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Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Perú, DECANA DE AMERICA


Facultad de Farmacia y Bioquímica
Escuela Académico Profesional de Toxicología
Departamento de TOXICOLOGÍA Y QUÍMICA LEGAL

TOXICOLOGÍA COSMÉTICA –PRÁCTICA

Grupo: LIPSTOX

PROFESOR RESPONSABLE DE LA PRÁCTICA:

Dr. JOSÉ ANTONIO LLAHUILLA QUEA


PRÁCTICA: MARTES (11:00-3:00 pm)

LIMA_PERÚ
2019
INFORME N°10: PRUEBA DE IRRITABILIDAD OFTALMICA DE
CHAMPUS POR EL METODO IN VITRO HET-CAM (OECD 405)

I. OBJETIVO:
➢ Determinar el índice de irritabilidad oftálmica de una marca comercial de un
champú por el método HET-CAM.
II. MARCO TEORICO:
Actualmente numerosos laboratorios en el mundo han incorporado el método con
la membrana corioalantoidea del huevo de gallina (HET-CAM, hen´s egg test
chorioallantoic membrane por sus siglas en inglés) para la evaluación de la
irritación ocular producida por cosméticos; debido a su rapidez, simplicidad,
sensibilidad, fácil ejecución y su relativo bajo costo (1)
En el sistema del método HETCAM, se determinan tres reacciones: hemorragia,
lisis y coagulación de la membrana corioalantoidea al noveno día de embrionación
cuando el tejido nervioso y la percepción del dolor aún no se han desarrollado (2)
Los huevos de gallina se incuban en una incubadora durante 9 días después de
cuyo tiempo los huevos defectuosos se descartan. La cáscara alrededor de la
celda de aire se retira y las membranas internas se extraen para revelar la
membrana corioalantoidea. Las sustancias de ensayo se añaden a la membrana
y se dejan en contacto durante 5 minutos. La membrana se examina para evaluar
el daño vascular y se registra el tiempo necesario para que se produzca la lesión.
La irritación se obtiene de acuerdo con la gravedad y la velocidad a la que se
produce el daño. Después de colocar la muestra de ensayo directamente sobre
la CAM, se lleva a cabo una evaluación de los parámetros mencionados
anteriormente durante un periodo de observación de 5 minutos(2).

III. METODOLOGÍA:
3.1. fundamento de la metodología:
El índice de irritación ocular se calculó a partir de la siguiente expresión.
IV. PROCEDIMIENTO

PREPARACION DE El proceso de incubación comienza entre 1


LOS HUEVOS E o 2 días después del ovado bajo
INCUBACIÓN condiciones normales de incubación
ARTIFICIAL artificial por 10 días.

Condiciones normales: El décimo día se recogen los huevos para


realizar la prueba, descartando los
T° 47-38°C huevos defectuosos.
HR: 55 – 60%

Rotación artificial cada 2h.

Realizar un orificio alrededor de la cascara en la zona de


la cámara de aire del huevo utilizando una tijera y una
METODO pinza. Ello para exponer la membrana corioalantoidea.
HET-CAM

❖ Añadir 2 mL de suero fisiológico para humectar


la capa que cubre el CAM durante cinco minutos,
luego retirar la capa superficial.
❖ aplicar 0.3 mL del champú sobre el CAM
expuesta. tomar nota del tiempo a la aparición
de hemorragias, lisis y coagulación dentro de los
5 min.
MATERIALES Y EQUIPOS:

Huevos incubados Pinzas y tijeras. Suero fisiológico

cronometro champú
PIPETAS DE 2 mL

Baño maria Microscopio

Incubadora
V. CÁLCULOS Y RESULTADOS

Determinación del Índice de Irritación (I.I)

𝟑𝟎𝟏−𝑻𝑯 𝟑𝟎𝟏−𝑻𝑳 𝟑𝟎𝟏−𝑻𝑪


I.I = ( 𝑿 𝟓) + ( 𝑿 𝟕) + ( 𝑿 𝟗)
𝟑𝟎𝟎 𝟑𝟎𝟎 𝟑𝟎𝟎

Donde:
TH: Tiempo de aparición de hemorragia.
TL: Tiempo de aparición de lisis.
TC: Tiempo de aparición de coagulación

Determinación del índice de Irritación (I.I) de Champo para bebés

𝟑𝟎𝟏−𝑻𝑯 𝟑𝟎𝟏−𝑻𝑳 𝟑𝟎𝟏−𝑻𝑪


I.I = ( 𝑿 𝟓) + ( 𝑿 𝟕) + ( 𝑿 𝟗)
𝟑𝟎𝟎 𝟑𝟎𝟎 𝟑𝟎𝟎

𝟑𝟎𝟏−𝟔𝟎 𝟑𝟎𝟏−𝟗𝟎 𝟑𝟎𝟏−𝟐𝟒𝟎


I.I = ( 𝟑𝟎𝟎
𝑿 𝟓) + ( 𝟑𝟎𝟎
𝑿 𝟕) + ( 𝟑𝟎𝟎
𝑿 𝟗)

I.I = 10,76999

Adicionar 2 mL de suero fisiológico, para


Realizar un orifico por la zona de la cámara de
humedecer la capa que cubre la membrana
aire, dejando expuesta la membrana
corioalantoidea por 5 min.
corioalantoidea.

Retirar la capa con una pinza.


Adicionar 0,3 mL de Shampoo para bebés
Coágulo
Lisis

Hemorragia

Evaluación del efecto de Shampoo para bebés para


bebes en la membrana corioalantoidea.

Determinación del índice de Irritación (I.I) de Jabón NEKO para cuerpo

𝟑𝟎𝟏−𝑻𝑯 𝟑𝟎𝟏−𝑻𝑳 𝟑𝟎𝟏−𝑻𝑪


I.I = ( 𝑿 𝟓) + ( 𝑿 𝟕) + ( 𝑿 𝟗)
𝟑𝟎𝟎 𝟑𝟎𝟎 𝟑𝟎𝟎

𝟑𝟎𝟏−𝟑𝟔 𝟑𝟎𝟏−𝟖𝟎 𝟑𝟎𝟏−𝟏𝟖𝟎


I.I = ( 𝑿 𝟓) + ( 𝑿 𝟕) + ( 𝑿 𝟗)
𝟑𝟎𝟎 𝟑𝟎𝟎 𝟑𝟎𝟎

I.I = 13,20333

Realizar un orifico por la zona de la cámara de Dejar humedecer por 5 min la capa que cubre
aire, dejando expuesta la membrana la membrana corioalantoidea, retirar la capa
corioalantoidea y agregar 2 mL de suero con una pinza.
fisiológico.
Lisis Hemorragia
Coágulo

Solución jabonosa (jabón NEKO Evaluación del efecto de jabón NEKO para el cuerpo
para cuerpo). en la membrana corioalantoidea.
VI. DISCUSIÓN

El objetivo general de esta práctica basada en la utilización de la membrana


corioalantoidea es la valoración del posible efecto irritante de dos productos siendo
estos el shampoo de bebé y el jabón sobre la membrana.

Una de las formas para disminuir el uso de animales de experimentación es el


método de HET-CAM .3
Este procedimiento de la membrana corioalantoidea del huevo de “gallina” (hen’s
egg test chorioallantoic membrane, Het-Cam) para determinar la irritación ocular es
sencillo, sensible, de fácil elaboración y bajo costo . 1

En este ensayo se observó cambios en la membrana corioalantoidea del huevo de


gallina, como son la hemorragia, la vasoconstricción y la coagulación, después del
tratamiento con los productos de ensayo. En la cual se aplicó una dosis determinada
que según el protocolo fue de 0,3 ml sobre la CAM de huevos fertilizados de
aproximadamente 89 días. Este es un punto importante ya que no se debe utilizar
huevos que hayan sido fecundados hace más de 10 días debido a que se considera
que a partir de ese tiempo el embrión ya tiene un sistema nervioso lo
suficientemente desarrollado

Generalmente, la concentración de tensioactivos que se añade en las formulaciones


de los productos utilizados no suele exceder del 5 % (p/v) aunque lo habitual es que
oscile entre el 1 y el 2 %4,5. Por este motivo, se valoró el potencial irritante de los
productos, disueltos en solución salina fisiológica.

Para cada producto, se ensayó en 1 huevo y los resultados individuales se observa


en la Tabla 1. Según el ensayo HET-CAM, los compuestos de los productos
utilizados se clasifican como irritantes severos.

Desde hace años se venía planteando en Europa la prohibición de los ensayos de


cosméticos utilizando animales, por ese motivo se desarrollaron gran número de
métodos alternativos, de los cuales unos han sido validados y aceptados por las
autoridades reguladoras y otros se encuentran en fase de validación y/o
aceptación.2

A pesar de los esfuerzos realizados en este sentido, todavía quedan lagunas por
resolver y no todos los métodos alternativos validados son útiles para todos los
productos que se evalúan.

VII. CONCLUSIÓN:

▪ Se determinó el índice de irritabilidad oftálmica de los 2 productos


cosméticos (shampoo y jabón), encontrándose que ambos productos
analizados son irritantes severos.
VIII. RECOMENDACIONES:
• Utilizar huevos que tengan como mínimo 7 días de incubación y como
máximo 10 días de incubación.

IX. BIBLIOGRAFÍA:

1. Pineda P, Neuman, Cervantes G, Luis, Vilchez C, Héctor, Villanueva B, Laura,


& Pulido C, Victor. (2019). Efecto irritante in vitro del gel elaborado con extracto
acuoso del mesocarpio de Hylocereus megalanthus (Cactaceae) "pitahaya" por
el método HET-CAM. Arnaldoa, 26(1), 369-
380. https://dx.doi.org/10.22497/arnaldoa.261.26118
2. Taype E, Evelyng. (2015). Estandarización y validación del método HET-CAM
para medir la irritabilidad ocular in vitro de los extractos de cinco frutos nativos
del Perú utilizados en la industria cosmética. revisado el 10 de noviembre del
2019, disponible en: http://cybertesis.unmsm.edu.pe/handle/cybertesis/4474
3. Martínez O. V. Marcadores de irritación en modelos celulares y organotópicos
alternativa a los ensayos in vivo, aplicado al estudio de tensioactivos de tipo
lipoaminoácidos. [Tesis para optar al título de Químico Farmacéutico].
Barcelona. Universidad de Barcelona. Facultad de Farmacia, Departamento de
Fisiología. 2007.
4. Taha M., Abdennourb S. HET-CAM test. Application to shampoos in developing
countries. Toxicología In Vitro. 2017; 45 (3):393-396.
5. Bruner LH, Miller KR,Owicki JC,Parce JW,Muir VC ,1991.Testing ocular iiritancy
in vitro with the silicon microphysiometer.Toxicol in vitro 5,277-284.
6. Harry RG .Harry´s cosmetology ,7 th.edition ,1982.Eds.JB Wilkinson ,RJ
Moore.Chem Publ Comp .Inc,New York .
7. Lewandowski H,Schwuger MJ,2 nd edition (2003).Chapter 13 : alfa-
Sulfomonocarboxylic esters.En: Novel surfactants.Preparation ,applications,and
biodegradability ,vol ,114,Ed.K Holmerg .Inc,Marcel Dekker,New York.
8. OECD. (2017). GUILDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS.
Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying
chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye
damage. (Nro. 492). OECD. Paris.
9. OECD. (2017). GUILDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS. Acute Eye
Irritation/Corrosion. (Nro. 405). OECD. Paris.
10. Jalón F. (2017). Reacciones oculares producidas por cosméticos. Universidad
de Sevilla. Sevilla-España.
X. ANEXO (CUESTIONARIO)

1. ¿Qué otros métodos cualitativos existen para la determinación de la irritabilidad


ocular de productos químicos?

GUÍA OECD 492: Método de prueba de epitelio similar a la córnea humana


(RhCE) reconstruido para identificar productos químicos que no requieren
clasificación y etiquetado para irritación ocular o daño ocular grave8.

La evaluación del daño ocular grave / irritación ocular generalmente ha implicado el


uso de animales de laboratorio (OECD Test Guideline (TG) 405; adoptada en 1981
y revisada en 1987, 2002, 2012 y 2017).

Esta guía de prueba describe un procedimiento in vitro que permite la identificación


de productos químicos (sustancias y mezclas) que no requieren clasificación y
etiquetado para irritación ocular o daño ocular grave de acuerdo con UN GHS. Utiliza
el epitelio humano similar a la córnea reconstruido (RhCE) que imita de cerca las
propiedades histológicas, morfológicas, bioquímicas y fisiológicas del epitelio
corneal humano. Otros cuatro métodos de prueba in vitro han sido validados,
considerados científicamente válidos y adoptados como Directrices de prueba de la
OCDE (TGs) 437, 438, 460 y 491 para abordar el punto final de la salud humana de
lesiones oculares graves. /irritación de ojo.

se concluyó que EpiOcular ™ EIT y SkinEthic ™ HCE EIT pueden identificar


correctamente los productos químicos (tanto sustancias como mezclas) que no
requieren clasificación y etiquetado para irritación ocular o daño ocular grave según
UN GHS, y los métodos de prueba se recomendaron como científicamente válidos
para ese propósito.

El químico de prueba se aplica tópicamente a un mínimo de dos construcciones de


tejido RhCE tridimensionales y la viabilidad del tejido se mide después de la
exposición y un período de incubación posterior al tratamiento. Los tejidos RhCE se
reconstruyen a partir de queratinocitos epidérmicos humanos primarios o células
epiteliales corneales inmortalizadas humanas, que se han cultivado durante varios
días para formar un epitelio escamoso estratificado y altamente diferenciado
morfológicamente similar al que se encuentra en la córnea humana. La construcción
de tejido EpiOcular ™ RhCE consta de al menos 3 capas viables de células y una
superficie no queratinizada, que muestra una estructura corneal similar a la
encontrada in vivo. La construcción de tejido SkinEthic ™ HCE RhCE consta de al
menos 4 capas de células viables, que incluyen células basales columnares, células
de ala de transición y células escamosas superficiales similares a las del epitelio
corneal humano normal.
El daño ocular grave / la irritación ocular inducidos por sustancias químicas, que se
manifiesta in vivo principalmente por opacidad corneal, iritis, enrojecimiento
conjuntival y / o quemosis conjuntival, es el resultado de una cascada de eventos
que comienzan con la penetración del producto químico a través de la córnea y / o
conjuntiva y producción de daño a las células. El daño celular puede ocurrir por
varios modos de acción, que incluyen: lisis de la membrana celular (por ejemplo, por
tensioactivos, solventes orgánicos); coagulación de macromoléculas
(particularmente proteínas) (por ejemplo, por tensioactivos, solventes orgánicos,
álcalis y ácidos); saponificación de lípidos (p. ej., por álcalis); y alquilación u otras
interacciones covalentes con macromoléculas (por ejemplo, por blanqueadores,
peróxidos y alquiladores). Sin embargo, se ha demostrado que la citotoxicidad juega
un papel importante, si no el principal, mecanicista en la determinación de la
respuesta global de daño ocular grave / irritación ocular de un producto químico
independientemente de los procesos fisicoquímicos subyacentes al daño tisular.
Además, el potencial de daño ocular grave / irritación ocular de un producto químico
se determina principalmente por el alcance de la lesión inicial, que se correlaciona
con el alcance de la muerte celular y con el alcance de las respuestas posteriores y
los resultados finales Por lo tanto, los irritantes leves generalmente solo afectan el
epitelio corneal superficial, los irritantes leves y moderados dañan principalmente el
epitelio y el estroma superficial y los irritantes severos dañan el epitelio, el estroma
profundo y, en ocasiones, el endotelio corneal. La medición de la viabilidad de la
construcción de tejido RhCE d
espués de la exposición tópica a un químico de prueba para identificar químicos que
no requieren clasificación para daño ocular grave / irritación ocular (UN GHS Sin
categoría) se basa en el supuesto de que todos los químicos que inducen daño
ocular grave o irritación ocular inducirán citotoxicidad en el epitelio corneal y / o
conjuntiva.
GUÍA OECD 4059:
Después del pretratamiento con un analgésico sistémico y la inducción de una
anestesia tópica adecuada, la sustancia a analizar se aplica en una dosis única a uno
de los ojos del animal experimental; El ojo no tratado sirve como control. El grado de
irritación / corrosión ocular se evalúa puntuando las lesiones de la conjuntiva, la
córnea y el iris, a intervalos específicos. También se describen otros efectos en el ojo
y efectos sistémicos adversos para proporcionar una evaluación completa de los
efectos. La duración del estudio debería ser suficiente para evaluar la reversibilidad o
irreversibilidad de los efectos. Los animales que muestren signos de angustia y / o
dolores severos en cualquier etapa de la prueba o lesiones consistentes con los
puntos finales humanos descritos en esta Guía de prueba deben ser sacrificados de
forma humana, y la sustancia evaluada en consecuencia. Los criterios para tomar la
decisión de matar humanamente a los animales moribundos y gravemente afectados
son objeto de un documento de orientación separado.
2. ¿Qué productos cosméticos comercializados han sido reportados con un alto grado
de daño ocular?10 Ejemplos.

Máscara de pestañas. (Rímel) “

• Las formulaciones cake contienen jabón y pigmentos, comprimidos en un disco y


son aplicadas en la base de las pestañas usando un cepillo humedecido. Este tipo
de formulaciones son fácilmente toleradas por pacientes con pieles sensibles. Sin
embargo, no son resistentes al agua y puede manchar fácilmente con el lagrimeo y
la transpiración. No es un producto muy usado porque puede ser contaminado por
microorganismos debido a su constante contacto con agua.
• Las formulaciones líquidas, están contenidas en un tubo y se aplican usando un
cepillo aplicador. Los consumidores consideran muy importante el cepillo, ya que en
definitiva, es el que se encarga de separar y generar volumen en las pestañas. La
composición de estas formulaciones es muy distinta a las anteriores ya que
contienen ceras, pigmentos y resinas disueltas para formar una emulsión
oleoacuosa, que se seque rápidamente tras su aplicación. Para hacer que el
producto sea más resistente al agua, se incluyen resinas adicionales en la
formulación, y añadiendo polivinilpirrolidona conseguimos disminuir el
apelmazamiento durante su uso.

Las máscaras resistentes al agua se consiguen añadiendo ceras y pigmentos a petróleo


destilado. El inconveniente es que a veces resulta complicado eliminarlo sólo con agua.
En este tipo de formulaciones se requiere una menor concentración de conservantes ya
que en ella se genera un medio desfavorable para la proliferación de bacterias.
Consecuentemente, estas formulaciones pueden ser más irritantes. Las máscaras
híbridas son formulaciones de base acuosa pero con un tiempo de secado más corto.
Son resistentes al agua y generan un gran efecto de separación de las pestañas.
Algunas de las máscaras de pestañas más novedosas, tienen un proceso de aplicación
en dos pasos: una capa base, y una capa superior que aporta el color. Añadiendo finas
fibras de nylon en la capa base, conseguimos que la formulación haga parecer que las
pestañas son más largas.
Shampoo
Causa irritación ocular debido al pH ligeramente ácido que presenta frente al pH neutro
que presentan nuestros ojos, produciendo incrementación de lágrimas para neutralizar
el efecto del exceso de ácido. También va a producir irritación ocular debido a que se
utiliza como tensioactivo Lauril Sulfato Sódico.

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