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I.

TITULO: Evaluación macroscópica y microscópica del semen fresco del toro


pocho
II. INTRODUCCION
Para considerar a un toro como apto reproductivo, asumiendo que es un animal
clínicamente sano, debe cumplir con tres requisitos básicos, como son: a) buena libido,
b) buen estado clínico reproductivo y c) buena calidad espermática. La evaluación del
semen es un punto importante para la certificación de la aptitud reproductiva en un toro.
El conocimiento de la fertilidad o de la capacidad fecundante de cada toro es uno de los
principales objetivos en la producción de semen bovino. Un requisito indispensable para
el desarrollo de la inseminación artificial es que el semen utilizado mantenga su
capacidad de fertilidad incluso después de haber sido crio preservado.
Muchos investigadores en el área de la reproducción animal están tratando de diseñar
el análisis seminal ideal, que valore adecuadamente y prediga la fertilidad de una
muestra seminal. El análisis de semen ideal seria aquel que de forma sencilla y eficaz
permitiera predecir la capacidad fecundante de un eyaculado concreto. Las cualidades
que deben tener los esperatozoides de un eyaculado fecundante son: motilidad
progresiva, morfología normal, metabolismo energético activo, capacidad para
desarrollar una motilidad hiperactivada, integridad estructural y funcionalidad de la
membrana, integridad de las enzimas asociadas con la fecundación, capacidad de
penetración y transferencia optima del material genético.
Los estudios actuales sobre contrastación seminal persiguen como objetivo final
identificar algún parámetro cinético, morfológico o bioquímico que indique el estado de
la celula espermática en un momento dado y que, al mismo tiempo, pueda ser
correlacionado con la fertilidad y calidad del eyaculado, además de asegurar que la
fertilidad de dicho semen sea optima.
En la actualidad los estudios andrológicos que se realizan en el país con el fin de conocer
el estatus reproductivo de los toros, se han basado principalmente en la evaluación de
muestras seminales, por medio de exámenes rutinarios de laboratorio, mediante la
observación de la muestra por microscopia óptica. De esta manera, se obtienen valores
que nos permiten clasificar al semen, siendo una valoración subjetiva; pero por otro lado
es el método mas simple, rápido y económico de evaluar la calidad seminal.
La evaluación del semen de toros se realiza a través de pruebas rutinarias de laboratorio,
pruebas macroscópicas y microscópicas, dentro de las cuales existen parámetro que son
evaluados de forma subjetiva y que varian según la destreza o experiencia del elevador.
Así, el error humano juega un papel definitivo en la selección, a través de la calidad
seminal, de los sementales, razón por la cual, se hace necesario unificar criterios
mediante el uso de equipos computarizados que permitan ser más objetivos en la
evaluación seminal, además de brindar mayor número de parámetros de evaluación,
tales como: velocidad del espermatozoide, tamaño de la cabeza y del flagelo, entre otros,
los cuales no se evalúan de forma rutinaria por lo complicado y laborioso de su
valoración, parametros que de forma directa tipifican un eyaculado, permitiendo conocer
la calidad del semen de forma más apropiada, objetiva y repetible.
III. OBJETIVOS
 Evaluar las características macroscópicas y microscópicas del semen fresco de
toro pocho.
 Evaluar la motilidad masal (MM) del toro pocho.

IV. MARCO TEORICO


Concentración
Existe una alta correlación significativa entre el número de espermatozoides
inseminados y la fertilidad del toro. La presencia de un mayor número de
espermatozoides, siempre y cuando sus características sean normales, incrementa la
posibilidad de fertilización. Este aspecto es crucial en el caso de los toros con baja
concentración espermática, o en los casos en que se utiliza semen descongelado, que
ha sido diluido y sometido a estrés durante el proceso de congelación-descongelación,
provocando un daño irreversible en un porcentaje elevado de espermatozoides. La
fertilidad de un toro usado en IA, entre otras razones, dependerá básicamente del
número de espermatozoides normales que se utilicen al inseminar. Existe una
variabilidad muy grande en la concentración de un eyaculado a otro, y de un toro a otro,
siendo importante conocer el número de espermatozoides por eyaculado, ya que de este
parámetro depende el número de hembras a inseminar. La concentración puede
calcularse por varios métodos a partir de la muestra de semen. Entre estos métodos,
destacan la espectrofotometría, la colorimetría, la citometría de flujo y el uso de cámara
de recuento celular, como las de Bürker, Neubauer o Thoma. La espectrofotometría,
técnica usada en nuestro laboratorio, es un método indirecto, que mide la luz
monocromática absorbida por las partículas en suspensión o los espermatozoides. Esta
densidad óptica de la muestra es comparada frente a una curva estándar patrón
previamente validada, y permite, así, conocer el número de espermatozoides. ( Hidalgo,
Tamargo Y Díez, 2012)
Motilidad
La motilidad es uno de los parámetros más importantes de la analítica seminal. Hasta
hace pocos años el estudio de la motilidad espermática se hacía exclusivamente
mediante métodos semicuantitativos. Estos métodos evalúan el porcentaje de
espermatozoides móviles, así como el tipo de movimiento que presentaba la media de
una población espermática. Estas medidas ofrecen una descripción general de la
motilidad espermática, pero la exactitud y precisión están limitadas por las condiciones
del sistema de medida y por la destreza del observador. A pesar de ello, la valoración
subjetiva de la motilidad hecha por personas experimentadas es de gran valor, debido a
que la información se presenta de forma inmediata, al tiempo que es un método
económico y de fácil ejecución. Los primeros intentos de objetivizar el movimiento
espermático se basaron en exposiciones fotográficas múltiples o video-micrografías.
Estos métodos son tediosos, largos y costosos, por lo que hoy en día no son de elección.
Sin embargo, la aparición de los sistemas informatizados de digitalización de imágenes
abrió un nuevo campo en el estudio de la motilidad de los espermatozoides. Estos
sistemas, denominados genéricamente CASA (Computer Assisted Motility Analysis), han
automatizado y simplificado el proceso. El análisis computerizado de la motilidad fue
propuesto por primera vez hace 25 años y es usado actualmente en centros de
investigación en andrología y centros de reproducción asistida. El CASA establece, de
una manera efectiva, medidas cuantitativas del movimiento individual de los
espermatozoides. Con este tipo de análisis se espera obtener medidas correctas de la
motilidad espermática que proporcionen información precisa acerca del estado funcional
del axonema y de las membranas espermáticas. Los sistemas automáticos de medición
de imágenes se basan en la captura sucesiva de espermatozoides en movimiento
provenientes de un microscopio. Estas imágenes se digitalizan identificando las células
espermáticas que contienen la primera imagen. Luego se procede al seguimiento de
estas células en imágenes sucesivas y al establecimiento de trayectorias definitivas. Las
trayectorias se procesan matemáticamente, obteniendo así resultados numéricos
precisos. Los parámetros determinados para cada espermatozoide son la velocidad de
movimiento sobre la base de varios descriptores, las trayectorias que realiza la cabeza
del espermatozoide y la frecuencia de los cambios de dirección que efectúa.
Actualmente, también existen en el mercado varios tipos de CASA que capturan el
movimiento espermático y lo analizan, tanto en tiempo real, como de manera diferida,
aportando un gran volumen de información. ( Hidalgo, Tamargo Y Díez, 2012)

Viabilidad
La rotura de la membrana plasmática está claramente asociada con la pérdida de
viabilidad celular, pero una membrana plasmática intacta no siempre indica que la célula
sea viable. El procesado del semen, incluida su criopreservación, es “estresante” para el
espermatozoide y afecta, primeramente, a sus membranas. Los daños que pueden
producirse en éstas pueden ser modificaciones en su organización, permeabilidad y
composición lipídica. Las membranas espermáticas que pueden verse afectadas por la
criopreservación incluyen la membrana plasmática, la membrana externa del acrosoma
y las membranas mitocondriales. En cualquier caso, la criopreservación, cuyo propósito
es garantizar la supervivencia del semen, causa daños irreversibles en la membrana
plasmática, lo que conlleva la muerte de un gran número de espermatozoides o, en los
supervivientes, cambios similares a los observados durante la capacitación espermática,
que provoca un acortamiento de su período de vida útil. La evaluación morfológica de la
integridad de la membrana plasmática se realiza usando la óptica de contraste de fases,
la óptica de contraste diferencial de interferencia o de Nomarski o las tinciones
supravitales, como el verde rápido/eosina o la eosina/azul de anilina, el tripán
azul/Giemsa o el amarillo de naftol/eritrosina. También ha sido valioso el examen a través
de la microscopía electrónica o de barrido, para determinar aspectos de la integridad
espermática. Actualmente, se están utilizando diversas tinciones fluorescentes, las
cuales presentan una mayor precisión en el estudio de las características de la
membrana plasmática. Así, se ha estado usando ampliamente el diacetato de
carboxifluoresceína y el ioduro de propidio, visualizándose con esta técnica los
espermatozoides viables de color verde, frente a los muertos que se observan de color
rojo anaranjado. ( Hidalgo, Tamargo Y Díez, 2012)
Estado del acrosoma
El acrosoma juega un papel fundamental en la fecundación y esta importancia hace que
convenga realizar una valoración específica del mismo. En un espermatozoide que tenga
el acrosoma en perfectas condiciones se pueden distinguir tres regiones claramente
diferenciadas en la cabeza: la zona acrosomal, con un borde apical, la zona
postacrosomal y el segmento ecuatorial entre ambas. Las muestras seminales con alta
proporción de acrosomas alterados o ausentes suelen tener una fertilidad baja. Para
determinar el estado del acrosoma se han usado desde hace mucho tiempo diferentes
tinciones. Entre éstas tenemos la tinción de eosina/verde rápido, Giemsa y la de
eosina/nigrosina, las dobles y triples tinciones, basadas en la combinación del azul tripán
con otros colorantes y tinciones comerciales como el Spermac®. Recientemente, se han
utilizado anticuerpos acrosomales específicos marcados con fluorescencia. En el caso
de los espermatozoides bovinos, su tamaño permite poder valorarlos mediante un
microscopio óptico de contraste de fases con un objetivo de gran aumento. ( Hidalgo,
Tamargo Y Díez, 2012)
Pruebas de funcionalidad espermática
La membrana espermática es una estructura dinámica que participa en el reconocimiento
y transporte de moléculas. Estas funciones permiten que el espermatozoide adapte su
metabolismo al medio circundante, proporcionando así un sistema molecular para el
reconocimiento del ovocito. El análisis de la integridad de la membrana constituye una
información importante en la evaluación de la fertilidad del macho. Además, esta
integridad no sólo es fundamental para el metabolismo espermático, sino que también lo
es para una adecuada capacitación y reacción acrosómica, y, por tanto, para la fertilidad
del macho. Un grupo de pruebas de funcionalidad espermática que han centrado gran
interés por su simplicidad y su valor predictivo son las de resistencia osmótica. Estas
pruebas se basan en la capacidad del espermatozoide para captar agua en un medio
hiposmótico y en que la hinchazón osmótica está asociada con el enrollamiento de la
cola del espermatozoide, que se desenrolla cuando la célula es devuelta a un medio
isosmótico. Dentro de las pruebas desarrolladas a partir de este fenómeno destaca el
test de endósmosis que consiste en situar los espermatozoides en presencia de un medio
de presión osmótica más baja que la fisiológica, lo que causa una entrada de agua en la
célula en un intento de equilibrar la presión osmótica interna con la del medio externo.
Para que esta respuesta se produzca, la membrana plasmática del espermatozoide debe
estar íntegra y con los mecanismos de intercambio de fluidos funcionando
correctamente. La entrada de agua provoca en estas células un hinchamiento y
enrollamiento del flagelo. Las células con la membrana física o funcionalmente dañada
no experimentan cambios en la forma del flagelo. Los valores obtenidos en esta prueba
se correlacionan con otros parámetros de calidad seminal, como la motilidad, la viabilidad
o la morfología. ( Hidalgo, Tamargo Y Díez, 2012)
Morfología
El análisis morfológico de los espermatozoides es uno de los principales componentes
de la evaluación de las características de una muestra seminal. La valoración de la
morfología del espermatozoide se basa en la relación directa que haya entre la
proporción de espermatozoides anormales en el eyaculado, el tipo de defecto
morfológico y su relación con la fertilidad in vivo de los toros. Atendiendo a una
clasificación estrictamente morfológica, las anomalías que puedan generarse se
clasifican en anomalías en la cabeza, en el tracto intermedio y en la cola. Según el órgano
donde pueden haberse generado diferenciamos las anomalías primarias y secundarias.
Esta evaluación de la morfología espermática puede ser utilizada para eliminar toros con
pobre calidad seminal (Fotografía 4) y refleja la funcionalidad de los testículos,
epidídimos y glándulas accesorias, por lo que siempre deben estar incluidas en las
pruebas de evaluación espermática. ( Hidalgo, Tamargo Y Díez, 2012)

Apariencia
El semen tiene una apariencia homogénea y un color entre blanco y gris claro, y
ocasional- mente amarilloso en pacientes con ictericia o que consumen ciertas vitaminas.
Un color rosado o rojo sugiere la presencia de sangre (hematospermia). (Toro, 2009)
Licuefacción
El semen se coagula casi inmediatamente después de su eyaculación, para
nuevamente li- cuarse 5 a 40 minutos después, por la acción del antígeno específico
de próstata. En algunos casos, la licuefacción no se completa hasta después de
una hora y se debe informar; sin embargo, su significado clínico es controvertido
[14, 15]. En los casos en que la licuefacción ocurra antes de que la muestra sea
evaluada en el laboratorio, se le debe preguntar al paciente si observó los coá- gulos
previos a la licuefacción. También es posible que el semen no se licue. Es normal
observar coágulos gelatinosos en las muestras y no se asocian con problemas de
infertilidad. La muestra se debe mezclar cuidadosamente en el recipiente antes de
tomar una parte para el análisis, con el fin de garantizar un recuento acertado. Si la
muestra no se licua, se le puede agregar un volumen igual de solución salina o de
un medio de cultivo y mezclar repetidamente con una pipeta. (Toro, 2009)

El volumen del semen está conformado por las secreciones de varias glándulas.
Los testículos y el epidídimo sólo contribuyen con el 5% del contenido
(principalmente espermatozoides y tes- tosterona), en tanto que las vesículas
seminales aportan entre el 46% y el 80% (enzimas responsa- bles de la coagulación
del semen y fructosa), la próstata entre el 13% y el 33% (varias sustancias, entre
ellas el antígeno específico de próstata que participa en la licuefacción del semen)
y las glándulas bulbouretrales y uretrales entre el 2% y el 5% (sustancias lubricantes
y ocasionalmente anticuerpos causantes de infertilidad).
El volumen se debe medir con un cilindro graduado de base cónica o con una pipeta
estéril de 5 mL o 10 mL y no se deben usar jeringas plásticas, ya que pueden alterar
la motilidad de los espermatozoides. El volumen normal del eyaculado debe ser
mayor o igual a 2 mL. Un volumen menor se asocia con una deficiencia en la secreción
de las vesículas seminales o con una eyaculación retrógrada, en tanto que volúmenes
mayores de 6 mL se asocian con varicocele o con períodos largos de abstinencia.
(Toro, 2009)

Viscosidad o consistencia
La viscosidad o consistencia del semen se puede evaluar aspirando la muestra en una
pipeta de 5 mL y permitiendo la caída libre de las gotas para observar la longitud del
filamento que se forma. Una muestra normal deja caer gotas pequeñas y bien definidas
o un filamento no mayor de 2 cm. Una viscosidad anormal puede dificultar la
determinación de ciertos parámetros, como son el recuento de espermatozoides y la
motilidad. Una viscosidad aumentada puede ser el resultado de una inflamación crónica
de la próstata, pero también se asocia con alto contenido de moco y con la presencia
de anticuerpos antiespermatozoides [16, 18, 19]. En estos casos, se recomienda diluir la
muestra con una solución, como se describió previamente. (Toro, 2009)

Vitalidad
El parámetro que evalúa la vita- lidad de los espermatozoides es útil para saber si los
espermatozoides in- móviles están vivos o muertos [10]. El porcentaje de
espermatozoides vivos se puede determinar por varios métodos, siendo la coloración
con eosina, el método más utilizado. Se mezcla una gota (10 L a 15 L) del semen con
una gota del colorante con eosina al 0,5% en una lámina portaobjeto y se cubre con una
laminilla, se deja reposar la muestra 30 segundos y se procede a contar 200
espermatozoides (coloreados y no coloreados), con una magnificación de 400X [16]. Los
espermatozoides vivos tienen su mem- brana intacta que impide la penetración del co-
lorante, en tanto que los muertos adquieren la coloración, como se observa en la figura
6. El resultado se expresa en porcentaje. Es importante comparar el resultado de la
vitalidad con el de los espermatozoides inmó- viles, ya que el porcentaje de
espermatozoides muertos no debe ser mayor que el de los inmó- viles o sólo
mínimamente (dentro de los errores permitidos en los recuentos). (Toro, 2009)

Recuento
Para el recuento de espermatozoides se puede utilizar la cámara de Neubauer. Se
cuentan en el cuadrante central que se utiliza para el recuento de los glóbulos rojos. Con
base en lo estimado en la observación inicial de la muestra, se diluye el semen, se llenan
ambos lados de la cámara de Neubauer con 10 L de la dilución y se procede a
contar con una magnificación de 200X a 400X. Para las muestras que contienen menos
de 10 espermatozoides en el cuadrado grande central, se deben contar en todo el
cuadrado (que contiene 25 cuadrados pequeños); para las muestras que contienen entre
10 a 40 espermatozoides en el cuadrado grande central, se pueden contar 10 cuadrados
pequeños, de los 25; y para las muestras que contienen más de 40 espermatozoides
en el cuadrado grande central, se pueden contar sólo 5 cuadrados pequeños. Si hay
espermatozoides sobre la línea que divide a dos cuadrados adyacentes, sólo se cuentan
los que estén en el lado superior y en el lado izquierdo, descartando los que estén en el
lado inferior y en el lado derecho. Los resultados de ambos lados de la cámara se
promedian y el valor se divide por el factor de conversión; el resultado final corresponde
al número (en millones) de espermatozoides por mL de eyaculado o concentración de
los espermatozoides por Ml. (Toro, 2009)

Aglutinación
La aglutinación de los espermatozoides puede ocurrir cabeza con cabeza,
segmento inter- medio con segmento intermedio, cola con cola o puede ser
mixta, por ejemplo cabeza con cola. La aglutinación es sugestiva de
presencia de anticuerpos antiespermatozoides [16, 17] y se debe evaluar al
momento de determinar la motilidad de los espermatozoides. Se puede
informar semicuantitativamente en escala de cruces.
La primera evaluación a realizar es la MACROSCÓPICA, que consta de los
siguientes pasos: Volumen: se observa directamente sobre el tubo graduado,
teniendo en cuenta que un toro mayor de 2 años debe tener un eyaculado de no
menos de 4ml. El volumen puede variar entre 2 y 12ml. Color: se consideran
normales los colores que van del blanco al amarillento, siendo patológicos, los
colores rosado, amarronado y verdoso. Densidad: la densidad del semen varía
desde un semen acuoso, lechoso, lechosocremoso, hasta un cremoso, estando
directamente relacionada con la concentración.
M.M.Ma (Motilidad en Masa Macroscópica): se evalúa observando el tubo de
recolección y detectando la presencia o no de movimiento masal o de remolinos.
Se considera como positiva o negativa. Ph: se evalúa extrayendo una gota de
semen del tubo y colocándola sobre una tira indicadora de pH. Se considera un pH
normal, entre 6.2 y 6.8. Nota: no introducir la tira dentro del tubo para no alterar el
semen con el reactivo de la misma. Cuerpos Extraños: se evalúa observando el
fondo del tubo para detectar la presencia de algún cuerpo extraño, se considera
como positivo o negativo. Schalm Test: se realiza para detectar la presencia de
leucocitos, pero sólo en casos que se sospeche la presencia de los mismos. No se
hace de rutina en cada evaluación.

Según Muiño et al. (2007), la motilidad espermática normalmente se valora de


forma subjetiva, mediante la observación de una muestra de semen a través de un
microscopio de contraste de fase, coadyuvado de una platina calentadora a 37ºC.
Este es el método más simple, rápido y barato de evaluar la motilidad, pero tiene el
inconveniente de ser altamente subjetivo.
El método estándar para evaluar la fertilidad de machos reproductores, aparte de
la evaluación directa de vacas gestantes en un rebaño, es el examen del semen,
mediante su uso podemos predecir el potencial reproductivo de los sementales,
dicha evaluación se realiza por medio de la observación de características
macroscópicas y microscópicas (Asprón, 2004).
Características Macroscópicas Las características macroscópicas a evaluar en
semen de bovinos son: volumen, color, olor, aspecto, densidad macroscópica.
Volumen: el volumen del eyaculado se expresa en mililitros (mL), y su lectura se
hace por medio de un tubo recolector graduado. Normalmente dicho valor, para el
eyaculado de toros, es de aproximadamente 2 mL en animales jóvenes y en
animales adultos ≥ a 4 mL, llegando hasta 12 mL.
Color: esta característica se evalúa por medio de la visualización en el
laboratorio. El color del eyaculado depende del contenido de riboflavina, siendo
normalmente desde blanquecino marfil hasta amarillento. Una coloración rojiza,
indica la mezcla con sangre fresca; si el color es pardo, indica la presencia de
sangre más vieja (hemolizada), denominándose ambos tipos como hemospermia.
Una coloración gris indica contaminación. Los eyaculados sin espermatozoides
tienen una coloración amarillo-verdosa y son de apariencia acuosa. El pus en el
eyaculado se reconoce frecuentemente por la presencia de flóculos,
denominándose piospermia.
Olor: las muestras de semen recolectadas higiénicamente, de toros sanos y
fértiles, tienen un débil olor sui géneris. Aspecto: por aspecto del semen se entiende
su consistencia normal y color. El aspecto depende del número de
espermatozoides/mm3 , de los componentes de secreción de las glándulas
accesorias y de eventuales agregados como: sangre, pus, células epiteliales y
contaminación externa.
Densidad macroscópica: para la evaluación de la densidad macroscópica se han
establecido criterios basados en intervalos de concentración espermática,
dependiendo de la opacidad de las muestras, lo que indica mayor o menor
concentración espermática. Esta evaluación debe ser verificada en la evaluación
microscópica, en la cual se calcula con gran precisión la concentración espermática,
mediante el uso de la cámara de 7 Neubauer o cualquier método de cuantificación
de concentración, como el espectrofotómetro. En el caso de los bovinos, la densidad
macroscópica se clasifica en:
‫ ە‬Azoospérmico: ausencia de espermatozoides en el eyaculado.
‫ ە‬Oligozoospérmico: ≤ 200 millones espermatozoides/mL. ‫ ە‬Ralo: 200–500
millones espermatozoides/mL.
‫ ە‬Semi-denso: 500–800 millones espermatozoides/mL. ‫ ە‬Denso: 800–1.500
millones espermatozoides/mL.
‫ ە‬Densísimo: ≥ 1.500 millones espermatozoides/mL.
Características Microscópicas
Las características microscópicas a evaluar en el semen de bovinos son:
motilidad masal, motilidad individual, vitalidad, morfología, concentración
espermática.
Motilidad masal: por movimiento de masa se entiende, el movimiento en onda
de todos los espermatozoides, observado en los eyaculados densos. Para su
evaluación se toma una gota del semen a examinar (gota de semen íntegro) con
una pipeta, se coloca la gota sobre un portaobjeto a 37°C y se observa en campo
claro (aumento 10X), sin colocar el cubreobjeto.
De acuerdo a Rosemberger (1981), el grado del movimiento en masa o motilidad
masal (MM) se describe según la siguiente escala:
++++: Actividad cinética muy buena, remolinos intensos con ondas espermáticas
apreciables.
+++: Actividad cinética buena, remolinos apreciables aunque menos intensos.
++: Actividad cinética regular, pocos remolinos y con menor frecuencia que la
anterior.
+: Actividad cinética deficiente, el semen no forma remolinos sino eventualmente
y sin ninguna intensidad.
- : Actividad cinética ausente.
Motilidad individual:
la motilidad individual de una muestra de semen se expresa como el porcentaje
de células móviles bajo un campo microscópico. Esta prueba de la motilidad debe
hacerse con la ayuda de un microscopio óptico (aumento 100X) a una temperatura
de 37°C. El semen no diluido, está demasiado concentrado como para hacer la
determinación exacta de la motilidad individual, por lo cual se diluye con una
solución isotónica de NaCl- al 0,9%, para poder observar individualmente a los
espermatozoides. En la evaluación de la motilidad individual de los
espermatozoides se estima el porcentaje de células espermáticas con movimiento
progresivo lineal (MPL), movimiento in situ y espermatozoides inmóviles. Para ello,
se toma con una pipeta (esterilizada con aire caliente), 1 gota (de 10 µL) del semen
diluido, se coloca sobre un portaobjeto a temperatura de 37ºC y se 9 cubre con un
cubreobjeto. Si se observa con el microscopio de contraste de fase a 100X, es
recomendable realizar la estimación de la siguiente manera: al principio se evalúa
si más de la mitad de los espermatozoides que hay en el campo poseen movimiento
o no. Luego el examinador se debe concentrar en estimar el porcentaje de
espermatozoides con movimiento lineal progresivo (X). Después se debe estimar el
porcentaje de células con movimiento in situ (Y). En este sentido, el porcentaje de
espermatozoides móviles se obtiene sumando X+Y.
Según la Sociedad de Teriogenología de Estados Unidos de Norteamérica
(1992), la clasificación de la motilidad espermática masal y la individual puede
correlacionarse, tomando como valores mínimos aceptables para monta natural,
una muestra que posea una motilidad individual de 30% y una motilidad masal
regular (+); mientras que para ser utilizado con fines de criopreservación, la muestra
de semen deberá tener una motilidad masal regular (+) con 50% de motilidad
individual.
Vitalidad:
esta característica mide el número de espermatozoides vivos y se expresa como
el porcentaje de células muertas. Para medir la vitalidad de una muestra de semen,
se utilizan colorantes vitales, tales como el colorante eosina-nigrosina, con el cual
los espermatozoides muertos serán teñidos de color rojo o en rosa, mientras que
los vivos quedan sin teñir, esto debido a que el colorante, cuando existe daño a
nivel de la membrana celular, como en la célula espermática muerta, es capaz de
atravesarla y colorearla; aquellos espermatozoides que se observan en la lámina
sin teñirse, son aquellos espermatozoides que poseen una membrana celular
intacta y no permeable al paso del colorante (Pérez y Pérez, 1985).
Morfología:
la morfología está estrechamente relacionada con la motilidad espermática en
forma más directa, y se mide en porcentaje de espermatozoides con defectos de
morfología. Se necesita, al menos, un buen porcentaje de espermatozoides móviles
y de ellos se espera que entre 70 a 80% posea morfología normal. Esto quiere decir,
que como máximo se acepta 20 a 30% de atipias.
Palacios (2005), señala que la morfología espermática es un factor determinante
en la capacidad de fertilización del semen, ya que existe una correlación entre
defectos espermáticos e infertilidad. Los espermatozoides son traslucidos y
virtualmente invisibles al microscopio de luz directa, por lo que se requiere del uso
de colorantes que provean de un fondo oscuro para visualizarlos. La coloración vital,
con eosina, azul de anilina, o 11 eosina−nigrosina, es la más comúnmente usada
para la evaluación morfológica de semen.
La morfología se evalúa de la siguiente manera: se coloca una gota de
aproximadamente 20 µL de semen diluido sobre un portaobjetos limpio y
desengrasado y se coloca una gota de colorante, se realiza el frotis en forma firme
y pareja. Luego de esperar, por lo menos 10 min, para el secado del frotis, se coloca
en el microscopio y se procede a contar los espermatozoides. Se cuentan 200
espermatozoides por muestra para determinar el porcentaje de espermatozoides
normales, el porcentaje de espermatozoides anómalos y de éstos cuáles poseen
atípias de tipo primarias y secundarias. Con el colorante de Giemsa, los
espermatozoides se visualizan de color violáceo y en el caso de tener presente su
acrosoma, se puede apreciar de color violáceo más intenso. De estar ausente el
acrosoma, se observa la cabeza del espermatozoide de un color homogéneo o con
el tercio superior más claro.
Las malformaciones espermáticas, se pueden clasificar siguiendo diferentes
criterios.
1) Uno de esos criterios clasifica las anormalidades encontradas en el semen en
atípias primarias y secundarias. Esta es la clasificación más usada en la bibliografía,
pero no por ello la más exacta. Las malformaciones primarias, por definición, son
aquellas que se originan dentro del testículo durante la espermatogénesis y las
malformaciones secundarias, son aquellas 12 que se originan a través de su paso
por el epidídimo. Cabe destacar que, por definición, se denota el origen y no la
severidad del defecto. Así tenemos como atipias primarias: microcefalias,
macrocefalias, cabeza piriforme, cabeza estrecha, defectos de la pieza media, gota
citoplasmática proximal, inserción abaxial de la pieza intermedia, flexión de la pieza
media, enrollamiento de la pieza media y la cola, cabeza doble, pieza media doble.
Entre las atipias secundarias se tiene: gota citoplasmática distal, enrollamiento final
de la cola, flexión de la cola, sin acrosoma, cabezas desprendidas, cola fracturada
(Hafez y Hafez, 2000).
2) Un segundo criterio las clasifica en atipias mayores y menores. Esta
clasificación la propuso Bloom en 1977, llamando malformaciones mayores a
aquellas que estaban asociadas con infertilidad, y malformaciones menores a
aquellas que, al momento de crear el método de clasificación, no se encontraban
relacionadas con la fertilidad en forma directa.
3) Y un tercer criterio que las clasifica como atípias compensables y no
compensables. Saacke et al. (1994) propusieron clasificar los defectos como
compensables, a aquellos en los que el espermatozoide no llega a la vecindad del
ovocito y no evita que otro espermatozoide realice la fertilización; por lo tanto, si se
aumenta la concentración de la dosis seminal, se podría llegar a compensar este
tipo de malformación, tal es el caso de espermatozoides con problemas en el
sistema de locomoción. Por el contrario, un defecto no compensable es aquel en el
cual el espermatozoide 13 está perfectamente capacitado para llegar hasta el
ovocito, realiza el bloqueo de la polispermia pero es incapaz de continuar el proceso
de fertilización. Dicho defecto no se puede compensar aumentando la
concentración de la dosis inseminante, ya que si una muestra posee 20% de
espermatozoides con este defecto, no habrá ninguna diferencia si hay 100, 1000 ó
10000 en el oviducto.
Se debe tomar en consideración que hasta un pequeña elevación de la
temperatura escrotal ocasiona daños en la morfología espermática, como fue
evaluado por Vogler et al. (1993), quienes realizaron experimentos sometiendo
muestras de semen provenientes de toros Holstein, a diferentes temperaturas,
concluyendo que las anomalías más comunes en los espermatozoides fueron:
problemas de cola, cabezas piriformes, problemas de acrosoma y efecto daga.
En la actualidad, quizás lo más adecuado sea identificar cada una de las
anormalidades por su ubicación dentro de la estructura del espermatozoide y la
relación de cada una de ellas con la fertilidad, para lo cual aún se requieren muchos
estudios. En general, el número máximo aceptable de anormalidades de cabeza se
encuentra entre 15 y 20%. Con respecto a las anormalidades de acrosoma y cola
se puede aceptar hasta 25%. Fuese cual fuese el sistema de clasificación, se debe
esperar un mínimo de 70% de espermatozoides normales en el eyaculado para
poder aceptar un toro como apto reproductivamente, en cuanto al semen.
Concentración espermática:
la concentración de los espermatozoides se expresa como el número de
espermatozoides/mL de semen. La determinación de la concentración espermática
se lleva a cabo mediante métodos semejantes al recuento de glóbulos rojos
realizado en hematología. El conteo directo de células, a través del hemocitómetro
o cámara de Neubauer fue diseñado para contar eritrocitos. Esta cámara de
Neubauer consiste de una laminilla especial que tiene 2 cámaras de conteo. Las
cámaras de conteo poseen 0,1 mm de profundidad y un área graduada en el fondo
de la cámara de 1 mm2 . Este cuadro se divide en 25 cuadros más pequeños. Al
conocerse la profundidad y el área se puede determinar el número de
espermatozoides en un volumen dado.
El diluyente utilizado debe inmovilizar a los espermatozoides para que se pueda
llevar a cabo el conteo. Normalmente se utiliza NaCl- al 3% (solución hipertónica),
lo cual hace que la célula deje de ser viable. La dilución de la muestra de semen,
para determinar la concentración espermática en el caso del bovino es de 1:200
(Bearden et al., 1982). Esto quiere decir que se diluye 1 volumen de semen en 199
volúmenes iguales de NaCl- al 3%. Una vez diluido el semen e inmovilizados los
espermatozoides, se coloca el semen diluido en la cámara de Neubauer. Para
calcular la concentración de espermatozoides se utiliza la siguiente ecuación:
(Espermatozoides/mL)= Número de espermatozoides contados en 5 cuadrados
(4 esquinas + el centro) x 5 x dilución (1:200) x 10 x 1000. 15
Según Graham (1996), las cualidades que deben tener los espermatozoides de
un eyaculado fecundante son: motilidad progresiva, morfología normal,
metabolismo energético activo, capacidad para desarrollar motilidad hiperactivada,
integridad estructural y funcional de la membrana, integridad de las enzimas
asociadas a la fecundación, capacidad de penetración y transferencia óptima del
material genético. Para todos estos parámetros existe gran variación en los valores
que la muestra seminal presenta, por tal motivo se han establecido los valores o
estándares mínimos para clasificar una muestra de semen bovino (Hafez y Hafez,
2000).
Además de estas técnicas antes descritas, también se encuentra la evaluación
de semen in vitro, mediante esta técnica se puede evaluar la capacidad fecundante
tanto de semen fresco como de semen descongelado, aunque son pruebas de alta
complejidad, ya que existen diferentes atributos necesarios para que un
espermatozoide pueda fecundar un óvulo (Graham y Mocé, 2005).

V. MATERIALES Y METODOS

4.1MATERIALES:
 Tubo colector de semen.
 Laminas porta objeto.
 Micro pipetas.
 Papel especial.

4.2 REACTIVOS
 Reactivos (agua desionisada, cloruro de sodio y formaldehido)
 Agua destilada.

4.3 MATERIAL BIOLOGICO


 Toro pocho(semen).

4.4 EQUIPO
 Espectofetrometo.
 Microscopio.

5.METODOS
5.1 EVALUACION MACROSCOPICA
 VOLUMEN: 9.5mL.
 COLOR: Blanco cremoso.
 ASPECTOS: Presencia de una pequeña pajita falto más higiene.
 PH:
6.2 EVALUACION MICROSCOPICA

MOTILIDAD
motilidad masal lo realizamos con semen fresco recién recolectado una gota
al porta objeto previo calentado en la platina esta platina mantiene la muestra
a 37 º c en 40 x y al observar vimos las vigorosas olas u ondas la cual fueron
bastante fuertes presentando una motilidad de 90% las olas u ondas lo
clasificamos de una motilidad 4 es mejor para poder congelar de 100
espermatozoides 30 tiene q tener un movimiento lineal progresivo.

CONCENTRACIÓN

se utilizó para la concentración el equipo Espectofetrometo o Densímetro


lavar la cubeta agua destilada y limpiar con un papel especial utilizamos el
reactivo la cual tiene tres componentes (de agua desionisada , cloruro de
sodio y formaldehido ) recolectar con una micro pipeta de la medida exacta
43.3 micro litros secar despacio la cubeta y este bien seco colocamos el
reactivo dos veces las ranuras va a la zona de lectura tapar y calibrar
apretamos 0 y me pide adiciona 43.2 adiciono semen coloco la muestra de
semen y homogenizamos y uniformizar y colocamos al fotómetro y
tendremos los resultados de concentración del toro pocho 1870 es muy
bueno el toro y una buena capacidad de fertilización en billones es 1.85de
espermatozoides en mL la cual nos da el espectrofotómetro de
espermatozoide.

VITALIDAD
No lo realizamos por los reactivos

VI. RESULTADOS Y DISCUCIONES


Figura: 1 características macroscópicas del semen
Figura :2,3 evaluación microscópica de la concentración
Figura 4,5,6 evaluación microscópica de la motilidad masal

ez
VII.RESULTADOS Y DISCUSIONES
Barth (2008), reporta que, el stress prolongado provoca cuadros de degeneración
testicular, que pueden variar de ligera hasta aplasia completa del epitelio seminífero
según la intensidad y tiempo de acción del estímulo, mientras que, Spiptzar (2000),
afirma que por stress se provoca un aumento de espermatozoides con anormalidades
de cabeza piriforme, elongados y estrecha y en casos severos podría provocar una
asospermia.
En el estado de Brasil se sometieron toros al método de electroeyaculacion obteniendo
4.2mL y una motilidad individual de 66±14.2% (Ramírez y col, 2016). En el caso del toro
pocho por colección de vagina artificial colectamos 9.2 ml del toro Pocho y en el toro Ozil
5ml
Cabrera y Pantoja (2012), reportan las características seminales de toros del banco de
semen (Lima), con una motilidad promedio de 85.5%±1.5, volumen (ml) promedio
4.5±1.0, con una concentración de (x10°6) 800±103 y con un % de espermatozoides de
80.4. En el caso del toro pocho quien fue evaluado, encontramos una concentración de
1.85 billones/ml .

VIII. REVISION BIBLIOGRAFICA

Asprón, M. 2004. Manejo reproductivo del ganado bovino. IVISO. Pp. 19- 22.
Pérez, F. and Pérez, F. 1985. Dilución del esperma. Reproducción Animal,
Inseminación Artificial y Transplante de Embriones. Editorial CientíficoMédica,
Barcelona, España. Capítulo 6: 215-249.

Barth, A. (2008). The effect of nutrition on sexual development of bullss;


theriogenelogy 70 485-494
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Cabrera, P y Pantoja, C. (2012). Viabilidad espermática e integridad del
acrosoma en semen congelado de toros nacionales. Rev. Inv. Vet. Peru 2012;
23 (2). Lima
Muíño, R., Fernández, M. y Peña, A.I. 2006. Parámetros cinéticos de
eyaculados bovinos de toros de raza Frisona y Rubia Gallega. ITEA:
Información Técnica Económica Agraria. 102: 55-66.
Palacios, C.J. 2005. Técnicas para la evaluación de la capacidad fecundante
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Hafez, E.S.E and Hafez, B. 2000. Espermatozoides y Plasma Seminal. En:
Reproducción e Inseminación Artificial en Animales. 7ª edición. Interamericana
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Graham, J. 1996. Cryopreservation in stallion spermatozoa. The Veterinary
Clinics of North America. 12: 131-147.
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Hidalgo, C., Tamargo, C. y Diez, C. 2012. Dilución del semen Bovino,
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informativo del SERIDA - n.º 2

Ramirez, C; Rugeles, C; Gomez, V, Miranda, T. (2016). Estadio de madurez


sexual en toros de la raza nelore. Rev. Med. Vet N° 31: 11-22. Bogota Colombia
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