitio de reco-
nocimiento de la enzima), no puede ser digerido. En Los iniciadores se preparan con agua-DEPC y se
el homocigoto para la mutación, la enzima es inca- mezclan a una concentración final de 1 µM. Se guar-
paz de romper a cualquiera de los dos alelos. dan en alícuotas de 100 µL a -20 oC.

Método Controles
1. Extraer el ADN de la sangre periférica anticoagu-
lada empleando cualquier equipo comercial o al- El control homocigoto normal y el control hetero-
gún otro método para purificación de ADN. cigoto se obtienen de personas sanas y de pacientes
2. Preparar la mezcla de reacción (por amplifica- con la mutación, respectivamente. Se recomienda
ción): utilizar una técnica de extracción que permita la pu-
rificación del ADN y preservarlo a –20 °C por perio-
a) 5 µL 10x PCR (15 mM MgCl2). dos prolongados. La cuantificación del ADN se hace
b) 5 µL 2 mM dNTPs (A,G,C,T). mediante el cociente: OD260/OD280 y debe encontrar-
c) 5 µL 1mM iniciadores. se entre 1.7 y 1.8. Los controles deben diluirse o
d) 0.2 µL Taq ADN polimerasa (~1U). concentrarse a 0.05 mg/mL.
e) aforar a 50 µL con agua bidestilada estéril.
Interpretación
3. Preparar un número adecuado de microtubos: un
tubo para la muestra del paciente; un tubo para Los productos de amplificación específicos tienen
el control homocigoto normal (por cada serie de un peso molecular de 161 pb. La digestión con Mnl I
amplificaciones); un tubo para el control hetero- del amplicón derivado del alelo normal produce frag-
cigoto (por cada serie de amplificaciones). mentos de 118 y 43 pb. Sólo se aceptan tres patrones
4. Distribuir a cada tubo 48 µL de la mezcla de re- de digestión que se interpretan como se indica:
acción y colocarlos sobre hielo.
5. Agregar 2 µL del ADN purificado correspondiente Homocigoto Heterocigoto Homocigoto
y mezclar con la pipeta. normal para la mutación
6. Colocar los tubos en el termociclador e iniciar el
programa en las condiciones siguientes: Fragmentos 118 pb 161 pb 161 pb
43 pb 118 pb
43 pb
a) pre-ciclo: 1 min a 95 ºC.
b) 35 ciclos: 15 seg a 94 ºC.
20 seg a 61 ºC. Es importante incluir en la amplificación y en la di-
20 seg a 72 ºC. gestión un control homocigoto normal y un control he-
c) post-ciclo: 2 min a 72 ºC. terocigoto. Los patrones de digestión correspondientes
deben coincidir con los esperados. Cualquier desvia-
Al terminar la PCR, las muestras están listas ción de los patrones esperados requiere de la repetición
para el análisis de restricción y se pueden guardar de uno o más pasos. Si no hay producto de amplifica-
por periodos cortos a 4 ºC o por periodos prolonga- ción se recomienda repetir la amplificación o agregar
dos a -20 ºC. Los productos de amplificación se pue- 4 µL de ADN. En caso de tener una digestión parcial
den analizar antes de la digestión, mediante un co- repetir la digestión con 20 U de enzima o aumentar el
rrimiento electroforético en geles de poliacrilamida tiempo de digestión a 4 h o hasta 24 horas.
al 4.5% y tinción con bromuro de etidio. Después, di-
gerir con 4 a 8 µL del producto de amplificación en Muestreo y muestra
un volumen final de 20 µL con 5 a 10 U de enzima
Mnl I con el amortiguador(es) acompañante(s) du- Tomar de 0.5-1.0 mL de sangre periférica anticoa-
rante 2 h o hasta 24 h a 37 ºC. gulada de preferencia con EDTA aunque puede utili-

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zarse citrato o heparina. Las muestras pueden ser mutación G20210A del gen de la protrombina.44 El
enviadas a temperatura ambiente durante 48 horas. valor predictivo positivo es 1:500 para mujeres em-
Las muestras pueden ser almacenadas durante una barazadas portadoras sólo de F-V Leiden, pero es de
semana a temperaturas entre 2° y 8 °C. Muestras 1:22 para aquellas con una combinación de F-V Lei-
que no cumplan con estas condiciones no son utili- den y mutación G20210A de la protrombina. Por
zables y se deben rechazar. Tampoco son utilizables esta razón, en toda mujer embarazada con historia
muestras expuestas al calor. de trombosis deben evaluarse estas mutaciones. Los
parientes en primer grado de portadores sintomáti-
RPCA, F-V LEIDEN Y TROMBOFILIA cos de F-V Leiden deben también evaluarse. Entre
parientes con mutación, la incidencia de tromboem-
En todo paciente joven con trombosis se debe in- bolismo es de 0.45% comparado con los parientes sin
vestigar la causa de su trombofilia.33 Se estima que la mutación, quienes tienen una incidencia anual de
el F-V Leiden produce casi 45% de las formas de 0.10%.45
trombofilia heredada. En México se ha descrito que Por todo lo expuesto anteriormente, era necesario
las frecuencias de F-V Leiden y RPCA en mestizos es contar en nuestro país con un diagnóstico de la si-
de 3.88% y 39%, respectivamente.34 Los sujetos con tuación actual del escrutinio de la trombofilia en ge-
F-V Leiden tienen un riesgo alto de trombosis veno- neral y de la RPCA en particular en el laboratorio.
sa profunda (mediana de edad para la primera trom- Esta reunión nacional se concibió con la intención
bosis, 44 años), comparado con otras causas de de llenar este vacío en la información acerca del pro-
trombofilia como deficiencias de PC, PS o AT-III cedimiento de las pruebas, ya que la búsqueda inten-
(mediana de edad para la primera trombosis, 40 cionada de las alteraciones trombofílicas en especial
años).35 El riesgo de trombosis venosa profunda en del F-V Leiden y de la RPCA parece ser una priori-
menores de 30 años es de 1/10,000/año para genoti- dad tanto en la atención clínica como en los progra-
po normal y 6/10,000/año para heterocigotos porta- mas de salud pública de nuestro país. La reunión
dores de F-V Leiden. Para sujetos mayores de 50 pretendió, además, lograr la optimización del recur-
años, el riesgo se incrementa en 2 y 15 por 10,000 so presente para un diagnóstico más amplio y econó-
por año para normales y portadores heterocigotos, mico de los pacientes con trombosis. Finalmente, a
respectivamente.36 La mutación homocigota está la par con las consideraciones que se muestran en
asociada con la aparición temprana de tromboembo- este trabajo, se han dejado sentadas las bases para
lismo (edad media 29 ± 11 años).37 La mutación ho- la organización de un consenso nacional para el es-
mocigota incrementa el riesgo de TVP 80 veces.36 tudio de la trombofilia en el laboratorio y para la ge-
El F-V Leiden eleva el riesgo de trombosis cuando neración de un centro de referencia y control de cali-
se asocia con otros estados trombofílicos. En fami- dad para pruebas trombofílicas.
lias con deficiencia de PS y F-V Leiden, 72% de los
miembros desarrollan trombosis comparado con sólo CONTROL DE CALIDAD DE
19% con sólo uno de los defectos.38 El riesgo relati- LA TÉCNICA PARA DETERMINAR RPCA
vo para tromboembolismo recurrente en personas
con F-V Leiden es de 2.4-4.1.39,40 El riesgo relativo Esta prueba debe realizarse bajo un estricto con-
para sujetos con F-V Leiden e hiperhomocistinemia trol de calidad para asegurar la precisión de las de-
incrementa hasta 20 veces para cualquier forma de terminaciones y su utilidad en el diagnóstico de la
tromboembolismo venoso.41 En mujeres que utilizan trombofilia. La técnica de laboratorio original para
anticonceptivos orales y que no tienen la mutación investigar el fenotipo de la RPCA es una modifica-
Leiden del F-V el riesgo relativo de tromboembolis- ción del TTPa. Después de la publicación de Dalh-
mo venoso es de 3.8 el cual se incrementa hasta 7.9 back sobre la RPCA y trombosis familiar,12 se han
cuando se combina con el uso de anticonceptivos descrito varias modificaciones al procedimiento ori-
orales incrementa el riesgo relativo para eventos ginal. En todas se debe tener precaución al manejar
tromboembólicos hasta 34.7 veces.42 La prevalencia las muestras en todas las fases del procedimiento.
de F-V Leiden es 8% entre mujeres con una historia
de abortos recurrentes comparado con 3.7% entre Fase preanalítica
mujeres sin historia de abortos.43 En mujeres emba-
razadas el riesgo relativo de tromboembolismo es de La prueba es sensible a ciertas circunstancias
9.3 para portadoras de F-V Leiden, pero es más alto preanalíticas: la centrifugación, el almacenamiento y
para aquellas con una combinación de F-V Leiden y la concentración del anticoagulante.46 Al realizar la

364 Montiel-Manzano G, et al. Evaluación nacional del diagnóstico de la resistencia a la proteína C activada. Rev Invest Clin 2003; 55 (3): 358-369
prueba con citrato de sodio al 3.2% y al 3.8%, se ob- dos han sido evaluados en muestras congeladas. La
servó que el TTPa + PCA se encontraba sólo ligera- adición de plasma deficiente en F-V permite obtener
mente prolongado (6%) si se empleaba la última con- resultados más confiables.
centración. Por lo que hace a la centrifugación, se Se espera que la adición de PCA al plasma prolon-
recomienda hacerla por duplicado a 2,500 g durante gue el TTPa. Los valores del TTPa regularmente se
15 min para eliminar las plaquetas y separar el plas- encuentran entre 30 y 40 seg, mientras que los de
ma rápidamente. Cuando la prueba no se practique TTPa + PCA están cerca de 130 seg. Posteriormente
el mismo día de la obtención de la muestra, el plas- se calcula el cociente TTPa + PCA/TTPa, el cual, se-
ma debe congelarse. Un factor a considerar es la es- gún algunos autores, debe tener un valor normal de
tabilidad de los factores de coagulación. Al ser esta 3 ± 0.4, aunque este parámetro debe establecerse en
prueba una modificación del TTPa depende de los cada laboratorio. Se considera que el coeficiente de
factores I, II, V, VIII, IX, X, XI y XII. La actividad variación (CV) interprueba debe ser menor al 5%. Es
de F-V y F-VII disminuye en plasmas congelados y el preciso evaluar los resultados obtenidos en diferen-
fibrinógeno y el F-II también pueden alterarse. Debi- tes fechas para investigar si hubo algún problema
do a esto, el TTPa puede prolongarse anormalmente debido a inestabilidad del material o del calibrador,
en proporción al tiempo de almacenamiento.47 Adi- degradación de los reactivos o alguna otra causa.
cionalmente, el componente anticoagulante del F-V Generalmente, se elabora una gráfica con los resul-
también puede deteriorarse durante el almacena- tados obtenidos para plasmas control en diferentes
miento. Se considera que las muestras de plasma fechas, la grafica obtenida indicará que existe deriva
congelado, aun con TTPa normal, no siempre son si la línea presenta una pendiente.
seguras, ya que el TTPa puede resultar más prolon- En la actualidad existen varios equipos para de-
gado que el del plasma fresco. Por ejemplo, un TTPa terminar la RPCA disponibles comercialmente. Los
de 38 a 40 seg es normal al igual que otro de 30 a 32 más importantes son fabricados por Stago, IL y
seg, lo que puede ser importante al establecer con- Dade-Behring existiendo un CV de 17% entre los re-
clusiones. En realidad, si el F-V y F-VIII están dis- sultados obtenidos por estos tres métodos, y 8% de CV
minuidos, el TTPa se prolongará ligeramente y al interprueba (información de las casas comerciales). Es
adicionar el PCA al sistema, el TTPa también se posible que esta variación se deba a diferencias en la
prolongará, pero el cociente será inferior a 2 (por actividad del reactivo PCA o en la inestabilidad del
ejemplo, 78/40 seg = 1.9), y, por lo tanto, se consi- reactivo para el TTPa. Por esta razón algunos fabri-
dera anormal. Si en lugar de 40 seg se obtiene un cantes recomiendan reportar los resultados como la re-
TTPa de 32 seg el resultado será de 2.4, lo que se lación problema/control, al menos hasta que los reacti-
considera normal. En un estudio,47 la prueba se prac- vos se estandaricen mejor.
ticó en 24 plasmas congelados y se obtuvieron resul-
tados normales. Al repetir la prueba en plasma fresco Fase analítica
de los mismos pacientes, 12 resultaron anormales.
Por lo tanto, los resultados de la prueba al emplear- La prueba es sensible al cambio de los reactivos
se plasma almacenado son dignos de crédito si el utilizados y de los aparatos de medición empleados
TTPa es idéntico al obtenido en plasma fresco. Estas en el estudio (mecánicos, foto-ópticos). La influen-
interpretaciones no descartan la posibilidad de que cia de estas variables a menudo depende de los
ciertos pacientes tengan RPCA adquirida y que, des- cambios de otras variables, por ejemplo, el reactivo
pués de cierto tiempo, desaparezca. Los ciclos de comercial para determinar TTPa usado en la prue-
congelación y descongelación afectan los resultados ba es muy sensible a la presencia de plaquetas resi-
de la prueba. 46 En algunos casos, el reactivo para duales. También influyen en la sensibilidad de la
RPCA contiene fosfolípidos y sílica como activado- prueba las concentraciones altas de F-VIII, la pre-
res, por lo que es sensible a la presencia de anticoa- sencia de anticoagulante lúpico, el embarazo y el
gulante lúpico.48 Ya que este anticoagulante no es tratamiento con anticonceptivos, heparina y anti-
raro en pacientes con trombofilia debe tenerse cuida- coagulantes orales.
do en la interpretación de resultados, especialmente Cuando se confirmó que la mayoría de las perso-
si el TTPa se encuentra anormalmente prolongado. nas con RPCA portaban el F-V Leiden y que la activi-
Por lo tanto, es importante asegurar que al utilizar dad de este factor era más resistente a la PCA que la
muestras congeladas los valores de TTPa sean simi- proteína normal, se idearon nuevas técnicas que pre-
lares a los de plasmas frescos. Es importante men- tendían ser más específicas para detectar la muta-
cionar que la mayoría de los datos de RPCA reporta- ción. Estas pruebas se basan en la prolongación del

Montiel-Manzano G, et al. Evaluación nacional del diagnóstico de la resistencia a la proteína C activada. Rev Invest Clin 2003; 55 (3): 358-369 365
tiempo de protrombina por PCA; el tiempo de coagu- METODOLOGÍA DE LA REUNIÓN
lación del factor Xa y el tiempo de coagulación con
veneno de víbora de Russell. Estas pruebas tienen en Después de una sesión matutina de trabajo en don-
común que en el tiempo de coagulación no intervie- de se analizaron y discutieron diferentes aspectos teó-
ne la presencia del F-VIII. ricos sobre las causas y prevalencia de la RPCA en di-
El conocimiento de que la RPCA está relacionada ferentes poblaciones y su expresión como eventos
con el F-V, orientó a modificar las pruebas ya esta- trombóticos tanto en territorio venoso como arterial,
blecidas en las que el plasma del paciente se predilu- se inició, en una sesión vespertina, una mesa redonda
ye con plasma deficiente de F-V. Esta propuesta se que contempló los siguientes objetivos:
basa en que una dilución suficientemente elevada de
la muestra normalizaría el resto de los factores que 1. Conocer el interés en cuanto a sensibilidad y espe-
afectan el cociente de PCA, como el F-VIII, el F-II y cificidad que cada participante desea obtener con
la PS.49 La dilución del plasma previene la interfe- el tipo de prueba que emplea en el laboratorio.
rencia de la heparina y del anticoagulante lúpico. 2. Hacer un diagnóstico sobre las situaciones y con-
Así, al diluir el plasma problema con plasma defi- diciones de trabajo de los diferentes participantes.
ciente de F-V, se conserva el fenotipo a PCA. 3. Conocer los criterios que utilizan para elegir un
punto de corte y poder establecer si el resultado
Fase postanalítica de la prueba que emplea es positiva o negativa.
4. Conocer si el resultado positivo se confirma con
Se sugieren diversas maneras de expresar la pro- pruebas posteriores más específicas, con el interés
longación del TTPa por la PCA. Originalmente se de discernir entre las diferentes causas posibles.
propuso informar los resultados en segundos. Más 5. Conocer si se hacen estudios familiares que auxi-
tarde se demostró que el cociente de sensibilidad de lien en el diagnóstico del enfermo en estudio o
PCA (CSPCA) es menos sensible en condiciones de al- permitan identificar grupos de riesgo de la enfer-
macenamiento y se utilizó el cálculo siguiente: medad trombótica.

TTPa + PCA Para alcanzar estos objetivos, los participantes


CSPCA =
TTPa sin PCA respondieron a preguntas directas y concretas y se
elaboró un cuestionario. La dinámica de la reunión
Dos autores informaron que el CSPCA depende permitió participar a todos los asistentes y al surgir
de factores como la concentración de citrato, cloru- puntos de controversia se discutieron y analizaron
ro de calcio y de PCA, así como de la presentación en el momento. Los reactivos para el establecimiento
de la PCA (congelada o liofilizada) y del tipo de ac- del diagnóstico fueron:
tivador.25,50 Una posible solución al problema es el
empleo del cociente de sensibilidad ajustado de PCA Fase preanalítica
(CSNPCA):
1. ¿La muestra se obtiene en la fase aguda del even-
CSNPCA =
CSPCA del paciente to trombótico?
CSPCA de una mezcla de plasmas normales 2. ¿La muestra se analiza inmediatamente o conge-
la?
Estos investigadores practicaron la prueba a 3. ¿Qué concentración de citrato de sodio se emplea
100 voluntarios normales obteniendo el CSPCA y como anticoagulante?
el CSNPCA y establecieron un criterio para diag- 4. ¿Se hacen ajustes al volumen de anticoagulante
nosticar RPCA considerando los siguientes valores dependiendo del hematócrito?
de referencia: 5. ¿Centrifuga una o dos veces la muestra?
6. ¿Estudia pacientes bajo tratamiento con anticoa-
1 Si se emplea el CSPCA: < 2.1 gulante?
2. Si se emplea el CSNPCA: < 0.84
Fase analítica
Estos mismos autores sugieren la utilización de
este criterio en todos los laboratorios para estan- 7. ¿Emplea pipetas de precisión en el laboratorio?
darizar el CSPCA de la mezcla de plasmas norma- 8. ¿Qué equipo emplea: foto-óptico, electromecánico
les. o ambos sistemas?

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Cuadro 3. Resultados del escrutinio metodológico acerca de la realización de la prueba diagnóstica de la RPCA.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 No No No No No Sí Sí Sí No No
2 Inm Post Post Post Inm Inm Inm Post Inm Post
3 3.8% 3.8% 3.8% 3.2% 3.8% 3.8% 3.8% 3.8% 3.8% 3.8%
4 No Sí No No No No No Sí No Si
5 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2
6 Sí No No Sí No No No Sí No No
7 Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí
8 Mec Mec FO Mec FO Mec/FO Mec FO FO Ambos
9 Stago Stago Stago Stago
Stago IL IL Stago IL Stago Stago IL IL IL
Chro Chro Chro Chro Chro Chro
10 No No No No No Sí No No No No
11 PDFV Ambos Ambos PDFV PDFV Ambos PDFV PDFV Ambos Ambos
12 Seg Coc Coc Seg Coc Seg Seg Coc Coc Seg
13 No Sí Sí Sí No Sí Sí No Sí Sí
14 Sí No Sí No Sí Sí No No No Sí
15 Sí No No No No No No No Sí Sí

Inm: inmediatamente; Post: posteriormente; Mec: mecánico; FO: foto-ópticos; IL: International Laboratories; Chro: Chromogenics; PDFV: plasma deficiente
en FV; Coc: cociente.

9. ¿Qué reactivo emplea? den, ya que emplean el reactivo más específico para
10.¿Siempre emplea el mismo equipo o puede inter- este caso. Un laboratorio emplea reactivos con dife-
cambiar diferentes equipos? rente sensibilidad, pero no aclaró en qué casos utiliza
11.¿Determina con el método clásico o modificado uno u otro. Los resultados se expresan en segundos
(PDF-V) o ambos métodos? cuando se utiliza el reactivo de reactivo de Stago y en
cociente cuando se utiliza el reactivo de Chromogenix.
Análisis de resultados Sólo uno de los participantes informa el resultado es-
tandarizado. Sesenta por ciento de los participantes
12.¿Cómo informa los resultados? estudió una población sana (donadores de banco de
13.¿Estableció el criterio de corte? sangre o personal del laboratorio) para establecer los
14.¿Hace estudios que confirmen la mutación Leiden? parámetros normales aunque no aclararon con qué
15.¿Hace estudios a familiares? criterio establecieron el corte de positividad. Ignora-
ron los resultados que podrían considerarse positivos
RESULTADOS DEL y no los incluyeron en el análisis para establecer
ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN punto de corte. Treinta por ciento hace referencia a
los resultados normales que se publican en las ins-
Los resultados generales se muestran en el cuadro trucciones de operación del reactivo. Diez por ciento
3. Los participantes conocían y practicaban las reco- estudió una población sana (donadores de sangre) y
mendaciones para obtener una muestra en las mejo- consideró normal la percentil 95 en donde colocó el
res condiciones preanalíticas. Sólo uno no conocía el corte de positividad. Cuarenta por ciento confirma la
efecto de los fosfolípidos de las plaquetas en el resul- mutación Leiden por análisis de ADN; 20% hace es-
tado de la prueba. Por su forma de operación, algu- tudios familiares y 10% sólo en algunas ocasiones
nos laboratorios no pueden ejercer un estricto con- (sin aclarar el criterio de decisión).
trol preanalítico porque las muestras llegan a su
centro referidas de otros laboratorios. Todos los CONCLUSIONES
participantes emplean la prueba modificada, lo que
expresa su interés por conocer la presencia de muta- 1. A pesar de su gran impacto en múltiples áreas de
ción Leiden. Cuarenta por ciento de los participan- la medicina, la determinación de la RPCA es una
tes centra su interés únicamente en identificar las prueba que se realiza en muy pocos centros en
RPCA primarias debidas a la presencia de F-V Lei- nuestro país.

Montiel-Manzano G, et al. Evaluación nacional del diagnóstico de la resistencia a la proteína C activada. Rev Invest Clin 2003; 55 (3): 358-369 367
2. No existe consenso acerca de la mejor técnica 10. Malm J, Laurell M, Nilsson IM, Dahlbäck B. Thromboembolic
para determinar la RPCA. Las diferencias entre disease-critical evaluation of laboratory investigation. Thromb
Haemost 1992; 68: 7-13.
los centros en las fases preanalítica, analítica y 11. De Stefano V, Finazzi G, Mannucci P. Inherited thrombophilia:
postanalítica son muy grandes. Pathogenesis clinical syndromes, and management. Blood
3. Con base en los dos puntos previos, se puede infe- 1996; 87: 3531-44.
rir que las mismas conclusiones pueden tomarse 12. Dahlbäck B, Carlsson M, Svensson PJ. Familial thombophilia
due to a previously unrecognized mechanism characterized by
para el diagnóstico global de la trombofilia. poor anticoagulant response to activated protein C: prediction
4. Con base en el gran impacto que tiene la trombofi- of a cofactor to activated protein C. Proc Natl Acad Sci USA
lia en la medicina moderna, es necesario estable- 1993; 90: 1004-8.
cer un consenso real entre los laboratorios que 13. Griffin JH, Evatt B, Wideman C, Fernandez JA. Anticoagulant
protein C pathway defective in majority of thrombophilic pa-
realizan estos estudios con la intención de deter- tients. Blood 1993; 82: 1989-93.
minar cuáles son las actividades preanalíticas, 14. Koster T, Rosendaal FR, de Ronde H, Briet E, Vandenbroucke
analíticas y postanalíticas más adecuadas para op- JP, Bertina R. Venous thrombosis due to poor anticoagulant
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zar el diagnóstico trombofílico en el laboratorio 16. Laffen M, Tuddenham E. Assessing thrombotic risk. Br J Med
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clínico, con el propósito de establecer las normas 17. Voorberg J, Roelse J, Koopman R, Büller H, Berends F, ten
para un mejor trabajo diagnóstico en nuestro Cate JW, Mertens K, van Mourik JA. Association of idiopathic
país en el área de trombofilia. Dicho consenso se venous thromboembolism with single point-mutation at Arg-
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dad para trombofilia mediante el envío de mues- tribution of factor V Leiden in 4047 men and women: implica-
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