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VALORES DE REFERENCIA

Notas

Índice
1. REFERENCIAS HISTÓRICAS ........................................................................................2
2. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................2
3. DEFINICIONES ...............................................................................................................3
4. CONCEPTO DE VALORES DE REFERENCIA...............................................................3
5. DETERMINACIÓN DE VALORES DE REFERENCIA .....................................................4
6. PREPARACIÓN DE LOS INDIVIDUOS DE REFERENCIA.............................................6
6.1. Preparación para la obtención de especímenes ........................................................................................ 6
6.2. Extracción ................................................................................................................................................... 7
6.3. Preparación del espécimen ........................................................................................................................ 7
6.4. Almacenamiento del espécimen................................................................................................................. 7
6.5. Recomendaciones especiales.................................................................................................................... 7
7. CONTROL DE CALIDAD EN LA PRODUCCIÓN DE VALORES DE REFERENCIA ......7
8. DESCRIPCIÓN DE LA MUESTRA DE REFERENCIA ....................................................8
8.1. Descripción gráfica de una muestra de referencia..................................................................................... 8
8.2. Pruebas de gaussianidad ........................................................................................................................... 8
8.3. Transformaciones ....................................................................................................................................... 8
8.4. Detección y tratamiento de valores aberrantes.......................................................................................... 9
9. DETERMINACIÓN DE INTERVALOS DE REFERENCIA .............................................11
9.1. Diferentes tipos de intervalos de referencia ............................................................................................. 11
9.2. Cálculo paramétrico del intervalo de referencia ....................................................................................... 11
9.3. Determinación no paramétrica del intervalo de referencia....................................................................... 12
9.4. Tamaño de muestra para la determinación de los valores de referencia ................................................ 13
9.5. Determinación del intervalo de referencia en muestras “censuradas”..................................................... 13
10. CRITERIOS PARA EL CÁLCULO DE INTERVALOS DE REFERENCIA SEPARADOS
(CRITERIOS DE PARTICIÓN) ..........................................................................................16
10.1. Criterio de Harris y Boyd (12) ................................................................................................................. 16
10.2. Criterio de Lathi (13-15).......................................................................................................................... 16
10.3. Criterio de Linton .................................................................................................................................... 16
10.4. Consideraciones no estadísticas............................................................................................................ 17
11. VALORES DE REFERENCIA INTRAINDIVIDUALES .................................................17
11.1. Variabilidad intraindividual...................................................................................................................... 17
11.2. Valores de referencia intraindividuales .................................................................................................. 19
11.3. Fundamentos teóricos ............................................................................................................................ 19
12. UTILIZACIÓN DE LOS VALORES DE REFERENCIA.................................................22
12.1. Comparación de poblaciones ................................................................................................................. 22
12.2. Comparación de un valor observado con los valores de referencia ...................................................... 23
13. VALORES DE REFERENCIA UNIVARIANTES FRENTE A MULTIVARIANTES ........25
13.1. Región de referencia multivariada.......................................................................................................... 25
13.2. Paradojas de la interpretación multivariada ........................................................................................... 27
14. TRANSFERIBILIDAD DE VALORES DE REFERENCIA.............................................28
14.1. Introducción ............................................................................................................................................ 28
14.2. Cálculo del intervalo de referencia ......................................................................................................... 28
14.3. Procedimiento general............................................................................................................................ 29
15. COMPARACIÓN DE INTERVALOS DE REFERENCIA CALCULADOS DE FORMA
PARAMÉTRICA.................................................................................................................29
15.1. Parámetros de centralización: comparación de medias ........................................................................ 29

1
15.2. Parámetros de dispersión: comparación de dos varianzas ................................................................... 31
15.3. Conclusiones .......................................................................................................................................... 31
16. COMPARACIÓN DE INTERVALOS NO PARÁMETRICOS ........................................32
16.1. Prueba de comparación de fractiles ....................................................................................................... 32
16.2. Conclusiones .......................................................................................................................................... 32
17. BIBLIOGRAFÍA CITADA..............................................................................................33
18. BIBLIOGRAFÍA ADICIONAL........................................................................................33

1. Referencias históricas
En 1969 con ocasión del XII Congreso de la Sociedad Escandinava de Química Clínica, R. Grasbeck y N.E.
Saris propusieron la denominación de valores de referencia en sustitución de lo hasta entonces valores
normales.
En 1970 la Internacional Federation of Clinical Chemistry (IFCC) designó un Comité de Expertos bajo la
presidencia del Dr. T. P. Whitehead para establecer recomendaciones en la teoría de valores de referencia,
el Scientific Committee, Clinical Section, Expert Panel on Theory of Referente Value (EPTRV), presidido
después por R. Gräsbeck (FI), y H. E. Solberg (NO), siendo miembros N. Montalbeti (IT), C. Petitclerc (CA),
G. Siest (FR), P. Wilding (US), G. Z. Willians (US), P. Stamm (DE) y R. Dybkaer (D). A su vez el
International Committee for Standardization in Haematology (ICSH), designó en 1977 a Standing Committee
on Reference Values (SCRV).
El Comité de Expertos de la IFCC ha publicado seis documentos:
• Part 1. The concept of reference values (1987) (1, 2).
• Part 2. Selection of individuals for the production of reference values (1987) (3).
• Part 3. Preparation of individuals and collection of specimens for the production of reference values
(1988) (4).
• Part 4. Control of analytical variation in the production, transfer and application of reference values
(1991) (5-7).
• Part 5. Statistical treatment of collected reference values. Determination of reference limits (1987) (8).
• Part 6. Presentation of observed values related to reference values (1987) (9).
Hay que destacar la importancia que ha tenido para la elaboración de la teoría de los valores de referencia y
las aplicaciones que de ella se derivaron los Congresos Internacionales de Química Clínica de Estocolmo y
México; las reuniones del International Data Communication Group en Minneapolis, Cancún y Graz; y los
Symposiums de Biologie Clinique de Pont-à-Mousson.

2. Introducción
El objetivo primordial del laboratorio clínico es la detección de las variaciones de los distintos constituyentes,
tanto de origen endógeno como exógeno, que estudia en los seres vivos originadas por la propia actividad
fisiológica o por circunstancias patológicas, aportando una serie de valores cuantitativos, con fines
preventivos, diagnósticos y de control de tratamiento. Estos valores deben ser interpretados en relación con
valores similares obtenidos en condiciones fisiológicas.
Los valores obtenidos en condiciones fisiológicas pueden estar sometidos a variaciones de origen genético,
constitucional o ambiental, así como a las introducidas por la administración de medicamentos u otros
agentes terapéuticos.
Al ser competencia del laboratorio clínico la producción e interpretación de valores analíticos, le
corresponde el establecimiento de valores de referencia en función de la población a la que presta sus
servicios y de la metodología que utiliza. Es imprescindible para la correcta obtención e interpretación de los
valores de referencia el conocimiento y la descripción meticulosa de todos los factores capaces de introducir
variaciones.

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3. Definiciones
Individuo de referencia: es un individuo seleccionado con fines de comparación mediante unos criterios
definidos en cada caso. Es importante que el criterio elegido sea el estado de salud, pero la definición no se
limita a esto, sino que también puede incluir un cierto estadio de una enfermedad, o un determinado estadio
fisiológico (por ejemplo el primer trimestre del embarazo), u otra condición que sea relevante a los fines
terapéuticos o pronósticos, o también se pueden tener intervalos de referencia hospitalarios.
Población de referencia: es el conjunto de todos los posibles individuos de referencia.
Muestra de referencia: es un subconjunto de la población de referencia constituido por el número adecuado
de individuos para que sea representativo de dicha población de referencia.
Valor de referencia: es el valor obtenido por la medición de una magnitud en el laboratorio en un individuo
de referencia que forma parte de la muestra de referencia.
Distribución de referencia: es la distribución de probabilidad de los valores de referencia. Las hipótesis y los
parámetros estadísticos de la distribución de probabilidad de la muestra de referencia se comprobarán y
calcularán a partir de la distribución de referencia con los métodos estadísticos apropiados.
Límites de referencia: son aquellos valores de la distribución de referencia que excluyen, con una
probabilidad determinada, una fracción de dicha distribución. Se establecen de la distribución y son
descriptivos de los valores de referencia.
Intervalo de referencia: es el intervalo de la distribución de referencia que queda comprendido entre los
límites de referencia, incluyéndolos a ambos.
Valores observados: son los valores obtenidos por medición de una magnitud en un individuo determinado,
para sustentar una decisión médica, pudiendo ser comparado con los valores, distribuciones, límites o
intervalos de referencia.

4. Concepto de valores de referencia


Cualquier resultado del laboratorio carece de interés por sí mismo. Una primera aproximación a dotar de
contenido el resultado de la determinación de un constituyente es su comparación con el valor de dicho
constituyente en una población considerada como “sana”, es decir, compararlo con los llamados valores de
referencia.
El concepto de valores de referencia ha sido formulado por el Expert Panel de la IFCC y recogido, en
ocasiones, con algunos matices diferentes, por comisiones nacionales ad hoc con el propósito de unificar
conceptos, métodos y terminología, habida cuenta de la importancia formal y conceptual de la comparación
antes aludida (10, 11).
Un valor de referencia se define como el resultado analítico obtenido en un individuo de referencia. Este
individuo es una persona que pertenece a la comunidad a la que sirve el laboratorio en cuestión, y que se
caracteriza fundamentalmente por disfrutar de un estado de salud definido por el propio investigador, no un
estado de salud “absoluto”. Esta flexibilidad en la definición de individuo de referencia permite establecer
valores de referencia utilizando grupos peculiares tanto por su estado fisiológico (mujeres embarazadas, por
ejemplo), patológico (insuficiencias renales en tratamiento con diálisis), o historia farmacológica (mujeres
tomando anticonceptivos orales), sin menoscabo de los fundamentos teóricos.
Todos los individuos que cumplan las condiciones de inclusión definidas por el investigador, constituyen la
población de referencia. La aplicación de la estadística a los datos obtenidos tras realizar observaciones –
efectuar determinaciones analíticas en nuestro caso- en todos estos individuos, permite la reducción de la
información. No se manejarán listas de resultados, sino tan sólo dos o tres parámetros que condensen la
información contenida en las listas, haciéndola manejable e inteligible. El cálculo de estas medidas (de
centralización y de dispersión) se verá más adelante.
El número de las personas que integran la población de referencia suele ser inmenso y, por lo tanto
imposible de obtener. Por esta razón se recurre a la teoría estadística del muestreo y se define la muestra
de referencia: un grupo representativo de la población de referencia sobre el que se realizarán las
determinaciones analíticas y sobre los datos obtenidos se inferirá los parámetros de la población. Es
evidente que al actuar así se introducirán errores debido a la imperfección de la selección de los individuos.
Esta imperfección, no obstante, será reducida según vaya aumentándose el tamaño de la muestra. Por esta
razón se definen unos intervalos de tolerancia, en función, en función del número de individuos que
constituyen la muestra de referencia, de cada estimación de los parámetros de la población. Dentro de
estos intervalos de tolerancia se contiene con una probabilidad determinada el auténtico valor del parámetro
poblacional: media aritmética, desviación típica, etc.

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Las distribuciones de probabilidad de los datos recogidos en la muestra de referencia constituyen la
distribución de referencia. Esta distribución no sigue necesariamente un modelo gaussiano, sino más bien la
obtención de tal modelo suele ser excepcional. El tipo de distribución condiciona el tratamiento estadístico
de los datos.
La probabilidad de que un resultado forme parte de la población de referencia a lo largo de toda la
distribución es, obviamente, máxima (igual a la unidad). En otras palabras el intervalo de resultados
analíticos que contienen la máxima probabilidad, la probabilidad igual a uno, es aquel que está delimitado
por los valores máximo y mínimo. Generalmente se suele definir el intervalo de referencia como el intervalo
de resultados que comprenden un 95 % de la probabilidad total. Los límites de este intervalo son pues los
límites de referencia y, por proceder de una muestra de la población, están sujetos al intervalo de tolerancia
al que aludimos antes.
Los valores de referencia pueden ser categorizados según diferentes criterios, por ejemplo valores de
referencia basados en población o valores de referencia basados en individuos los cuales pueden ser
univariados o multivariados, tiempo especificados o tiempo no especificados.
La mayoría de los valores de referencia publicados son valores de referencia basados en población,
univariados y tiempo no especificados, es decir los especímenes son tomados de varios individuos de
referencia sin tener en cuenta los ritmos biológicos y analizados para un tipo de magnitud.

5. Determinación de valores de referencia


La determinación de valores de referencia en un laboratorio clínico se hace necesario fundamentalmente en
dos situaciones:
• al instaurar la medición de un nuevo constituyente;
• al utilizar un método nuevo o diferente.
Para la determinación de los valores de referencia hay que cumplir una serie de requisitos tanto en la fase
preanalítica como en las fases analítica y postanalítica.
En la fase preanalítica, un punto clave es la selección de los individuos de referencia. Esto es quizás la
parte más crítica del trabajo, ya que cuanto más estrictos seamos en la definición de individuo de referencia,
se obtendrán valores de referencia mejores y más representativos, pero el número de individuos se verá
disminuido marcadamente. El mayor de los problemas es definir el estado de salud. El límite entre salud y
enfermedad puede llegar a ser difuso y además variar de institución a institución. Por esto deberían
definirse claramente los criterios utilizados en la literatura para que se pudieran utilizar los mismos criterios.
Dadas las dificultades en la definición de salud, conviene aplicar los criterios de exclusión, basándose en un
a serie de exámenes, historia clínica, examen físico y pruebas de laboratorio. El primer paso para la
selección de los individuos de referencia es establecer los criterios de exclusión. Estos criterios deberían ser
descriptos y documentados, para que sea factible realizar comparaciones con otros laboratorios. Entre los
criterios de exclusión para los valores de referencia podemos citar los siguientes:

Condiciones patológicas o intervención médica Hospitalización


Cirugía reciente
Transfusión reciente
Drogas Anticonceptivos orales
Drogas prescriptas
Drogas de abuso
Abuso de vitaminas
Alcoholismo
Tabaquismo
Factores de riesgo Obesidad
Ocupación
Factores genéticos
Estados fisiológicos Embarazo
Lactancia
Presión sanguínea

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También es sumamente importante y apropiado establecer, mediante criterios de partición, los subgrupos
de referencia elegidos. Entre los criterios de partición para los valores de referencia se pueden citar:

Edad
Factores genéticos Raza
Sexo
Grupo sanguíneo
Factores fisiológicos Variación circadiana
Momento del ciclo menstrual
Momento del embarazo
Hábitos personales Dieta
Ejercicio
Consumo de alcohol
Consumo de tabaco
Factores preanalíticos Hora del día en que se hace el muestreo
Tipo de extracción sanguínea
Factores ambientales Altitud
Época del año

En la preparación de los sujetos para la determinación de los valores de referencia hay que tener en cuenta
los siguientes factores:

Factores críticos Factores biológicos: metabólicos, hemodinámicas, inducción enzimática, daño celular
Factores metodológicos: obtención de muestra, transporte de muestra, manipulación
de muestra
Factores de variabilidad y estandarización
Factores Preparación del individuo: dieta anterior, ayuno, régimen de drogas, momento de la
preanalíticos toma de muestra en relación con los ritmos biológicos, actividad física, encamado o
no, estrés
Obtención de muestra: condiciones ambientales durante la toma de muestra,
momento, postura del cuerpo, sitio de la toma de muestra, preparación del sitio de la
toma de muestra, flujo sanguíneo, equipo, técnica
Manipulación de la muestra: transporte, coagulación, separación del suero o plasma,
preparación para el análisis

Por otra parte la selección de los individuos de referencia puede hacerse atendiendo diversos intereses y
recursos disponibles. Los criterios de exclusión a utilizar dependen del uso que se hará de los valores de
referencia y de la magnitud medida. Las particiones deberán limitarse a aquellos valores de referencia
cuyas diferencias sean significativas.
Para la toma de muestra se puede aplicar un muestreo directo cuando se toman individuos al azar de una
población sana. A veces se encuentra la dificultad de no lograr el número apropiado de individuos, por lo
que generalmente se los busca en los exámenes laborales o en muestreo de voluntarios. También puede
ser por muestreo indirecto como el que se hace sobre una población no seleccionada, aunque estos
métodos dan distribuciones sesgadas hacia los valores patológicos y con desviaciones típica mayores.
En la literatura se han definido otros métodos de muestreo:
• A priori: requiere tener bien definidos los criterios de exclusión y partición antes de la selección. Es el
mejor método para procedimientos de laboratorio bien estudiados y donde se conocen las causas de
variabilidad biológica. Luego de obtener de la literatura una lista de exclusión y partición, se realiza un
cuestionario para excluir del muestreo a quienes no cumplen con los criterios fijados.
• A posteriori: puede ser apropiado para procedimientos nuevos o poco estudiados y cuando se tiene
poca información. También en estudios para determinar criterios de exclusión y partición. En primer

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lugar se realiza el muestreo y luego la exclusión y partición. Resulta particularmente indicado cuando los
factores que definen los subgrupos no son bien conocidos.
Los criterios de exclusión antes expuestos, al igual que los criterios de partición, contribuyen a definir la
población. Para la exclusión o partición se deben plantear cuestiones con preguntas simples que se
responderán por sí o no. En cuanto a los criterios de partición dependen del constituyente, por ejemplo la
hemoglobina se afecta por la edad y el sexo. Otras veces un criterio de partición puede ser también un
criterio de exclusión como es el caso del embarazo. Otros factores preanalíticos a tener en cuenta son los
siguientes:

Momento de obtención Hora del día


Horas después de despertarse
Minutos después de descanso
Consumo de alimentos (24 h antes de la obtención) Comida
Agua
Alcohol
Posición del individuo Sentado
Acostado
Punto de obtención Vena antecubital
Vaso sanguíneo
Tiempo que el torniquete se encuentra ajustado en el brazo
Uso de tubo separador de suero

En la fase analítica, se debe asegurar que el procedimiento y el instrumento analítico sean similares a los
utilizados en los estudios clínicos y que todos los procedimientos estén bajo control, monitorizando por un
sistema de control de calidad apropiado. En caso contrario los intervalos de referencia obtenidos no tendrán
validez.
En la fase postanalítica, el análisis de los datos se puede hacer de dos formas, dependiendo del tipo de
distribución. Si se trata de una población con distribución gaussiana, se puede calcular la media y la
desviación típica de los valores para crear el intervalo de confianza del 95 %. Si no se conoce la distribución
de los valores o no es gaussiana ni transformable en gaussiana, el método no paramétrico es el mas
sencillo, el más directo y el adecuado. Se calculan así los percentiles 2,5 y 97,5 como límites de referencia.

6. Preparación de los individuos de referencia


La estandarización de la obtención de especímenes es importante para el control de variables preanalíticas
que pueden influir en la dispersión del intervalo de referencia o no ajustar el valor observado a la población
de referencia. Se pretende definir una situación estándar o basal en la que las condiciones del individuo, de
la técnica y del material de obtención de especímenes estén perfectamente establecidas.
Las condiciones que se exponen luego –basadas en recomendaciones efectuadas por la Sociedad
Escandinava de Química Clínica– deben ser idénticas a las que se practicarán en la rutina habitual del
laboratorio.
Las condiciones de preparación de los individuos de referencia y de obtención de los especímenes para
analizar deben ser conocidas por los clínicos que recibirán los informes del laboratorio. Si los valores de
referencia son objeto de eventual transferencia a otro centro es imprescindible comunicar de alguna forma
las modalidades de preparación y obtención de los especímenes, con el fin de lograr una interpretación
correcta.

6.1. Preparación para la obtención de especímenes


Las siguientes recomendaciones se refieren a la estandarización de los aspectos relacionados con la
extracción de sangre.

6.1.1. El día anterior a la obtención del espécimen


Se recomienda una ingestión energética total no superior a 8400 julios diarios, distribuidos de modo que la
última comida no supera los 2000 julios. La ingestión será inferior a 2 gramos y únicamente durante la

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comida principal. Se indicará la prohibición de fumar. Desde las 21:00 h se restringirá cualquier comida,
únicamente se autorizará la ingestión de agua. Se aconseja reposar desde las 22:00 h.

6.1.2. Instrucciones para el día de la obtención del espécimen: individuos hospitalizados


No se les autorizará ir al lavabo una hora antes de la extracción. No se permitirá trabajo muscular desde 15
minutos antes de la extracción ni durante el tiempo en que se realice.

6.1.3. Instrucciones para el día de la obtención del espécimen: individuos ambulatorios


Se le indicará que se levante de la cama entre una y tres horas antes de la extracción. El desplazamiento
hasta el centro donde se efectuará la extracción en transporte público o personal se limitará a un máximo de
una hora. El desplazamiento andando a velocidad moderada se limitará a 500 m o a 20 minutos. En
cualquier caso se anotará esta circunstancia, y si el individuo acude conduciendo personalmente el
automóvil.

6.2. Extracción
La extracción se realizará en intervalos fijos. En individuos hospitalizados con el brazo horizontal; en
individuos ambulatorios con el brazo a 45º del plano horizontal. La piel se desinfectará utilizando siempre el
mismo desinfectante. Se recomienda el uso de etanol o 2-propanol 70 %, o clorhexidina 0,5 %, dejando
secar antes de proceder a la flebotomía. Se utilizará siempre el mismo tipo de material, que previamente se
habrá comprobado que no produce interferencias con las determinaciones. No se recomienda el uso del
torniquete, ni la compresión digital de las venas. Cuando sea imprescindible se indicará por escrito, así
como todas las dificultades halladas. Si se requiere una segunda flebotomía se practicará en el otro brazo,
tras un descanso de 15 minutos, en el que no se autorizará al enfermo ni levantarse ni realizar ningún
esfuerzo muscular.

6.3. Preparación del espécimen


Si se desea obtener plasma, la sangre (con el anticoagulante apropiado) Se centrifuga a 1200 x g durante
10 minutos; caso de que haya que congelar la muestra, separar el plasma sobrenadante de las células,
transfiriéndolo a un tubo adecuado.
Si se desea obtener suero, la sangre (sin anticoagulante) se mantiene a temperatura ambiente al abrigo de
la luz durante el tiempo necesario para su coagulación; seguidamente se centrifugará y se actúa lo mismo
que en el caso del plasma.

6.4. Almacenamiento del espécimen


Si la determinación analítica se realiza dentro de las 3 h siguientes se mantendrá el espécimen a
temperatura ambiente. Si la determinación se realiza dentro de las 24 h siguientes a la extracción a 4 ºC.
Por último, si la determinaciones realiza dentro de los 7 días siguientes a la extracción, se mantendrán
alícuotas congeladas a –20 ºC; la descongelación de estas muestras se hará en una baño a 37 ºC,
homogeneizándose por inversión y evitando una nueva congelación.
Se recomienda que en el protocolo de obtención de valores de referencia, o en la hoja de petición de
análisis, se reserve un espacio para que la persona encargada de la obtención de especímenes pueda
indicar las eventualidades aparecidas en dicha obtención. También se recomienda proveer al individuo de
una hoja que contenga información sobre lo que va hacer, así como instrucciones claras y precisas acerca
de las condiciones de preparación previa a la recogida del espécimen.

6.5. Recomendaciones especiales


Debe tenerse en cuenta que estas recomendaciones se hacen con carácter general. En la producción de
valores de referencia de ciertos constituyentes bioquímicos deberán adoptarse otro tipo de precauciones.
Sobre conservación de muestras puede verse el documento correspondiente que aparece en la página web
de la SEQC.

7. Control de calidad en la producción de valores de referencia


Dentro de la información general que deberá suministrarse al clínico, debe constar la “inveracidad”,
imprecisión (o su suma, inexactitud), especificidad analítica (substancias interferentes), procedimientos de
control de calidad y variabilidad a largo plazo, que mediatizarán la obtención de los valores de referencia.

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La varianza del intervalo de referencia observado ( s ) puede considerarse como la suma de la varianza
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0

debida a la variación fisiológica (intra e interindividual) ( s ) y la variación metodológica ( s ) . La relación


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v m

entre ambas puede formularse:


s 20 = s 2v + s 2m
Esta relación es correcta cuando se trata de distribuciones gaussianas, en las que el intervalo de referencia
ha sido calculado por métodos paramétricos. Cuando no sea éste el caso, no es en rigor utilizable. Sin
embargo, en muchas ocasiones la contribución de la variación metodológica es pequeña, por lo que puede
utilizarse de forma aproximada.

8. Descripción de la muestra de referencia


La muestra de referencia es un subconjunto de la población de referencia. Los resultados analíticos
obtenidos en los elementos de este subconjunto son valores de una variable aleatoria real. En la producción
de valores de referencia se obtiene, por tanto, una serie estadística constituida por un conjunto de números
reales. Puesto que la enumeración de la serie no es un método adecuado para transmitir información, la
información contenida en esta serie se describirá mediante unos parámetros que caractericen su tendencia
central y su dispersión. Otro procedimiento, la expresión de su función de distribución, no es por lo general,
ni fácil de obtener ni de interpretar.

8.1. Descripción gráfica de una muestra de referencia


Se recomienda representar siempre los valores de referencia antes de proceder a calcular los respectivos
intervalos. El histograma es el método gráfico habitual para presentar los datos. Es un gráfico de
rectángulos dibujado en un sistema de coordenadas en el que la magnitud medida se representa en
abscisas y la frecuencia relativa en ordenadas. El área de cada rectángulo es proporcional al número de
observaciones de la correspondiente clase.
La adecuada selección del tamaño del intervalo de clase (amplitud) es importante para obtener el máximo
de información del histograma: sesgo (asimetría), curtosis (apuntamiento), datos aberrantes, etc. Un
procedimiento recomendado para obtener el tamaño del intervalo en el histograma consiste en aplicar la
siguiente fórmula:
x máximo − x mínimo
amplitud =
1 + 3,321× log n

8.2. Pruebas de gaussianidad


El desarrollo de intervalos de referencia paramétricos exige que la distribución de referencia sea gaussiana,
y en caso contrario deberá optarse por: (a) transformar los datos para obtener una distribución gaussiana; o
(b) proceder a calcular intervalos de referencia no paramétricos. Es un hecho constatado que un buen
número de distribuciones de variables biológicas se apartan claramente de la distribución de Gauss. Por ello
no se recomienda asumir, de entrada, la gaussianidad de la distribución, debiéndose comprobar en cada
caso.
Para verificar la gaussianidad de una población hay varios tipos de pruebas y la IFCC recomienda dos: los
coeficientes de sesgo y curtosis (tests de coeficientes) y el test de Anderson–Darling.

8.3. Transformaciones
Las transformaciones matemáticas de los valores de referencia tienen por objeto: (a) conseguir que la
varianza sea uniforme en todo el intervalo de valores; (b) conseguir la aditividad en análisis de varianza; (c)
normalizar la distribución de frecuencia; y (d) linealizar una distribución. Desde el punto de vista de la
producción de valores de referencia la normalización de una distribución de referencia permitirá el cálculo
de intervalos de referencia por métodos paramétricos, la homogeneidad de las varianzas permitirá utilizar
pruebas paramétricas en la comprobación de la hipótesis de la igualdad de varios intervalos de referencia,
por ejemplo entre sexos, y la linealidad permitirá realizar estudios de regresión lineal paramétricos.
El cálculo de intervalos de referencia paramétricos parece ser más preciso que los no paramétricos, aunque
sólo sea por que en los paramétricos participan todos los valores numéricos de la serie estadística,

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condensándose la información en dos parámetros suficientemente conocidos: la media y la desviación
típica.
Deberá evaluarse la eficacia de la transformación chequeando los datos transformados con un test de
normalidad. Según que la falta de normalidad se deba a sesgo o a curtosis, se utilizarán las
transformaciones que se verá más adelante.
Algunas veces, cuando existe asociación entre la variación intra e interindividual, deberá hacerse el proceso
en dos fases: una primera transformación en la que por ejemplo se elimine el sesgo y en menor grado la
curtosis, y una segunda transformación, en la que se elimine la curtosis restante.

8.3.1. Corrección del sesgo


Las transformaciones logarítmica, logarítmica ampliada y potencial:
y = log ( x )
y = log ( x + c )
y = xa
son especialmente útiles para corregir el sesgo positivo
De una forma general, la transformación log ( x + c ) sugerida por Boyd y Flinn, y que tiene igual potencia
que la transformación raíz cuadrada, puede ser recomendable cuando se trabaja con ordenadores, ya que
el cálculo de la constante c debe hacerse por procedimientos iteractivos.
La transformación potencial de Box y Cox tiene la ventaja de corregir tanto el sesgo positivo como negativo,
cuando x > 0 . Sin embargo, se requiere un proceso iteractivo por ordenador para el cálculo de la constante
c.
La transformación exponencial de Manly, por su carácter general (puede aplicarse tanto a datos positivos
como negativos) ha sido recomendada; asimismo se recomienda utilizar datos estandarizados a media cero
y desviación típica unidad, substrayendo de cada valor original la media y dividiendo por la desviación típica.

8.3.2. Corrección de la curtosis


La curtosis positiva puede ser eliminada en ocasiones utilizando la transformación seno hiperbólico de las
variables estandarizadas tras la corrección del sesgo:
e x − e− x
senh x =
2
(
senh -1 x = ln x + x2 +1 )
La platicurtosis es eliminable utilizando la transformación inversa. La curtosis en ambos sentidos se elimina
utilizando la función potencial, según Boyd o la función, modular de John y Draper, aunque bajo la
suposición de que la distribución es simétrica y de que los datos han sido previamente estandarizados:
Ambas transformaciones requieren la utilización del ordenador para realizar las correspondientes
iteraciones.

8.3.3. Reconversión de los datos


Una vez calculados los límites de referencia a partir de los datos transformados, el intervalo de referencia
definitivo se obtendrá utilizando la transformación inversa para deshacer el anamorfismo (transformación)
utilizado. Los intervalos de referencia definitivos serán diferentes a los obtenidos sin la transformación de los
datos, o incluso pueda que sean asimétricos.

8.3.4. Conclusión
Si las distribuciones de referencia no son normales, y las transformaciones referidas resultan ineficaces
para su normalización, deberá utilizarse un método no paramétrico, que satisface un buen número de
requisitos sin tener en cuenta la forma de la distribución.

8.4. Detección y tratamiento de valores aberrantes


La dispersión que se halla en un Intervalo de referencia es la suma de la dispersión debida a: (a) la propia
población de referencia, es decir la suma de las variaciones intra e interindividuales; (b) la variación

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atribuible a los procedimientos analíticos utilizados (error analítico); (c) lo que Ascombe llama error de
“ejecución”, por ejemplo, equivocaciones en la selección de la muestra de referencia en la que se hubiera
incluido un individuo enfermo, que introduce variaciones “disparatadas”. Cuando un valor de referencia se
encuentra especialmente alejado del conjunto constituido por el resto de la muestra de referencia, se le
califica de valor aberrante; ya sea porque refleje un error analítico no tolerable, o un error “de ejecución” que
lo sitúa en una región de “improbabilidad”.

8.4.1. Detección de datos aberrantes


Por regla general no es posible conocer con certeza si un determinado valor de referencia es o no un valor
aberrante; por otra parte, la detección de datos aberrantes se fundamenta, en la mayoría de los casos, en la
suposición de que la distribución de referencia se ajusta a un modelo determinado, habitualmente
gaussiano. Por lo tanto, la validez de la detección de datos aberrantes dependerá en gran manera de la
validez de tal suposición.
Existen muchos procedimientos para detectar valores aberrantes. A continuación nos vamos a referir a dos.
Una fórmula de utilidad es la que se indica a continuación:
Q 3 + 1,5 ( Q 3 − Q1 ) [1]
Q1 − 1,5 ( Q 3 − Q1 ) [ 2]
donde: Q1 es el primer cuartil (o percentil 25); y

Q3 es el tercer cuartil (percentil 75).

[]
Todo valor mayor que 1 o inferior a [ 2] es un valor aberrante. Esta fórmula es muy útil porque es
independiente del tipo de distribución.
Otra prueba utilizada para detectar datos aberrantes o marginales es el test de Reed. Este consiste en el
cálculo del cociente
D
R
donde D es la diferencia absoluta entre la observación extrema (máxima o mínima) y el siguiente
valor;
R es el rango (amplitud) de todos los datos, incluyendo los extremos.

Este cociente debe ser menor que 1 . Si es mayor que este valor se trata de un dato aberrante (marginal).
3
8.4.2. Estimaciones con datos aberrantes
Se han propuesto dos soluciones para evitar perturbaciones ocasionadas por la existencia de datos
aberrantes:
(a) el desarrollo de estimaciones de parámetros de la población de referencia robustos (resistentes a la
existencia de datos aberrantes) y eficaces (con poca pérdida de información); estimando la media a
partir de la mediana y la desviación típica a partir de múltiplos del intervalo interfractílico.
(b) recortar la muestra de referencia y estimar a continuación los parámetros
La estimación de la media a partir de la mediana según el modelo (a) tiene una eficacia del 64 %, y por el
procedimiento (b) de 100 −
g (siendo g el porcentaje de valores recortados). La estimación de la
30
desviación típica por el método (a) tan sólo tiene una eficacia del 37 %, mientras que por el método de
Dawson puede llegar al 98 %.

8.4.3. Actitud ante los datos aberrantes


Una completa información de la producción de valores de referencia debe necesariamente hacer alusión al
número y procedimiento utilizado en la detección de datos aberrantes.
Ante la presencia de un dato aberrante no debe actuarse con ligereza eliminándolo sin más, sino que debe
procederse a una cuidadosa revisión e investigación acerca de la procedencia de tales valores aberrantes:
debe averiguarse si lo es por tratarse de un error analítico excesivamente grande, por ejemplo revisando el
protocolo de control de calidad y repitiendo la determinación analítica; o bien si se trata de un error de

10
ejecución al seleccionar la muestra de referencia, por ejemplo un individuo que sufriera una enfermedad en
el momento de ser calificada como individuo de referencia.
Una vez conocido el origen del dato aberrante, podrá actuarse en consecuencia: eliminándose de la
muestra de referencia, o bien revisando los criterios de inclusión y por lo tanto el resto de individuos de
referencia, o bien admitiendo que la distribución de referencia posee un sesgo mayor del previsto.

9. Determinación de intervalos de referencia

9.1. Diferentes tipos de intervalos de referencia


Existen varios tipos de intervalos de referencia, cuya diferencia reside en sus bases teóricas, ya que en la
práctica si se dispone de un número adecuado de datos los valores numéricos que se obtienen al aplicarlos
son muy semejantes entre sí. Estos intervalos son:
Intervalo interfractílico. El término fractil indica un valor por encima o por debajo de cual existe una
proporción determinada de los datos de la distribución. Una extensión del término fractil es la de percentl,
esto es, el fractil referido a 100 datos. Este tipo de intervalo es el más utilizado. Los valores comprendidos
entre dos fractiles (generalmente el 2,5 y el 97,5) delimitan el intervalo de referencia. Estos límites se
escogen de forma arbitraria y, en ocasiones, pueden ser asimétricos. Por esta razón debe expresarse a
partir de qué fractil se ha calculado el intervalo.
Existen dos problemas en la utilización de los fractiles. En primer lugar, el intervalo de referencia obtenido
en la muestra de datos utilizada sólo es una estimación del intervalo de referencia de la población de
referencia, siempre y cuando los individuos que compongan esta muestra hayan sido escogidos al azar. El
segundo problema es la imprecisión de los fractiles de la muestra como estimación de los de la población.
Esta imprecisión está inversamente relacionada con el tamaño de la muestra; cuanto mayor sea el tamaño
de la muestra, menor será la imprecisión de los fractiles. Ambos problemas se minimizan al aumentar el
número de datos de la muestra.
Intervalo de tolerancia. Este intervalo es aquel en que se halla comprendida una proporción específica de
los valores de referencia con un grado de confianza determinado. En este caso debe cumplirse la condición
de la muestra al azar, ya que este intervalo de referencia se basa en la certeza de que la muestra es
realmente un estimación de la población.
Intervalo de predicción. Es un intervalo definido por unos límites superior e inferior, entre los cuáles se
espera que se halle comprendido un valor de referencia con un grado de confianza determinado. También
en este caso debe cumplirse la condición de la obtención aleatoria de la muestra.
De todo lo expuesto resulta claro que es preferible determinar el intervalo de referencia por el método de los
fractiles. Estos siempre son una descripción válida de los valores de referencia y si la muestra está obtenida
al azar, se puede obtener una estimación de los verdaderos fractiles de la población.
El cálculo de los intervalos de referencia, dependiendo de que la distribución se ajuste o no a la gaussiana,
puede hacerse mediante métodos paramétricos –con estimación de parámetros, y por lo tanto relacionados
con la forma de la distribución– o por métodos no parámetricos que son independientes de la distribución.

9.2. Cálculo paramétrico del intervalo de referencia


Cuando una distribución es gaussiana, los parámetros de la población, media y varianza, pueden ser
estimados a partir de los estadísticos muestrales con un intervalo de confianza determinado. Este intervalo
de referencia es, en principio, el más sensible y preciso,

9.2.1. Intervalo interfractílico


Para calcular el intervalo interfractílico se procederá de la forma siguiente:
(a) Calcular las estimaciones de la media y la desviación típica de la forma usual;
(b) Calcular los límites de referencia de acuerdo con la fórmula:
l = x ± ks
donde: k es el valor de la distribución de Gauss para el nivel de probabilidad fijado (generalmente se
toma α = 0, 05 , siendo entonces k = 1,96 ).

11
El límite superior así calculado correspondería al fractil 1 − (0, 05 2 ) = 0,975 (percentil 97,5) y el

inferior al fractil
0, 05 = 0, 025 (percentil 2,5).
2
(c) Calcular el intervalo de confianza paramétrico de cada fractil. La siguiente expresión permite calcular el
intervalo de confianza al 90 % de cada fractil
s
fractil ± 2,81
n
donde: s es la desviación típica de la muestra en cuestión; y
n es el número de datos.

9.3. Determinación no paramétrica del intervalo de referencia


Aunque el primer intervalo de referencia no paramétrico fue publicado en 1938, no es hasta 1950 cuando s
empieza a utilizar en Bioquímica Clínica unos intervalos interfractílicos no paramétricos para clasificar a los
individuos. En 1958 se publican las primeras recomendaciones formales acerca de métodos no
paramétricos para obtener el intervalo de referencia, que posteriormente será recomendado por diversos
autores. Aunque en teoría los intervalos así construidos son más imprecisos que los paramétricos, en la
práctica no presentan grandes diferencias.
Procedimiento para el cálculo de los intervalos interfractílicos:
(a) Ordenar los valores de referencia en orden ascendente, aunque en realidad basta con ordenar unos
cuantos valores por ambos extremos. En caso de que existan valores de referencia repetidos, se
adjudicarán números de orden sucesivos, aunque tengan el mismo valor numérico, o bien se obtendrán
resultados analíticos con más decimales de los habituales para deshacer los empates.
(b) Calcular los fractiles –generalmente los percentiles 2,5 y 97,5– correspondiente a los límites de
referencia, mediante las expresiones siguientes:
fractil inferior = 0, 025 ( n + 1)
fractil superior = 0,975 ( n + 1)
Los límites de referencia serán los valores de referencia cuyo orden sea el indicado por el fractil. En
caso de obtener un número con decimales, se interpolará el valor de referencia correspondiente.
Supóngase que se tiene una muestra de referencia de 199 datos, cuyos diez primeros datos ordenados
de menor a mayor son los siguientes (en la línea inferior se indica su número de orden):
{24, 0 , 24,3 , 25, 0 , 25,8 , 26,5 , 27,3 , 28, 0 , 28, 7 , 29, 0 , 29,1}
{ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10}
y los diez últimos son:
{107,5 , 109,3 , 110,3 , 112,1 , 112,1 , 112, 4 , 113,5 , 113,9 , 115, 0 , 115, 7}
{ 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199}
El resultado sería el siguiente:
fractil inferior = 0, 025 (199 + 1) = dato número 5 = 26,5
fractil superior = 0,975 (199 + 1) = dato número 195 = 112, 4
(c) Calcular el intervalo de confianza de cada límite de referencia. Generalmente se calculan Intervalos de
Confianza al 90 % o al 70 %. Puede hallarse varias tabulaciones en la literatura.
Según estas tablas –basadas en una distribución binomial– el intervalo de confianza al 90 %, para el
fractil 0,025 estará comprendido entre el dato número 2 y el dato número 10 : (24,04; 29,05). Tabla 1
y el intervalo de confianza para el fractil 97,5 estará comprendido entre el dato número 190 y el dato
número 197: (107,5; 113,9).

12
n inferior superior n inferior superior n inferior superior
120 1 7 418 6 17 725 12 26
133 1 8 436 6 18 733 12 27
161 1 9 469 6 19 766 12 28
188 2 9 471 7 19 774 13 28
190 2 10 501 7 20 800 13 29
219 2 11 523 8 20 823 14 29
249 2 12 534 8 21 834 14 30
250 3 12 566 8 22 868 14 31
280 3 13 575 9 22 872 15 31
308 4 13 599 9 23 902 15 32
310 4 14 625 10 23 920 16 32
341 4 15 632 10 24 936 16 33
364 5 15 666 10 25 968 17 33
373 5 16 675 11 25 971 17 34
404 5 17 699 11 26
Tabla 1. Número de orden de los valores que constituyen el intervalo de confianza con probabilidad
de 0,90 del fractil 0,025. Los correspondientes valores del fractil 0,975 se obtiene restando de ( n + 1)
los resultados obtenidos para el fractil 0,025. n es el número de observaciones que constituyen la
muestra de referencia. “inferior” es el número de orden del límite de confianza inferior y “superior”
el número de orden del resultado que constituye el límite superior del intervalo de confianza.

9.4. Tamaño de muestra para la determinación de los valores de referencia


La imprecisión en la estimación de los fractiles aumenta en la medida que el tamaño de la muestra
disminuye.
Los α fractiles y (1 − α ) fractiles no son estimables al menos que α sea como mínimo del orden de 1/n,
siendo n el tamaño de muestra (estimación paramétrica). De este modo la determinación paramétrica de los
fractiles 0,025 y 0,975 requiere al menos 40 valores.
Para obtener estimaciones no paramétricas fiables de los intervalos de confianza al 90 % de los fractiles
tanto la IFCC como el NCCLS recomiendan como mínimo un tamaño de muestra de 120.

9.5. Determinación del intervalo de referencia en muestras “censuradas”


Una muestra aleatoria se denomina “censurada” cuando algunas observaciones quedan situadas en una
región perfectamente identificable pero cuyos valores absolutos se desconocen. Por ejemplo, los valores de
referencia obtenidos en aquellas determinaciones analíticas cuyo método tenga un límite detección tal que
un cierto número de valores son inferiores a dicho límite de detección x lod , comunicándose el resultado
como “menor que x lod ”. Se clasifican las muestras censuradas como “tipo I” cuando existe un punto fijo a
partir del cual se obtiene la información cuantitativa, y un “tipo II” cuando es un número fijo de
observaciones para el que no se dispone de valores cuantitativos. En el laboratorio clínico el caso más
habitual es la existencia de muestras censuradas tipo I.

9.5.1. Estimación de Intervalos de referencia en muestras censuradas tipo I


Procedimiento:
(a) Estimar el valor de la media y la varianza a partir de los datos existentes mediante las siguientes
fórmulas. Los datos deben ser normales (o normalizables) mediante las transformaciones oportunas
según se comentó anteriormente).

13
x * = x − λ ( x − x lod )
s2 = s 2 + λ ( x − x lod )

donde x * y s *2 son respectivamente las estimaciones de la media y la varianza de la población


censurada;
x y s2 son respectivamente la media y varianza muestrales;
x lod es el límite de detección; y

λ es el valor tabulado por Cohen (Tabla 2) al que se accede mediante el cálculo de


los parámetros:
s2
g =
(x − x )
2
lod

n−m
h =
n
Supóngase que se tiene la siguiente serie de resultados de una muestra de referencia

<46,40 (13) 51,10 52,80 62,10 73,40 99,70


46,40 51,40 53,17 65,70 80,10 102,70
46,70 52,20 53,60 68,70 83,20 105,70
49,10 52,40 54,10 68,70 83,90 107,50
49,50 52,40 56,40 69,50 85,90 112,10
49,60 52,51 57,50 72,00 88,70 112,40
50,50 52,80 60,40 73,40 90,30 115,70

Como se puede ver en este caso hay 13 resultados imposibles de detectar, por lo tanto se trata de una
muestra censurada tipo I. En este caso, suponiendo la normalidad de la distribución, la media muestral
“detectable” valdría 69,91 y la desviación típica 22,02; los parámetros h y g serían respectivamente:

22, 022
g = = 0,88
( 69,91 − 46, 4 )
2

51 − 38
h = = 0, 25
51
El valor de λ deducido de la tabla 2 es 0,4362, y por lo tanto las estimaciones de la media real y la
desviación típica de la distribución de referencia “censurada” serían:

x * = 69,91 − 0, 4362 ( 69,91 − 46, 4 ) = 59, 65


2

s * = 22, 022 + 0, 4362 ( 69,91 − 46, 4 ) = 26,95


(b) Estimar el intervalo de tolerancia según se ha comentado anteriormente. En este caso los límites de
referencia paramétricos serían:
l inf = 59, 65 − 1,96 × 26,95 = 6,83
l sup = 59, 65 + 1,96 × 26,95 = 112, 47

14
Tabla 2. Valores de l para fracciones de datos censurados h comprendidas entre 0,01 a 0,35 –parte
(a)– y entre 0,40 y 0,90 –parte (b): y valores del parámetro g entre 0,00 y 1,00.
El cálculo de g y de h se indica en el texto

15
10. Criterios para el cálculo de intervalos de referencia separados (criterios de
partición)

10.1. Criterio de Harris y Boyd (12)


Partiendo de dos subgrupos, por ejemplo varones y hembras, con medias µ1 y µ 2 , desviaciones típicas
σ1 y σ2, y n1 y n 2 los tamaños muestrales de dichos subgrupos, Harris y Boyd plantean la siguiente
ecuación:
µ 2 − µ1
z = 2
 σ 12 σ 22 
 + 
 n 1 n 2 
y proponen inicialmente un valor crítico de 3 para z , ajustado por el tamaño muestral, como un umbral para
participación:
n
z crítica 3 = 3
120
donde n es la media de los tamaños muestrales de los subgrupos.
Si la z calculada excede el valor crítico antes citado, Harris y Boy recomendaban la partición. Sin embargo,
observaron posteriormente que este criterio original era demasiado permisivo para la partición y propusieron
ajustarlo a 5:
n
z crítica 5 = 5
120
Aplicando este criterio se obtienen los siguientes estados de clasificación:
• Si z < z crítica 3 no se recomienda la partición;

• Si z crítica 3 ≤ z ≤ z crítica 5 la decisión de la partición debe hacerse basándose en otras


consideraciones que las meramente estadísticas (marginal);
• Si z ≥ z crítica 5 se recomienda la partición (partición).

10.2. Criterio de Lathi (13-15).


Se calculan las desviaciones típicas de los dos subgrupos
• Si el cociente R de las desviaciones típicas (la mayor dividida por la más pequeña) de los dos
subgrupos es R > 1,5 , se recomienda la partición;
• Si R ≤ 1,5 calcular D L y DU , las distancias entre los límites más bajos y más altos de referencia,
respectivamente, de los grupos y usar la desviación típica del subgrupo más pequeña como escala
unidad ( s ) ;

• Si ambas D L y DU son < 0, 25 s , no se recomienda la partición;

• [ ]
Si D L , DU está en el intervalo 0, 25 s , 0, 75 s y ninguna es ≥ 0, 75 s , la decisión de partición debe
hacerse en base a otras consideraciones que las meramente estadísticas (marginal);
• Si D L , DU o ambas son ≥ 0, 75 s se recomienda la partición.

10.3. Criterio de Linton


Recomiendan dividir los datos en subgrupos. Si la diferencia entre las medias de los subgrupos excede el
25 % de la amplitud del intervalo de referencia del 95 % para el grupo combinado, se recomienda la
partición.

16
10.4. Consideraciones no estadísticas
Las consideraciones no estadísticas necesarias en los casos marginales pueden incluir las siguientes:
• ¿es fácil en la práctica clínica obtener la información deseada para ser usada como un subgrupo
descriptor?
• ¿se usa el límite de referencia como un límite fijado de decisión clínica (valor discriminante, punto de
corte)? Una respuesta positiva a esta cuestión apoya la partición porque se incrementa la importancia
de un límite de referencia preciso;
• ¿apoyan los datos de la literatura la partición?
Es importante recordar que la aplicación de estas reglas presuponen que la distribución de los subgrupos
son normales o han sido transformadas en normales mediante la transformación de los datos (por ejemplo,
logarítmica), y que los tamaños deben ser en cada grupo lo que anteriormente se comentó.

11. Valores de referencia intraindividuales

11.1. Variabilidad intraindividual


La variabilidad total de los resultados analíticos puede expresarse de la siguiente forma :
s 2T = s 2ea + s 2a + s 2b + s 2w
2
donde: s T es la varianza total;

s 2ea es la varianza extraanalítica;

s 2a es la varianza analítica;

s 2b es la varianza interindividual;

s 2w es la varianza intraindividual.
2
La variabilidad biológica interindividual, s b , se estima como la dispersión de los resultados analíticos
obtenidos en una serie de individuos de referencia en idénticas condiciones.
2
La variación intraindividual, s Bw , se calcula mediante la dispersión de los resultados analíticos obtenidos en
un mismo individuo en las mismas condiciones que definen, por ejemplo, un estado de salud. En el estudio
de la variabilidad intraindividual deben tenerse en cuenta dos factores: el periodo de tiempo durante el que
se van recogiendo resultados –valores de referencia– y la frecuencia con que son obtenidos. Dentro de la
variabilidad biológica interindividual puede distinguirse una variabilidad a corto plazo que incluye las
variaciones producidas a lo largo de un día y la variabilidad a largo 'plazo que incluye periodos más
prolongados, por ejemplo, meses o años.
Hace años se introdujo el concepto de índice de individualidad ( i.i.) definido por la siguiente expresión:

CV a2 + CV w2
i.i. =
CV b2
donde CV a representa el coeficiente de variación analítico;

CV w representa el coeficiente de variación biológica intraindividual;

CV b representa el coeficiente de variación biológica interindividual.


Cuando el i.i. es superior a 1,4, los valores de referencia basados en población tienen utilidad con fines
comparativos, pero si es inferior a 0,6 el intervalo de referencia basado en la población es poco sensible, ya
que incrementos relativamente grandes observados en un individuo pueden pasar desapercibidos al
comparados con un intervalo de referencia, poblacional cuya amplitud lo enmascare. En la figura 1 se puede
ver un ejemplo de una magnitud con fuerte individualidad biológica, la fosfatasa alcalina, con i.i. < 0, 6 y

17
como puede observarse los valores de referencia poblacionales son de muy poca utilidad. En la figura 2 se
expone el caso del potasio con i.i. > 1, 4 y como puede observarse los valores de referencia basados en
población si son de utilidad.

Figura 1. Medias de los individuos (círculos), intervalos individuales (barras horizontales) y límites
de referencia poblacionales (líneas discontinuas) de la concentración de fosfatasa alcalina en suero
de 37 sujetos sanos (16)

Figura 2. Medias de los individuos (círculos), intervalos individuales (barras horizontales) y límites
de referencia poblacionales (líneas discontinuas) de la concentración de ion potasio del. suero de 37
sujetos sanos. (16)

Una solución general a este problema es la participación de la población según criterios que reduzcan la
variabilidad a través de aumentar la homogeneidad de la subpoblación. Otra forma de mejorar la

18
sensibilidad del intervalo de referencia, en estos casos donde la variabilidad interindividual es
proporcionalmente mayor, es calcular intervalos de referencia para el individuo.
Los valores de referencia basados en individuos son valores puros del mismo individuo, obtenidos cuando
el/ella estaba en un estado de salud definido. La comparación de valores observados con valores de
referencia basados en individuos frecuentemente es un método más sensible para detectar cambios en el
estado bioquímico o fisiológico porque la variabilidad generalmente es menor en un individuo que en el
conjunto de individuos.

11.2. Valores de referencia intraindividuales


Los valores de referencia intraindividuales se obtendrán calculando un intervalo de resultados analíticos que
contenga –con una determinada probabilidad– el resultado de analizar un próximo espécimen siempre y
cuando se tengan en cuenta los especímenes anteriores. Un intervalo así definido es un intervalo de
predicción y su estimación es el intervalo de referencia del individuo.
Para poder utilizar un intervalo de referencia individual deberán satisfacerse las siguientes condiciones:
(a) deben haberse obtenido determinaciones analíticas con las que calcular el intervalo de referencia;
(b) estas determinaciones previas deben haberse realizado en igualdad de condiciones por lo que hace
referencia tanto a los aspectos analíticos (mantenimiento de la misma inveracidad e imprecisión) como
fisiopatológicos del individuo;
(c) para poder efectuar el cálculo del intervalo de predicción se asume que las determinaciones analíticas
fueron realizadas con una periodicidad regular;
(d) los modelos teóricos en los que se basan los cálculos propuestos corresponden al análisis de series
temporales.

11.3. Fundamentos teóricos


El cálculo de los valores de referencia intraindividuales se basa en la parte de la estadística denominada
análisis de series temporales. El análisis de series temporales tiene por finalidad la descripción de
fenómenos que se suceden en el tiempo, su explicación, la predicción de eventos futuros, y el control de
tales fenómenos si esto es posible. Los fenómenos a los que se alude son fenómenos aleatorios, es decir,
que se observan con una cierta variabilidad, como sucede con los resultados analíticos, sin que se
presuponga que la variabilidad sea intrínseca de los fenómenos o, por el contrario, sea atribuible a los
procedimientos de observación.
En el análisis de series temporales se consideran observaciones ordenadas en el tiempo que pueden ser
dependientes o no dependientes. Cuando una observación es dependiente de las anteriores, éstas pueden
ser utilizadas para predecir con un margen de confianza determinado, su valor. Si pudiera predecirse con
toda exactitud se trataría de fenómenos determinísticos, Por lo general, las series temporales que pueden
ser encontradas en Bioquímica Clínica son de tipo no determinístico, esto es, que pueden ser utilizadas
para predecir sólo en parte un resultado o, dicho de otro modo, predicen un resultado con un determinado
grado de confianza.
Aunque no de forma unánime, en análisis de series de tiempo se consideran varios tipos de variación
susceptible de ser analizada y posteriormente eliminada:
(a) variaciones cíclicas, por ejemplo, la variación estacional, circadiana, etc.;
(b) tendencias, cambios en el valor promedio;
(c) fluctuaciones irregulares que se producen aleatoriamente sin seguir un patrón definido.
El análisis de series temporales distingue dos tipos de modelos: los modelos estacionarios, caracterizados
por la ausencia de cambios sistemáticos en la tendencia, en su varianza y en la periodicidad; y los modelos
no estacionarios. Las técnicas estadísticas hacen referencia a modelos estacionarios. Cuando aparece un
fenómeno no estacionario, a través de transformaciones matemáticas se puede convertir en estacionario,
suprimiendo la periodicidad o la tendencia.
En un instante t la concentración real de un constituyente bioquímico es m t . Sin embargo, al existir una
desviación o error analítico y preanalítico ya se obtiene una estimación de esta concentración:
xt = mt + a
Un modelo general que explique la variabilidad de m t podría ser:

19
(
m t = µ + ρ ( m t −1 − µ ) + e t )
donde: µ es el valor homeostático subyacente al que tiende el constituyente bioquímico;

ρ ( m t −1 − µ ) indica la influencia del último instante considerado m t −1 ;

ρ es el denominado coeficiente de autocorrelación;


et corresponde a las fluctuaciones biológicas aleatorias que se distribuyen normalmente
con media 0 y varianza σ 2e .
Uno de los parámetros particularmente interesantes es el denominado coeficiente de auto correlación ρ .
Este parámetro se calcula de forma semejante a un coeficiente de correlación entre datos apareados,
teniendo en cuenta que aquí se aparea el primer resultado con el segundo, el segundo con el tercero, el
tercero con el cuarto hasta el penúltimo con el último. El coeficiente de auto correlación ρ adquiere valores
comprendidos entre –1,0 y 1,0. Si es negativo indica que el valor verdadero tiende a oscilar entre un
instante y otro. Cuando ρ es igual a 0 indica que no existe ninguna relación entre las determinaciones.
Cuando ρ se aproxima a 1,0 tanto más probable es la dependencia entre determinaciones sucesivas. El
valor absoluto de ρ igual a 1,0 indica que no existe un punto homeostático donde referirse.

A partir de las observaciones disponibles se realizarán las estimaciones de los parámetros µ , σ 2a , ρ , σ 2e


y el intervalo de predicción. Sin embargo, para que las estimaciones sean válidas el número de
observaciones previas debe ser muy grande –sobre las cincuenta puede empezar a calcularse con ciertas
garantías. Este número raramente se alcanza en química clínica por lo que debe adoptarse una actitud
práctica, considerando dos situaciones extremas: cuando ρ = 0 y cuando ρ = 1 .
Cuando el coeficiente de autocorrelación sea cero se tendrá un modelo denominado estrictamente
homeostático. El modelo general será:
mt = µ + et
xt = µ + et + a
Cuando el coeficiente de autocorrelación sea la unidad se tendrá el denominado modelo random walk
(camino al azar). Es un modelo de serie temporal no estacionario, donde el término de errores, e t , es en
realidad un número indeterminado ya que no existe el punto de referencia o valor homeostático. El modelo
general será:
m t = m t −1 + e∗t

20
i xi x i2 d i = x i − x i +1 d i2 x1 − x (x i − x )( x i +1 − x )

1 x1 x12 d 1 = x1 − x 2 d 12 x1 − x (x 1 − x )( x 2 − x )
2 x2 x 22 d1 = x 2 − x3 d 22 x2 − x (x 2 − x )( x 3 − x )

x n −1 − x
n −1 xn −1 x n2−1 d n −1 = x n −1 − xn d n2−1 (x n −1 − x )( x n − x )
n xn xn2 − − xn − x

n n n n n −1
Sumas ∑ xi ∑ x i2 ∑di ∑ d i2 A = ∑ ( x i − x )( x i −1 − x )
i =1 i =1 i =1 i =1 i =1

1 n
Media aritmética x= ∑ xi
n i =1
2
 n 
Suma de
cuadrados y n
 ∑ xi 
SCD = ∑ x i +  
2 i =1
desviaciones
i =1 n
2
 n 
SCD n
 ∑ di 
σˆ a = estimación de la
s2 = ∑ di +  
i =1
Varianzas
n −1 i =1 n impresión analítica
s d2 =
n −1

modelos
homeostático autorregresivo random walk
ρˆ = 0 B = ( t − 1) σˆ 2a
ρ coeficiente de
A ρˆ = 1
autorrelación ρˆ =
SCD − B
cˆ = 0

cociente entre σˆ d s d2
c σˆ e′  SCD  cˆ = = −2
variancias cˆ = = −1 (1 − ρˆ 2 ) σˆ a σˆ a
σa  B
ˆ 

ponderación (indeterminado)
asignada a la H =I +c−ρ 2
( c + 2)
2
w última −c+ −4
− H + H + 4c ρ 2 wt =
observación wt = 2
2ρ 2
( xt )
yi = xi y i = xi

x 0 = y t ± 2 σ a wt + c +1 x 0 = y t ± 2 σ a wt + c + 1

21
s ( x j −1 − y j )
calculada por métodos
convencionales

n +1
x0 predicción
x 0 = x ± 2,5
n x0 = yt ± 2 s ( x j−n − y j ) (
x0 = y t ± 2 s x j,n − y j )
Tabla 3

La selección de uno u otro modelo implicará la forma de establecer los futuros valores. La representación
gráfica de las diferencias:
yt = xt − yt −k
frente a los diferentes valores de k permite distinguir el tipo de modelo: si la gráfica oscila alrededor del eje
se trata de un modelo homeostático; si se desplaza linealmente se trata de un modelo random walk. En esta
relación k = 1, 2, representa los espacios entre dos determinaciones.
En la tabla 3 se presenta de forma esquemática el cálculo de los intervalos según los diferentes modelos
extremos, utilizando un mínimo de 3 ó 4 determinaciones. Para el cálculo del intervalo de referencia se
calculará una ponderación w , de la observación más reciente x t . Esta ponderación depende del cociente
e entre la variación analítica y la variación fisiológica –diferencias d t –. En el modelo general, c′ es el
σ 2b
cociente entre la variación biológica y la analítica: calculada a partir de la fórmula citada
σ 2a
anteriormente, conteniendo el coeficiente de autocorrelación ρ .
Cuando un valor observado rebasa el límite de referencia intraindividual debe ser considerado patológico,
aunque no llegue a rebasar el límite de referencia poblacional.

12. Utilización de los valores de referencia


Los intervalos de referencia pueden utilizarse para comparar entre sí diferentes poblaciones o para
comparar un valor aislado con los valores de referencia.

12.1. Comparación de poblaciones


La comparación de diferentes poblaciones entre si puede tener diferentes objetivos: (a) estudios
epidemiológicos o antropológicos –que resultan obligados cuando se considere la posibilidad de transferir
los valores hallados en una población a otra diferente; (b) estudios de selección de determinaciones
bioquímicas, en que la población de referencia actúa de control en la valoración de la efectividad clínica de
una determinación analítica; (c) estudios de valoración de efectos de medicamentos y otros agentes
exteriores sobre las determinaciones bioquímicas.

12.1.1. Estado de referencia


En la comparación de dos o más poblaciones, puede ser interesante desde el punto de vista de economizar
tiempo, esfuerzo y costes, el definir un estado de referencia en que se realizará la comparación. En base a
estudios epidemiológicos, puede definirse el siguiente estado de referencia:
• Individuos de 20 a 30 años;
• Sin sobrecarga ponderal;
• Ayuno previo de 12 h;
• No tomar medicamentos;
• Consumir menos de 45 g de alcohol por día;
• Fumar menos de 10 cigarrillo por día;
• Sin enfermedad manifiesta.

22
12.2. Comparación de un valor observado con los valores de referencia
Cuando se habla de “comparación” se hace en un sentido más trivial que estadístico de la palabra. Sin
embargo, no debe perderse de vista que tal comparación puede resultar equívoca si no se ajusta al máximo
la población (subpoblación) de referencia a las características del individuo del que se ha observado el valor
analítico que se desea interpretar.
El valor observado puede presentarse solo o acompañado de alguna transformación que “suplante” su
valor, y que contenga simultáneamente la información inherente al valor observado y a los valores de
referencia. Existen numerosas transformaciones descritas en la literatura. Su elección deberá hacerse en
función tanto de la situación clínica en que deba actuarse (cribado, diagnóstico diferencial, seguimiento,…)
como de las disponibilidades de cálculo o apoyo informático de que disponga el laboratorio.

12.2.1. Transformaciones lineales basadas en la dispersión de la población de referencia


(a) Clasificación de los valores observados en tres tipos. Se clasificará al valor observado en tres
categorías (“–1”, “0”, “+1”) si su valor está por debajo, dentro, o por encima de los límites de referencia.
El intervalo de referencia vale “0”. Se trata de un procedimiento poco sensible que puede enmascarar la
variación intraindividual y representa una pobre y grosera utilización del intervalo de referencia. En el
caso de una muestra de referencia con media 60, 60 pertenecería a la categoría “0”; un valor de 30
sería “–1” y un valor observado de 100 sería “+1”
(b) Clasificación en nueve (sta-nine) o diez (sta-ten). Para obviar la pérdida de información del método
anterior, se ha propuesto aumentar el número de categorías en nueve y diez. Cada categoría
representaría la novena o la décima fracción de la desviación típica de la muestra de referencia, de
modo que el intervalo de referencia al 95 % valdría respectivamente [2, 8] y [1, 8]. Este sistema a pesar
de representar un refinamiento respecto al anterior, no ha llegado a hacerse demasiado popular.

12.2.2. Transformaciones lineales basadas en la localización de la población de referencia

Siendo x el valor de la media aritmética de la muestra de referencia, x 0 el valor observado y L el límite de


referencia, se han propuesto las siguientes transformaciones:
x0
(a) en este caso, el intervalo de referencia recubre la extensión de la recta real;
x
x0
(b) en este caso el intervalo de recubre el Intervalo entre − ∞ y 1;
L
x0
(c) (“Centinormalizado”) descrito en principio para resolver el problema de la interpretación de los
L
100
Intervalos de referencia de enzimas. El factor L es un factor propio de cada laboratorio
100
fácilmente sustituible cuando se modifique la metodología, instrumental, etc.. Sólo existiría un
límite de referencia igual para todas las determinaciones, 100.

12.2.3. Transformaciones lineales basadas en la localización y la dispersión


(a) Unidades SD (“USD”, desviaciones equivalentes normales, etc.) que miden la distancia a la media de la
muestra de referencia en desviaciones típicas de esta muestra. Se calcula la cantidad
x0 − x
s
que implica la utilización de dos estadísticos, x y s , razón por la que se debe comprobar la
gaussianidad de la muestra de referencia. De no ser normal, se desaconseja su uso. Sin embargo, se
puede utilizar con efectivos superiores a 500 valores y muestras aproximadamente simétricas. Con
intervalos de referencia estrechos (desviaciones típica pequeñas) pueden obtenerse valores USD tan
grandes como las propias magnitudes, perdiendo interés la transformación. El intervalo de referencia del
95 % sería [-1,96 ; 1,96].
(b) Transformaciones probit. Se obtienen añadiendo 5 unidades a los valores USD citados anteriormente.
El intervalo de referencia del 95 % sería [3,04 ; 6,96]
(c) Valor relativo. Definido por:

23
2 x0 − R
R
donde R es el rango del intervalo de referencia. El intervalo de referencia del 95 % sería [-1 ; 1].
(d) Unidades clínicas, definidas por:
 x 0 − Me 
 + 10  × 10
 R 
donde Me es la mediana. El intervalo de referencia del 95 % central sería [80; 120].
(e) Unidades de cociente normal, definidas como:
20 × x 0 − 20 × Me + 100 × R
R
El intervalo de referencia del 95 % sería [90, 100]
(f) Valor relativo, definido como:
x 0 − moda
moda − L p
donde Lp es el límite de referencia más próximo a la moda. El Intervalo de referencia del 95 % sería
[-1; 1]

12.2.4. Otras transformaciones: fractiles


Esta transformación consiste en sustituir el valor observado por el fractil correspondiente. Cuando se trata
de distribuciones gaussianas se pueden calcular los fractiles (generalmente se usan percentiles) a partir de
las tablas de la distribución de Gauss. Si la distribución no es gaussiana, puede obtenerse el
correspondiente fractil a través de la comparación con una tabla de frecuencias relativas acumuladas de la
distribución de referencia, y viendo que frecuencia relativa tiene un valor de referencia igual al valor
observado (si no existe ningún valor de referencia idéntico, se interpolará entre los inmediatos superior e
inferior).
Constituye una forma más informativa y libre de suposiciones acerca de la forma de la distribución de
referencia. Por definición el Intervalo de referencia del 95 % estará delimitado por los percentiles 2,5 y 97,5.

12.2.5. Aproximación bayesiana


Existen otra serie de técnicas paramétricas –por lo tanto, únicamente utilizables cuando las distribuciones
sean gaussiana– basadas en el teorema de Bayes, que permiten asociar a cada valor observado la
probabilidad de que se halle dentro o fuera del Intervalo de referencia.

12.2.6. Índice de atipismo


Este método, muy próximo al método de los fractiles y como se dijo anteriormente, bajo la suposición de
que la población sea gaussiana, asocia a cada valor observado x 0 un índice i 0 que representa la
probabilidad de hallar un valor analítico x que se halle más próximo a la media x que el valor observado
x 0 . Por tratarse de una probabilidad, i 0 se hallará comprendido entre 0 y 1. Los valores observados más
cercanos a la media tendrán índices de atipismo próximos a 0, y los más alejados tendrán índices próximos
a 1.
2
Llamando d al cuadrado de la distancia relativa a la desviación típica s entre el valor observado x 0 y la
media x :
2
 x0 − x 
d 2
=  
 s 
el índice de atipismo del valor observado x 0 viene dado por:

24
(
i o ( x 0 ) = Pr d 2 ( x ) ≤ d 2 ( x 0 ) )
La relación antes aludida del índice de atipismo i o x 0 ( ) con el fractil fr x 0 ( ) de un determinado valor
observado x 0 –cuando se trata de distribuciones gaussianas– se puede expresar por:

i 0 ( x 0 ) = 2 × fr ( x 0 ) − 1 para x 0 > x


i 0 ( x 0 ) = 1 − 2 × fr ( x 0 ) en otros casos

13. Valores de referencia univariantes frente a multivariantes

13.1. Región de referencia multivariada


Desde hace varios años, se ha procurado adaptar el método de los intervalos de referencia al caso
particular de los perfiles bioquímicos, constituidos por pruebas bioquímicas que forman un conjunto
coherente desde el punto de vista biológico (por ejemplo pruebas de función tiroidea, perfil hepático, etc.).
Estos perfiles contemplan específicamente un órgano o una función del organismo. Entre las
determinaciones que constituyen un perfil se encuentran correlaciones y complementariedades que
aumentan su eficiencia diagnóstica. Parece lógico pues, que un perfil sea interpretado globalmente,
teniendo en cuenta las interrelaciones entre sus distintos componentes. En este campo, es necesario tener
en consideración la distribución multigaussiana, generalización de la distribución gaussiana clásica.

{
En teoría, sea X = X 1 , X 2 ,… , X p } un perfil constituido por p determinaciones y suponiendo que las
distribuciones de X en una población de referencia de individuos presuntamente sanos sea
multigaussiana, de vector medio µ y de matriz de varianzas–covarianzas Σ . El vector medio está
constituido por las medias de cada uno de las pruebas {X 1 , X 2 ,… , X p } por lo que

µ = {µ 1 , µ 2 ,… , µ p }
Por otra parte, la matriz Σ es la generalización, al caso particular del perfil, de la varianza σ . Se trata de
2

una “tabla” cuadrada que comprende en su diagonal las varianzas de cada una de las pruebas, es decir,
{σ 2
1 , σ 22 ,… , σ 2p } , y por fuera de la diagonal, las covarianzas entre las determinaciones tomadas dos a dos
σ i j = cov { X i , X j } para i ≠ j .

En efecto, la covarianza σij es

σ i j = ri j σ i σ j
donde ri j es la correlación entre las dos pruebas X i y X j ; y

σi y σj son las desviaciones típicas correspondientes.


De modo que la covarianza mide las relaciones existentes entre las pruebas tomadas dos a dos.
El conocimiento de µ y Σ permite calcular la distancia de cualquier perfil observado
X = { X 1 , X 2 ,… , X p } , al centro de gravedad µ . Así, se puede escribir:
D 2 ( X ) = ( x − µ ) Σ −1 ( x − µ )
= ∑σ ( x
i, j
ij i − µ i )( x j − µ j )

−1
donde Σ es la inversa de la matriz Σ .

25
Debe tenerse en cuenta que D
2
( X ) es un número positivo, de valor tanto mayor a medida que X se aleja
de L . Si X = L , entonces D2 ( X) = D2 ( L ) = 0 .
Es necesario desde el punto de vista gaussiano, incluir en la región de referencia el 95 % de los individuos
cuya distancia D
2
( X) no exceda un valor crítico. Se demuestra que este valor crítico corresponde al fractil
0,95 de la ley de χ para p grados de libertado En otras palabras, la región de referencia, que es de
2

hecho una elipse, queda definida por:


RR = {X : D 2 ( X ) ≤ χ p2 ,0,95 }
Por ejemplo, para p = 3 , el límite vale 7,82, para p = 8 es igual a 15,51. Un perfil biológico X se interpreta
entonces de la siguiente manera: si X cae en el interior de RR , es decir, si su distancia D
2
( X) a µ es
inferior o igual a χ p2 ,0,95 , el perfil es considerado como “normal”, en caso contrario se califica de
“patológico”.

= 3,84 , es decir (1,96 )


2
Es importante remarcar que si p = 1 (una única prueba), χ 1,0,95
2
.
Por otro lado:
x −µ
D ( x) =
σ
y

{
RR = x : D ( x ) ≤ 1,96 }
= { x : µ −1,96 σ ≤ x ≤ µ + 1,96 σ }
es decir, el intervalo de referencia clásico. Así la región de referencia RR es la generalización del intervalo
de referencia.
En la práctica, cuando se quiere determinar la región de referencia, es necesario estimar µ y Σ . Para ello
se determina el perfil biológico X = X 1 , X 2 ,… , X { p } en n sujetos obtenidos al azar en la población de
referencia. Se obtienen así n perfiles x 1 , x 2 ,… , x n { } , siendo x = { x , x ,…, x } el vector medio de las
1 2 p

medias aritméticas de cada una de las pruebas y S la matriz de las varianzas–covarianzas de la muestra tal
que:
n  n  n 
n ∑ xi x j − ∑ xi ∑ x j 
S =
i , j =1  i =1   j =1 
n ( n −1)
2
Esta fórmula es la misma que la dada para la varianza s pero generalizada al caso de un perfil. Conviene
hacer una distinción sobre el tamaño muestral n , teniendo en cuenta, además, el número de pruebas p .

En general se debe tener en cuenta que n ≥ 10 . Así para 5 pruebas son necesarias como mínimo 50
p
observaciones y para 10 pruebas 100 observaciones. Por debajo de estos valores se debe actuar con
cautela.
En la práctica la región de referencia se obtiene sustituyendo x y S por µ y Σ , y modificando la distancia
crítica χ p2 ,0,95 de manera que se tenga en cuenta el tamaño de la muestra. Se obtiene entonces:

RR = {X : ( x - x ) S −1 ( x - x ) ≤ K }

p ( n 2 −1)
donde K= Fp , n − p ,0,95 ; y
n(n − p)

26
Fp , n − p ,0,95 es el fractil 0,95 de la distribución F de Snedecor con p y n − p grados de
libertad.
3× 9999
A título de ejemplo supóngase que p = 3 y n = 100 , el valor K es × 2, 70 = 8,34 en lugar de
100 × 97
χ 3,0,95
2
= 7,82 . Para comprobar si un perfil es patológico es suficiente calcular su distancia respecto a x y
ver si esta es superior o igual a 8,34. Albert (1981) determinó la región de referencia de un perfil bioquímico
constituido por magnitudes séricas, urea (mmol/L), urato (µmol/L) y creatinina (µmol/L), en 284 individuos
presuntamente sanos. En este caso K = 7,99 es próximo al valor teórico 7,82. En este ejemplo el perfil
(5,4, 298, 78) puede ser considerado como “normal” ya que D
2
( x ) = 0,58 . Por el contrario, el perfil (6,6,
387, 62) es claramente “patológico” ya que D
2
( x ) =14,53 > 7,99
A remarcar: (a) la hipótesis de multigaussianidad es esencial. Es necesario que cada constituyente
bioquímico del perfil siga una distribución gaussiana, de no ser así es necesario utilizar alguna
transformación como ha sido indicado anteriormente. En la práctica, calculando para cada perfil de la
muestra el valor de D
2
( x) y representando sobre un papel probabilístico los valores de D2 ( x ) o
3 D 2 ( x ) , se puede conocer la gaussianidad o no de la distribución. Así en el caso multigaussiano, los
puntos se reparten más o menos alrededor de una recta.
(b) El mismo método permite también juzgar la presencia de perfiles aberrantes (o extremos) que afectarían
de forma importante al cálculo de x y de S . Estos perfiles deben ser eliminados o corregidos.

13.2. Paradojas de la interpretación multivariada


La interpretación de un perfil bioquímico por el método de la región de referencia RR , o por el que consiste
en comparar cada resultado de una determinación separadamente respecto a su intervalo de referencia
(obteniéndose así una «caja» multivariada RR′ conduce a veces a situaciones paradójicas. Ello es debido
al hecho de que en el segundo caso, la probabilidad de que todos los resultados del perfil se encuentren en
( 0,95 )
p
el interior de su intervalo de referencia respectivo, es decir , disminuye con el valor de p .
Expresado de otra forma, a medida que aumenta el número de determinaciones, aumenta la probabilidad de
obtener algún resultado patológico. Así, para p = 10 , ( 0,95 ) = 0, 60 . Es decir hay una probabilidad de 4
10

sobre 10 de obtener un resultado anormal en alguna de las 10 determinaciones. Esta situación empeora
cuando existen correlaciones importantes entre las distintas determinaciones. Estos resultados se confirman
en la práctica.
(a) Paradoja de tipo 1
La paradoja de tipo 1 es la más frecuente. Se produce cuando el perfil es «normal» en la interpretación a
( )
nivel multivariado D ≤ K , pero uno o más resultados del perfil son «patológicos», es decir se encuentran
2

fuera de su intervalo de referencia. Las desviaciones univariadas no están exentas de interés clínico y
pueden quedar enmascaradas por una interpretación de los resultados estrictamente multivariada. Por lo
tanto, es aconsejable utilizar las dos aproximaciones con buen sentido.
(b) Paradoja de tipo 2'
Este tipo de paradoja, más rara (inferior al aproximadamente 1 %), ocurre cuando el resultado de cada una
de las determinaciones del perfil son normales, pero el perfil es “patológico” desde el punto de vista
multivariado. Así el perfil descrito anteriormente (urea = 6,6 mmol/L, urato = 387 µmol/L, y creatinina = 62
µmol/L) es “muy patológico” aunque cada resultado individual sea perfectamente normal. Esto se explica por
el hecho que la concentración de creatinina es mucho más baja respecto a la de urea y la de urato en este
paciente, ya que estas tres magnitudes se correlacionan de forma positiva.
Debido a la presencia de las paradojas de uno y otro tipo, se recomienda unir una interpretación
multivariada con la univariada. La eficiencia diagnóstica aumenta. La aproximación multivariada es menos
susceptible a los cambios individuales de las determinaciones de un perfil, pero permite poner en evidencia
la existencia de perfiles anormales que de otra forma hubieran pasado desapercibidos al bioquímico o al
médico.

27
14. Transferibilidad de valores de referencia

14.1. Introducción
Muchos laboratorios clínicos obtienen sus valores de referencia de acuerdo con las recomendaciones
elaboradas por las sociedades nacionales y por la IFCC, que instan a cada laboratorio a cumplir con su
responsabilidad de ofrecer unos valores de referencia apropiados que constituyan el primer eslabón en la
interpretación de los resultados producidos por este laboratorio. En algunas ocasiones la producción de
valores de referencia no resulta fácil o incluso puede no ser posible. Puede suceder que el número de
individuos de referencia disponible sea escaso. Esto ocurre en algunos centros hospitalarios cuya actividad
asistencial se realiza en pacientes previamente seleccionados y donde el individuo presuntamente sano
acude muy raramente. En otros casos, el volumen de trabajo del laboratorio es pequeño, y aunque el
número de individuos sanos que pueda acudir a este laboratorio para que se le realicen exploraciones sea
proporcionalmente mayor, el tiempo necesario para reunir una muestra de referencia sería demasiado largo.
En tales casos se recurre a buscar una muestra de referencia constituida por personal de laboratorio,
muestra que a menudo es sesgada y que adolece de representatividad por tratarse de un muestreo dirigido.
Por último, el coste de las determinaciones destinadas a obtener valores de referencia puede ser
demasiado oneroso para un determinado laboratorio. En cualquier caso, puede parecer excesivo que se
dupliquen trabajos de producción de valores de referencia en varios laboratorios o centros que sirvan a una
misma comunidad y muchas veces geográficamente muy próximos.
Por todo ello, la adopción de valores de referencia producidos por otro laboratorio –o por el mismo
laboratorio, pero con otro método analítico– constituye una solución para aquellos casos en que no sea
posible atender a la recomendación de producir valores de referencia en el mismo laboratorio. No obstante,
para que la adopción de valores de referencia sea correcta debe verificarse previamente la transferibilidad
de los mismos. Por transferibilidad se entenderá la propiedad de poder ser asumidos como propios los datos
obtenidos por un laboratorio diferente (o en el mismo laboratorio, por un método diferente) al que los ha
producido.
La transferencia de valores de referencia puede hacerse dentro del propio laboratorio cuando, por ejemplo,
se sustituye un método analítico o un instrumento por otro, y la repetición de la producción de valores de
referencia se considera lenta, cara o simplemente poco práctica. En otras ocasiones se implanta una nueva
determinación analítica en un laboratorio, dentro del área de influencia de otro centro donde ya se han
producido valores de referencia, siendo razonable entonces adoptar los del otro centro. Finalmente, cuando
ninguna de las circunstancias mencionadas es posible, debe recurrirse a la literatura científica o comercial
disponible.
En cualquier caso, el laboratorio que adopta los valores de referencia anteriormente producidos en este
mismo laboratorio, producidos en otro laboratorio, descritos en la literatura o contenidos en el folleto que
acompaña a los equipos de reactivos, tiene la obligación de comprobar que tales valores se ajustan a la
población que atiende este laboratorio y que la comparación que efectuará el médico clínico cuando reciba
el informe analítico será hecha con valores de referencia apropiados.
El sistema que se recomienda consiste en:
(a) La producción en el mismo laboratorio de una serie de valores de referencia dentro de los límites de lo
posible por lo que se refiere a número y representatividad;
(b) El estudio detallado de las características técnicas de los métodos analíticos utilizados;
(c) El estudio de los constituyentes bioquímicos desde el punto de vista fisiopatológico, de las variaciones
intra e interindividuales;
(d) La consideración de las características epidemiológicas o de representatividad de la muestra de
referencia, que constituye la base de la comparación.
Una vez se dispone de esta información, puede procederse a adoptar, recalcular o rechazar los valores de
referencia de otro origen según las técnicas estadísticas apropiadas.

14.2. Cálculo del intervalo de referencia


El intervalo de referencia puede calcularse de forma paramétrica o de forma no paramétrica según criterios
expuestos anteriormente. El tipo de intervalo marcará claramente la estrategia a seguir cuando se vaya a
transferir o a adoptar intervalos de referencia.

28
14.3. Procedimiento general
El procedimiento recomendado aquí se inicia con la producción de una serie corta de valores de referencia
en el laboratorio que desea adoptarlos. Estos valores se obtienen con todas las limitaciones ya citadas que
impedían al laboratorio producir sus propios intervalos de referencia según las recomendaciones habituales.
A pesar de todo, la selección de individuos deberá hacerse de la forma más precisa y representativa
posible. En caso de disponer de información contrastada acerca de factores de variación que sugieran la
necesidad de introducir particiones en la población (por ejemplo, la edad), todas las anteriores
consideraciones sobre la transferibilidad de valores de referencia pueden hacerse extensivas a
subpoblaciones de referencia originadas como consecuencia de tales participaciones. Se introduce
entonces el problema de seleccionar además un grupo o segmento de la población de referencia. En tales
casos se recomienda seleccionar un grupo homogéneo de individuos por ejemplo, en el estado de
referencia). A partir de este momento la estrategia a seguir viene condicionada por la información
disponible.
(a) Si se dispone de la serie completa de valores de referencia que ha dado origen al intervalo de referencia
candidato a ser adoptado, puede procederse a una comparación de los estadísticos que caracterizan a las
dos muestras. La comparación puede ser paramétrica (comparación de medias y varianzas) o no
paramétricas (mediante la prueba de Kolmogorov para la comparación de dos grupos de datos). La
hipótesis a demostrar es que ambas muestras proceden de la misma población.
(b) Cuando solamente se dispone del intervalo de referencia candidato a ser adoptado, desconociendo la
eventual equivalencia analítica o biológica, no es excesivamente recomendable proceder a la transferencia
de estos intervalos.
(c) Cuando el intervalo de referencia a adoptar sea un intervalo calculado de forma paramétrica y se
conozcan las equivalencias analíticas y biológicas se seguirá el esquema descrito en el apartado 15,
Comparación y transferencia de intervalos de referencia calculados de forma paramétrica.

15. Comparación de intervalos de referencia calculados de forma paramétrica


La transferencia de intervalos de referencia calculados de forma paramétrica será posible siempre que el
intervalo candidato a ser transferido y el intervalo producido sean equivalentes, es decir, se demuestre que
proceden de la misma población de referencia.

15.1. Parámetros de centralización: comparación de medias


La comparación estadística de dos medias x1 y x 2 estimadas a partir de dos muestras compuestas de n1
y n 2 observaciones, se hará mediante la prueba t de Student. La prueba no paramétrica equivalente, la
prueba U de Mann–Whitney, implica el conocimiento de toda la serie de valores de referencia candidatos a
ser transferidos. Por esta razón, caso de no satisfacer los requisitos de la prueba t , la comparación de
intervalos de referencia deberá hacerse por el procedimiento general no paramétrico descrito en el apartado
16.
(a) Hipótesis: se trata de verificar si la media µ de la otra población, con varianza σ2 común, pero
desconocida:
 H 0 : µ 1 = µ 2

 H 1 : µ 1 ≠ µ 2
(b) Realización de la prueba: se calculará el estadístico t de Student:
x1 − x 2
t =
1 1
s +
n1 n 2
donde: x1 es la media de la muestra de referencia producida provisionalmente con n1 individuos;

x 2 es la media de la muestra de referencia candidata a ser transferida, obtenida con n 2


individuos

29
s es la estimación de la desviación típica de la población calculada utilizando las respectivas
desviaciones típicas de las dos poblaciones: s 1 y s 2 :

s =
2 ( n −1) s + ( n
1
2
1 2 −1) s 22
n1 + n 2 − 2
(c) Conclusión: Se rechaza la hipótesis nula, aceptando que ambas medias son diferentes cuando:
t > t1− α 2
donde t1− α
2
es el valor en la tabla encontrado en la tabla de la t de Student, para un riesgo α con
n1 + n 2 − 2 grados de libertad.
(d) Limitaciones: esta prueba es utilizada correctamente cuando:
• ambas muestras han sido seleccionadas independiente y aleatoriamente;
• ambas muestras han sido obtenidas de una población que aproximadamente se distribuye según la
ley de Gauss o por lo menos simétricamente si es numerosa ( n > 30 individuos);
• cuando siendo n1 ≠ n 2 se ha verificado la igualdad de varianzas (según se indica en el apartado
15.2.). Cuando las varianzas son desiguales se procederá según se indica en el apartado 15.1.6.
(d) Número de casos necesarios: el número de casos está relacionado con la potencia de la prueba
estadística, es decir, la resistencia a caer en el llamado error β o declarar falsamente que dos medias son
iguales cuando no lo son. Cuando mayor sea la diferencia relativa que se pretenda poner de manifiesto,
menor será la cantidad de individuos necesaria.
Siendo n′ el número de individuos necesario a tomar:
t 1− α 2 CV 2
n′ =
d2
donde: t 1− α es el valor de la distribución t ;
2

CV es el coeficiente de variación;
d es el error relativo máximo, expresado en porcentaje de la media, con una confianza de
1−α .
Cuando n es suficientemente grande ( n > 30 ) , entonces: t 1− α
2
puede ser reemplazado por su
correspondiente valor en la distribución gaussiana: para α = 0, 05 , entonces t ≅ 2 y la fórmula queda
simplificada:
4 CV 2
n′ =
d2
(e) Cuando las varianzas σ 12 y σ 22 no son iguales se distinguen dos situaciones:

• Cuando el número de casos es pequeño n1 , n 2 > 30 ( ) se calculará la misma cantidad, t observada y se

comparará con la t 1− α tabulada para un número de grados de libertad ν :


2

2
 s12 s 22 
 n +
n1 
ν =  2 
2 2
 s 12   s 22 
 n   n 
 2
+
1

n 2 −1 n1 − 1

30
• Cuando el número de casos es mayor (n , n
1 2 > 80 ) ) entonces t = z N ( 0,1) , pudiéndose calcular la
siguiente expresión de t :
x1 − x 2
t observada =
s 12 s 22
+
n1 n2
2 2
donde: s 1 y s 2 son, respectivamente, las estimaciones de las varianzas de las poblaciones.

Se rechazará la hipótesis de igualdad de medias cuando t observada sea superior a la t tabulada .

15.2. Parámetros de dispersión: comparación de dos varianzas


La comparación de la dispersión de dos intervalos de referencia se hará mediante la prueba F :
(a) Hipótesis: las varianzas de dos distribuciones son iguales:
 H 0 : σ 12 = σ 22

 H 1 : σ 1 ≠ σ 2
2 2

(b) Cálculos: se calculará el estadístico F de la siguiente forma:


s 2máxima
Fobservada =
s 2mínima
(c) Interpretación: se rechazará la hipótesis de que ambas varianzas son iguales cuando:
Fobservada ≥ Fα ,ν 1 ,ν 2
donde: ν1 es el número de observaciones menos una correspondiente a la muestra que presenta
una varianza máxima;
ν2 es el número de observaciones menos una correspondiente a la muestra que presenta
una varianza mínima.
(d) Limitaciones: la prueba F es sensible a la no-gaussianidad de las poblaciones.
(e) Número de datos: la determinación del número de datos necesario para obtener una determinada
potencia estadística, o lo que es lo mismo, el determinar la potencia, dado el número de observaciones con
que se cuenta no es sencillo de establecer. A título orientativo, para un nivel de significación habitual
(α = 0, 05) y una potencia equivalente a un error β = 0,10 para poder detectar como estadísticamente
significativas diferencias del 100 % se requiere un número aproximado de 90 individuos. Si la diferencia a
detectar se desea que sea del 50 % las observaciones necesarias se acercan a 250.

15.3. Conclusiones
Cuando las comparaciones de los parámetros que definen la centralización y la dispersión de la muestra de
referencia, candidata a ser transferida con la serie de valores obtenidos en el laboratorio que desea
adoptarlos, dan como resultado que ambas muestras proceden de la misma población, podrán adaptarse
los valores de referencia y es razonable admitir los intervalos correspondientes a subpoblaciones originadas
a partir de particiones según criterios de variación biológica.
Cuando uno de los parámetros estudiados no sea igual podrá sustituirse en el valor del intervalo de
referencia:
x ± 1,96 s
Cuando ambos parámetros son diferentes, se rechazará la transferencia.
Esquemáticamente:

varianzas

31
iguales diferentes
iguales aceptar x ± 1,96 s′
medias
diferentes x′ ± 1,96 s rechazar

donde: x′ corresponde a los estadísticos candidatos a ser transferidos; y


x corresponde a los estadísticos calculados en el laboratorio y que desea adoptar.

16. Comparación de Intervalos no parámetricos


La transferencia de intervalos de referencia expresados de forma no paramétrica podrá hacerse cuando los
fractiles que limitan este intervalo sean iguales.

16.1. Prueba de comparación de fractiles


La prueba de comparación de fractiles está basada en la distribución binomial.
(a) Hipótesis: si el fractil p * de una muestra aleatoria X es x *

 H 0 : Pr ( X ≤ x *) ≥ p *

 H 1 : Pr ( X < x *) ≤ p *
(b) Cálculos: se utilizarán dos estadísticos:
T1 = número de observaciones menores o iguales a x * ;
T 2 = número de observaciones menores a x * .
de modo que cuando no existan observaciones iguales al valor propuesto de x * entonces, T1 = T 2 .
La región crítica de rechazo de la hipótesis, de un tamaño aproximado al valor α deseado, se obtiene
entrando en la tabla el número n de observaciones en la muestra de referencia provisional y valor p del
fractil apropiado (se presentan tablas para fractiles p = 0,95, 0, 05, 0,90, 0,10 ). En la tabla se buscará un
valor Y1 que sea aproximadamente la mitad del valor α deseado (por ejemplo, para α = 0, 05 deberá
localizarse un número t 1 correspondiente a un valor Y1 cercano a 0,025) y un segundo número t 2
correspondiente a un valor Y 2 tal que 1 − Y 2 sea aproximadamente la otra mitad de la región crítica
deseada (es decir, para una región α = 0, 05 entonces 1 − Y 2 = 0, 025 ). El grado de significación de la

prueba será α = Y1 + (1 − Y 2 ) .
(c) Interpretación: la hipótesis nula de igualdad de fractiles se rechaza, con un nivel de significación igual a
Y1 + (1 − Y 2 ) cuando T1 ≤ t 1 o bien cuando T 2 > t 2 .

16.2. Conclusiones
Cuando los fractiles que limitan el intervalo de referencia candidato a ser transferido pertenecen a la misma
población que los límites de referencia de la muestra producida en el laboratorio que desea adoptarlos,
podrán ser transferidos en los mismos términos expresados en el apartado 3.3.
Cuando no sea posible admitir tal igualdad, pero, no obstante, se tenga la evidencia de que ambos métodos
son analíticamente equivalentes, de modo que se conozca una ecuación de regresión que permita convertir
resultados de un método a otro, pueden transformarse las observaciones y proceder a recalcular los límites
de referencia y recomprobar su adecuación. En caso de que se comprobara dicha igualdad, podría
procederse a la transferencia de los valores candidatos aplicándoles la función inversa.

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