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Lab. Microbiología - Guía Práctica de Bacteriología Oscar D. Orós B.

INTRODUCCION
El objetivo del Laboratorio de Microbiología es el aislamiento del agente etiológico de la
enfermedad que aqueja a nuestro paciente. Luego a partir de éste se procederá a la
identificación y determinar la sensibilidad del microorganismo aislado.
Con el objeto de lograr esto y para dar una orientación temprana al clínico, se puede
proceder a la tinción y observación directa de la muestra. Luego se sembrará para
obtener colonias aisladas del agente infeccioso. Es a partir de estas colonias que se
procederá a la identificación mediante pruebas bioquímicas y a la determinación de la
sensibilidad a los antibióticos. En el Laboratorio de Microbiología deben tenerse
especiales precauciones a fin de evitar la contaminación de las muestras clínicas y de los
cultivos, así como la infección del operador.
Durante el siglo XX la Microbiología ha experimentado un rápido desarrollo en dos
direcciones distintas, una básica y otra aplicada. En su aspecto aplicado, los progresos
de Koch condujeron a un extenso desarrollo de la microbiología médica y la inmunología
en la primera parte del siglo, con el descubrimiento de muchas nuevas bacterias
patógenas y el establecimiento de los principios por los que estos patógenos infectan el
cuerpo y se hacen resistentes a las defensas del mismo
Hacia los años setenta nuestros conocimientos sobre los procesos básicos de la
fisiología, la bioquímica y la genética bacteriana avanzaron de tal modo que hicieron
posible manipular experimentalmente el material genético de las células usando
bacterias como instrumentos. Esos conocimientos también permitieron introducir
material genético (DNA) de origen exógeno en bacterias y controlar su replicación y
características. Esto llevó a la aparición de la biotecnología.

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CONTENIDO

INTRODUCCION Pag.

RECOMENDACIONES Y BIOSEGURIDAD 03
Prac, Nro. 1. MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO 07
Prac, Nro. 2. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 12
Prac. Nro. 3.PLAQUEO Y ENTUBADO DE MEDIOS DE CULTIVO 15
Prac. Nro. 4.MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS. 20
Prac. Nro. 5.SENCIBILIDAD BACTERIANA 24
Prac. Nro. 6.TINCIÓN GRAM 27
Prac. Nro. 7.TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (acido resistente) 31
Prac. Nro. 8.COLORACIÓN DE ESPORAS, TINCIÓN NEGATIVA 33
Prac. Nro. 9.RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS. 35
Prac. Nro. 10.RECUENTO DE COLIFORMES: DETERMINACIÓN DEL (NMP). 38
Prac. Nro. 11.IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS. 42
Prac. Nro. 12. IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS 47
Prac. Nro. 13.IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS 52
Prac. Nro. 14.IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS 56

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RECOMENDACIONES Y BIOSEGURIDAD

La BIOSEGURIDAD, se define como el conjunto de medidas preventivas, destinadas


a mantener el control de factores de riesgo laborales procedentes de agentes
biológicos, físicos o químicos, logrando la prevención de impactos nocivos.

Se entienden como Precauciones Universales al conjunto de técnicas y


procedimientos destinados a proteger al personal que conforma el equipo de salud
de la posible infección con ciertos agentes, principalmente Virus

Medidas de Bioseguridad son un conjunto de medidas de sentido común que


permiten prevenir la exposición del personal a riesgos innecesarios.

En el Laboratorio de Microbiología deben tenerse especiales precauciones a fin de


evitar la contaminación de las muestras clínicas y de los cultivos, así como la
infección del operador.

Recomendaciones:

Antes de venir a clase lea el ejercicio o práctica que será ejecutada ese día, de tal
forma que Ud. Pueda entender lo que se hará en clase.

Siempre planifique su trabajo para evitar perdidas de tiempo. Tome nota de todo lo
que se está ejecutando durante las prácticas.

Asuma que todos lo microorganismos con que Ud. Está trabajando son patógenos
(causantes de enfermedad).

Riesgo por agentes biológicos

Este se produce por la inhalación, ingestión o contacto directo


con la piel, mucosas y conjuntiva de los microorganismos.

Riesgo por agentes químicos

Este se produce por la ingestión, inhalación y contacto directo


de la piel, mucosas y conjuntiva con sustancias tóxicas,

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corrosivas, inflamablese irritantes.

Riesgo por agentes físicos

Este se produce al estar en contacto con sustancias


radioactivas, radiaciones, exposición a ruidos, fuego o
electricidad.

Medidas mínimas de bioseguridad que deben ser aplicadas en el Laboratorio


de Microbiología

1. Uso obligatorio de guardapolvo o mandil


blanco.
2. Si tiene el pelo largo, éste debe ser recogido.
3. No comer, fumar ni beber dentro del
Laboratorio.
4. Tener absoluto cuidado del material y equipo,
manteniéndola limpia y cumpliendo con las
instrucciones del jefe de prácticas.
5. En caso de derrame de material contaminado,

avisar inmediatamente al encargado.


6. Nuncausar la boca directamente para
pipetear ni etiquetar o rotular los envases.
7. Cualquier accidente (rotura de tubos,
placas que contengan cultivos, así como
heridas de las personas) debe comunicar
al técnico de laboratorio para que tome
las medidas necesarias.
8. Desechar el material contaminado en los
recipientes adecuados.
9. Uso cuidadoso de los mecheros (guantes)
para evitar quemaduras.
10. No amontonar material innecesario en la
mesa de trabajo, sino tener lo

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indispensable.
11. Prever una probeta que contenga solución
de fenol al 2 %, lugol o amonio cuaternario
para introducir las pipetas usadas.
12. Debe dejarse las mesas de trabajo limpias y
en orden y no botar basura a las canaletas
para evitar obstrucciones.
13. Cerrar el gas cada vez que no sea
empleada así como las llaves de grifos y
lámparas.
14. Lavarse las manos con agua y jabón antes
de retirarse del Laboratorio.

Control de la contaminación dentro del Laboratorio

Es de la mayor importancia el evitar la contaminación de las muestras, para así


obtener un buen diagnóstico. Es necesario por lo tanto que el operador trabaje
haciendo uso de una buena técnica aséptica y usando material estéril.

Esterilización

Proceso que elimina toda forma de vida. Elimina bacterias y sus formas de
resistencia, las esporas, elimina virus, y hongos.

Técnica aséptica

Tanto los medios de cultivo como las muestras deberán manipularse con técnica
aséptica, que será practicada en el laboratorio. Las técnicas de siembra aséptica y
de siembra de aislamiento también serán llevadas a la práctica.

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PRACTICA Nro. 1

RECONOCIMIENTO DE MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

En el laboratorio de microbiología se usa una infinidad de materiales y equipos


desde las más simples hasta las más sofisticadas, a continuación se mostrarán y
conocerán su uso especialmente en microbiología.

1. Refrigeradoras y congeladoras.

Las refrigeradoras se requieren para


almacenar medios de cultivo, sueros, discos
de sensibilidad. El uso de las congeladoras
son para el almacenamiento prolongado de
sueros, enzimas, etc.

Deben localizarse lejos de los hornos de aire


caliente, de radiadores y de tuberías de
agua caliente.

2. Autoclave.

Hay de diversos modelos y marcas, estos pueden


funcionar a electricidad o a gas propano, cuya
temperatura de funcionamiento es de 121ºC por 15
Libras de presión durante 15 a 30 minutos. Se
fundamenta en la ebullición del agua a una presión
superior al normal, elevando la presión atmosférica así
como la temperatura,en consecuencia el vapor de
agua penetra por osmosis a la célula coagulando su
citoplasma, destruyéndose las formas vegetativas y
esporuladas.

3. Equipo para filtraciones.

En la actualidad se usan tres tipos de filtros, para la esterilización por filtración:

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Filtro de membrana.- Disco de elevada porosidad de esteres de celulosa (acetato de
celulosa), con variada gama de diámetro de poros, retienen en su superficie aquellas
partículas que sobrepasan un tamaño dado. La retención de partículas se efectuará
por medio de poros y no por atracción o adsorción
electrostática.

Filtro Seitz.- Discos formados por una mezcla de


amianto y celulosa. La retención de bacterias se
hace por adsorción y atracción electrostática.

Filtros de placa filtrante de vidrio.- Compuesto de


fragmentos de vidrio fundido formando un disco, y
que suelen utilizarse para volúmenes relativamente baratos y resultan útiles para
volúmenes grandes.

4. Centrifuga.

Son aparatos diseñados para acelerar la


separación de particular sólidas suspendidas en
líquidos. La velocidad a la cual sedimentará las
partículas en un líquido depende de varios
factores como; Tamaño de partícula, viscosidad
del líquido, peso de la partícula y fuerza
gravitacional.

Existen centrífugas de los más diversos tipos de acuerdo al uso al cual están
destinados. Las velocidades que se obtienen son también variables, hay centrífugas
de mano, centrífugas que dan 1,500 rpm y otras de 3,000 a 5,000 rpm y otras son
ultra centrífugas que dan hasta 18,000 rpm.

Para trabajar con las centrífugas, se debe tener en cuenta las siguientes
recomendaciones:

- Asegurarse de conocer el manejo de una centrifuga determinada antes de


utilizarla, seleccionando los tubos adecuados a su velocidad.
- Cubrir los tubos a centrifugar con tapón de algodón (sujetado de tal forma que

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no vaya al fondo) o con papel de aluminio.
- Contrapesar los tubos por centrifugar que van opuesto uno del otro.
- Subir la velocidad de la centrifuga lentamente, una vez terminada la operación
reducirla también lentamente.

5. Microscopio.
El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio
óptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen
aumentada del objeto.Algunos microscopios ópticos
pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces.
El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de
lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos
opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está compuesto
de varias lentes que crean una imagen real aumentada del
objeto examinado. Las lentes de los microscopios están
dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular.
Cuando se mira a través del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la
imagen real. El aumento total del microscopio depende de las distancias focales de
los dos sistemas de lentes.

6. Estereoscopio.

También, llamado microscopio estereoscópico, utilizado


en el laboratorio de microbiología para realizar
observaciones de la morfología de las colonias en medios
de cultivo en placas petri, etc.

7. Estufa eléctrica.
Equipo empleado para el cultivo de las muestras
clínicas, en medios de cultivo. La temperatura de
este equipo se gradúa de acuerdo al tipo de
microorganismo que se quiere aislar (psicrófilos,
mesófilos y termófilos).

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8. Horno eléctrico.

Equipo eléctrico cuyo funcionamiento es automático


llegando a un máximo de 220ºC de temperatura por
un tiempo de 2 horas. Se usa para esterilizar
material resistente al calor seco como acero
inoxidable, pirex, etc.

9. Cuenta colonias.

Equipo eléctrico, provista de una fuente de luz y


una lupa, con la finalidad de visualizar las colonias
pequeñas presentes en la placa petri, de esta
manera efectuar un conteo más exacto del
número de colonias.

10. Balanza de precisión.

Este equipo es útil para el pesado de los


medios de cultivo en su preparación, así como
muestras clínicas, alimento que serán
sometidas a análisis y cuantificación de
gérmenes por gramo de muestra.

11. Jarras de anaeobiosis.

Este equipo sirve para proporcionar un ambiente


carente de oxigeno y muchas veces
proporcionarle un determinado porcentaje de
CO2, en el proceso de cultivo de
microorganismos anaeróbicos o microaerófilos.

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12. Estuches para pipetas y placas petri.

Necesarios para someter a las pipetas y placas


al proceso de esterilización. Posterior a esta
mantenerlos estériles hasta el momento de su
utilización.

Homogenizador.

Equipo eléctrico que a través de vibraciones


enérgicas se consigue el homogenizado del
contenido que generalmente es liquido
mezclado con partículas grandes.

13. Equipo de siembra.

Existe una variedad de materiales y equipos de siembra como; trípode, malla de


asbesto, mechero bunzen, guantes de asbesto,asa de kolle, aguja de kolle, espátula
de Drigalky, teas,placas petri, gradillas, etc. Algunos de ellos se muestran en las
siguientes fotos.

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PRACTICA Nro2
ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN DE MATERIAL DE LABORATORIO

Introducción.
Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios
de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido adaptar a estos
cambios, se han distribuido en una gran diversidad de hábitats incluyendo los de
condiciones extremas sobre todo de tipo físico y químico.
Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y
esterilización para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización es un método
de eliminación total de todo tipo de organismo y que asegura la ausencia absoluta
de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso que
solamente elimina formas vegetativas de los microorganismos.
ESTERILIZACION POR METODOS FISICOS.
 CALOR SECO. Realizada en hornos, elimina bacterias y esporas por destrucción
oxidativa de los componentes celulares a temperaturas de 180 a 200°C por 1
hora.
 CALOR HUMEDO.
 Ebullición. El agua hirviendo a 100°C por 10 minutos destruye todos los
microorganismos no esporulados.
 Autoclave. El vapor a 15 Lbrs. De presión a una temperatura de 121°C
elimina a las esporas en 15 minutos.
 Pasteurización. En la pasteurización lenta, la temperatura alcanza los
63°C y debe permanecer durante 30 minutos, y en la pasteurización
rápida la T° debe alcanzar 72°C durante 15 minutos, sobreviven alguna
bacterias en forma vegetativa que resisten al calentamiento.
 FILTRACION.
 Filtros. A través de filtros de membrana, estos poseen varios grados de
porosidad, el diámetro de los poros oscila entre 0.22 a 0.10 μm. se emplea
para la purificación de medios a través de la retención de bacterias.
 RADIACION. La luz solar directa destruye con bastante rapidez las formas
vegetativas de los microorganismos que carecen de protección. La acción
bactericida de la luz solar se debe a la banda ultravioleta del espectro.
 LUZ ULTRAVIOLETA. Es utilizada en flujo laminar, quirófanos y otras zonas, con
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el fin de disminuir las infecciones transmitidas a través del aire.
ESTERILIZACION POR METODOS QUIMICOS. Pueden utilizarse como
desinfectante muchas sustancias químicas, dado que el número y la variedad de
productos es cada vez mayor, deben elegirse cuidadosamente las formulaciones de
acuerdo a las necesidades concretas.
La actividad germicida de muchas sustancias químicas pueden ser modificadas u
optimizadas por factores externos como: La temperatura, pH, tiempo de la actividad,
naturaleza del microorganismo, presencia de material extraño, etc.

Objetivos.
1. Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización de
materiales de vidrio y medios de cultivo de uso común en microbiología.
2. Observar el efecto de asepsia en el control de la contaminación
microbiana en el laboratorio.

Materiales de laboratorio por equipo Materiales del equipo


6 cajas Petri con agar nutritivo (AN) Limpiador de pisos Marcador indeleble
6 cajas de Petri con agar papa dextrosa
cloro Cerillos
(PDA)
Hisopos estériles Franela Colores
Algodón

Actividad práctica
Prueba de esterilidad
1. Abrir una caja de Petri de cada medio durante 1 min. En el laboratorio o zonas
accesorias al mismo y se etiquetará “aire”
2. La segunda caja de cada medio de cultivo se abrirá durante 30 seg. En el
área aséptica y se etiquetará “área aséptica”
3. Tercer caja se conservará sin abrir y se etiquetará “control”

Prueba de desinfección
1. Limpiar el área de trabajo con el limpiador de pisos siguiendo las
instrucciones del fabricante.

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2. Con el hisopo estéril recorre toda el área que limpiaste y posteriormente
siembra tu caja de Petri con el mismo hisopo.
Resultados
o Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con
diferentes medios de cultivo y con los distintos tratamientos en relación a la
caja control.
o Reportar el crecimiento en forma cualitativa: sin crecimiento (-), poco
crecimiento (+), crecimiento regular (++), crecimiento abundante (+++).
o Discuta los resultados y determine si la esterilización en la autoclave y horno
fue adecuada, así como el manejo de materiales.

Cuestionario
1. ¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en microbiología?

2. ¿en que tipo de materiales se aplica cada uno?

3. Explique cuales son los procesos de esterilización, desinfección y asepsia.

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PRACTICA Nro. 3

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIÓN

Los medios de cultivo son fuentes nutritivas, naturales o sintéticas, que semejan el
nicho ecológico de los microorganismos. Especies bacterianas diferentes,
cultivadas en el mismo tipo de medio, pueden aparecer diferentes, de este
modo el conocimiento de la apariencia o de las características culturales, de las
especies bacterianas, es útil para el reconocimiento de cierto tipo de
bacterias.

FUNDAMENTO

Cada individuo tiene propio ambiente y forma de vida, y para cultivar o


hacer multiplicar a los microorganismos, se les somete a un ambiente parecido
donde haya alimentos, temperatura, pH, presión atmosférica, y presión osmótica
adecuados.

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

1- Por su origen.

Naturales, medios a base de leche y papa.

Artificiales, siendo transformados por medios mecánicos o químicos,


Ejm. Agar nutritivo, Agar McConkey.

2- Por su consistencia.

Líquidos, soluciones acuosas; Caldo nutritivo, caldo BHI.

Solidos el componente principal es el Agar-agar; el Agar nutritivo,


Agar sangre, Agar SS etc.

3 - Por su objetivo.

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a. Medios de transporte, mantiene microorganismos viables y
conservados; Cary Blair, Medio Stuard.
b. Medios de enriquecimiento. Multiplica bacterias antes de su siembra;
Caldo selenito, Caldo tetrathionato.
c. Medios de enriquecimiento mejorados. Constituidos por un medio
base, se añade sustancias ricas en proteínas como el Agar sangre.
d. Medios de aislamiento.
 Medios de aislamiento no selectivos Sirven para aislar o cultivar
bacterias, no contienen inhibidores; Agar nutritivo Agar BHI, y
mejorados como el Agar sangre.
 Medios de aislamiento selectivos. Presentan el medio base, además
llevan un substrato más indicadores y de manera especial
inhibidores; sales, colorantes, como el Agar EMB, ENDO, Manitol
salado, Agar verde brillante.
 De aislamiento especifico. Son altamente enriquecidos; Lowestein
(Mycobacterium) y el agar Sabouraud (hongos y levaduras).
e. Medios diferenciales o bioquímicos. Son aquellos que llevan un
medio corriente, caldo o Agar nutritivo al que se le ha añadido un
substrato conocido, además lleva indicador de pH, así tenemos el TSI,
SIM, LIA etc.

MATERIALES

- Matraz de Erlynmeyer.
- Probeta graduada.
- Balanza de precisión.
- Medios de cultivo deshidratado.
- Mechero bunzen.
- Agua destilada.
- Potenciómetro.
- Autoclave.
- Estufa a 37°C.

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FORMAS DE PREPARACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

POCEDIMIENTO

1. Algunos se preparan pesando ingrediente por


ingrediente, otros medios vienen ya preparados,
para un litro.
2. No mezclar los medios con espátula sucias,
luego tapar herméticamente, para evitar su
deshidratación.
3. Pesar en papel manteca que no exceda
del tamaño del platillo, y no dejar partículas de medio en el papel.
4. Usar frascos bien lavados, preferiblemente secos, de tamaño adecuado a la
cantidad de medio de cultivo.
5. Usar agua destilada o bi-destilada y probeta limpia.
6. Se disuelven los substratos calentando a temperatura de ebullición, y
cuando esté a 40°C se le ajusta el pH de 7.2 a 7.4; para ajustar el pH, se usa
soluciones de NaOH y/o HCI.
7. Se tapona el frasco con algodón y papel craft con el nombre del medio,
fecha e iniciales del que lo preparó, se amarra sujetando el papel al
cuello del frasco.
8. Llevar a autoclave, lavado y limpio con agua
destilada.
9. Se esterilizan los medios de cultivo a 15
libras de presión,121°C por 15 minutos.

10. Dejar que la presión y la temperatura bajen


solas; cuando estos estén a 45°C se reparten
en placas o tubos.

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PRACTICA Nro. 4.

PLAQUEO Y ENTUBADO DE MEDIOS DE CULTIVO

Existen medios de cultivo sólidos y líquidos, dependiendo de esta característica


se pueden utilizar placas petri y/o tubos para la siembra respectiva:

PLAQUEO

El plaqueo consiste el reparto de los medios de cultivo especialmente de


consistencia sólida, utilizando para este fin placas petri, para cumplir los
siguientes objetivos:

OBJETIVOS

 Aislam#iento.- Para la siembra de muestras, con el objeto de conseguir


colonias aisladas, la siembra es por estrías.
 Contaje de colonias.- Para contar el número de colonias por ml., se
coloca en la placa 1 ml. De la muestra problema, luego 10 ml. De
medio de cultivo (TSA, BHI, Agar Mueller Hilton). La siembra se realiza por
difusión.
 Bacteriofagotipaje o antibiograma.- Se reparte el medio de cultivo,
luego de endurar, la siembra se hace por diseminación, resbalando el
cultivo bacteriano con la ayuda de la espátula de Drigalsky o un hisopo.

CONSIDERACIONES PREVIAS

Se debe tener el ambiente limpio y desinfectado, el material de vidrio


esterilizado y frió.

MATERIALES

- Placas petri.
- Tubos de ensayo.
- Frascos
- Mecheros con gas.

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- Medios de cultivo esterilizado, licuados y a una temperatura entre 48 y 52°C.
- Matraz de Erlynmeyer.
- Baño maría.
- Lápiz de cera.
- Estufa.

PROCEDIMIENTO

1. Colocar todo el equipo necesario sobre la mesa de trabajo.


2. Abrir las placas Petri, del estuche o quitando el hilo y papel.
3. Abrir el medio a repartir, y flamear un, ida y vuelta sobre la llama.
4. Con la mano izquierda coger la placa Petri, los dedos anular y meñique van
por debajo de la placa, pulgar y medio cogen por el borde, el índice toca la
superficie externa de la placa.
5. Abrir lentamente la placa hasta el ángulo de 45°, manteniéndola cerca de la
llama.
6. Con la mano derecha coger el frasco que contiene el medio de cultivo, agitar
suavemente rotando, flamear la boca del
frasco y verter dentro de la placa una
cantidad adecuada, más o menos 12 ml.
7. Cerrar la placa y dejar sobre la mesa sin que
el medio toque la tapa.
8. Proseguir con el resto del medio y placas,
flameando con una, ida y vuelta la boca del
frasco.
9. Una vez acabado de repartir, se debe enjuagar con agua de caño, los
frascos.

10. Una vez enfriado y endurado los medios en las placas, se voltean y
rotulan con lápiz de cera.
11. Se deja en refrigeradora a 4°C.

REPARTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN TUBOS.

- Medios líquidos.

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Conocido también como "Caldo", si el medio es corriente puede servir para
estudios de desarrollo bacteriano, turbidez, sedimento. Si el medio presenta un
substrato conocido, se estudiará metabolismo, ejemplo, en caldo peptonado
se estudiará la prueba del Indol.

- Medios sólidos.

Este tipo de medio es aquel que lleva 1.5 % de agar-agar, y los medios
pueden adoptar las siguientes formas:

En columna.- Cuando no se inclina, se siembra por picadura o puntura,


por lo general sirve para conservar cepas.

En plano inclinado.- Se reparte la quinta parte del tubo, más o menos,


2 ml. De medio, luego se le inclina en una varilla, el medio debe estar
por debajo de la tapa de algodón a 2 cm. En este medio se puede
estudiar desarrollo bacteriano, si el medio lleva un substrato conocido
más indicador, entonces se estudiará la bioquímica, ejemplo: Agar
úrea, se estudiará el metabolismo de la úrea; en el Citrato de simons, se
estudiará el desdoblamiento del Citrato.

En plano semi inclinado.- El medio se reparte en 1/4 ó 1/3 del volumen


del tubo, se semi-inclina, recostándolo sobre una tablita que tenga una
altura o ancho de 3 cm. Este medio se siembra en la superficie por estrías
y por picadura en el fondo, generalmente son medios de diferenciación,
sirve para el estudio bioquímico, Ejm. TSI, LIA.

- Medios semi-sólidos.

Este medio es aquel que lleva solo el 0.5% de Agar-agar, al mismo tiempo
contiene substratos conocidos para estudios bioquímicos, por ejemplo; el
medio fluido de Thioglicolato, sirve para el control de esterilidad de
substancias, puede usarse para mantener Cepas: el medio SIM sirve para
estudiar las siguientes pruebas bioquímicas; H2S, Indol y Motilidad.

Para repartir los medios de cultivo en tubos, sean líquidos o sólidos, el medio

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debe estar estéril, bien homogenizado, licuado y a una temperatura de
45°C, en la que el operador no sufra por el calor, los tubos deben estar
estériles y fríos, la mesa de trabajo debe estar desinfectado, el operador
debe sentase cómodamente, colocando los tubos al lado izquierdo y el medio
a repartir al lado derecho.

PROCEDIMIENTO.

1. Se desatan los hilos de los paquetes de tubos y de la boca del frasco.


2. Se abre el frasco tomándolo con la mano derecha y con la izquierda se
destapa, y se deja el tapón de algodón dentro del papel del capuchón que la
mantenía envuelto.
3. Se flamea 2 a 3 ida y vueltas, la boca del frasco y se mantiene en
posición semi-inclinado este frasco cerca del mechero.
4. Con la mano izquierda se coge el tubo de la parte central, y se lleva
arriba a la altura del tórax del operador, cerca del mechero, con el
borde del margen inferior de la mano derecha y entre el dedo meñique,
y anular se retira el tapón del tubo. Debe rotarse el tubo y tapón para
mantener estable el tapón.
5. Se flamea el tubo y se lleva cerca del pico del frasco.
6. Se vierte una cantidad adecuada de medio de cultivo, en forma lenta.
7. Luego se flamea el tubo, se vuelve a taponar y se deja en una gradilla o se
inclina sobre un soporte en la mesa de trabajo.
8. Se continúa de idéntica manera.
9. Si sobra medio de cultivo en el frasco se flamea la boca, y se tapona, se
coloca el papel rotulado, se amarra el hilo y se deja en la
refrigeradora.
10. Si se acabó el medio de cultivo, se debe enjuagar el frasco antes que se
enfríe, para evitar que el medio se enfrié dentro del recipiente.
11. Se rotula los tubos, se colocan en una misma gradilla y se dejan en la
refrigeradora.

La siembra debe hacerse cuando el medio de cultivo esté bien duro, esto en el caso
de medios sólidos.

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Lab. Microbiología - Guía Práctica de Bacteriología Oscar D. Orós B.
PRACTICA Nro. 4

MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTODE MICROORGANISMOS.

SIEMBR A. - Es el procedimiento que consiste en acondicionar el microorganismo en un


medio de cultivo fértil, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones óptimas de
temperatura y tiempo de incubación pueda desarrollar y multiplicarse IN VITRO.

Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie de un medio


sólido.

OBJETIVOS

Conocer los métodos de siembra tiene los siguientes objetivos:

 Realizar un correcto aislamiento de colonias.


 Hacer un transplante de microorganismos.
 Conocer la técnica de siembra para recuento demicroorganismos.

IMPORTANCIA

 En el aislamiento permite la separación de losmicroorganismos al estado de pureza a


partir de unamuestra problema, y generar su progenie (cepa).
 Si se aíslan especies distintas, cada colonia tendrácaracteres especiales
necesarios para la identificaciónde un determinado microorganismo.
 Se realiza trasplante con la finalidad de mantener en lafase exponencial una cepa
determinada.
 El transplante en medios de cultivo especiales se lograconocer sus características
bioquímicas.
 Una correcta siembra para recuento permite obtenerresultados reales.

MATERIALES

- Estufa de incubación.
- Tubo de ensayo.
- Espátula de Drigalsky.
- Asa de Kolle.

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- Pipeta graduada de 5 - 10 ml.
- Mortero.
- Gradilla y canastillas.
- Matraz de Erlyn Meyer.
- Mechero bunzen.
- Probeta graduada de 100 ml.
- Placas petri, con medios de cultivo.
- Cepas.

METODOLOGÍA

A. SIEMBRAS DIRECTAS:

1. Siembra por estría.

 Poseer la muestra, tomada ya sea con


un hisopo o torunda,aguja hipodérmica
o asa de kolle.
 La muestra tomada se toca la
superficie del medio decultivo
depositado en la placa petri,
colocándola en unextremo del medio.
 Con un asa de siembra estéril, se da
inicio a la siembra, apartir de donde se depositó la muestra, produciendo líneassigzageantes.
 Concluida la siembra, cerrar la placa y dejarla sobre la mesacon la base hacia arriba.
 Etiquetar la placa, y dejarla en la estufa a 37°C por 24 a 48horas
 Realizar este procedimiento con asepsia cerca del mecherobunzen.

B. SIEBRA A PARTIR DE DILUCIONES SERIADAS. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LA MUESTRA.

Las siembras a partir de diluciones seriadas es un método por agotamiento y se realiza con la finalidad de
cuantificar el número de colonias por una cantidad de muestra determinada Ejm. El Número más Probable
de Coliformes, cuantificar mesófilos viables, etc.

 En un mortero estéril pesar un gramo de muestra, adicionar 9 ml. De agua peptonada


para obtener la dilución 1 : 10 ml.
 Pipetear 1 ml. De la dilución anterior y trasvasarlo a otro tubode ensayo que contenga 9

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ml de agua peptonada. Proseguirhasta obtener la dilución 1 :1000000.

2. Siembra por diseminación.

Método de siembra mayormente usado para


el Recuento total de mesófilos viables. El
resultado de dicha siembra presenta un
crecimiento de las colonias sobre la superficie
de medio de cultivo en forma diseminada, no
siguiendo una línea de siembra como en el
caso de la siembra por estrías.

 Obtener el inoculo preferentemente de


muestras líquidas oa partir de diluciones de muestras.
 Añ ad ir a ca da p laca 15 m l. d e a ga r pa ra re cuen to yenfriarlos a 45 a60°C y dejar
solidificar.
 Utilizando una única pipeta, tomar O.1ml. de cada una dela diluciones, y depositarlo
en la superficie del agar.Comenzar por la dilución más baja, llenando y vaciando
lapipeta 3 veces antes de transferir 0.1 ml.a la placa.
 Extender las muestras de 0.1 ml. pronto después dedepositarlas sobre la superficie
del agar con la ayuda de laespátula de Drigalsky, dejar secar la superficie del
agardurante 15 minutos.
 Incubar las placas invertidas por dos días a 37 °C.
 Contar las colonias en las placas que presenten entre30 y 300 colonias.

3. Siembra por difusión.

A diferencia de la siembra por diseminación, en esta en el que el procedimiento es fundir el


medio de cultivo con el inóculo o la muestra diluida, el crecimiento de las colonias además de
observarse en la superficie del medio, hay crecimiento en el fondo así como en el medio del agar.

 Pipetear en placas petri 1 ml. De las diluciones efectuadasen el punto B.


 Inmediatamente verter en las placas inoculadas 10 a 15ml. De agar Estándar fundido y
templado a 45°C.
 Mezclar el inoculo de siembra con el medio de cultivo
 Una vez solidificado el agar invertir las placas eincubarlas a 35 °C durante 24 a 48 horas.

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 Utilizando el contador de
colonias, y el dispositivo
deregistro automático, contar todas
las colonias en las placasque
presenten 30-300 colonias

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PRÁCTICANro5

SENSIBILIDAD BACTERIANA

INTRODUCCION.

El aislamiento de un agente infeccioso a partir de un paciente no es con frecuencia suficiente para


establecer la terapia adecuada. Muchas bacterias y algunos hongos presentan resistencia a los
agentes antimicrobianos y algunos virus han desarrollado resistencia a los agentes antivirales
más actuales. Los patrones de resistencia cambian en forma constante y no importa lo
rápidamente que se introduzcan los nuevos agentes terapéuticos porque los microbios parecen
siempre dispuestos a superarlos.

Ya que no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias, hongos y virus a los agentes
antimicrobianos, con frecuencia es necesario estudiar la sensibilidad individual de cada patógeno
a estas drogas, pudiéndose elegir entonces el agente apropiado (el más activo contra el
patógeno, el menos tóxico para el huésped, con las características farmacológicas apropiadas y el
más económico), que proporciona mayores posibilidades de una evolución favorable.

Un concepto importante sobre el que es necesario insistir es que no se pueden realizar pruebas
de sensibilidad in vitro con cultivos mixtos, sólo los cultivos puros proporcionarán resultados
válidos sobre la eficacia de un antibiótico.

OBJETIVOS.

 Medir la sensibilidad de una cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una


infección a uno o varios antibióticos.
 Seguir la evolución de las resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento
epidemiológico, a escala de un servicio, un centro de atención médica, una región o un
país puede adoptar medidas de control.

FUNDAMENTO.

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Las primeras pruebas se realizaron inoculando la
superficie de una placa de agar con el microorganismo en
estudio, colocando pequeñas cubetas (de metal o vidrio)
sobre el agar y agregando las soluciones de los
diferentes antimicrobianos dentro de dichas cubetas. Los
agentes antimicrobianos difundían en el medio en forma
radial alrededor de la cubeta e inhibían el desarrollo del
microorganismo en la zona donde su concentración era
suficientemente alta. Las áreas de inhibición grandes
indicaban una actividad antimicrobiana más efectiva.

MATERIALES

- Cultivo de bacterias de 24 horas de crecimiento.


- Agua destilada estéril.
- Tubos de ensayo.
- Asa de kolle, y espátula de drigalsky.
- Pipetas graduadas.
- Mechero bunzen.
- Estufa eléctrica a25ºC.
- Placas petri con medio Mueller-Hinton.

PROCEDIMIENTO.

El microorganismo a investigar se inocula cepas recientemente incubadas y previamente


diluidas en agua destilada.en una o varias placas de agar.

Sobre su superficie se disponen los discos correspondientes a varios antibióticos.

Se incuban las placas durante 16-24 horas a 35ºC y al cabo de este tiempo se estudia el
crecimiento en ellas.

Se valora el diámetro de la zona de inhibición que se forma alrededor de cada disco y se


compara con las referencias publicadas por el NCCLS.

Con esta referencia podemos informar si el microorganismo es Sensible, Intermedio o


Resistente (S, I, R) a cada uno de los antibióticos ensayados en las placas.

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En la imagen de la izquierda se muestra una vista general de una placa con crecimiento
bacteriano y con seis discos de antibióticos. La zona de color claro que ocupa la mayor parte de la
placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no inhibidas. Los círculos negros que rodean a
cinco de los seis discos marcan las zonas en que los respectivos antibióticos han inhibido, con
mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo a estudio. El sexto disco (AM-10) no
tiene a su alrededor halo de inhibición lo que indica la resistencia del microorganismo a ese
antibiótico.

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PRACTICA Nro.6

TINCIÓN GRAM

INTRODUCCIÓN

La observación de las bacterias fijadas sobre una lámina portaobjetos debe hacerse
mediante el empleo de tinciones. El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que
resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de
contraste entre la célula y el medio que la rodea. El modo más simple de aumentar el contraste
es la utilización de colorantes,uno muy usado en microbiología es la tinción Gram.

Esta tinción fue desarrollada empíricamente por Christian Gram en 1884. A pesar del tiempo
transcurrido, la tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se
realiza para cualquier identificación bacteriana. La técnica es capaz de diferenciar dos grandes
grupos de eubacterias: Gram positivas (G+) y Gram negativas (G-).

Esta tinción tiene gran importancia en taxonomía bacteriana ya que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.

Mientras que las bacterias gram-negativas son constantes en su reacción, los microorganismos
gram-positivos pueden presentar respuestas variables en ciertas condiciones (son gram-
lábiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias gram-positivas pierden la
propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia, se tiñen por la safranina
apareciendo como gram-negativas. Análogo efecto se produce en ocasiones por cambio en el
medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecución de la técnica.

Para explicar el mecanismo de la tinción de Gram se han propuesto varias hipótesis


fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los microorganismos.Diferencias
estructurales y químicas de los dos tipos de pared bacteriana:

OBJETIVOS:

Iniciación en las técnicas del estudio de microorganismos: cultivo,tinción y morfología.

Entrenamiento en preparación de extendidos y realización decoloraciones.

Observación microscópica de morfología y agrupamientosbacterianos.

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MATERIAL NECESARIO:

Cultivo de bacterias.

Cristal violeta (1 g. de cristal violeta en 100 ce de agua destilada).

Lugol (1 g. de yodo en 2 g. de yoduro potásico en 100 cc de agua destilada).

Safranina (1 g. de safranina en 100 cc


de agua destilada).

Aceite de inmersión.

Microscopio binocular.

Portaobjetos.

Asas de cultivo.

Mechero.

Placas de Petri,

TÉCNICAS DE FROTIS Y TINCIÓN GRAM.

Para ello se debe limpiar un


portaobjeto con alcohol se evapora este
pasándolo rápidamente por el mechero, se
deja enfriar y se marca con un lápiz la parte que vamos a tomar.

PREPARACIÓN DEL FROTIS:

El frotis tiene como finalidad una delgada película del preparado para una adecuada
tinción y observación microscópica. La preparación de un frotis se hace de la siguiente manera:

EXTENSIÓN:

Se coloca una gota de agua destilada en el centro del porta y enseguida se esteriliza un
asa de argolla colocándola directamente en el mechero y se toma unpoco del material
biológico a examinar. Se emulsiona la pequeña cantidad de bacteria con la gota de agua

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delporta, luego, se incinera el asa en el mechero.

SECADO:

Pasamos el porta por la parte mas alta del mechero (flamear) hasta que la gota con
bacterias quede seca (se hace sin que el porta se queme ya que puede carbonizar las células),
hasta que obtenemos una marca de una gota con material biológico en el porta.

Fundamento

Se usa primero el cristal violeta (violeta genciana) el que penetra la pared celular tanto de
bacterias gram-positivas como gram-negativas. A continuación se agrega el lugol (yodo +
yoduro), que actúa como mordiente formando un complejo con el cristal violeta. Al decolorar con
una mezcla de alcohol y acetona, la pared de los gram-positivos formada por una gruesa capa
de peptidoglicano impide la salida del complejo cristal violeta-lugol, manteniéndose la coloración
violeta. En los gram-negativos por el contrario el complejo cristal violeta-lugol sale por los poros
que ha generado el alcohol-acetona en la membrana externa de la pared celular. La bacteria por
lo tanto se decolora y al agregar la safranina se tiñe de rojo.

PROCEDIMIENTO DE LA TINCIÓN GRAM

1. Rotular convenientemente cada uno de los portaobjetos.


2. Preparar extendidos de los microorganismos indicados por el docente.
3. Tomar material de la colonia elegida, con un asa previamente esterilizadaa la llama y
suspender este material en una gota de agua colocada en lamitad del portaobjetos.
Extender el material sobre toda la superficie delportaobjeto.
4. Dejar secar al aire junto a la llama del mechero.
5. Se cubre completamente el frotis con una solución de "cristal violeta", yse deja actuar
durante 60 segundos.
6. Lavar con abundante agua destilada.
7. Agregar una solución de "lugol" y dejar actuar
durante 30 segundos.
8. Lavar con abundante agua destilada.
9. Decolorar el frotis obtenido colocándole
sobre este alcohol acetonadejando actuar
durante 10 a 20 segundos.
10. Lavar con abundante agua destilada.

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11. Cubrir el frotis con gotas de una solución llamada "safranina", dejándola actuar durante
30 segundos.
12. Lavar con abundante agua destilada nuevamente.
13. Observar al microscopio con el objetivo de 100X

Secar el preparado colocando el porta objeto en


papel absorbente, y si queda mucha agua se
puede flamear suavemente sin que se quemen las
muestras, y se observa bajo inmersión.

A la observación en el microscopio binocular de


investigación, esta se presenta como en la lámina
abajo expuesta, donde se observa
microorganismos bacilos gram-positivos teñidos
de azul, y los bacilos gram-negativos teñidos de color fucsia.

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PRACTICA Nro. 7

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (acido resistente)

Tiene una enorme importancia en microbiología puesto que permite poner en evidencia la
presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) tales como el Mycobacterium
tuberculosis, agente causal de la tuberculosis. También puede ser usada para detectar la
presencia de Cryptosporidium en deposiciones.

Fundamento

El colorante que se usa en esta tinción, la fucsina forma un complejo con los ácidos micólicos
de la pared celular de las Mycobacterias. Este complejo resiste la decoloración con alcohol-
ácido clorhídrico permaneciendo de color fucsia, en cambio las otras bacterias pierden la
coloración. Al usarse el azul de metileno como colorante de contraste éstas se coloran de azul.

INSTRUCCIONES:

1. Preparar extendidos de los microorganismos a estudiar.


2. Fijar con calor.
3. Cubrir todo el porta con fucsina básica fenolada (carbolfucsina)
4. Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento durante 2 minutos
más. Si se seca alguna parte del porta
objeto, agregar el colorante sobre el
preexistente y no sobre la parte seca,
hasta cubrirlo nuevamente.
5. Lavar con agua.
6. Decolorar con alcohol-ácido hasta que
no se desprenda más colorante.
7. Lavar con agua.
8. Cubrir el extendido con azul de
metileno. Dejar en contacto durante 30 segundos.
9. Lavar con agua. Secar.
10. Observar con objetivo de inmersión.

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A la observación en el microscopio se
observa teñido de color azul todas las
células que corresponden a tejido epitelial,
si la muestra procede de esputo. Pero el
bacilo acido resistente se presenta de un
color fucsia, manteniendo el colorante
primario, tal como se muestra en la
siguiente lámina.

PREPARACION DE COLORANTES:

Solución de Ziehl (Fucsina fenicada)


1. Fucsina básica 0.3 g
Alcohol etílico 10 ml.
2. Fenol 5g
Agua destilada 95 ml.

Mezclar soluciones 1 y 2.

Alcohol ácido
HCI (densidad 1.19) 3 ml.
Alcohol etílico 97 ml.

Solución de azul de metileno


Azul de metileno 1.4 g
Agua destilada 100 ml.

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PRACTICA Nro. 8

COLORACIÓN DE ESPORAS, TINCIÓN NEGATIVA

Coloración de esporas

OBJETIVO:

Esta técnica permite distinguir las esporas, del cuerpo vegetativo delmicroorganismo, como así
también ver su localización y forma.

INSTRUCCIONES:

1. Prepare un extendido del microorganismo.


2. Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solución de Verde de malaquita.
3. Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos
(no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el
preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlonuevamente.)
4. Lavar con agua y cubrir con solución de Safranina.Dejar actuar 30 segundos.
5. Lavar con agua, secar y observar con
objetivo de inmersión.
6. lnformar: morfología, color y tipo de
espora.

Solución de Verde de Malaquita.

 Verde de Malaquita al 5 % en agua


destilada.
 Solución de Safranina
 Safranina 0.5 g. en agua destilada.

Tinción negativa

Es un método de coloración sencillo, se puede emplear para un frotis directo de la muestra clínica
en caso de no contar con la batería de coloración Gram esto puede evidenciar solo si se trata de
cocos o bacilos. También se puede emplear para la prueba de motilidad en porta objetos.

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INSTRUCCIONES

1. Colocar una pequeña gota de tinta china en la parte central del portaobjetos.
2. Utilizando el asa de kolle, colocar una gota de la suspensión de microorganismos sobre la
tinta china.
3. Colocar sobre el preparado un cubreobjeto para que se forme un film (tinta -cultivo).
4. Observar con objetivo de inmersión.

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PRACTICA Nro. 9

RECUENTO TOTAL DE BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS.

Recuento Estándar en Placa (REP): también conocido como recuento de aerobios


mesófilos, es el análisis directo mayormente empleado para determinar la calidad
microbiológica de la leche y otros alimentos.

OBJETIVOS

 El objetivo de realizar este análisis es conocer el " número de microorganismos


aerobios mesófilos que contiene un alimento.
 Conocer el grado de contaminación bacteriana, siendo indicador de la posible
presencias de microorganismos patógenos
 Se aplica a todos los alimentos con excepción de los productos fermentados o
madurados tales como queso, ciertos tipos de embutidos, yogurt, etc.

IMPORTANCIA

 Los resultados de este análisis permiten verificar la efectividad de los procedimientos de


limpieza y desinfección.
 Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.
 Determinar el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración de
los alimentos. Verificar condiciones óptimas de almacenamiento y transporte.
 Obtener información acerca de la vida útil de los alimentos.

MATERIALES

- Autoclave.
- Estufa de incubación.
- Balanza de precisión.
- Mechero Bunzen.
- Asa de kolle.
- Espátula de Drigalsky
- Pipeta graduada de 5 - 10 ml.
- Mortero y pistilo.
- Gradilla y canastillas

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- Cuenta colonia.
- Matraz de Erlyn Meyer.
- Tubos de ensayo.
- Probeta graduada de 100 ml.
- Placas petri.
- Medio de cultivo.

METODOLOGÍA

A. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LA MUESTRA.

En un mortero estéril pesar un gramo de muestra, adicionar 9ml. De agua peptonada para
obtener la dilución 1 : 10 ml.

Pipetear 1 ml. De la dilución anterior y trasvasarlo a otro tubode ensayo que contenga 9 ml. de
agua peptonada. Proseguir hasta obtener la dilución 1 : 1000000

B. SIEMBRA.

1. MÉTODO STANDARD DE RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD.

 Pipetear en placas petri 1 ml. De las diluciones efectuadas en el punto A.


 Inmediatamente verter en las placas inoculadas 10 a 15 ml. De agar Estándar fundido y templado
a 45°C.
 Mezclar el inoculo de siembra con el medio de cultivo
 Una vez solidificado el agar invertir las placas e incubarlas a 35 °C durante 24 a 48 horas.
 Utilizando el contador de colonias, y el dispositivo de registro automático, contar todas las
colonias en las placas que presenten 30-300 colonias.

2. MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA DE SIEMBRA POR EXTENSIÓN EN


SUPERFICIE.

 Añadir a cada placa 15 ml de agar para recuento y enfriarlos a 45 a 60°C y dejar


solidificar.
 Utilizando una única pipeta, tomar 0.1 ml. de cada una de la diluciones a ensayar, y
depositarlo en la superficie del agar (2placas por dilución). Comenzar por la dilución
más baja, llenando y vaciando la pipeta 3 veces antes de transferir 0.1 ml a la placa.
 Extender las alícuotas de 0.1 ml. pronto después de depositarlas sobre la superficie del

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agar (espátula de Drigalsky), dejar secar la superficie del agar durante 15minutos.
 Incubar las placas invertidas por tres días a 35 °C .
 Contar todas las colonias en las placas que presenten entre 30 y 300 colonias.

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PRACTICA Nro10

RECUENTO DE COLIFORMES: DETERMINACIÓN DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP).

El empleo de coliformes como indicadores de organismos patógenos en el agua es una


práctica vigente en la actualidad. Las bacterias Coliformes, comprenden la E. Coli y Enterobacter
aerogenes. Ambos organismos son bacilos cortos, gram-negativos que fermentan la lactosa con
producción gas. E. Coli tiene su localización primaria en el tracto intestinal del hombre y de los
animales, y de allí su nombre "Coli", que deriva del colon. E. Coli se encuentra normalmente en
el tracto gastrointestinal de los animales, donde no suele causar enfermedad.

Los organismos coliformes son buenos indicadores de la calidad higiénica de los alimentos,
se basa en la experiencia positiva adquirida en el agua. El hallazgo de gran número de
organismos en los alimentos y en el agua indica la polución o contaminación fecal. Ya que las
enfermedades transmitidas por el agua generalmente son de carácter intestinal, la presencia de
polución indica la posibilidad de que existan agentes etiológicos productores de
enfermedades gastrointestinales.

OBJETIVOS

 Estimar el número de microorganismos (coliformes) presentes en muestras de alimentos


líquidos o el agua.
 Conocer la metodología del NMP coliformes como, indicador de contaminación de los
diferentes alimentos.
 Determinar la presencia de coliformes, procesando tres diluciones proporcionales seriadas,
sembradas en 9 tubos con el medio adecuado para comparar con la tabla estándar.

IMPORTANCIA

Los resultados de este análisis permiten:

 Revelar el índice de contaminación fecal, proveniente de heces del hombre y animales


de sangre caliente.
 Conocer que la presencia de coliformes es indicador de que pueda existir la presencia de
patógenos como salmonelas y E.coli enterotixigénica.
 Determinar el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración de los alimentos.

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MATERIALES

- Autoclave.
- Estufa de incubación.
- Balanza analítica.
- Mechero Bunzen.
- Asa de colle.
- Espátula de Drigalsky
- Pipeta graduada de 5 - 10 ml.
- Gradilla y canastillas
- Matraz de Erlyn Meyer.
- Campanas Durham.
- Tubos de ensayo.
- Probeta graduada de 100 ml.
- Placas petri.
- Medios de cultivo.

METODOLOGÍA

1. Preparar las muestras de alimento hasta la obtención de las diluciones.


2. Pipetear 1 ml. De cada uno de las diluciones del homogenizado del alimento en tubos
con medio de cultivo (tres tubos por dilución).
3. Incubar los tubos a 35°C durante 24 a 48 horas.
4. Pasadas las 24 horas, anotar los tubos que muestren producción de gas. Volver a la
estufa los tubos gas negativos para su incubacióndurante 24 horas más.
5. Pasadas las 48 horas, anotar los
tubos que muestren producción
de gas.
6. Elegir la dilución más alta
(positivos a gas), los tres tubos y
las dos diluciones superiores más
próximas. Si no fuese factible
seleccionarlas tres últimas
diluciones y anotar el número de
tubos positivos encada una.
7. Confirmar que los tubos

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inoculados y seleccionados, sean positivos a coliformes, transfiriendo un asa de cada tubo
a aplacas de agar eosina azul de metileno (EMB), ENDO o McConkey, observar
colonias típicas de coliformes después de 24 a 48 horas de incubación a 37°C.

8. Para obtener el NMP, ver en cada una de las tres diluciones seleccionadas el
número de tubos en los que se confirmo la presencia de coliformes. Buscar en la tabla del
NMP.

Para obtener el Número Más Probable (NMP); Ver en cada una de las 3 diluciones seleccionadas, el número de
tubos en los que se determinó la presencia de coniformes previa confirmación. Buscar en la tabla del NMP y anotar el
NMP que corresponda al número de tubos positivos de cada dilución. Así si como ejemplo tenemos una lectura 3, 1, 0,
la tabla indica que este resultado significa un NMP de 43/100 ml.

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Para obtener el NMP de coniformes por gramo de alimento se utiliza la siguiente formula:

NMP de la tabla X El factor de dilución intermedio = NMP/ g.

100

Si el factor de dilución intermedio empleado para la prueba es; 1 : 100, 1 : 1000, y 1: 10000

Entonces se reemplaza la formula de la siguiente manera:

43 X 1,000 = 430 coliformes por gramo

100

TABLA NMP
Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos y
negativos cuando se utilizan tres alícuotas de 10 ml., tres de 1 ml., y otras tres de 0,1 ml.

Número de tubos positivos del total de: Indice del NMP Limites
por de confianza 95%
3 tubos; 10 ml. 3 tubos; 1 ml. 3 tubos; 0.1 ml. 100 ml. Inferior Superior
0 0 1 3 0.5 9
0 1 0 3 0.5 13
1 0 0 4 0.5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800

Fuente: F.S. Thatcher y D.S. Clark 1972

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PRACTICA Nro 11

IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS.

Normalmente se encuentran Staphylococcus patógenos en procesos pyogenos, en todas las


especies animales y en pájaros. Ellos son frecuentemente aislados de septicemias en
animales, así como de los casos de artritis y mastitis. Normalmente se encuentran
patógenos en las superficies de la piel y en la nariz de personas sanas y algunas especies
animales.

Cultivo

Los estafilococos patógenas crecen eficazmente bajo condiciones aeróbicas en la mayoría de


los medios bacteriológicos usuales de extracto de carne y peptona, pero lo hacen de manera
mas profusa en agar sangre que se usa por lo común para aislar formas. Estos crecen
rápidamente a 37°C pero tienden a formar pigmentos mejor a temperatura ambiente (20°C).
Las colonias en medio sólido son redondeadas, uniformes, sobresalientes y resplandecientes.
Pueden formar varios tipos de pigmentos: Staphylococcusaureuspresenta un color amarillo oro
intenso; S epidermis es de color blanco porcelana; también pueden observarse coloraciones
intermedias. Muchas colonias desarrollan pigmentos solo después de una prolongada
incubación a 20°C.

En general las cepas recién aisladas de S. aeureusson las masexigentes en sus necesidades
alimenticias; los viejos cultivos de laboratorio y S. epidermis lo son menos.

EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ESTREPTOCOCOS Los estreptococos son uno de


los grupos más importantes de organismos que son patógenos para los animales y hombre. Las
especies domésticas padecen de estreptococosis que varia desde lesiones supurativas
localizadas, mastitis, meningitis, artritis y septicemias. Ellos también pueden aislarse de la nariz,
garganta, piel y cavidad bucal de animales sanos.

EL AISLAMIENTO

El cultivo de muestras provenientes de lesiones supurativas locales, o del hígado, bazo,


glándula linfática, riñón, fluido cerebro-espinal y sangre asícomo en condiciones del
septicemia, en agar sangre y agar MacConkey. También es aconsejable inocular en caldo de
suero o caldo de Todd-Hewittal mismo tiempo. Se incuba a 37°C. La incubación anaerobio

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mejora actividad hemolítica.

IDENTIFICACIÓN

Las características culturales En agar sangre de oveja forman las colonias pequeñas, elevadas,
semi-translúcidas después de 24 horas. Ellos pueden ser alfa hemolíticas o beta, cultivos
recientes puede ser los mucoides si los cocos presentan una cápsula.

Características bioquímicas que Ellos son los llamados catalasa-negativos y


oxidasa-negativo. Ellos fermentan los azúcares pero no producen gas.

OBJETIVOS

 Describir las características microscópicas culturales y bioquímicasque permiten ejecutar el


aislamiento y la diferenciación entreStaphylococcusaureus y los estafilococos coagulasa
negativa.
 Seleccionar los medios de cultivo empleados para llevar a cabo ladetección de los
estafilococos.
 Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a losestafilococos.
 Describir los fundamentos, técnicas y limitaciones de lasmetodologías asociadas a la
detección de los estafilococos en lasmuestras clínicas.

IMPORTANCIA

Los resultados de este análisis permiten identificar al agente causal de la enfermedad materia de análisis de
laboratorio.

MATERIALES

- Autoclave.
- Estufa de incubación.
- Balanza analítica.
- Mechero Bunzen.
- Asa de colle.
- Espátula de Drigalsky
- Pipeta graduada de 5 - 10 mi
- Gradilla y canastillas
- Matraz de ErlynMeyer.

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Lab. Microbiología - Guía Práctica de Bacteriología Oscar D. Orós B.
- Campanas Durham.
- Probeta graduada de 100 mi.
- Placas petri.
- Medios de cultivo.
- Muestras clínicas.
- Batería de coloración Gram

METODOLOGÍA

1. Ponga a alcance los materiales y muestras junto al mechero.


2. Prepare la muestra a sembrar con estricta asepsia.
3. Tome un hisopo o asa de kolle
4. Retire todo tipo de protección de las muestras obtenidas.
5. Con el mechero de Bunsen encendido y respetando el margen deesterilidad inocule con el
hisopo o asa el material, en una placa con agarsangre y agar S110, empleando la técnica de
estriación.
6. Queme su hisopo para que no sea nuevamente utilizado
7. Incube a 37°Cdurante 24 horas.
8. Transcurrido las 24 horas, saque las cajas de la incubadora y encienda elmechero, para
realizar el repique correspondiente en agar sangre.
9. Haga un frotis de las colonias que crecieron
en el agar sangre

10. Tina con la técnica de Gram


11. Observe con aceite de inmersión el frotis
12. De acuerdo a lo observado en cada uno
de los frotis realice las
pruebascorrespondientes.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS USADAS EN LA


IDENTIFICACIÓN DECOCÁCEAS

Catalasa

Este test busca la presencia de la enzima catalasa que


desdobla el aguaoxigenada en agua + oxígeno.Esta
enzima la poseen los Staphylococcus, Micrococcusy

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Listeria. Noposeen catalasa los Streptococcus.Se coloca una gota de peróxido de hidrógeno
sobre un portaobjetos y luegose agrega la colonia en estudio, la aparición rápida y mantenida de
burbujasindica que el test es (+).

Coagulasa

Este test busca la presencia de la enzima coagulasaproducida por


elStaphylococcusaureus.Esta enzima es un activador del fibrinógeno, transformándolo en
fibrina. Lapared del Staphylococcusaureusademás posee un receptor del fibrinógenolo que
permite la formación de uniones entre bacteria y bacteria, formándoseun coágulo. Permite
diferenciar los estafilococos coagulasa (+) de losestafilococos coagulasa(-).Se realiza
usando de preferencia el plasma de conejo.

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PRACTICA Nro. 12

IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS

INTRODUCCION.
El grupo de bacilos anaeróbicos esporulados incluye diversas formas, algunas de éstas son
patógenas para el hombre y animales. La patogenicidad de estos bacilos se atribuye más bien a
la capacidad de formar potentes exotoxinas. Por tanto las infecciones por anaerobios esporulados
no es común en circunstancias ordinarias, ya que en la mayor parte de los casos hay una lesión
traumática antes de la infección.

Dentro de este gran grupo de microorganismos se puede diferenciar bacilos gram positivos
anaeróbicos que generalmente son miembros del genero Clostridium, y los del grupo de aerobios
son muchos, dentro de los cuales están el Genero Listeria, Lactobacilos y Bacilus.

Todos los bacilos gram-positivos anaeróbicos esporulados son por definición miembros del
género Clostridium. Además indica que la prueba de la catalasa es útil para diferenciar las
especies de Clostridium de las de Bacillus si las pruebas de aerotolerancia resultan dudosas.

Los bacilos del género Clostridium, se encuentran como comensales normales de los tractos;
gastrointestinal, respiratorio y urogenital del hombre y los animales. Los Clostridiums también se
hallan en múltiples substratos como: suelo, agua, aguas residuales, plantas, alimentos, etc., como
consecuencia de la contaminación fecal.

MUESTRAS.

Las muestras para esta práctica se pueden obtener de pus, y líquidos de lesión local, sangre,
esputo, incluso del suelo.

CARACTERISTICAS CULTURALES;

Dentro del Género Clostridium existe una variedad de especies dentro de las cuales están el Cl.
perfringens, Cl. botulinum, Cl, sépticum, Cl. novy, Cl, tetani, etc. Estas difieren enormemente
en cuanto a sus características culturales. El aspecto de las colonias de Cl. perfringens en agar
yema de huevo son pequeñas, globosas, traslúcidas, mucosas y que producen opalescencia. En
agar-sangre las colonias que forman una fina película rizoide y con tendencia a proliferar en el
medio son consideradas como Clostridiumsépticum y Clostridiumtétani y que además

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producen una discreta hemólisis en el medio.

Las características morfológicas a la coloración de Gram son: el Clostridiumperfringens en el


frotis demuestran ser bacilos gram-positivos gruesos de bordes redondeados y de longitud poco
variable. El Clostridiumtétani son bacilos gram-positivos delgados con una longitud variable en
cuyos extremos se encuentra la espora terminal.
El Clostridiumsépticum demuestran ser bacilos
muy variables en cuanto a sus dimensiones y se
colorean irregularmente.

OBJETIVOS.

 La presente práctica tiene por finalidad


hacer que los alumnos se familiaricen con la identificación de los bacilos gram-positivos.
 Aislar e identificar miembros del Género Clostridium y Bacillus a partir de muestras clínicas
y substratos.
 Seleccionar los medios de cultivo empleados para llevar a cabo la detección de los Bacilos
gram - positivos.
 Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a los Clostridios.

MATERIALES.

- Estufa de incubación.
- Balanza analítica.
- Mechero Bunzen.
- Asa de kolle.
- Espátula de Drigalsky
- Gradilla y canastillas
- Matraz de ErlynMeyer.
- Tubos de ensayo.
- Probeta graduada de 100 mi.
- Placas petri.
- Medios de cultivo.
- Muestras clínicas.
- Batería de coloración Gram

METODOLOGÍA

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Lab. Microbiología - Guía Práctica de Bacteriología Oscar D. Orós B.
1. Ponga a alcance los materiales y muestras junto al mechero.
2. Prepare la muestra a sembrar con estricta asepsia.
3. Tome un hisopo o asa de kolle
4. Retire todo tipo de protección de las muestras obtenidas.
5. Con el mechero de Bunzen encendido y respetando el margen de esterilidad inocule con el
hisopo o asa el material, en una placa con agar sangre empleando la técnica de
agotamiento porestría.
6. Queme su hisopo para que no sea
nuevamente utilizado
7. Incube en jarras de anaerobiosis a
37°Cdurante 48 horas.
8. Transcurrido las 48 horas, saque las placas
petri de la jarra de anaerobiosisy encienda el
mechero, para realizar el repique
correspondiente nuevamente en agar
sangre.
9. Haga un frotis de las colonias que crecieron en el agar sangre
10. Tina con la técnica de Gram
11. Observe con aceite de inmersión el frotis
12. De acuerdo a lo observado en cada uno de los frotis realice las pruebas correspondientes.
Para la identificación definitiva
Se ejecutaron las siguientes pruebas:
HIDROLISIS DE LA ESCULINA.
Para esta prueba se puede utilizar el medio base VL recomendado para anaerobios por el
"Círculo de Estudios e Investigación Galeno" (1988), con
la adición de 0.5% de esculina. La siembra se realiza
utilizando el asa de Kolle, e incubándolas a 37oC durante
48 horas en anaerobiosis. Luego se procede a adicionar 2
a 3 gotas de solución de citrato férrico amoniacal al 1%. La
presencia de una coloración obscura indica una reacción
positiva.
PRODUCCION DE INDOL.
Dado que el medio base VL para anaerobios contiene
triptona, se utiliza el reáctivo de Kovac (tiras de papel), el
cual se introduce en los tubos inoculados e incubados. El

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viraje del reactivo a un color rosado, indica una reacción positiva.
REDUCCION DE NITRATOS.
Para la ejecución de esta prueba se utilizó el caldo nitrato (CN), la preparación y distribución de
este medio fue siguiendo la técnica dada por el "Círculo de Estudios e Investigación Galeno"
(1988). Luego de la inoculación de las cépas en los tubos se incuba a 37oC durante 48 horas,
posteriormente se agrega 2 gotas del reactivo A (*) y dos
gotas del reactivo B (**). La aparición de un color rojo
indica la presencia de nitritos, si no aparece el color rojo
vinoso se agrega mallas de zinc, si hubiera nitratos NO3
en el medio este será reducido a nitritos y aparecerá el
color rojo vinoso, por tanto la bacteria no ha degradado el
nitrato. Por el contrario si no aparece el color rojo vinoso
se debe a la ausencia de nitratos, es decir que la bacteria
ha reducido hasta NH3 y N2.

* Reactivo A: -Acidosulfanílico 0.8 g


- Acido acético (5N) 100.00 ml.
** Reactivo B: - Alfa naftilamina 0.6 g.
- Acido acético (5N) 100.00 ml.

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PRACTICA Nro. 13

IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS

La gonorrea es una enfermedad de transmisión sexual (ETS), provocada por la


Neisseriagonorrhoeae, una bacteria que puede crecer y multiplicarse fácilmente en áreas
húmedas y tibias del tracto reproductivo, incluidos el cuello uterino (la abertura de la matriz), el
útero y las trompas de Falopio (también llamadas oviductos) en la mujer, y en la uretra
(conducto urinario) en la mujer y en el hombre. Esta bacteria también puede crecer en la boca, la
garganta, los ojos y el ano.

MORFOLOGÍA E IDENTIFICACIÓN

Los microorganismos del grupo Neisseriason diplococos gram-negativos, no mótiles con un


diámetro aproximado de 0.8 micrómetros, de manera individual estos cocos tienen la forma
de un riñón.

CULTIVO

A las 48 Horas de cultivo en medios enriquecidos (Mueller-Hinton, medioSéller-Martin y


otros) los gonococos y meningococos forman coloniasmucoides convexas,
resplandecientes y elevadas, con un diámetro de 1 a5mm. La coloración depende de la especie
variando desde no pigmentadas,opacas hasta amarillas.Son aerobios estrictos pero también
requieren para su crecimiento un 5% deCO2 o microaerofilia.

IDENTIFICACIÓN

La mayor parte fermentan los carbohidratos y producen ácido, pero no gas, tiene reacción
oxidasa positivas.

OBJETIVOS

 Describir las características microscópicas culturales y bioquímicasque permiten ejecutar


el aislamiento y la diferenciación cocos gramnegativos.
 Seleccionar los medios de cultivo empleados para llevar a cabo ladetección de Neisseria.
 Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a lasNeiserias.

IMPORTANCIA.

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Lab. Microbiología - Guía Práctica de Bacteriología Oscar D. Orós B.
Los resultados de este análisis permiten:

 Determinar la presencia de cocos gram negativos eninfecciones génito urinarias.


 Familiarizarse con la identificación de cocos gram negativos.

MATERIALES

- Autoclave.
- Estufa de incubación.
- Mechero Bunzen.
- Asa de colle.
- Pipeta graduada de 5 - 10 mi
- Gradilla y canastillas
- Tubos de ensayo.
- Probeta graduada de 100 mi.
- Placas petri.
- Medios de cultivo.
- Muestras clínicas.
- Batería de coloración Gram.

METODOLOGÍA

1. Ponga a alcance los materiales y muestras junto al mechero.


2. Prepare la muestra a sembrar con estricta asepsia.
3. Tome un hisopo o asa de kolle
4. Retire todo tipo de protección de las muestras obtenidas.
5. Con el mechero de Bunsen encendido y respetando el margen deesterilidad inocule con el
hisopo o asa el material, en una placa con agarBHI, Mueller-Hintons, agar sangre,
empleando la técnica de estriación.
6. Queme su hisopo para que no sea
nuevamente utilizado
7. Incube a 37°C durante 48 horas.
8. Transcurrido las 48 horas, saque las
cajas de la incubadora y encienda
elmechero, para realizar el repique
correspondiente en agar sangre.

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Lab. Microbiología - Guía Práctica de Bacteriología Oscar D. Orós B.
9. Haga un frotis de las colonias que crecieron en el agar sangre.
10. Tiña con la técnica de Gram.
11. Observe con aceite de inmersión el frotis
12. De acuerdo a lo observado en cada uno de los frotis realice las pruebascorrespondientes.

PRUEBAS COMPLEMENTARIAS.

 Prueba de la oxidasa.

Se requiere de discos impregnados con oxidasa, se humedecen estos con agua destilada esteril,
luego se cologa sobre una colonia sospechosa, incubar a 35ºC por 25 minutos, obserbar los
cambios de color que se presenten.

Las colonias oxidasa positivas toman un color rosado, después marron y finalmente negro.

Las colonias oxidasa negativas no produce cambio de color en las colonias o solo adquiere un
ligero color rosado debido al reactivo.
 Fermentación de carbohidratos; Lactosa, maltosa y sucrosa

Para la realización de esta prueba se utiliza un medio base al cual se le adiciona el carbohidrato
a testar (Glucosa, sacarosa, etc.). Una vez inoculado la cepa a testar se lleba a incubación a 37ºC
por 24 horas. La fermentación del carbohidrato se evidencia por el grado de turbidez en el medio
de cultivo ocasionado por el crecimiento del germen.

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Lab. Microbiología - Guía Práctica de Bacteriología Oscar D. Orós B.
PRACTICA Nro. 14

IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAMNEGATIVOS

La familia de las enterobacteriaceaeincluyen muchos géneros como Escherichia, Shigella,


Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia y Proteus. Algunos microorganismos
intestinales por Ejemplo Escherichiacolison parte de la microbiota normal y producen de
manera accidental enfermedad, en tanto que otros como Salmonelas y Shigelas son patógenos
de manera regular para el hombre y los animales.

Escherichiacoli. es causante de muchas infecciones intestinales especialmente en


neonatos de muchos animales y es la causa de mortalidad, así como enterotoxemias e
infecciones por Escherichiacoli en cerdos destetados . En la alpaca han sido observados
cuadros diarreicos en crías dentro de sus dos primeros meses de vida, de algunos de estos
casos se aislaron Escherichiacoli de heces diarreicas.

MORFOLOGÍA E IDENTIFICACIÓN

Son gram-negativos variando desde formas cocoides, bipolares hasta largos filamentosos,
frecuentemente se presenta aislados pero no son raras las cadenas cortas, no presentan
esporas. Los bacilos son cortos de 0.5 um. de ancho por 1 - 3 um. de largo entendiéndose
que se trata de bacilos delgados. Pero otros autores señalan que se trata de bacilos gruesos y
que mide 1.5 x 4 um.

CULTIVO

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Cultivos fecales en agar McConkey muestran colonias circulares, convexas y lisas con
bordes definidos de un color rosado. En agar eosina - azul de metileno las colonias presentan
centros ennegrecidos con un brillo metálico característico. Aparte de las características
mencionadas existe variaciones de colonias lisas y rugosas, y las cepas recién aisladas son
generalmente lisas. El desarrollo en la mayoría de los medios artificiales de cultivo es rápido y

pueden aparecer sobre ellos como


colonias lisas, rugosas ó mucoides, generalmente las colonias rugosas no son patógenas, a
diferencia de las colonias mucoides las cuales están asociadas a procesos enteropatogénicos o
septisémicos.

En medios selectivos como agar Salmonella - Shiguella (S-S) el desarrollo de las colonias de
Salmonella son incoloras con centro negro debido a la producción de gas, H2S. Las especies
de Shiguella muestran inhibiciones variables y sus colonias incoloras no presentan
ennegrecimiento. En agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) la mayor parte de las especies de
Salmonellay Arizona forman colonias rojas, la mayoría con centro negro por el gas, H2S. Los
géneros Providencia y Shiguella y muchas especies de Proteus no utilizan ningún hidrato de
carbono y forman colonias traslúcidas.

IDENTIFICACIÓN Y DIFERENCIACIÓN

Se emplean básicamente los patrones de reacción bioquímica, los patrones de fermentación


de los carbohidratos y la actividad de las descarboxilasas de los aminoácidos y otras enzimas.

OBJETIVOS

13. Describir las características microscópicas culturales y bioquímicasque permiten ejecutar


el aislamiento y la diferenciación bacilos gramnegativos.
14. Seleccionar los medios de cultivo empleados para llevar a cabo ladetección de las
Facultad De Medicina Veterinaria y Zootecnia – UNA – PUNOpag. 55
Lab. Microbiología - Guía Práctica de Bacteriología Oscar D. Orós B.
enterobacterias.
15. Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a lasenterobacterias.

IMPORTANCIA

√ Los resultados de este análisis permiten:


√ Determinar la presencia de bacilos negativos en infeccionesgastrointestinales.
√ Familiarizarse con la identificación de bacilos gram negativos.
√ Interpretar las pruebas bioquímicas para la diferenciación delas enterobacterias y otros
bacilos gram negativos.

MATERIALES

- Autoclave.
- Microscopio.
- Estereoscopio
- Estufa de incubación.
- Mechero Bunzen.
- Asa de kolle.
- Pipeta graduada de 5 - 10 ml
- Gradilla y canastillas
- Tubos de ensayo.
- Placas petri.
- Medios de cultivo.
- Muestras clínicas.
- Batería de coloración Gram.
- Laminas porta objetos.

METODOLOGÍA

1. Ponga a alcance los materiales y muestras junto al mechero.


2. Prepare la muestra a sembrar con estricta asepsia.
3. Tome un hisopo o asa de colle
4. Retire todo tipo de protección de las muestras obtenidas.
5. Con el mechero Bunzen encendido y respetando el margen deesterilidad inocule con el
hisopo o asa, el material, en una placa con agarMcConkey, EMB, SS agar, empleando la
técnica de agotamiento enestrías.
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Lab. Microbiología - Guía Práctica de Bacteriología Oscar D. Orós B.
6. Queme su hisopo para que no sea nuevamente
utilizado
7. Incube a 37°C durante 24 horas.
8. Transcurrido las 24 horas, saque las placas de la
incubadora y enciendael mechero, para realizar el
repique correspondiente en agar McConkey.
9. Haga un frotis de las colonias que crecieron en el agar
McConkey.
10. Tina con la técnica de Gram
11. Observe con aceite de inmersión el frotis
12. De acuerdo a lo observado en cada uno de los frotis
realice las pruebascorrespondientes.

PRUEBAS COMPLEMENTARIAS.

SIEMBRA EN AGAR TRIPLE AZÚCAR HIERRO (TSI).

Empleando el asade kolle se sembró en el fondo por


picadura y en la superficie en estría.La fermentación de los
carbohidratos se demuestra por el viraje del colordel medio de
rojizo a amarillo; la glucosa en el fondo del tubo, sacarosa enla
parte intermedia y la lactosa en la superficie.

SIEMBRA EN AGAR CITRATO DE SIMMONS. Solo crecen en


este mediolos gérmenes que utilizan el citrato como fuente
de carbono. Seconsideran citrato (-) si no muestran
crecimiento tras 4 días de incubación.

SIEMBRA EN CALDO O AGARUREA. Los microorganismos que


tienen la enzimaureasa, desdoblan la urea en amoniaco y en
anhídrido carbónico, loscuales hacen virar el indicador rojo de

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fenol al color rojo cereza.

SIEMBRA EN LISINA DESCARBOXILASA AGAR. Las


descarboxilasas(+), hacen virar el color al
violeta.También se lee la reducción detiosulfato a
sulfuro de hidrógeno, produce ennegrecimientopor la sal
de Fe.
PRODUCCION DE INDOL.
Para esta prueba se utilizan medios de cultivo que
contengantriptona o peptona, luego de la incubación por
24 horas, se emplea el reactivo de Kovac (tiras de
papel), el cual se introduce en los tubos inoculados El
viraje del reactivoa un color rosado, indica una reacción positiva.

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BIBLIOGRAFIA

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2. CIRCULO DE ESTUDIOS E INVESTIGACION GALENO. Medios de Cultivo en
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4. Frazier, w. 1985. "Microbiología de los Alimentos" 3ra. Edición Edit. Acribia. Zaragoza
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Manual Moderno S.A. México.
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8. NICOLET, J. Compendio de Bacteriología Médica Veterinaria. Editorial Acribia
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En El Intestino Grueso de la Vicuña – PUNO.1990. Tesis UNA.
11. Thatcher F. y Clarck D. 1973. "Análisis Microbiológico de los Alimentos" Edit. Acribia
Zaragoza España.

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