INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO DE INGENIERÍA DE PRODUCTOS BIOLÓGICOS

PRÁCTICA 3 “PRODUCCION DE ANTICUERPOS EN CONEJOS”

GRUPO: 8FM1

EQUIPO: 1

INTEGRANTES DEL EQUIPO:

COETO RODRÍGUEZ CYNTHIA SAMANTHA

GALARZA CASTILLO GUADALUPE MONSERRAT
GUTIÉRREZ TORRES CLARA ISABEL
RESÉNNDIZ GARCÍA ALMA CAROLINA
TLATELPA MARTÍNEZ ABIGAIL

PROFESORAS:

AIDA MARGARITA ZAMORA CONTRERAS

LAURA CRISTINA CABRERA PÉREZ

Ciudad de México, 13 de Junio de 2018

 PRÁCTICA 3.
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS EN CONEJOS

I. OBJETIVOS

General
■ Obtener anticuerpos procedentes de suero de conejo
Específicos
■ El alumno ensayará las técnicas de inmunización con los animales de uso
más común en el laboratorio, practicando algunos de los esquemas de
inmunización establecidos.
■ Realizar técnicas cuantitativas y cualitativas para la identificación de los
anticuerpos obtenidos.
■ El alumno conocerá distintas maneras de poner en evidencia la reacción de
precipitación que ocurre cuando un antígeno soluble interacciona con su
anticuerpo homólogo.

II. INTRODUCCIÓN
Un anticuerpo es una molécula de naturaleza proteica producida por las células
plasmáticas (un tipo de linfocito B) la cual se produce después de que se ha
desencadenado una respuesta inmune humoral. Son unidades tetra peptídica (2
cadenas pesadas “H” iguales y dos cadenas ligeras “L” iguales), que poseen muy
alta especificidad para una región en particular (epítopo) de la molécula que unen.

Imagen 1. Estructura de un anticuerpo

Sus principales funciones son: Opsonizar (marcar para fagocitar), neutralizar
(impedir la unión de virus/ toxinas a la molécula blanco) y fijación y activación del
complemento.
Existen diferentes clases de anticuerpos, las cuales son determinadas por el tipo de
cadena pesada. Hay cinco tipos de cadenas pesadas, denotados por las letras
griegasα, β, δ, ε, γ y µ para cada una de las inmunoglobulinas IgG, IgA, IgD, IgE e
IgM, respectivamente. En estas clases pueden existir cadenas livianas ya sea de
tipo kappa (κ) o tipo lambda (λ).
Los anticuerpos pueden estar constituidos por una sola molécula (monómero) como
es el caso de la IgG, IgD e IgE; formar dímeros como es el caso de la IgA, o
pentámeros unidos por sus extremos Fc como es el caso de la IgM.

Imagen 2. Tipos de anticuerpos

Uno de sus principales usos es en la obtención de sueros, los cuales son un
preparado biológico que contiene una mezcla de anticuerpos contra un antígeno de
interés, su administración provee inmunidad pasiva temporal contra un antígeno
nocivo, ya sea intoxicaciones causadas por venenos de animales, toxinas o
infecciones por virus.
El proceso de producción se inicia con la selección y obtención del anticuerpo,
selección del sistema de producción, diseño y ejecución del protocolo o programa
de inmunización, obtención del suero purificado y finaliza con el análisis y
formulación.
La inmunidad producida por los sueros es inmediata, pero es menos intensa y
duradera que la inmunidad producida por las vacunas, por eso se emplean sueros
en el tratamiento de enfermedades infecciosas de urgencia, especialmente en
situaciones donde no hay tiempo suficiente para producir una inmunización activa.
Se pueden dividir en sueros de origen animal o heterologos y sueros de origen
humano u homólogos.
 Sueros homólogos
Estos a su vez se dividen en:
a) suero multivalente: Procedente de voluntarios “sanos” contienen gran diversidad
de anticuerpos contra patógenos comunes en el ambiente
b) suero específico: se obtiene a partir de pacientes recuperados de alguna
enfermedad.
 Sueros heterologos
a) Primera generación: Suero parcialmente crudo.
b) Segunda generación: Anticuerpos purificados.
c) Tercera generación: Anticuerpos modificados enzimáticamente.
d) Cuarta generación: Anticuerpos modificados genéticamente
III. METODOLOGÍA

 Obtención del Ag

Se centrifugó la Se almacenó el
Se extrajeron
sangre en tubos Se recuperó el suero en el
40 mL de
vacutainer a suero en un refrigerador,
sangre de un
1500 rpm por tubo vacutainer para su
voluntario
15 min posterior uso

 Primer sangrado en el conejo

Se sangró al conejo
Se recuperó el
de la oreja, con una Se almacenó el
La sangre extraída suero en un tubo
mariposa para suero en el
se centrifugó a 3500 vacutainer y se
venóclisis, refrigerador, para
rpm por 15 min calentó a baño
obteniendo 2.5 mL su posterior uso
maría a 37°C 30 min
de sangre

 Pruebas de esterilidad del suero humano

Se añadió 0.1 mL
Se pesaron 1.54 g Se colocaron 9 mL del suero humano
Se dejaron
de caldo tioglicolato en 3 tubos con tapa en dos tubos
incubando los 3
en polvo y se y posteriormente se (control +) y en el
tubos a 37 °C por
llevaron a 50 mL esterilizaron en tercer tubo no se
tres días
con agua destilada autoclave. añadió nada
(control -)
 Inmunización del conejo

El día 1 se inoculó al Tres días después se Tres días después se Tres días después se
conejo por vía inoculó al conejo inoculó al conejo inoculó al conejo
subcutánea con 0.5 por vía subcutánea por vía subcutánea por vía subcutánea
mL de suero con 1.0 mL de suero con 1.5 mL de suero con 2.0 mL de suero
humano, en 2 humano, en 4 humano, en 6 humano, en 8
punciones distintas, punciones distintas, punciones distintas, punciones distintas,
administrando 0.25 administrando 0.25 administrando 0.25 administrando 0.25
mL en cada una mL en cada una mL en cada una mL en cada una

 Obtención de Anticuerpos

Se sangró al conejo
de la oreja, con una Se almacenó el
La sangre extraída Se recuperó el
mariposa para suero en el
se centrifugó a 3500 suero en un tubo
venóclisis, refrigerador, para
rpm por 15 min vacutainer
obteniendo 4 mL de su posterior uso
sangre

 Prueba de capilaridad

En 11 capilares se
colocaron 35 µL de
Se realizaron 10 la dilución
diluciones en Las posteriores respectiva y 35 µL
tubos eppendorf, diluciones del suero con el Tres días después
la primera contenían 250 µL Ac, se mezclaron, se observó si había
contenía 250 µL de de la dilución se colocaron en precipitación o no y
suero humano y anterior y 250 µL una tira de se midió la altura de
de solución salina la misma.
250 µL de solución plastilina y se
salina al 0.85 % al 0.85 % guardaron en el
refri
  Prueba de inmunodifusión

Se realizaron 10
diluciones en tubos Las posteriores
Se colocó una
eppendorf, la diluciones Se prepararon 50
capa de 10 mL de
primera contenía contenían 250 µL mL de una
la solución de
250 µL de suero de la dilución solución de
agarosa al 3 % en
humano y 250 µL de anterior y 250 µL agarosa al 0.5 % y
una caja Petri y
solución salina al de solución salina otra al 0.3%
se dejó solidificar
0.85 % al 0.85 %

En el pozo central Se guardó en el refri

En la misma caja se Se realizaron 12
se colocaron 30 µL y tres días se
colocó una segunda pozos antes de que
del suero con los Ac observó si había o
capa de 10 mL de la solidificara la
y en los demás no líneas blancas
solución de agarosa segunda capa de
pozos 10 µL de la alrededor de cada
al 5 % agarosa
dilución respectiva pozo

IV. RESULTADOS
 Prueba de precipitación

Imagen 3. Prueba de precipitación

Tabla 1. Resultados experimentales para la prueba de precipitación

Dilución Precipitación
(mm)

1 11
½ 7.5

¼ 5.5

1/8 4

1/16 5
1/32 4
1/64 3.5

1/128 3

1/256 3.5
1/512 2

Control -
 12

10

Precipitado (mm)
8

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Dilución

Imagen 4. Curva de precipitación

 Prueba de inmunodifusión

Imagen 5. Prueba de inmunodifusión

V. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Se inmunizó un conejo de raza nueva Zelanda con suero Humano obtenido por
venopunción a partir de sangre sin anticoagulante de un donador sano.
El primer sangrado del conejo se realizó previo a la primera inmunización con el
objeto de obtener suero sin anticuerpos específicos; dicho suero se utiliza como
control en los ensayos de detección y caracterización de los anticuerpos producidos.
Antes de inocular el suero se debe asegurar que este no representa riesgo de
patogenicidad o toxicidad al animal o al personal, por ello se realizó una prueba de
esterilidad, esta se realizó en tres tubos de ensayo que contenían 9 ml de caldo
tioglicolato y .1 mL de la muestra de suero a usar y se incubó a 37 °C una vez
obtenidas las pruebas y cerciorarse de la esterilidad del suero comenzó el protocolo
de inmunización.
La vía de inoculación del antígeno fue subcutánea, debido a que esta disminuye la
reacción local severa y abarcar una mayor superficie de absorción, cada dosis de
antígeno fue distribuida en diferentes sitios (máximo ocho) a lo largo del dorso
torácico con un volumen de 0.25mL en cada punción. Se inoculó en 4 dosis
crecientes de 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 ml sin adyuvante, cada 3 días. Al suministrar el
suero (antígeno) al conejo el tipo de respuesta que se obtuvo por parte de su
sistema inmune fue una inmunidad humoral, esto debido a que la inmunidad
humoral es el principal mecanismo de defensa contra los microorganismos
extracelulares y sus toxinas, en el cual, los componentes del sistema inmune que
atacan a los antígenos no son las células directamente sino los anticuerpos
secretados por activación antigénica, está a su vez tiene dos tipos de respuestas,
respuesta humoral primaria y respuesta humoral secundaria.
En la respuesta humoral primaria se lleva a cabo el reconocimiento del antígeno
extraño dentro del organismo por células B a través de su receptor de membrana.
La cantidad de anticuerpo secretado por células plasmáticas y la clonación de estas
mismas células la primera vez que entra en contacto el receptor con el antígeno
encuentra su máximo aproximadamente a los 7 días de la primera infección (5-10
días), los anticuerpos secretados en esta etapa son de tipo IgM. La respuesta
humoral secundaria se lleva a cabo después de una infección repetida por un mismo
antígeno (se observó debido a las inmunizaciones crecientes y repetidas con el
suero), está activa los linfocitos de memoria creados como consecuencia de la
respuesta humoral primaria. La respuesta, entonces, se inicia más rápidamente, al
cabo de unos 3 días. Por su parte, la respuesta máxima de anticuerpos es mayor,
con una intensidad de 100 a 1000 veces la respuesta primaria, y es principalmente
del isotipo IgG. El isotipo puede cambiar, bien sea IgA o IgE, dependiendo del
estímulo adecuado, por otra parte estos anticuerpos de alta afinidad por el antígeno
inicial maduran. Es importante destacar que la variabilidad de isotipos se da
mediante un proceso de reordenamiento genético en donde durante el proceso de
maduración de los linfocitos B para producir las inmunoglobulinas los segmentos
se reordenan, de modo que se colocan adyacentes un segmento de cada tipo de
los que intervienen en la codificación de cada tipo de cadena:
 V+J de cadenas L (lambda o kappa) determinan la región VL de la cadena
ligera.
 V+D+J de cadenas H determinan la región VH de la cadena pesada.
 En cada caso, el segmento C, se coloca cercano al conjunto ya reordenado
de V+J o V+D+J para determinar la correspondiente región constante.
 El pequeño segmento L acompaña en 5’ a cada segmento V. Determina un
péptido líder corto que sirve para guiar a la cadena polipeptídica en formación
hacia el retículo endoplásmico rugoso. Durante el proceso de secreción este
péptido se elimina, por lo que no participa de la Ig madura.
La recombinación la lleva a cabo el complejo recombinasa VDJ, que es común para
el reordenamiento de los genes del TcR. En la mayoría de los linfocitos B en
desarrollo, la recombinación se inicia en la cadena pesada de las Ig.