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Viabilidad
La rotura de la membrana plasmática está claramente asociada con la pérdida de
viabilidad celular, pero una membrana plasmática intacta no siempre indica que la célula
sea viable. El procesado del semen, incluida su criopreservación, es “estresante” para el
espermatozoide y afecta, primeramente, a sus membranas. Los daños que pueden
producirse en éstas pueden ser modificaciones en su organización, permeabilidad y
composición lipídica. Las membranas espermáticas que pueden verse afectadas por la
criopreservación incluyen la membrana plasmática, la membrana externa del acrosoma
y las membranas mitocondriales. En cualquier caso, la criopreservación, cuyo propósito
es garantizar la supervivencia del semen, causa daños irreversibles en la membrana
plasmática, lo que conlleva la muerte de un gran número de espermatozoides o, en los
supervivientes, cambios similares a los observados durante la capacitación espermática,
que provoca un acortamiento de su período de vida útil. La evaluación morfológica de la
integridad de la membrana plasmática se realiza usando la óptica de contraste de fases,
la óptica de contraste diferencial de interferencia o de Nomarski o las tinciones
supravitales, como el verde rápido/eosina o la eosina/azul de anilina, el tripán
azul/Giemsa o el amarillo de naftol/eritrosina. También ha sido valioso el examen a través
de la microscopía electrónica o de barrido, para determinar aspectos de la integridad
espermática. Actualmente, se están utilizando diversas tinciones fluorescentes, las
cuales presentan una mayor precisión en el estudio de las características de la
membrana plasmática. Así, se ha estado usando ampliamente el diacetato de
carboxifluoresceína y el ioduro de propidio, visualizándose con esta técnica los
espermatozoides viables de color verde, frente a los muertos que se observan de color
rojo anaranjado. ( Hidalgo, Tamargo Y Díez, 2012)
Estado del acrosoma
El acrosoma juega un papel fundamental en la fecundación y esta importancia hace que
convenga realizar una valoración específica del mismo. En un espermatozoide que tenga
el acrosoma en perfectas condiciones se pueden distinguir tres regiones claramente
diferenciadas en la cabeza: la zona acrosomal, con un borde apical, la zona
postacrosomal y el segmento ecuatorial entre ambas. Las muestras seminales con alta
proporción de acrosomas alterados o ausentes suelen tener una fertilidad baja. Para
determinar el estado del acrosoma se han usado desde hace mucho tiempo diferentes
tinciones. Entre éstas tenemos la tinción de eosina/verde rápido, Giemsa y la de
eosina/nigrosina, las dobles y triples tinciones, basadas en la combinación del azul tripán
con otros colorantes y tinciones comerciales como el Spermac®. Recientemente, se han
utilizado anticuerpos acrosomales específicos marcados con fluorescencia. En el caso
de los espermatozoides bovinos, su tamaño permite poder valorarlos mediante un
microscopio óptico de contraste de fases con un objetivo de gran aumento. ( Hidalgo,
Tamargo Y Díez, 2012)
Pruebas de funcionalidad espermática
La membrana espermática es una estructura dinámica que participa en el reconocimiento
y transporte de moléculas. Estas funciones permiten que el espermatozoide adapte su
metabolismo al medio circundante, proporcionando así un sistema molecular para el
reconocimiento del ovocito. El análisis de la integridad de la membrana constituye una
información importante en la evaluación de la fertilidad del macho. Además, esta
integridad no sólo es fundamental para el metabolismo espermático, sino que también lo
es para una adecuada capacitación y reacción acrosómica, y, por tanto, para la fertilidad
del macho. Un grupo de pruebas de funcionalidad espermática que han centrado gran
interés por su simplicidad y su valor predictivo son las de resistencia osmótica. Estas
pruebas se basan en la capacidad del espermatozoide para captar agua en un medio
hiposmótico y en que la hinchazón osmótica está asociada con el enrollamiento de la
cola del espermatozoide, que se desenrolla cuando la célula es devuelta a un medio
isosmótico. Dentro de las pruebas desarrolladas a partir de este fenómeno destaca el
test de endósmosis que consiste en situar los espermatozoides en presencia de un medio
de presión osmótica más baja que la fisiológica, lo que causa una entrada de agua en la
célula en un intento de equilibrar la presión osmótica interna con la del medio externo.
Para que esta respuesta se produzca, la membrana plasmática del espermatozoide debe
estar íntegra y con los mecanismos de intercambio de fluidos funcionando
correctamente. La entrada de agua provoca en estas células un hinchamiento y
enrollamiento del flagelo. Las células con la membrana física o funcionalmente dañada
no experimentan cambios en la forma del flagelo. Los valores obtenidos en esta prueba
se correlacionan con otros parámetros de calidad seminal, como la motilidad, la viabilidad
o la morfología. ( Hidalgo, Tamargo Y Díez, 2012)
Morfología
El análisis morfológico de los espermatozoides es uno de los principales componentes
de la evaluación de las características de una muestra seminal. La valoración de la
morfología del espermatozoide se basa en la relación directa que haya entre la
proporción de espermatozoides anormales en el eyaculado, el tipo de defecto
morfológico y su relación con la fertilidad in vivo de los toros. Atendiendo a una
clasificación estrictamente morfológica, las anomalías que puedan generarse se
clasifican en anomalías en la cabeza, en el tracto intermedio y en la cola. Según el órgano
donde pueden haberse generado diferenciamos las anomalías primarias y secundarias.
Esta evaluación de la morfología espermática puede ser utilizada para eliminar toros con
pobre calidad seminal (Fotografía 4) y refleja la funcionalidad de los testículos,
epidídimos y glándulas accesorias, por lo que siempre deben estar incluidas en las
pruebas de evaluación espermática. ( Hidalgo, Tamargo Y Díez, 2012)
Apariencia
El semen tiene una apariencia homogénea y un color entre blanco y gris claro, y
ocasional- mente amarilloso en pacientes con ictericia o que consumen ciertas vitaminas.
Un color rosado o rojo sugiere la presencia de sangre (hematospermia). (Toro, 2009)
Licuefacción
El semen se coagula casi inmediatamente después de su eyaculación, para
nuevamente li- cuarse 5 a 40 minutos después, por la acción del antígeno específico
de próstata. En algunos casos, la licuefacción no se completa hasta después de
una hora y se debe informar; sin embargo, su significado clínico es controvertido
[14, 15]. En los casos en que la licuefacción ocurra antes de que la muestra sea
evaluada en el laboratorio, se le debe preguntar al paciente si observó los coá- gulos
previos a la licuefacción. También es posible que el semen no se licue. Es normal
observar coágulos gelatinosos en las muestras y no se asocian con problemas de
infertilidad. La muestra se debe mezclar cuidadosamente en el recipiente antes de
tomar una parte para el análisis, con el fin de garantizar un recuento acertado. Si la
muestra no se licua, se le puede agregar un volumen igual de solución salina o de
un medio de cultivo y mezclar repetidamente con una pipeta. (Toro, 2009)
El volumen del semen está conformado por las secreciones de varias glándulas.
Los testículos y el epidídimo sólo contribuyen con el 5% del contenido
(principalmente espermatozoides y tes- tosterona), en tanto que las vesículas
seminales aportan entre el 46% y el 80% (enzimas responsa- bles de la coagulación
del semen y fructosa), la próstata entre el 13% y el 33% (varias sustancias, entre
ellas el antígeno específico de próstata que participa en la licuefacción del semen)
y las glándulas bulbouretrales y uretrales entre el 2% y el 5% (sustancias lubricantes
y ocasionalmente anticuerpos causantes de infertilidad).
El volumen se debe medir con un cilindro graduado de base cónica o con una pipeta
estéril de 5 mL o 10 mL y no se deben usar jeringas plásticas, ya que pueden alterar
la motilidad de los espermatozoides. El volumen normal del eyaculado debe ser
mayor o igual a 2 mL. Un volumen menor se asocia con una deficiencia en la secreción
de las vesículas seminales o con una eyaculación retrógrada, en tanto que volúmenes
mayores de 6 mL se asocian con varicocele o con períodos largos de abstinencia.
(Toro, 2009)
Viscosidad o consistencia
La viscosidad o consistencia del semen se puede evaluar aspirando la muestra en una
pipeta de 5 mL y permitiendo la caída libre de las gotas para observar la longitud del
filamento que se forma. Una muestra normal deja caer gotas pequeñas y bien definidas
o un filamento no mayor de 2 cm. Una viscosidad anormal puede dificultar la
determinación de ciertos parámetros, como son el recuento de espermatozoides y la
motilidad. Una viscosidad aumentada puede ser el resultado de una inflamación crónica
de la próstata, pero también se asocia con alto contenido de moco y con la presencia
de anticuerpos antiespermatozoides [16, 18, 19]. En estos casos, se recomienda diluir la
muestra con una solución, como se describió previamente. (Toro, 2009)
Vitalidad
El parámetro que evalúa la vita- lidad de los espermatozoides es útil para saber si los
espermatozoides in- móviles están vivos o muertos [10]. El porcentaje de
espermatozoides vivos se puede determinar por varios métodos, siendo la coloración
con eosina, el método más utilizado. Se mezcla una gota (10 L a 15 L) del semen con
una gota del colorante con eosina al 0,5% en una lámina portaobjeto y se cubre con una
laminilla, se deja reposar la muestra 30 segundos y se procede a contar 200
espermatozoides (coloreados y no coloreados), con una magnificación de 400X [16]. Los
espermatozoides vivos tienen su mem- brana intacta que impide la penetración del co-
lorante, en tanto que los muertos adquieren la coloración, como se observa en la figura
6. El resultado se expresa en porcentaje. Es importante comparar el resultado de la
vitalidad con el de los espermatozoides inmó- viles, ya que el porcentaje de
espermatozoides muertos no debe ser mayor que el de los inmó- viles o sólo
mínimamente (dentro de los errores permitidos en los recuentos). (Toro, 2009)
Recuento
Para el recuento de espermatozoides se puede utilizar la cámara de Neubauer. Se
cuentan en el cuadrante central que se utiliza para el recuento de los glóbulos rojos. Con
base en lo estimado en la observación inicial de la muestra, se diluye el semen, se llenan
ambos lados de la cámara de Neubauer con 10 L de la dilución y se procede a
contar con una magnificación de 200X a 400X. Para las muestras que contienen menos
de 10 espermatozoides en el cuadrado grande central, se deben contar en todo el
cuadrado (que contiene 25 cuadrados pequeños); para las muestras que contienen entre
10 a 40 espermatozoides en el cuadrado grande central, se pueden contar 10 cuadrados
pequeños, de los 25; y para las muestras que contienen más de 40 espermatozoides
en el cuadrado grande central, se pueden contar sólo 5 cuadrados pequeños. Si hay
espermatozoides sobre la línea que divide a dos cuadrados adyacentes, sólo se cuentan
los que estén en el lado superior y en el lado izquierdo, descartando los que estén en el
lado inferior y en el lado derecho. Los resultados de ambos lados de la cámara se
promedian y el valor se divide por el factor de conversión; el resultado final corresponde
al número (en millones) de espermatozoides por mL de eyaculado o concentración de
los espermatozoides por Ml. (Toro, 2009)
Aglutinación
La aglutinación de los espermatozoides puede ocurrir cabeza con cabeza,
segmento inter- medio con segmento intermedio, cola con cola o puede ser
mixta, por ejemplo cabeza con cola. La aglutinación es sugestiva de
presencia de anticuerpos antiespermatozoides [16, 17] y se debe evaluar al
momento de determinar la motilidad de los espermatozoides. Se puede
informar semicuantitativamente en escala de cruces.
La primera evaluación a realizar es la MACROSCÓPICA, que consta de los
siguientes pasos: Volumen: se observa directamente sobre el tubo graduado,
teniendo en cuenta que un toro mayor de 2 años debe tener un eyaculado de no
menos de 4ml. El volumen puede variar entre 2 y 12ml. Color: se consideran
normales los colores que van del blanco al amarillento, siendo patológicos, los
colores rosado, amarronado y verdoso. Densidad: la densidad del semen varía
desde un semen acuoso, lechoso, lechosocremoso, hasta un cremoso, estando
directamente relacionada con la concentración.
M.M.Ma (Motilidad en Masa Macroscópica): se evalúa observando el tubo de
recolección y detectando la presencia o no de movimiento masal o de remolinos.
Se considera como positiva o negativa. Ph: se evalúa extrayendo una gota de
semen del tubo y colocándola sobre una tira indicadora de pH. Se considera un pH
normal, entre 6.2 y 6.8. Nota: no introducir la tira dentro del tubo para no alterar el
semen con el reactivo de la misma. Cuerpos Extraños: se evalúa observando el
fondo del tubo para detectar la presencia de algún cuerpo extraño, se considera
como positivo o negativo. Schalm Test: se realiza para detectar la presencia de
leucocitos, pero sólo en casos que se sospeche la presencia de los mismos. No se
hace de rutina en cada evaluación.
V. MATERIALES Y METODOS
4.1MATERIALES:
Tubo colector de semen.
Laminas porta objeto.
Micro pipetas.
Papel especial.
4.2 REACTIVOS
Reactivos (agua desionisada, cloruro de sodio y formaldehido)
Agua destilada.
4.4 EQUIPO
Espectofetrometo.
Microscopio.
5.METODOS
5.1 EVALUACION MACROSCOPICA
VOLUMEN: 9.5mL.
COLOR: Blanco cremoso.
ASPECTOS: Presencia de una pequeña pajita falto más higiene.
PH:
6.2 EVALUACION MICROSCOPICA
MOTILIDAD
motilidad masal lo realizamos con semen fresco recién recolectado una gota
al porta objeto previo calentado en la platina esta platina mantiene la muestra
a 37 º c en 40 x y al observar vimos las vigorosas olas u ondas la cual fueron
bastante fuertes presentando una motilidad de 90% las olas u ondas lo
clasificamos de una motilidad 4 es mejor para poder congelar de 100
espermatozoides 30 tiene q tener un movimiento lineal progresivo.
CONCENTRACIÓN
VITALIDAD
No lo realizamos por los reactivos
ez
VII.RESULTADOS Y DISCUSIONES
Barth (2008), reporta que, el stress prolongado provoca cuadros de degeneración
testicular, que pueden variar de ligera hasta aplasia completa del epitelio seminífero
según la intensidad y tiempo de acción del estímulo, mientras que, Spiptzar (2000),
afirma que por stress se provoca un aumento de espermatozoides con anormalidades
de cabeza piriforme, elongados y estrecha y en casos severos podría provocar una
asospermia.
En el estado de Brasil se sometieron toros al método de electroeyaculacion obteniendo
4.2mL y una motilidad individual de 66±14.2% (Ramírez y col, 2016). En el caso del toro
pocho por colección de vagina artificial colectamos 9.2 ml del toro Pocho y en el toro Ozil
5ml
Cabrera y Pantoja (2012), reportan las características seminales de toros del banco de
semen (Lima), con una motilidad promedio de 85.5%±1.5, volumen (ml) promedio
4.5±1.0, con una concentración de (x10°6) 800±103 y con un % de espermatozoides de
80.4. En el caso del toro pocho quien fue evaluado, encontramos una concentración de
1.85 billones/ml .
Asprón, M. 2004. Manejo reproductivo del ganado bovino. IVISO. Pp. 19- 22.
Pérez, F. and Pérez, F. 1985. Dilución del esperma. Reproducción Animal,
Inseminación Artificial y Transplante de Embriones. Editorial CientíficoMédica,
Barcelona, España. Capítulo 6: 215-249.