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Pruebas bioquímicas primarias

La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes


combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes. Los
ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas
convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de
reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la
bacteria al crecer transforma o no. Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples
que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica
bioquímica como presencia o ausencia de alguna actividad enzimática, grupo de enzimas o
determinada vía metabólica, crecimiento a cierta temperatura, crecimiento en presencia de
inhibidores, etc.

● GRAM
Nos permite separar las bacterias en dos grandes grupos GRAM (+) y GRAM (-). Esta tinción
se fundamenta y actúa directamente sobre la pared celular de las mismas, las GRAM (+)
poseen una pared celular gruesa compuesta de peptidoglicano y se tiñen de un color azul o
violeta, mientras que las GRAM (-) poseen una delgada pared de peptidoglicano recubierta
por una membrana celular externa y se tiñen de color rosa/rojo.
Pasos para la tinción:
1.- Aplicar cristal violeta, solo el suficiente para cubrir la muestra (dejar actuar por 60
segundos y enjuagar).
2.- Agregar Lugol y dejar por 60 segundos, posteriormente enjuagar.
3.- Agregar alcohol-cetona y enjuagar inmediatamente.
4.- Agregar safranina y dejar por 60 segundos, enjuagar y secar al medio.
Fundamento:
La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene
afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca Lugol, el
cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación de un
complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared
bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared
bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la membrana externa de las
bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos,
como la mezcla de alcohol-acetona. Las bacterias Gram positivas, al contener una gran
cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gram
negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se
coloca safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contra tinción y sirve
para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo.
NOTA:
· No se debe sobrepasar los tiempos de tinción y decoloración.
· Los cultivos viejos hacen que las bacterias Gram positivas se tiñen parcial o totalmente
de color rosa.
· Hay que tomar en cuenta que el agua usada en el frotis se encuentre en el rango de Ph
7-7.8 ya que:
Los grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
Los gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.

● OXIDASA
Esta prueba está basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada citocromoC
oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.
Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de
respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana celular
bacteriana, en las siguientes líneas se dará una breve explicación de la cadena respiratoria
solo con la finalidad de entender de donde proviene y que realiza la enzima citocromoC
oxidasa, entiéndase que todo este proceso tiene la finalidad de producir ATP.
En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que pasan los electrones
desde sus sustratos hasta llegar al citocromoC, la enzima llamada citocromoC oxidasa le
quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos por la enzima al oxígeno
siendo este el último aceptor de electrones en la cadena respiratoria, finalmente debido a que
el oxígeno tiene un exceso de electrones puede atraer átomos de Hidrógeno formando dos
posibles productos: Agua o peróxido de hidrógeno.

Reactivos utilizados: Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptores


artificiales de electrones que sustituyen de cierta manera al oxígeno usado por la bacteria, los
más usados son:
® Tetrametil-p-fenilendiamina.
® Dimetil-p-fenilendiamina.
® Indofenol.
El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, es el más
común y recibe el nombre de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar en discos
o fragmentos de papel filtro grueso. En el comercio ya se venden tiras o discos impregnados
con el reactivo.
Fundamento básico: El reactivo de Kovacs es incoloro, pero al ponerlo en contacto con la
enzima citocromoC oxidasa cambia a un color morado debido a que el tetrametil-p-
fenilendiamina es una amina aromática y la oxidación de esta produce quinolonas de color
morado-azulado.
Realización de la prueba:
® Se toma con un palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una
colonia aislada proveniente de un cultivo de 24h.
® La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado.
® Se debe observar una coloración morada en un lapso no mayor a 30 segundos para
que sea positivo, de lo contrario el resultado es negativo.
NOTA:
-No considerar un resultado positivo después de 30 segundos ya que el oxígeno molecular
del ambiente oxida al reactivo.
-No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas contienen hierro y este es
capaz de oxidar el reactivo dando falsos positivos.
-No realizar la prueba de bacterias que provienen de colonias obtenidas de medios de cultivos
que contienen glucosa u otro carbohidrato ya que la fermentación del carbohidrato inhibe a
la oxidasa dando como resultado falsos negativos en la prueba.
-Para realizar la prueba usar bacterias provenientes de medios de cultivo como son: Agar
sangre, Agar BHI, agar tripticasa soya, agar nutritivo, agar Mueller Hinton.
● CATALASA
El peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a
esta vía metabólica recibe el nombre de metabolismo aerobio-oxidativo.
La acumulación del peróxido es muy tóxico por lo que la mayoría de las bacterias aerobias y
anaerobias facultativas exceptuando a Streptococcus sp. producen una enzima llamada
catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno obteniendo agua y oxígeno gas.
Interpretación de la prueba:
El reactivo utilizado en la prueba es el peróxido de hidrógeno al 30%, Hay diferentes técnicas
para realizar la prueba la más común es poner una gota de peróxido en el portaobjetos y
posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir de una colonia aislada,
si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay producción de oxígeno por
lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa., hay bacterias que dan una
reacción positiva débil aunque son las menos.

Reacción de la catalasa.
● PRUEBA OF
Las bacterias ocupan diferentes vías metabólicas para obtener sus nutrientes y la energía, casi
todas las bacterias consumen algún tipo de carbohidrato generalmente el más utilizado por
las bacterias es la glucosa, usan la vía oxidativa, fermentativa o ambas.
La vía oxidativa utiliza oxígeno, un sinónimo es vía aerobia. El metabolismo fermentativo
no utiliza oxígeno, sinónimo metabolismo anaerobio.
Ingredientes del medio OF.
Peptona. 2g
NaCl. 5g
D-glucosa. 10g
Azul de bromotimol. 0.03g
Agar. 3g
Fosfato2 dipotasico. 0.3g
Agua. 1000m
Ph debe ser 7.1, que dará un color verde en la preparación.
Fundamento:
El metabolismo oxidativo de la glucosa produce ácidos débiles, por lo tanto en la prueba
bioquímica se utiliza de indicador el azul de bromotimol que tiene un vire de ph menor
respecto al rojo de fenol, ya que son ácidos débiles se agrega una mayor cantidad de glucosa
hasta el 1%, para que se produzca una mayor cantidad de ácidos y se alcance más fácilmente
el vire del indicador.
El metabolismo de las peptonas produce sustancias alcalinas que podrían disminuir el Ph del
medio evitando así evidenciar la presencia de los ácidos débiles producidos por la vía
oxidativa, para solucionar esto el medio tiene poca cantidad de peptonas hasta el 2% respecto
a la D-glucosa.
En el tubo sin aceite: La producción de ácidos débiles reduciría el ph del medio esto será
evidenciado gracias al indicador produciéndose una coloración amarilla en todo el tubo,
aunque puede variar su intensidad.
En el tubo con aceite: La fermentación de la glucosa produce ácidos fuertes respecto a los
que produce la vía oxidativa, ejemplo de estos ácidos son el ácido láctico, ácido fórmico,
ácido acético, entre otros. El medio se acidifica y el vire del indicador da como resultado una
coloración amarilla intensa en la totalidad del tubo.
Técnica de la prueba:
Se van a usar dos tubos, utilizando un asa recta la cual se flamea en el mechero, se puede
enfriar en agar estéril, después se toma un poco de bacteria a partir de una colonia aislada
posteriormente se inoculan ambos tubos por el método de picadura y finalmente se preparan
las condiciones de los tubos;
Un tubo se cerrará su tapa de tal forma que quede floja con la intención de que entre algo de
oxígeno, al segundo tubo se le agregara 1.5-2 mL de aceite mineral estéril y la tapa se cerrará
completamente, se incubarán durante 24h.
Interpretación:
Ambos tubos verdes se interpretan como: negativo o no sacarolítico debido a que no consume
glucosa.
Interpretación de tubos amarillo, amarillo: Fermentador facultativo y se reporta como: F
Cuando el tubo abierto es amarillo y el tubo con aceite es verde se interpreta como reacción
oxidativa y se reporta como: O
● PRUEBA DE MOTILIDAD
La motilidad se puede observar por un crecimiento turbio lejos de la picadura realizada en la
inoculación de los medios OF o en un medio SIM, este método es de confianza variable ya
que la picadura se pudo haber hecho chueca o irregular lo que nos darían falso positivo. Para
evitar este factor se realiza la técnica de gota suspendida bacteriana.
Técnica de gota suspendida 8 ki: Agregar sobre un portaobjetos una gota de solución
fisiológica salina estéril, ponerle un poco de muestra bacteriana, homogeneizar de tal forma
que la gota no se extienda mucho, ponerle encima un cubreobjetos al que previamente se le
a puesto una base de 4 bolitas pequeñas de plastilina con el objetivo de evitar que aplaste
totalmente la gota con bacteria, finalmente observar al microscopio con un objetivo de 40X.
Se alcanzan haber bacterias muy pequeñas y casi translúcidas moverse a velocidad variable,
observar al menos de 5-10 bacterias recorrer todo el campo de visión para declarase una
motilidad positiva. La mayoría de las bacterias motiles son de morfología bacilar o sea
Bacilos., Pero no todos los bacilos son motiles.

OBJETIVO
Identificar y clasificar ciertas bacterias en género y especie mediante la aplicación de
pruebas bioquímicas primarias que permitirán conocer características propias de su
metabolismo y morfología para así distinguirlas de manera más concreta.

METODOLOGÍA
Nota: A cada equipo se le proporcionaron cierto tipo de bacterias inoculadas en agares
enriquecidos, las cuale fueron: E.Coli, Pseudomonas, Bc, Staphy y Stepto. A cada una de
ellas se les aplicaron las pba’s bqa’s primarias en el siguiente orden:

● Tinción de Gram para todas los cultivos con las bacterias antes mencionadas.
1.-Tomar una muestra con el asa bacteriológica previamente esterilizada de la bacteria
inoculada.
2.- En un portaobjetos, colocar una gota de agua y extender la muestra de la bacteria de forma
circular (en espiral) sobre la gota de agua.
3.- Secar la muestra al aire o pasándola suavemente por el mechero.
4.- Una vez seca, colocar una gota de cristal violeta y esperar por 1 min.
5.- Escurrir el excedente.
6.- Colocar unas gotas de lugol p9(mordiente) durante 1 min.
7.-Decantar el exceso.
8.- Colocar unas gotas de alcohol-acetona durante 5 seg e inmediatamente enjuagar con agua
de forma rápida.
9.-Colocar gotas de safranina por 1 min.
10.- Enjuagar y secar al aire libre o con el mechero.
11.- Observar a 10x, 40x, 60x y 100x en el microscopio.
12.- Repetir procedimiento para todas las bacterias (Ec, Ps, Bc, Stepto y Staphy)

● Prueba de Catalasa para Stepto


1- Agregar una gota de peróxido en el portaobjetos
2- Posteriormente y con un palillo plano, tomar un poco de bacteria a partir de una colonia
aislada
3- Observar si hay brubujeo significativo de producción de oxígeno

● Prueba de Oxidasa para Strepto


1- Tomar con palillo grueso de madera una muestra bacteriana a partir de una colonia aislada
proveniente de un cultivo de 24h.
2- Poner la muestra en contacto con la tira o disco impregnado.
3- Observar una coloración morada en un lapso no mayor a 30 segundos para que sea
positivo, de lo contrario el resultado es negativo.

● Prueba de Motilidad para Staphy y Ps


1.- A un cubreobjetos colocarle en las esquinas bolas pequeñas de plastilina
2.- Encima del cubreobjetos colocar una gota de agua esterilizada y con el asa bacteriológica
desinfectada, homogeneizar la bacteria inoculada.
3.- Colocar encima un portaobjetos sin aplastar la gota, de modo que permanezca el
fundamento de gota suspendida.
4.- Observar únicamente a 40x para cada bacteria.

● Prueba de O/F para E.coli

Nota: Se usarán dos tubos


1.- Tomar una muestra de la bacteria con un asa bacteriológica esterilizada
3- Inocular ambos tubos por el método de picadura
5- Cerrar el primer tubo de tal forma que la tapa quede floja con la intención de que entre
algo de oxígeno
6- Agregar al segundo tubo 1.5-2ml de aceite mineral estéril y cerrar la tapa completamente
7- Incubar durante 24h.

RESULTADOS
BACTERIA Gram Catalasa Oxidasa Motilidad O/F

streptococcu + 1- 1 - 1 - No
s estreptococo 2- 2 - 4 - sacarolítico
violeta 3- 3 - 9 + 7. cerrado:
4- 4 - acido
5- 5 - abierto:
6- 6 - acido
7- 7 - ***cerrado:
8- 8 - neutro
9- 9 - abierto:
10 - 10 - neutro
***cerrado:si
n cambios
abierto:sin
cambio
staphylococc + 1 + 1- 8- Fermentativa
us estafilococo 2 + 2- 6- cerrado:
violeta 3+ 3- amarillo
4+ 4- abierto:
5+ 5+ amarillo
6+ 6-
7+ 7-
8+ 8-
9+ 9-
10 + 10

escherichia - 1+ 1- 3 - Fermentativo
coli bacilos rojos 2+ 2- 5 + 3 cerrado:
3- 3- ácido
4- 4- abierto:
5+ 5+ ácido
6- 6- 5 cerrado:
7- 7- ácido
8- 8- abierto:
9+ 9- ácido
10 - 10 + 1 cerrado:
ácido
abierto:
ácido
10 cerrado:
ácido
abierto ácido

pseudomona - 1+ 1 + 1 + Oxidativo
s bacilos rojos 2+ 2 - 2 - abierto:
3+ 3 + 4 + ácido
4+ 4+ 6 + cerrado
5+ 5+ 7 + alcalino
6+ 6+ 8 + ***abierto:
7+ 7+ ácido
8+ 8+ cerrado
9+ 9+ alcalino
10 + 10 - **cerrado:
alcalino
abierto:
ácido

bacillus + 1+ 1+ 2 - Fermentativo
morados 2+ 2 - 1 - facultativo
cadenas 3+ 3+ Cerrado:
4+ 4 - amarillo
5+ 5+ Abierto:
6+ 6 - amarillo
7+ 7+
8+ 8+
9+ 9+
10 - 10 -

ANÁLISIS DE RESULTADOS
Las pruebas bioquímicas primarias son métodos de identificación para las bacterias, estas
ayudan a definir el género o la familia a la que pertenecen con base en si se habla de bacterias
o enterobacterias respectivamente. En esta práctica se llevó a cabo un protocolo experimental
de identificación para 5 muestras de bacterias distintas (pseudomonas, bacillus, escherichia
coli, staphylococcus y streptococcus) a las cuales se les aplicaron las pruebas bioquímicas
primarias existentes (tinción GRAM, oxidasa, catalasa, prueba O/F y pruebas de motilidad
tales como gota suspendida y O/F) y con ello se pudo observar, la morfología de la bacteria,
así como también algunas de las reacciones metabólicas que llevan a cabo estas.
Se realizó la prueba de tinción GRAM para las 5 muestras que se proporcionaron por equipo.
Una vez realizada la técnica de fijación y coloración de forma ordenada para cada una de las
muestras, se procedió a observar las laminillas a objetivos de 10x, 40x, y 100x.
NOTA: el objetivo de 40x del microscopio con el que se trabajó estaba dañado, por lo cual
no se pudieron observar las muestras a éste objetivo.
Al observar la laminilla de Streptococcus se observó que ésta era una bacteria Gram (+) de
color violeta/azul con morfología de estreptococo. El ser Gram (+) indica que el grosor de su
pared celular es gruesa y se compone de peptidoglicanos, lo que le permite retener con mayor
fuerza el complejo que se forma al agregar alcohol-cetona y deshidratar su pared bacteriana.
La laminilla de Staphylococcus al observarse al microscopio se clasificó como una bacteria
Gram (+) de color violeta/azul con morfología de estafilococo. El fundamento para las Gram
(+) es el anteriormente mencionado.
Al observar la laminilla que contenía la bacteria E.Coli se identificó que ésta era Gram (-) de
color rojo/rosa con morfología de bacilos. Las bacterias Gram (-) tienen una fina capa de
peptidoglicano en su pared celular y no soportan la deshidratación por el alcohol-cetona,
destruyendo su membrana externa.
La laminilla de Pseudomonas fue Gram (-) de color rojo/rosa y se observó una morfología de
bacilos.
Al observar la laminilla de Bacillus se observó que esta era Gram (-) de color rosa con
morfología de bacilos en cadenas.
Los resultados obtenidos en cada una de las muestras fijadas y teñidas coinciden con lo
reportado en la literatura para éste tipo de microorganismos. Una vez que se tienen las
lecturas de ésta primer prueba, se procede a realizar las siguientes para clasificar de forma
más concreta a cada m.o.
Siendo así, se realizó la prueba de oxidasa y catalasa; con base a los resultados obtenidos y
al fundamento de estas pruebas se pudo observar que las bacterias positivas a oxidasa fueron
pseudomonas y bacillus, lo que indica que estas bacterias metabolizan una enzima llamada
citocromoC oxidasa durante la cadena respiratoria en donde activa la oxidación del citocromo
reducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como aceptor de electrones para la
producción de agua y peróxido de hidrógeno. Para observar la presencia de esta enzima se
hace uso del reactivo de Kovacs el cual genera una reacción de oxidación gracias a que este
produce quinolinas al entrar en contacto con la enzima oxidasa y eso es lo que da el color
morado de la prueba. La oxidasa positiva está limitada para organismos que pueden crecer
en presencia de oxígeno y va ligada a la prueba de catalasa que en esta experimentación dió
positivo para staphylococcus, bacillus, pseudomonas y escherichia coli; esta prueba indica
que la bacteria produce la enzima catalasa gracias a que llevan a cabo un metabolismo
aerobio-oxidativo el cual genera altas cantidades de peróxido de hidrógeno en cantidades
tóxicas para las bacterias, por lo que como medio de defensa la bacteria produce catalasa,
degradando el H2O2 y produciendo oxígeno gas y agua. Gracias a ello se puede observar
burbujeo al realizar la prueba.
Las bacterias que dieron negativo a estas pruebas cumplen otros criterios metabólicos ya que
con estas dos pruebas se está evaluando el tipo de metabolismo presente en ellas.
La prueba O/F permite determinar el metabolismo de la bacteria al igual que las dos pruebas
anteriores pero basándose en fundamentos de fermentación y oxidación ,así como también
evalúa si hay presencia de estructuras que permitan la motilidad de la bacteria gracias a una
turbidez que se puede observar alrededor del sitio en el que se inoculo,
De las bacterias inoculadas la única que presenta motilidad es el bacillus debido a que en su
estructura posee flagelos que le brindan esa propiedad. La vía oxidativa utiliza oxígeno por
lo que las bacterias que presentan este comportamiento requieren ser aerobias mientras que
la vía fermentativa la llevarán a cabo las bacterias anaerobias estrictas, estas vías indican el
metabolismo de un glúcido, aquellas bacterias que no muestran ninguno de estos
comportamientos se denominan no sacarolíticas debido a que son bacterias capaces de
hidrolizar el azúcar. De las bacterias que se estudiaron aquella que se definió como no
sacarolítica fue el streptococcus, en cambio las pseudomonas son oxidativas ya que en ambos
medios se aprecia un vire ligeramente amarillo esto debido a que se produce poca acidez y
esta no es suficiente para alcanzar el pH necesario para que vire del indicador (azul de
bromotimol). En este medio el aceptor final de electrones es un compuesto orgánico y esto
favorece a la producción de ácidos. Por último, los bacillus, staphylococcus y escherichia
coli son son bacterias que presentaron el vire amarillo pero se definen como organismos
anaerobios facultativos, los cuales en presencia de oxígeno utilizan preferentemente una
respiración aerobia pero pueden carecer de él y seguir realizando sus funciones con
normalidad . Por esta capacidad , el comportamiento de estas en la prueba O/F será
fermentativo facultativo, presentando un color amarillo en ambos medios (tubo ligeramente
abierto que permite la entrada de oxígeno y tubo con aceite cerrado) el color indica que el
medio está acidificado gracias a que la fermentación de la glucosa produce ácidos fuertes y
esto ayuda a alcanzar el pH para obtener el vire del indicador (azul de bromotimol). Este
cambio de color y el definir que llevan a cabo un metabolismo por vía fermentativa dan una
referencia de que son organismos capaces de actuar en presencia y ausencia de oxígeno por
lo que el medio en el que fueron trabajadas cumplia las condiciones necesarias para fermentar
o degradar carbohidratos.

La prueba de motilidad se aplicó a Pseudomonas y Staphylococcus. Para el primer


microorganismo se esperaba ver una motilidad positiva ya que se sabe que son bacilos
rectos que tienen un sólo flagelo que les concede cierta movilidad; el resultado obtenido fue
negativo puesto que el objetivo de 40x del microscopio utilizado estaba dañado y no se
pudo observar esta propiedad.
Por otra parte, Staphylococcus presentó una motilidad negativa ya que los microorganismos
con morfología de cocos no presentan flagelos en su estructura, por lo tanto no tienen
capacidad para desplazarse.

OBSERVACIONES
Debido a cuestiones de tiempo , las pruebas bioquímicas primarias no se les realizaron a
todas las bacterias proporcionadas al equipo, sin embargo los resultados se complementaron
con los obtenidos de manera grupal. Haciendo una comparativa, se observó que en el caso
de las pseudomonas, se obtuvo una motilidad negativa, esto fue debido a que el
microscopio con el que se trabajó tiene dañado el objetivo 40x y no posee objetivo de 60x ,
de manera que esto imposibilita identificar si ésta bacteria tiene flagelos o no, dato que se
comprobó en la literatura indicando que las pseudomonas presentan una motilidad positiva.
A su vez, se obtuvo un resultado negativo para Oxidasa utilizando ésta misma bacteria, dato
equívoco ya que la literatura marca que las pseudomonas son oxidasa positivas
Para la prueba de catalasa en Bc, se obtuvo un resultado negativo, siendo esto erróneo dado
que los Bacillus son catalasa positivos ya que poseen enzimas oxidantes que producen agua
o peróxido de hidrógeno.
Para Staphylococcus en Oxidasa, el grupo obtuvo una prueba negativa, dato que al buscarse
en la literatura indica que es un microorganismo Oxidasa positivo.
Los fallos en la obtención de resultados se debieron quizá a una mala técnica al momento
de realizar las pruebas o debido al tiempo en que éstas se deben dejar para poder realizarles
la lectura.

CONCLUSIONES
Existen una gran cantidad de técnicas que permiten analizar los diversos tipos de bacterias
que pueden crecer en un medio de cultivo determinado. La tinción de gram nos permite
conocer la morfología de las bacterias presentes en los medios de cultivos así como
características propias de su pared celular y membrana externa , mientras que las pruebas
bioquímicas son utilizadas para identificar el género y especie de una bacteria presente en
una colonia.

Con base en los resultados obtenidos en la experimentación, ésta se cumple de manera


satisfactoria ya que se pudieron identificar características propias del metabolismo de cada
bacteria y analizarlas con la ayuda de las distintas pruebas bioquímicas primarias utilizadas.
Para poder lograr un diagnóstico de todas estas especies es necesario llevar acabo las
pruebas bioquímicas en un orden especifico para ir descartando posibilidades de género y
especie. Toda prueba bioquímica debe empezar con una tincion de gram que nos permitirá
conocer si es Gram (-) o Gram (+) así como su morfología y agrupación, partiendo de esto
se realizan las pruebas catalasa , oxidasa, motilidad y O/F.
Con los resultados obtenidos en estas pruebas se pueden realizar pruebas secundarias para
continuar con el diagnóstico y análisis de cierto tipo de bacteria.
BIBLIOGRAFÍA
UNIVERSIDAD NACIONAL
AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS
SUPERIORES CUAUTITLÁN

Laboratorio de Microbiología

Práctica 6. Pruebas bioquímicas secundarias


(Reporte experimental de)

Equipo 10:
López----------------- Itzel
Rivera Matías Alejandro Ángel Rodolfo
Sosa Pascacio Karen Michelle
Vargas Reyes Samantha Elizabeth

Profesores:
Dra. Alma Nuñez del Arco
Víctor Hugo Vázquez Valadez

Fecha de entrega 21/03/19


INTRODUCCIÓN

-Respiración bacteriana
En las bacterias la respiración puede ser de tipo:
-Anaerobia: Este tipo de respiración se lleva a cabo en total ausencia de oxígeno
molecular; algunos microorganismos recurren a este tipo de respiración únicamente
cuando disminuye el oxígeno en su medio. La respiración anaerobia más frecuente
ocurre en la fermentación alcohólica y en la fermentación láctica.
Las bacterias que presentan respiración anaerobia, degradan parcialmente la glucosa
hasta obtener ácido pirúvico, luego lo transforman en acetaldehído, y finalmente en
Etanol.
-Anaerobios estrictos
Los anaerobios estrictos crecen y se multiplican en ausencia total de Oxígeno
molecular (O2) logrando obtener energía libre y sintetizar todos sus componentes
estructurales sin la ayuda del O2 ya que les resulta tóxico.

-Anaerobios facultativos
Utilizan preferentemente respiración aerobia en presencia de oxígeno, pero tienen la
capacidad o facultad, de ahí el nombre, de realizar fermentación o algún tipo de
respiración anaerobia si no disponen de oxígeno. Por ejemplo, Escherichia coli,
Salmonella, Listeria o Staphylococcus.

-Aerobios estrictos
Son microorganismos al que le son imprescindible el oxígeno libre, ya que su fuente de
energía la obtienen de la respiración aeróbica, donde se requiere oxígeno molecular
como oxidante terminal.

-Familia Enterobactericeae
La familia Enterobacteriaceae constituye un grupo grande y
heterogéneo de bacterias gramnegativas. Reciben su nombre
por la localización habitual como saprofitos en el tubo digestivo, aunque se trata de
gérmenes ubicuos, encontrándose de
forma universal en el suelo, el agua y la vegetación, así como
formando parte de la flora intestinal normal de muchos animales además del hombre.
Escherichia coli, el microorganismo más prevalente de esta
familia, es una de las bacterias prototípicas sometidas a estudio

-Géneros y especies
El género es una categoría taxonómica que se ubica entre la familia y la especie. Así,
un género es un grupo de organismos que a su vez puede dividirse en varias especies
(existen algunos géneros que son monoespecíficos, es decir, contienen una sola
especie).

-Utilidad de las pruebas bioquímicas secundarias


Las pruebas bioquímicas se emplean para identificar de forma clara y precisa, la
presencia o ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas, o de una vía metabólica
completa en uno o más
microorganismos.

-Cuáles son las pruebas bioquímicas secundarias y sus fundamentos


Pruebas líquidas:
● KIA (agar hierro de Kliger): Medio de cultivo frecuentemente usado en
microbiología para la diferenciación de enterobacterias, en base a la
fermentación de hidratos de carbono y a la producción de ácido sulfhídrico.
Fundamento:
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de
carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
producción de ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones
Fe3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de
color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el
balance osmótico. El agar es el agente solidificante.Por fermentación de azúcares se
producen ácidos que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al
color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno
el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de
hierro de color negro.
Resultados:
1- Producción de ácidos de la glucosa (no de la lactosa) En la superficie del medio las
enterobacterias respiran consumiendo la glucosa: Cuando la agotan (solo tiene 0.1%)
consumen los péptidos y se alcaliniza el medio (la superficie rosa). En el fondo las
enterobacterias fermentan la glucosa produciendo ácidos (fondo amarillo).
2- Producción de ácidos de la lactosa (y de la glucosa): En la superficie del medio las
enterobacterias respiran utilizando la glucosa y luego la lactosa. En el fondo producen
una elevada cantidad de ácidos y difunden hasta la superficie (todo el medio amarillo).
3-Producción de SH2 (color negro): la bacteria ha realizado una respiración
anaerobia utilizando el tiosulfato como aceptor de electrones; el tiosulfato se convierte
en SH2 que con el Fe3+ ornitina S3Fe2 (color negro).
● Malonatos: Pone de manifiesto la capacidad que poseen determinadas
bacterias de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono, con la
consiguiente liberación del catión, que en presencia de iones agua produce
alcalinidad. Solamente los microorganismos que pueden usar simultáneamente
malonato de sodio como fuente de carbono y sulfato de amonio como fuente de
nitrógeno son capaces de ejercer una acción tampón produciendo hidróxido de
sodio. El aumento de la alcalinidad resultante hace que el azul de bromotimol
cambie de verde a azul. Los microorganismos malonato negativos que
fermentan glucosa hacen que el indicador cambie de verde a amarillo. Se
utiliza en la diferenciación de especies entre las Enterobacteriaceae. La
mayorÌa de las especies de Enterobacter y Klebsiella utilizan malonato de
sodio.
● MR-VP: Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo y
Voges Proskauer. Es particularmente útil para la clasificación de
enterobacterias.
Fundamento:
En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable.La glucosa
puede ser metabolizada por los microorganismos, a través de distintas vías
metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos (ácido
láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil metil
carbinol).Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la
adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos
ácidos, y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la
presencia de productos finales neutros. Voges y Proskauer, describieron una
coloración rojiza que aparecía después de adicionar hidróxido de potasio a los cultivos
de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloración se debe a la
oxidación del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del
medio para dar un color rojo.
Interpretación de resultados
Prueba del rojo de metilo:
Resultado positivo: color rojo.
Resultado negativo: color amarillo.
Prueba de Voges proskauer:
Resultado positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos después de
una completa agitación del tubo.
Resultado negativo: ausencia de color rojo
● ALO: La lisina, la arginina y la ornitina son enzimas descarboxilasas que
generalmente se forman y se activan en condiciones de acidez y anaerobiosis.
Para estudiarlas se debe inocular la bacteria en estudio en un caldo base para
descarboxilasas de Möeller, el cual contiene 0,05% de glucosa para que las
bacterias fermentadoras la utilicen y acidifiquen el medio virando el color del
mismo por acción del indicador de pH: rojo de cresol, que vira el medio de
púrpura (pH 8,8) a amarillo (pH 7). De esta manera se activan las
descarboxilasas, que actúan sobre los aminoácidos produciendo aminas
(cadaverina a partir de lisina y putrescina a partir de arginina y ornitina ) las
cuales elevan el pH del medio, virando nuevamente el color del mismo, esta vez
por acción del segundo indicador de pH: púrpura de bromocresol, que vira el
medio de amarillo (pH 5,2) a púrpura (pH 6,8).

● Nitratos (NO3): En esta prueba se detecta una respiración anaerobia: la que


utiliza nitrato como aceptor final de electrones. Los nitratos se reducen a
nitritos y algunas bacterias reducen los nitritos a productos gaseosos ( N2 y
N2O). Las enzimas responsables de ambas reducciones se denominan nitrato y
nitrito reductasa, respectivamente.
La prueba detecta nitritos en los cultivos con reactivos que originan una
coloración roja. La reducción de nitritos hasta gas se detecta por medio de una
campanita Durham.

Pruebas semisólidas
● SIM: Con el medio SIM (Sulfuro Indol Movilidad)se puede verificar la
movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo.
Fundamento:
Es un medio semisólido que se utiliza para el estudio de la formación de indol,
movilidad y SH2 en las bacterias entéricas gram negativas. Las cepas móviles pueden
observarse por la turbidez que producen alrededor del punto de siembra. Apropiado
para enterobacterias como E. coli, Salmonella typhimurium y Shigella flexneri.
Es un medio diferencial utilizado en la confirmación presuntiva de miembros de la
familia Enterobacteriaceaea, a partir de cultivos puros, en base a la capacidad de
producción de SH2 ( Sulfuro de hidrógeno), formación de Indol, y manifestación de
movilidad, después de su identificación presuntiva en otros medios diferenciales como
Kligler o T.S.I. La producción de SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del
medio, como consecuencia de la formación de un precipitado negro (Sulfuro de
Hierro). Su contenido en peptona proporciona los niveles necesarios de Triptófano
para la producción de Indol. Para determinar si se ha producido Indol, añadir tres o
cuatro gotas de reactivo de Kovac: la formación de un color rojo en la superficie del
medio, se interpreta como reacción positiva, mientras que un color amarillo, como
una reacción negativa. La movilidad se manifiesta por un crecimiento difuso desde la
línea de inoculación hacia las paredes del tubo, mientras que aquellos
microorganismos no móviles, concentran su crecimiento alrededor de la línea de
inoculación.
● MIO: El Medio de Motilidad – Indol – Ornitina (M.I.O.) es un medio de cultivo
ampliamente utilizado para la diferenciación de bacilos Gram negativos
entéricos, sobre la base de la producción de Indol, la actividad de la enzima
Ornitina decarboxilasa y la capacidad de motilidad.
● Gelatina: La gelatina nutritiva se utiliza para la diferenciación de
microorganismos sobre la base de la producción de gelatinasa en un entorno de
laboratorio. La gelatina nutritiva no está destinada a ser utilizada en el
diagnóstico de enfermedades u otras condiciones en humanos.
La identificación de bacilos Gram-negativos fermentativos y no fermentativos
incluye la prueba de licuefacción de gelatina. Si la enzima proteolítica
gelatinasa está presente, la gelatina se hidroliza y pierde su característica de
gelificación. Edwards y Ewing incluyen esta prueba en el esquema de
diferenciación de Enterobacteriaceae. Están disponibles procedimientos para
realizar el método de tubo estándar para la licuefacción de gelatina.

Pruebas sólidas
● LIA: El Medio de Lisina y hierro (L.I.A.) es un medio de cultivo
ampliamente utilizado para la diferenciación de bacilos Gram negativos
entéricos, especialmente miembros del género Salmonella con capacidad
de fermentación de lactosa, sobre la base de la producción de H2S y la
actividad de la enzima Lisina decarboxilasa. También es posible
observar cambios debidos a la actividad de la enzima lisina deaminasa,
característica del género Proteus y Providencia. Las peptonas y el
extracto de levadura aportan aminoácidos y nutrientes esenciales, la
dextrosa constituye una fuente de energía. El citrato de amonio férrico
y el tiosulfato de sodio actúan como marcadores de la producción de
H2S, en este caso se observa el desarrollo de sulfuro de hierro negro en
el tubo.
● Citratos: La alcalinización del medio sucede por el propio amoniaco
formado fruto de la liberación de las sales amónicas del medio y de la
eliminación del citrato. Esto se pone de manifiesto con el indicador que
incluye el medio, que es azul de bromotimol.
● Fenilalanina: Medio de cultivo utilizado para diferenciar Morganella
morganii bio-grupo 1 y 2, Proteus spp. y Providencia spp., de la
mayoría de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae, en base a
la presencia de la enzima fenilalanina deaminasa.7
Fundamento:
En el medio de cultivo, el extracto de levadura aporta los nutrientes necesarios para el
adecuado desarrollo bacteriano.El aminoácido fenilalanina es sometido a la
desaminación oxidativa catalizada por la enzima fenilalanina deaminasa (es una
flavoproteína), para producir ácido fenilpirúvico y amoníaco. La presencia del ácido
fenilpirúvico se demuestra con el agregado de cloruro férrico en medio ácido, con el
cual se forma un quelato de color verdoso entre el ácido fenilpirúvico y los iones Fe3+.
OBJETIVO
● Conocer los fundamentos de las pruebas bioquímicas secundarias (IMViC,
KIA, urea, MIO, LIA, arginina, fenilalanina, nitrato , malonatos y gelatina)
para identificación de género y especie en enterobacterias.
● Aplicar la técnica adecuada de inoculación para cada prueba bioquímica
secundaria.
● Identificar las características metabólicas de la cepa evaluada en el laboratorio
mediante el uso de estas pruebas.

METODOLOGÍA
Nota: al equipo se le proporcionó una cepa desconocida, con ella se realizaron las
siguientes pruebas.
● Pruebas líquidas (urea, malonatos, MR-VP, arginina y nitratos)
1.-Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar un inóculo pesado de una
colonia aislada de la cepa problema. Todo a una distancia no menor de 20 cm del
mechero.
2.-Introducir el inóculo al tubo de la prueba bioquímica secundaria y girar el asa
hasta depositarlo.
3.-Cerrar parcialmente el tubo y homogeneizar con golpes suaves.
4.-Incubar durante 24 hrs a 37°C y registrar resultados.
5.- Repetir para cada prueba.
Nota: para la prueba de arginina, colocar unas gotas de aceite mineral en la
superficie.

● Pruebas semisólidas (SIM, MIO y gelatina)


1.-Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar un inóculo mediano de
una colonia aislada de la cepa problema. Todo a una distancia no menor de 20 cm del
mechero.
2.-Introducir el inóculo al tubo de la prueba bioquímica secundaria mediante la
técnica de picadura procurando que sea una trayectoria recta hasta el fondo del tubo.
3.-Retirar el asa bacteriológica y cerrar parcialmente el tubo.
4.- Incubar durante 24 hrs a 37°C y registrar resultados.
5.-Repetir para cada prueba.
● Pruebas sólidas (KIA/TSI, LIA, citratos, fenilalanina)
1.-Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar un inóculo mediano de
una colonia aislada de la cepa problema. Todo a una distancia no menor a 20cm del
mechero.
2.-Introducir el inóculo en el tubo de la prueba bioquímica secundaria mediante la
técnica por picadura y estriado en la superficie del medio una vez que se retira el asa
bacteriológica.
3.-Retirar el asa bacteriológica y cerrar parcialmente el tubo.
4.-Incubar durante 24 hrs a 37°C y registrar resultados.
5.-Repetir para cada prueba.

Adición de reactivos posterior a la incubación


● MR-VP
1.-Separar y rotular los tubos destinados para MR y VP.
2.-Adicionar gotas de rojo de metilo en el tubo de MR
3. Adicionar gotas de KOH al 40% y posteriormente alpha-naftol. Registrar
resultados.

● Nitratos
1.-Añadir gotas alpha-naftilamina y ácido sulfanílico. Observar si existe cambio de
coloración (rojo). En caso de no existir tal, agregar granilla de zinc y observar cambio
de ñnnstcoloración. Registrar resultados.

● Indol
1.- Añadir gotas del reactivo de Kovacs (Dimetilamino-benzaldehído). Observar la
presencia de un anillo rojo en la superficie. Registrar resultados.

TABLAS DE RESULTADOS
Tabla 1. Resultados de las pruebas bioquímicas primarias para enterobacterias.

Prueba bioquímica primaria Resultado

Gram (-)

Catalasa (+)
Oxidasa (-)

Motilidad (+)

O/F (Ff)

Tabla 2. Resultados de las pruebas bioquímicas primarias para


enterobacterias

Prueba bioquímica Resultado Fotografía


secundaria

Indol (+)

Rojo de Metilo (MR) (+)

Vogues Proskauer (VP) (-)

Citratos (-)

Urea (+)

Malonatos (-)

Arginina (-)

Nitratos (+)

Fenilalanina (-)

Gelatina (-)

KIA Alcali/Acid
Fermentadora de glucosa
(+)
Producción de gas
LIA Alcali/Acid
Lisina descarboxilasa (-)

MIO O. Descarboxilasa (+)


Motilidad (+)
Indol (+)

SIM Sulfuro(+)
Indol (+)
Motilidad(+)

TSI Alcali/Acid ó K/A


Fermentadora de glucosa
(+)
Lactosa (-)

ANÁLISIS
Realizar un diagnóstico certero requiere una ejecución correcta de las pruebas
bioquímicas secundarias, empezando por la prueba IMViC (Indol, Rojo de metilo,
Vogues Proskauer y Citratos). Dicha prueba es de gran importancia ya que permite
identificar el género de la cepa problema a trabajar.

La prueba de Indol se evaluó en el tubo de SIM, el cual, pasadas las 24 hrs de


incubación a 37°C (condiciones que aseguran crecimiento bacteriano en todos los
tubos y por lo tanto actividades metabólicas) se le agregó reactivo de Kovacs (Elrich)
el cual contiene Dimetilamino-benzaldehído que reacciona con el indol formado a
partir del triptófano por la acción de la enzima triptofanasa. Esta interacción forma
un compuesto color violeta que se pudo observar como un anillo en la superficie del
medio, esto indica que la prueba es positiva debido a que la bacteria contiene la
enzima triptofanasa.

La prueba de Rojo de metilo se evalúo en el tubo de MR-VP una vez que éste se
separó y rotuló en dos tubos: MR y VP. En el tubo de MR se agregó el indicador rojo
de metilo y se observó un cambio de color de amarillo (casi incoloro) a naranja/rojizo,
esto indica que la bacteria fue capaz de fermentar glucosa y la producción de ácidos
fue lo suficientemente favorable para bajar el pH a casi 4. Esto se comprueba ya que
la literatura expresa que el rojo de metilo es un indicador cuyo vire de color varía de
rojo (pH 4.4) a amarillo (pH 6.3).
Así mismo, Vogues Proskauer se evaluó en el tubo VP, al cual se le agregó KOH al
40% y alpha-naftol. Esta prueba indica la capacidad de un microorganismo de
producir un producto final neutro (acetoína) a partir de la fermentación de la glucosa
por vía butanodiolica. Este proceso se observa si al agregar en orden dichos reactivos
y agitar fuertemente, se forma un anillo rojo intenso en la superficie del medio. Esta
prueba fue negativa ya que solamente se observó un tono lechoso en el medio, sin el
anillo rojo mencionado. Por lo tanto, la bacteria no fermenta glucosa por dicha vía ni
da como producto acetoína.

El tubo de la prueba de Citratos permite conocer la facultad de la bacteria para


utilizar el citrato del medio (Citrato de sodio) como única fuente de carbono y al
amonio como única fuente de nitrógeno. Éste medio contiene como indicador al azul
de bromotimol, una prueba positiva hace que el pico de flauta del medio se torne de
color Azul prusia por alcalinidad del medio y producción de acetato. En este tubo,
pasado el tiempo de incubación, no se observó ningún cambio de color (el tubo es en
un inicio verde, lo cual indica condiciones neutras), esto indicó una prueba negativa.

La prueba de Urea refiere a la capacidad de un micoorganismo de desdoblar


(hidrolizar) a la urea, formando dos moléculas de amoniaco por la acción de la enzima
ureasa. Este medio contiene como indicador rojo de fenol, el cual vira a rosa cuando el
medio está alcalino por la presencia del amoniaco. Este dato se comprueba ya que la
literatura indica que el rojo de fenol tiene un vire de amarillo (pH 6.8) a rosa/rojo (pH
8.4). Por lo tanto, la prueba analizada fue positiva, indicando la capacidad de
hidrólisis de la bacteria.

El tubo con la prueba de Malonatos se evalúa con la capacidad del microorganismo de


utilizar el malonato como única fuente de carbono y y la desaminación de la
fenilalanina, en forma combinada. Debido a que el microorganismo a evaluar
proviene de la familia de las enterobacterias, solamente se evalúa la utilización del
malonato o la desaminación de fenilalanina. Este medio tiene como indicador al verde
de bromotimol. Un viraje en el color verde a azul del medio, es una prueba positiva,
sin embargo, el color del medio no cambió, siendo una prueba negativa ya que los
organismos no son capaces de realizar ninguna de estas actividades.

Para la prueba de Arginina se evalúa si la bacteria posee una enzima descarboxilasa


que es capaz de atacar el grupo carboxilo de distintos aminoácidos, produciendo
anhídrido carbónico o una amina. En este medio se observó un cambio de coloración a
púrpura, esto debido a que una bacteria capaz de fermentar glucosa, produce ácidos
que bajan el pH del medio y cambian el color de vire de púrpura a amarillo. La ácidez
del medio estimula la acción de la enzima descarboxilasa y el aminoácido es
degradado a una amina. La formación de aminas como cadaverina y putrescina
(diamina creada al pudrirse la carne, de olor característico) eleva el pH del medio y
hacen que éste vuelva a la alcalinidad, cambiando el color del indicador de amarillo a
púrpura. Si el organismo no produce la enzima apropiada, el medio permanece en
color amarillo. Esto da como resultado una prueba negativa ya que no se observó
cambio de color y permaneció amarillo,

La prueba de Nitratos indica la capacidad de una bacteria para reducir los nitratos a
nitritos o nitrógeno molecular. Una vez pasado el tiempo de incubación, al tubo de
ésta prueba se le agregó Alfa-naftilamina y ácido sulfanílico para que éste medio se
redujera a nitratos, al no observarse cambio de coloración, se agregó granilla de zinc
que permitiría reducir hasta nitrógeno molecular. Se logró identificar un color rojizo
en el medio después de agregar zinc, lo cual indica una reacción negativa para la
reducción de nitratos y positiva para la reducción de nitrógeno molecular.

La prueba de Fenilalanina se incubó en aerobiosis, por lo tanto no fue necesario


agregar aceite mineral. Esta prueba sirve para diferenciar Morganella Morganii
biogrupo 1 y 2, Proteus sspp. y Providencia sspp. De la mayoría de otros grupos de la
familia Enterobacteriaceae en base a la presencia de la enzima fenilalanina
deaminasa. El aminoácido fenilalanina es sometido a la desaminación oxidativa
catalizada por la enzima fenilalanina deaminasa para producir ácido fenilpirúvico y
amoníaco. La presencia de éste ácido en conjunto con otros compuestos presentes en
el medio hacen que éste se torne de color verdoso en el pico de flauta. Esta prueba fue
positiva.

La prueba de Gelatina pretende determinar la capacidad de un microorganismo de


producir enzimas de tipo proteolíticas (gelatinasas) que licuan/hidrolizan la gelatina o
muestran cambios característicos debido a los productos de degradación. La gelatina
como proteína derivada del colágeno animal es2 hidrolizada por la gelatinasa en sus
aminoácidos constituidos, con pérdida de sus características gelificantes.El tubo que
contenía esta prueba dio un resultado negativo ya que al voltearse, éste permaneció en
su lugar de forma gelificada.

La prueba KIA indica la capacidad de una bacteria para atacar un carbohidrato


específico con producción de CO2 o sin ella, junto con la determinación de una posible
producción de ácido sulfhídrico.
El tubo de dicha prueba se observó de color rojizo en el pico de flauta y amarillo en el
fondo, lo cual indica que es fermentador de glucosa (dado el fondo ácido amarillo) y
que utilizó el nitrógeno presente en las peptonas del medio para formar amoniaco y
alcalinizar la superficie del medio, es por ello el color rojizo del pico de flauta. El
indicador presente en el medio es el rojo de fenol. No se observó la producción de
ácido sulfhídrico ya que el medio no estaba negro, sin embargo hubo producción de
CO2 debido a presencia de burbujas y rompimiento del medio.
Para la prueba LIA no fue necesario agregar aceite mineral dado que las condiciones
de incubación son en aerobiosis, por lo tanto sólo se dejó el tubo medianamente
abierto. Esta prueba se basa en la descarboxilación y desaminación de la lisina y en la
producción de ácido sulfhídrico. Si la bacteria tiene la capacidad de fermentar glucosa
y tiene actividad lisina descarboxilasa, se produce cadaverina que eleva el pH del
medio y lo colorea púrpura debido a que el indicador utilizado es púrpura de
bromocresol. Por otro lado, los microorganismos que fermentan glucosa y no tienen
actividad lisina descarboxilasa producen un viraje amarillo en todo el medio y
pasadas las 24 hrs de incubación, se observa el fondo de color amarillo (por
fermentación de glucosa y acidificación del medio) y el pico de flauta púrpura debido
al consumo de peptonas que producen alcalinidad. En base a esto, el resultado
obtenido fue lisina descarboxilasa (-).

El tubo con la prueba MIO permite evaluar 3 pruebas: Motilidad, Indol y Ornitina
descarboxilasa. Dichas pruebas permiten conocer la movilidad de las Enterobacterias,
producción de indol y actividad enzimática ornitina descarboxilasa. En las pruebas
anteriores se obtuvo motilidad (+) e Indol (+). Las condiciones de incubación dictan
aerobiosis, por lo tanto no es necesario agregar aceite mineral al medio ya que la
bacteria realiza su actividad metabólica en presencia de oxígeno.
Para conocer la actividad de la enzima Ornitina D., se necesita saber si la bacteria
fermenta glucosa, ya que esto permite que el medio se acidifique y favorezca la
actividad enzimática que actúa sobre la ornitina produciendo putrescina (diamina
creada al pudrirse la carne, de olor característico) con la alcalinización del miedo y el
vire a púrpura. La prueba fue Ornitina (+).

El tubo con la prueba SIM permite evaluar 3 pruebas: Sulfuro, Indol y Motilidad, con
ellas se puede verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en
un mismo medio. En las pruebas anteriores se obtuvo motilidad (+) e indol (+). Las
condiciones de incubación son de igual forma en aerobiosis.
En el tubo SIM no se observó ennegrecimiento del medio, por lo tanto no hubo
producción de H2S. La prueba fue Sulfuro (-).

La prueba TSI se evalúa la capacidad de una bacteria para atacar un carbohidrato


específico con producción de gas CO2 o sin ella, junto con la determinación de una
posible producción de ácido sulfhídrico.
El tubo contiene dos cámaras de reacción, en la parte inclinada (pico de flauta) se
fermenta la lactosa y la sacarosa y en la parte profunda se fermenta la glucosa. Se
puede fermentar los tres azúcares o uno de ellos lo cual dependerá del
microorganismo que se estudie.
Si la bacteria metaboliza sólo la glucosa: en la superficie la utilizará por vía
respiratoria, y donde la tensión de oxígeno disminuya lo suficiente, emplea una
pequeña proporción por vía fermentativa. Esto generará una pequeña cantidad de
ácidos que serán neutralizados por las aminas derivadas de la decarboxilación
oxidativa de las proteínas.
El tubo observado fue K/A , el pico de flauta fue rojo mientras que el fondo fue
amarillo por la fermentación de glucosa.

OBSERVACIONES
Las pruebas bioquímicas secundarias realizadas en la práctica se llevaron a cabo bajo
las condiciones de esterilización e incubación necesarias para la correcta
identificación de la bacteria . Sin embargo, para las pruebas de Rojo de metilo y
Vogues Proskauer existió una variable que complicó la determinación del género de la
bacteria ya que en ambos tubos no se observaba con claridad la presencia del color
rojizo y del anillo rojo en la superficie del medio, respectivamente. Dicha variable
radicó en no haber
posterior a la incubación en el caso de VP o haber dejado abierto el tubo en el caso de
MR, afectando el vire del indicador.
Al comprobar datos en la literatura, se corrigieron los resultados de la prueba, dando
así Rojo de metilo (+) por el cambio de color naranja/rojizo observado al agregar el
indicador y Vogues Proskauer (-) al no observar con claridad ni grosor suficiente el
anillo rojo en la superficie de este medio.
A su vez, en la experimentación se agregó aceite mineral al tubo de MIO, dato que
según la literatura es erróneo ya que ésta prueba se trabaja bajo condiciones de
aerobiosis,por lo tanto la bacteria necesita de oxígeno para realizar actividades
metabólicas. Sin embargo, este paso no afectó al resultado ni al vire de color ya que,
según las pruebas bioquímicas primarias, la Enterobacteria manejada es
Fermentadora facultativa.

CONCLUSIONES
Con base a los resultados obtenidos en la experimentación para la identificación de
una bacteria de la familia Enterobacteriaceae mediante el uso de pruebas bioquímicas
secundarias, se determinó que la bacteria de la cepa problema trabajada fue Indol (+),
MR (+), VP(-), Citrato (-), Urea (+), Malonatos (-), Arginina (-), Nitrato (+),
Fenilalanina (-), Gelatina (-), KIA (K/A), LIA (K/A lisina descarboxilasa (-)), MIO (O.
Descarboxilasa +), SIM (Sulfuro -) y TSI (K/A fermentador de glucosa). De esta
forma, y basándonos en las tablas del libro Mac Faddin "Pruebas bioquímicas para la
identificación de bacterias de importancia clínica" para bacterias de la familia
Enterobacteriaceae, se determinó que la bacteria inoculada en la cepa desconocida
pertenece al género Morganella y especie Morganella Morganii.
Dicha bacteria es un microorganismo con morfología de bacilos gramnegativos
perteneciente a la familia Enterobacteriaceae.
Es capaz de hidrolizar la urea, tiene una movilidad variable a 37° C y produce ácido y
gas a partir de la glucosa. Además, es capaz de reducir los nitratos a nitritos, de
fermentar la manosa y como todos los integrantes de la familia Enterobacteriaceae, es
oxidasa negativo.
Es común encontrarla en la microbiota fecal y es causante de infecciones urinarias o
infecciones aislados en las áreas quirúrgica, ginecológica y en recién nacidos de igual
manera puede dar lugar a artritis séptica preferentemente en individuos con
determinadas circunstancias predisponentes. Además, esta bacteria presenta una gran
resistencia antimicrobiana.
Por lo tanto, la práctica se concluye de manera exitosa ya que se lograron los objetivos
planteados y se logró identificar una bacteria desconocida de una cepa problema. Los
conocimientos adquiridos sobre los fundamentos de cada técnica en esta práctica
serán de vital importancia en prácticas posteriores

ANEXOS
Fotografía 1. Tabla J.Clin.Microbiology. Enterobacterias: M. Morganii

Fotografía 2. Reacciones en KIA/TSI de la mayoría de los miembros d la familia


Enterobacteriaceae (todos glucosa positivos).
BIBLIOGRAFÍA
● Tortora. (2007). Introducción a la microbiología. Médica Panamericana. pag. 207-
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● Negroni. (2009). Microbiología estomacal, 2ed. Médica Panamericana, Argentina.
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● Decré D, Barbut F, Petit JC. Role of the microbiology laboratory in the diagnosis of
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● Mac Faddin, J. "Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica". Ed. Panamericana, 1980

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