Está en la página 1de 8

EXTRACCIÓN DE ADN EN SANGRE

BLOOD DNA EXTRACTION


PRACTICA Nº 8
Rivero-Arrieta, V*; López-Torres, M & Palacio-Durango, C.

*riverplate2545@gmail.com

*Estudiantes de Biología Molecular.

Biología
Facultad de Ciencias Básicas
Presentado a: Msc. Álvaro Lorduy
Docente de Biología celular y Molecular.
Universidad de Córdoba.
Montería
2019

RESUMEN
La extracción de ADN es un proceso básico en biología molecular, y puede hacerse a partir
de cualquier ser vivo, sin embargo ciertos grupos de organismos y ciertas estructuras
celulares, son objeto de mayor interés para estas prácticas. La sangre es un fluido a través del
cual pasan la mayor cantidad de sustancias en el cuerpo y dado el hecho de que llega a cada
célula del organismo y su extracción es relativamente sencilla, los estudios que hay sobre ella
no son pocos. Durante esta práctica se aisló el material genético de una muestra de sangre
recolectada horas antes, a través de un kit comercial, Wizard Genomic DNA from whole
blood, gracias al cual se comprobará la eficiencia de este método.
PALABRAS CLAVE: ácidos nucleícos, sobrenadante, lisis celular
ABSTRACT
The DNA extraction is a basic process in molecular biology, and it can be done from any
living being, however certain groups of organisms and certain cellular structures are the most
used for these practices. Blood is a fluid through which the majority amount of substances
circulate in the body, besides the fact that it reaches each cell in the body and its extraction
is relatively simple, the studies on it are not few. During this practice the genetic material
was isolated from a blood sample collected hours earlier, through a commercial kit, Wizard
Genomic DNA from whole blood, thanks to which the efficiency of this method will be
checked.
KEY WORDS: nucleid acids, supernatant, cell lysis
INTRODUCCIÓN
El ADN fue aislado por primera vez por Friedrich Miescher, quien descubrió una sustancia
llamada "nucleina" en 1869. La extracción consiste en el aislamiento y purificación de
moléculas de ADN y se basa en las características fisicoquímicas de la molécula. El ADN
está constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice.
Los nucleótidos están integrados por un azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base
nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el
grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la
molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen mediante puentes de hidrógeno y mantienen
estable la estructura helicoidal (Velazquez,2012)
La sangre es la principal fuente de ADN para estudios relacionados con genotipos en
humanos. Se necesita un método rápido, eficiente y rentable para el aislamiento del ADN
genómico de la sangre completa para analizar una gran cantidad de muestras (Suguna, 2014).
El kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega) es muy simple y se puede utilizar para
el aislamiento de ADN de sangre. Brevemente, las células se lisan, luego las proteínas
celulares se eliminan mediante sal y el ARN se elimina con RNasa. Finalmente, el ADN se
precipita usando isopropanol. (Dhaliwal,2013)
Aquí, se aplica un protocolo para obtener la mayor cantidad de ADN de la sangre y de la
mejor calidad. El objetivo principal de esta práctica fue aislar la mayor de cantidad de ADN
óptimo para ser utilizado en técnicas de caracterización molecular.
METODOLOGÍA
Área de estudio
Esta práctica tuvo lugar en el laboratorio de biología molecular, de la universidad de
Córdoba, Montería, con coordenadas geográficas: 8°47’33” N 75°51’46” W

Temperatura Promedio: 23 °C a 35 °C
Humedad: 86%
Precipitación: 35 %

Fig.1. Ubicación del laboratorio de


biología molecular de la universidad de
Córdoba
Tomado…de:
https://www.google.com.co/maps/place/Centro+de+Investiga%ADcola+CINPIC/@8.8035119,75.
873538,14z/data=!4m8!1m!2m1!1scinpic+cerca+de+Universidad+De+C%C3%B3rdoba
Fase de Laboratorio
Previo a la realización de la práctica se tomó una muestra de 2 mL de sangre humana, y se
conservó en un vacutainer con EDTA como anticoagulante. Como primer paso, con la ayuda
de una micropipeta se agregaron 900µL de solución de lisis a un tubo Eppendorf de 1.5 mL
y se adicionó 300 µL de sangre, se mezcla suavemente una vez por inversión. Posteriormente
se incubó a temperatura ambiente por 3 minutos y luego se sometió a una centrifugación a
13000 rpm a 20ºC durante 1 minuto. El sobrenadante es descartado y el pellet obtenido se
homogenizó en el Vortex a 1500 rpm durante un minuto.
Para la lisis de núcleos y demás proteínas, se agregaron 300 µL de solución de lisis nuclear,
y se mezcló cuidadosamente una vez por inversión. Luego se adicionaron 100 µL de solución
precipitadora de proteínas, se mezcló hasta homogenizar en el Vortex durante 1 minuto a
1500 rpm, seguido a esto se centrifugó la solución a 13000 rpm a 20ºC por 4 minutos.
Por último para la precipitación del ADN, se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo con
300 µL de isopropanol, y se mezcló suavemente una vez por inversión. La solución se
centrifugó por 2 minutos a 13000 rpm a 20ºC, y se descartó el sobrenadante resultante, para
luego adicionar 300 µL de etanol al 70%, mezclando una vez por inversión. Se repitió la
centrifugación bajo las mismas condiciones, con el fin de purificar el ADN obtenido, se
descartó nuevamente el sobrenadante y se agregaron 100 µL de la solución de rehidratación
al tubo rotulado debidamente para su conservación a 4ºC.

Fig. 2 Muestra de Sangre Fig. 3. Solución de sangre más


con anticoagulante solución de lisis celular
Fig. 4. Homogenización de la Fig. 5. Resultado de la lisis de glóbulos
solución rojos y nuclear-sobrenadante obtenido

RESULTADOS
Luego del proceso anteriormente descrito, se obtuvo una fase blanquecina en el fondo del
tubo Eppendorf, la cual se identificó como el ADN presente en los 300 µL de sangre
tomada como muestra inicial.

Fig. 3. Resultado final de la extracción de ADN en


sangre

ANALISIS DE RESULTADOS
El primer método de extracción de ADN, denominado extracción salina, fue descrito por
Miller en 1998 ( (Miller, Dykes, & Polesky, 1998), el cual usaba la propiedad de los ácidos
nucleicos de reaccionar con el proceso de precipitación salina, un método relativamente
sencillo y poco costoso, sin embargo con el paso del tiempo se le han hecho pocas
modificaciones, y el único cambio notable que se ha hecho a los kits comerciales que se
fabrican hoy en día (todos se basan a grandes rasgos en el “salting out”) es el uso de la
microcentrifugadora.
Sin embargo, está comprobado que estos kits, para su uso con muestras de sangre
conservadas, resulta en una baja concentración de ADN y usualmente su calidad no es muy
buena (Tassi Mousquer, Maciel, Pompeu, Dalla, & Rossetti, 2018), lo cual explicaría la poca
cantidad de ADN obtenido durante esta investigación.
CONCLUSIONES
Luego de realizar el proceso de extracción de ADN de sangre con el kit PROMEGA
siguiendo los pasos propuestos en la guía de laboratorio, se obtuvieron las siguientes
conclusiones:
 El protocolo utilizado en este estudio para extraer ADN es eficaz y rápido
 El Kit de extracción Promega tiene todos los componentes necesarios para aislar
ADN de sangre
 No son necesarias técnicas complicadas para aislar el ADN de sangre
BIBLIOGRAFIA

Miller, S., Dykes, D., & Polesky, H. (1998). A simple salting out procedure for extracting
DNA from human nucleated cells. Nulceid Acids Research, 1215.
 Tassi Mousquer, G., Maciel, L., Pompeu, A. C., Dalla, E., & Rossetti, M. L. (2018).
Validation of a quick and low-cost DNA extraction protocol applicable to long-
stored blood samples. Analytical Biochemestry, 47-51.
 Velázquez, P., Aragón, C., & Romero, A. (2012). Extracción y purificación de ADN.
56 Retrieved from
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf
 Suguna, S. & Nandal, D.H. & Kamble, S. & Bharatha, Ambadasu & Kunkulol, R..
(2014). Genomic DNA isolation from human whole blood samples by non enzymatic
salting out method. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences.
6. 198-199.
 Dhaliwal, Anandika. (2013). DNA Extraction and Purification. Materials and
Methods. 3. 10.13070/mm.en.3.191.
ANEXOS
PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
 ¿CUÁL ES LA FUENTE DE ADN EN LA SANGRE?
La sangre es una fuente excelente de ADN. Éste está presente en los glóbulos blancos (o
leucocitos), pero no en los glóbulos rojos humanos. Los glóbulos rojos no tienen ADN, ya
que pierden sus núcleos (el compartimento en una célula que contiene el ADN) a medida que
maduran. Entonces el ADN de la sangre está en tus glóbulos blancos. Para llegar a esto, los
científicos primero hacen girar una pequeña muestra de sangre a alta velocidad para separar
las células del fluido sanguíneo. Luego, liberan el ADN de las células usando un detergente
y una enzima especial. Finalmente, agregan alcohol, lo que hace que su ADN aparezca como
una gota pegajosa en la mezcla.
 ¿POR QUÉ ES IMPORTANTE PURIFICAR EL ADN?
La purificación de ADN se considera de vital importancia para la mayoría de los métodos
involucrados en biología molecular, genómica, biotecnología e investigación clínica, ya que
puede ayudar a determinar el éxito o el fracaso de todas sus experimentaciones inmediatas y
posteriores. En pocas palabras, la purificación de ADN puede ayudarlo a: Extraer grandes
cantidades de su muestra de ADN genómico y / o plasmídico de una fuente limitada para
satisfacer los requisitos de su investigación, purificarla para reducir la cantidad de
contaminantes que pueden comprometer los resultados de su investigación. y acortar la vida
útil de sus preciosas muestras.

Cuando comienza con una muestra de ADN contaminada, existe una alta probabilidad de que
obtenga resultados erróneos en sus experimentos posteriores. Al purificar sus muestras de
ADN, reduce la probabilidad de que tales cosas sucedan y puede preservar mejor la calidad
y la pureza de sus ácidos nucleicos.

 ¿CUÁLES SON LOS MÉTODOS EXISTENTES PARA LA PURIFICACIÓN


DEL ADN, EXPLIQUE EN QUE CONSISTE CADA UNO DE ELLOS?
Métodos comunes de extracción de ADN
Los diferentes métodos de extracción dan como resultado diferentes rendimientos y pureza
del ADN. Algunos de los métodos de extracción se han evaluado sistemáticamente para
aplicaciones específicas, como muestras de suelo y sedimentos, microbioma humano y
muestras fecales
- Extracción orgánica
En este método convencional, ampliamente utilizado, las células se lisan y los restos celulares
generalmente se eliminan mediante centrifugación. Luego, las proteínas se desnaturalizan /
digieren usando una proteasa y se precipitan con solventes orgánicos como fenol, o una
mezcla 1: 1 de fenol y cloroformo. El precipitado de proteína se elimina después de la
separación por centrifugación. El ADN purificado generalmente se recupera por
precipitación usando etanol o isopropanol. En algún momento del proceso, los ARN se
degradan por incubación con RNasa. En presencia de cationes monovalentes como Na +, y a
-20 ° C, el etanol absoluto precipita eficientemente ácidos nucleicos poliméricos y deja
componentes de ácido nucleico monomérico de cadena corta, incluidos los ribonucleótidos
del tratamiento con RNasa en solución. Este método utiliza solventes orgánicos peligrosos,
es relativamente lento y el fenol residual o el cloroformo pueden afectar las aplicaciones
posteriores, como la PCR. Un ejemplo de un kit comercialmente disponible que se basa en
esta química es el Kit Easy-DNA® de Thermo Fisher.
- Tecnología basada en sílice
Las tecnologías basadas en sílice se emplean ampliamente en los kits actuales. El ADN se
adsorbe específicamente a las membranas / perlas / partículas de sílice en presencia de ciertas
sales y a un pH definido [10]. Los contaminantes celulares se eliminan mediante pasos de
lavado. El ADN se eluye en un tampón bajo en sal o tampón de elución. Las sales caotrópicas
se incluyen en los tampones del kit para ayudar en la desnaturalización de proteínas y la
extracción de ADN. Este método puede incorporarse en columnas giratorias y microchips,
es rentable, tiene un procedimiento más simple y rápido que la extracción orgánica, y es
adecuado para la automatización. Los kits basados en este método incluyen el kit de
extracción de ADN Genómico Purelink de Thermo Fisher y el kit de sangre y tejidos DNeasy
de QIAGEN.
- Separación magnética
La separación magnética se basa en el ADN que se une de forma reversible a una superficie
/ perla / partículas sólidas magnéticas que han sido recubiertas con un anticuerpo de unión al
ADN, o un grupo funcional que interactúa específicamente con el ADN [11]. Después de la
unión del ADN, las perlas se separan de otros componentes celulares contaminantes, se lavan
y el ADN purificado se eluye usando extracción con etanol. Este método es rápido, simple
de realizar y puede automatizarse. Sin embargo, puede ser más costoso que otras
metodologías. Los ejemplos de kits disponibles comercialmente incluyen el kit Agencourt
DNAdvance de Beckman Coulter) y el kit de extracción de ADN genómico Magnetic Beads
de Geneaid.
- Tecnología de intercambio aniónico
La extracción de ADN por cromatografía de intercambio aniónico se basa en la interacción
específica entre fosfatos con carga negativa del ácido nucleico y moléculas de superficie con
carga positiva en el sustrato. El ADN se une específicamente al sustrato en presencia de poca
sal, los contaminantes se eliminan mediante pasos de lavado usando un tampón de sal bajo o
medio, y el ADN purificado se eluye usando un tampón de alta sal .Esta tecnología se emplea
con mayor frecuencia en kits de aislamiento de plásmidos como los kits de purificación de
ADN de plásmido PureLink® HiPure de Thermo Fisher, kits de mini / midi de plásmido
QIAGEN y kits de PC Genomic-tip y NucleoBond® de Macherey Nagel.
- Otros
Otros métodos de extracción de ADN incluyen la salazón, los gradientes de densidad de
cloruro de cesio y la resina chelex 100 [17, 18]. Los métodos de aislamiento de ADN a
menudo se modifican y optimizan para diferentes tipos de células o fuentes de muestra. Por
ejemplo, el bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) y el tiocianato de guanidio (GITC) a
menudo se incluyen en los protocolos para la extracción de ADN de materiales vegetales, y
se tratan con más detalle en "Extracción de ADN de tejidos y células vegetales".

También podría gustarte