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1 de Noviembre del 2017

DETERMINACION DE
HONGOS
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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL


CALLAO
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DETERMINACION DE HONGOS
I. INTRODUCCION

Los hongos son organismos eucariotas que se engloban en el reino Fungí (hongos),
son heterótrofos y requieren materiales orgánicos que utilizan como fuente de
energía y como esqueletos carbonatados para la síntesis celular. Están ampliamente
distribuidos por la naturaleza, encontrándose en hábitats muy diversos de ahí su
frecuente aparición como alterantes en alimentos. En alimentos ácidos y en la baja
actividad del agua, los hongos filamentosos y las levaduras crecen con mayor rapidez
que las bacterias provocando importantes pérdidas por alteración de frutas frescas,
vegetales, quesos, productos derivados de los cereales, alimentos salazonados y
encurtidos, así como en los alimentos congelados y en los deshidratados cuyo
almacenamiento se realiza en condiciones inadecuadas.

En alimentos no ácidos que conservan la humedad, los hongos filamentosos y las


levaduras crecen más lentamente que las bacterias y por ello pocas veces determinan
problemas en tales alimentos.

En los alimentos frescos y congelados, pueden encontrarse números reducidos de


esporas y levaduras, pero su presencia en estos alimentos es de escaso significado.

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II. OBJETIVOS

 Realizar adecuadamente mediante el método de conteo en placa, el número de


hongos, presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano.

 Aprender el método de aislamiento para hongos, utilizando como medio de


cultivo el Agar-Oxitetraciclina-glucosa-extracto de levadura, “OGY” Agar.

 Conocer las características de las colonias, formada por los hongos.

III. MARCO TEORICO

Naturaleza de los hongos

Los hongos son seres vivientes diferentes de los vegetales y de los animales.
Se les reconoce actualmente como un reino propio y se le denomina “Reino
Fungí”. Existen más de 100 mil especies reconocidas por la ciencia
mundial, de las cuales el 90% pertenecen a hongos microscópicos
conocidos como mohos, el 10% restante son hongos macroscópicos, es
decir que se pueden ver a simple vista. A este tipo de hongos pertenece el
champiñón y los hongos comestibles que podemos ver en los mercados.

Lo que consumimos como alimento de los hongos macroscópicos es una


estructura formada por ellos para producir esporas microscópicas y de esta
manera reproducirse y esparcirse en la naturaleza; es decir de estas
estructuras tienen la misma función de un fruto o sea producir semillas y
esparcirlas.

MOHOS Y MICOTOXINAS

Las micotoxinas en la mesa del consumidor constituye un problema que


comienza en el campo y continúa durante el acopio y la comercialización,
cuya única solución es prevenir el crecimiento fúngico. Se ha comprobado
la acción de unas pocas toxinas en brotes de intoxicación humana y animal,
las otras han sido ensayadas en animales de experimentación.

Los mohos crecen sobre los materiales vegetales produciendo el deterioro


de los mismos. Forman metabolitos secundarios que actúan como
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antibiótico favoreciendo la prevalencia del moho frente a otros


microrganismos, muchos de los cuales son tóxicos para la planta y/o
animales. Estos metabolitos que enferman o matan a los animales que los
consume se conocen como micotoxinas y la afección se llama micotoxicosis.

Las micotoxinas son compuestos ubicuos que difieren mucho de sus


propiedades químicas, biológicas y toxicológicas. Una micotoxicosis
primaria se produce al consumir vegetales contaminados, y secundaria al
ingerir carne o leche de animales que comieron forrajes con micotoxinas.
La presencia de aflatoxina M1 en la leche materna es consecuencia de la
ingesta de aflatoxina B1 en los alimentos de algunas regiones y produce una
micotoxicosis en él bebe.

Las características de una micotoxicosis son las siguientes:

 No es una enfermedad transmisible.

 El tratamiento con drogas o antibióticos tiene poco o ningún efecto.

 En los brotes observados en el campo, el problema es estacional


debido a que las condiciones climáticas afectan el desarrollo del
hongo.

 El brote esta comúnmente asociado a un alimento o forraje


especifico.

 El examen del alimento o forraje sospechoso revela signos de


actividad fúngica.

Los primeros casos de micotoxicosis conocidos fueron debidos al


centeno contaminado con Claviceps purpuea, en la edad media. En
1912 Quevedo, en la Argentina describió la acción de los metabolitos
tóxicos de un Aspergillus del maíz sobre varias especies animales, lo
que constituye la primera observación científica de las micotoxicosis en
Sudamérica en 1960 la intoxicación masiva de pavos en Inglaterra llevo
al aislamiento de las aflatoxina, llamadas así pues son producidas por
especies del grupo Aspergillus flavus.

La presencia de micotoxinas en los vegetales puede deberse:


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 La infección de la planta en el campo por el hongo patógeno o a


la colonización por los saprobios.

 Al crecimiento de los mohos saprobios o patógenos post cosecha


sobre los frutos y granos almacenados.

 Al desarrollo fúngico saprobio durante el almacenamiento de los


materiales ya procesados.

HONGOS EN EL CAMPO Y EL ALMACENAMIENTO

Los hongos adquiridos en el campo son: Altemaria, Aspergillus, Cladosporium,


Epicoccum, Fusarium, Vedillium además de los otros Fitopatógenos y las especies
que difieren según el vegetal, clima o región geográfica. Requieren generalmente una
humedad relativa entre 90 y 100%y un contenido de agua en las semillas del 22 a
33% para crecer, con un amplio rango de temperatura entre 0 y 30 °C, aunque
algunos pueden desarrollarse a 35°C o más.

La colonización de las partes aéreas de las plantas por los microorganismos comienza
tan pronto como son expuestas al aire. Las bacterias suelen aparecer primero, luego
las levaduras y finalmente los hongos filamentosos saprofitos y patógenos. Los mohos
continúan desarrollándose a lo largo de todo el crecimiento de la planta, lo que se
acentúa cuando envejece y las semillas maduran. La cosecha perturba el ecosistema y
las condiciones relativamente estables del almacenamiento entrañan un profundo
cambio en la composición de la microbiota. Los restos vegetales abandonados en el
campo suelen albergar esclerocios, como es el caso de A. flavus que serán la fuente de
contaminación del cultivo en la temporada siguiente.

El crecimiento fúngico continua en los productos frescos después dela cosecha y


causa lesiones que desfiguran el aspecto de frutas y hortalizas. En los granos de
cereales, los hongos persisten si el grano está suficientemente seco como para
soportar la competencia de otras especies incorporadas posteriormente.

Otros hongos presentes en los productos almacenados son especies de Aspergillus


penidillium y algunos xerófilos. Los factores que influyen en su desarrollo son el
contenido de humedad de substrato, la temperatura, el tiempo, el grado de invasión
fúngica antes del almacenamiento y la actividad de insectos y ácaros que facilitan la
diseminación. Requieren menor humedad relativa ambiente (70-90%) y contenido de
agua en las semillas (15-20%), pero el rango de temperatura es más amplio (0-45°C) y
pueden crecer a menor concentración de oxígeno.
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ALGUNOS GENEROS DE HONGOS IMPORTANTES EN LOS ALIMENTOS

Mucor: Intervienen en la alteración de algunos alimentos y se utilizan en la


fabricación de otro. M. rouxii se utiliza para la sacarificación del almidón, para la
maduración de quesos y para la fabricación de algunos alimentos orientales.

Rhizopus: La especie R. stolonifer, o moho del pan, es muy común e interviene en la


alteración de algunos alimentos: bayas, hortalizas, pan, etc.

Aspergillus: Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen
en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otras son de
utilidad para preparar alimentos.

Penicillium: Es otro género de mohos frecuentes incidencia y de importancia en los


alimentos, P. expansum produce la podredumbre blanda de las frutas; P. digitatum y
P. italicum producen la podredumbre de las frutas cítricas. Las especies P.
camemberti, P. roqueforti se utiliza en maduración de quesos.

AGAR OGY

Medio selectivo para la enumeración de levaduras y mohos en muestras alimenticias.

Composición: Extracto de levadura 5.0 g/l, glucosa 20.0 g/l, biotina 0.0001 g/l, agar
12.0 g/l. Ph final: 7.0

Almacenamiento y caducidad: Todos los contenedores deben ser almacenados bien


cerrados en un lugar seco a 25°C o por debajo hasta la fecha de caducidad mostrada
en la etiqueta del envase.

IV. MATERIALES Y EQUIPO

 Estomacher u homogenizador.

 Incubadora (22 a 25°C).

 Equipos para sembrar las muestras de alimentos.

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 Contador de colonias.

 Material de vidrio para la preparación y dilución de la muestra.

 Placas Petri (6).

 Pipetas (1ml, 5ml, 10ml).

MEDIOS DE CULTIVO

 Agua peptonada.

 Agar OGY.

 Tetraciclina.

V. PARTE EXPERIMENTAL

Agar OGYE

 Pesar según lo indica el fabricante y adicionar 1 L de agua destilada.


 Calentar ligeramente para su completa disolución
 Enfriar y medir el pH del, medio de cultivo 6,6 ±0,2 con electrodo de contacto.
 Dispensar 100 ml en frasco con tapa rosca.
 Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 minutos.

Cultivo

 Pesar 10 gr. de muestra en nuestro caso es pimienta


 Agregar los 10 gr. en la solución de agua peptonada.
 Mover hasta que la mezcla esté homogenizada y dejar reposar para que la
pimienta se sedimente.
 Una vez sedimentada, con una pipeta de 5 ml, agregar 1 ml en cada dilución.
 De cada dilución con una nueva pipeta se extraerá 1 ml y sembramos en la placa
Petri realizándolo por el método de diseminación con la espátula de drigalsky.
 Dejamos pasar 15 minutos hasta que la muestra se solidifique y procedamos a
empaquetar.
 Una vez empaquetado, colocamos las muestras en lugares oscuros y esperamos
de 3 a 5 días para el conteo de hongos encontrados en la muestra. Incubando a
temperatura ambiente (23 – 25 °C).
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Técnica recuento en placa por diseminación profunda

1 mL

HOMOGENEIZADO:

9 mL AP
10 g muestra

90 mL Agua peptonada 0.1%


Dil 10 -1 10 -2 10 -3

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

LECTURA PLACAS : Lectura de placas que contengan entre 10 a 150 ufc

Colonias levaduras Colonia mohos, (micelio)

Tinción de Gram

Formas alargadas o cocáceas Gram positivas

Agar OGYE incubación

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VI. RESULTADOS

a) Hongos en pimienta 10-¹

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b) Hongos en pimienta 10-²

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c) Hongos en pimienta 10-ɜ

VII. CONCLUSIONES

Con la teoría leída anteriormente podemos concluir que en alimentos (condimentos)


como la pimienta en nuestro caso, encontramos la presencia de hongos debido a que
la muestra adquirida está expuesta al medio ambiente y a todos los microrganismos
presentes.

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Bibliografía
Camacho A., M. G. (2009). Tecnica para el analisis microbiologico de alimentos. Facultad de
Quimica, UNAM, Mexico. Recuperado el 30 de noviembre de 2017 , de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-mohos-
levaduras_6530.pdf

CHILE, G. D. (2008). PROCEDIMIENTO DE RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURA EN


ALIMENTOS NORMA ISO 7954. INSTITUTO DE SALUD PUBLICA , CHILE. Recuperado el
30 de NOVIEMBRE de 2017, de
http://www.ispch.cl/lab_amb/doc/microbiologia_alimentos/PRT-031.pdf

Mast. (s.f.). Agar OGY. Virginia, USA. Recuperado el 30 de noviembre de 2017, de


http://www.mastgrp.com/IFUS/IFU458_SPA.pdf

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DETERMINACION DE MESOFILOS
I. INTRODUCCION

La cuenta en placa es la técnica comúnmente utilizada cuando se requiere investigar el


contenido de microorganismos viables en un alimento (NOM-092-SSA1-1994).

La cuenta en placa inicia con una dilución primaria con el objeto de distribuir lo más
uniformemente posible los microorganismos contenidos en la muestra destinada para
el análisis. Posteriormente se preparan diluciones decimales adicionales para reducir
el número de microorganismos por unidad de volumen y permitir la adecuada
distribución y conteo de microorganismos en placa después de la incubación (NOM-
110-SSA1-1994).

Otra técnica comúnmente empleada para determinar el número de microorganismos


es la técnica del número más probable. Esta también se conoce como técnica de
dilución en tubo, proporciona una estimación estadística de la densidad microbiana
presente con base a que la probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo
disminuye conforme es menor el volumen de muestra inoculado (NOM-112-SSA1-
1994).

En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de


desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la
microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria
de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la
materia prima.

Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de


patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa
presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por
fermentación, no son recomendables recuentos elevados.

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II. MARCO TEORICO

MESOFILOS AEROBIOS

Son todas aquellas bacterias aerobias, mesofilas capaces de crecer en agar nutritivo. Se
investigan por el método de recuento en placa con siembra de profundidad, que se basa
en contar el número de colonias desarrolladas en una placa de medio de cultivo solido
(Agar para recuento en placa o PCA), donde se ha sembrado un volumen conocido de
la solución madre o sus diluciones (1 ml), incubadas a 37ºC durante 24 hs.

La palabra mesofilos significa que son afines a temperatura media (30-37ºC) y la


palabra aerobios que son dependientes de oxígeno.

Se deberán contar todas las colonias desarrolladas en cada placa. Si se ha sembrado


más de una dilución se seleccionara la que proporcione entre 30 y 300 colonias,
descartando las demás. El recuento no se efectuara; en placas que contengan menos de
30 colonias, excepto en aquellas sembradas con solución sin diluir.

DETERMINACION DE MESOFILOS AEROBIOS

Los recuentos "totales" expresan el número por gr o


ml de (ufc), de alimentos obtenido en determinadas
condiciones de cultivo en medio solido incubado en
aerobiosis.

No existe una relación directa entre la flora aerobia


y la posible presencia en los alimentos de
microorganismos patógenos de procedencia
intestinal, ni tampoco de otros agentes de infecciones e intoxicaciones alimentarias de
diversas procedencias. En realidad un recuento alto de ufc en un alimento indica que,
probablemente, ha estado conservado en condiciones de tiempo y temperatura que han
permitido el desarrollo de microorganismos.

En alimentos congelados y en los conservadores en refrigeración, los recuentos de la


flora bacteriana psicrotrofa pueden relacionarse con las condiciones de conservación y
son indicativos de la calidad bacteriológica en estos productos. En algunos alimentos
tales como, los envasados al vacío, está indicado el recuento de la flora anaerobia
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mesofila, no debe utilizarse el tioglicolato sódico en los medios para el recuento de


anaerobios.

Los resultados de este análisis permiten:

 Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfección.

 Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.

 Determinar el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración


de los alimentos.

 Verificar condiciones óptimas de almacenamiento y transporte.

 Obtener información acerca de la vida útil de los alimentos.

 Indicar alteración incipiente en ciertos alimentos.

El análisis de los alimentos para determinar la existencia, tipo y número de


microorganismos es básico para la microbióloga
de alimentos. Sin embargo ninguno de los
métodos utilizados habitualmente permite
determinar el número exacto de microorganismos
que existe en un determinado alimento.

El recuento en placa con siembra en profundidad


es el método más utilizado para la determinación
del número de células viables o unidades
formadoras de colonias (ufc) en un alimento, pero
deben hacerse en función de uno de los siguientes
factores:

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 Método de muestreo utilizado

 Distribución de los microorganismos en la muestra

 Naturaleza de la microflora del alimento

 Naturaleza del alimento

 Antecedentes del alimento

 Adecuación nutricional del medio de cultivo

 Temperatura y medio de incubación

 pH, aw, potencial de oxidación reducción del medio

 Tipo de diluyente utilizado

Numero relativo de microorganismos en la muestra

Un recuento elevado puede significar:

 Excesiva contaminación de la materia prima

 Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración

 La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesofilos

 La inmediata alteración del producto

El recuento de mesofilos por lo tanto, y esto es lo más importante: NOS INDICA LAS
CONDICIONES DE SALUBRIDAD DE ALGUNOS ALIMENTOS.
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III. OBJETIVOS

 Cuantificar la microflora mesófila aerobia e identifique la contaminación


microbiana en alimentos utilizando las técnicas más comunes.

 Determinar diferencias en cada dilución de las muestras de forma experimental.

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MATERIALES Y EQUIPOS

 Materiales y Reactivos:

 Botellas de 500 mL

 Placas descartables

 Vaso de precipitados

 Pipeta y pro pipeta

 Gradilla y 2 tubos de ensayo

 Agua peptonada

 Agar Plate Count

 Mechero de Bunsen

 Alcohol

Muestras:

Solución estándar de Queso expuesto al ambiente.

Equipos:

Horno microondas

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IV. PROCEDIMIENTO

Para realizar la determinación de mesofilos en una muestra de queso expuesta al


ambiente se sigue el siguiente esquema:

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PASOS A SEGUIR

1. Primero debemos tener preparado 120 ml de agua peptonada en una botella de


500 mL y 2 mecheros de Bunsen encendidos para esterilizar cada pipeta antes
que la usemos.

2. Luego debemos mantener el Agar Plate Count (120 ml) temperado con la ayuda
del microondas a una temperatura de 44º – 46ºC.

3. Después pesamos 10 gr. de la muestra de queso la cual servirá para ser analizada
experimentalmente.

4. Posteriormente se vierte 90 ml de agua peptonada en un vaso de precipitados y


9 ml de lo mismo en 2 tubos de ensayo.

5. Se preparan 6 placas las cuales serán para realizar la prueba en 3 diferentes


diluciones: 10 -1; 10 -2 y 10 -3 respectivamente del paso anterior.

6. Teniendo todo listo se comienza a realizar la prueba agregando entre 16 – 20 ml


del agar Plate Count en cada placa que servirá como medio de cultivo nutritivo.
A continuación se agregan 10 gr. de queso en los 90 ml de agua peptonada (10 -
1), luego de esta mezcla se extrae con la ayuda de la pipeta 1 ml para pasarlo al
1er tubo de ensayo con los 9 ml de agua peptonada (10 -2) después se extrae del
1er tubo 1 ml para pasarlo al 2do tubo de ensayo con los 9 ml de agua peptonada
(10 -3) y posteriormente se bota al caño 1 ml del 2do tubo.

7. Finalmente se extrae 1 ml del 10 -1 ; 1 ml del 10 -2 y 1 ml del 10 -3 para añadir a


cada placa (2 placas para cada dilución) y se procede a incubar a una
temperatura de 35ºC por 48 horas.

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V. RESULTADOS

PLACAS CON DILUCION 10-1

PLACAS CON DILUCION 10-2

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PLACAS CON DILUCION 10-3

COMPARACION ENTRE TODAS LAS DILUCIONES

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VI. DISCUSION

En una prueba experimental realizada por las siguientes instituciones:

Universidad Autónoma de Querétaro

Universidad Autónoma de Coahuila

Universidad Autónoma de Zacatecas

Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Se analizaron un total de 105 muestras de 5 diferentes productos lácteos, siendo 21


muestras de cada una de estos: queso panela, queso tipo Oaxaca, queso ranchero, leche
y rompope por 21 días. Los objetivos del presente trabajo fueron: evaluar la vida de
anaquel, y el cambio de pH de los productos lácteos antes mencionados.

El análisis microbiológico se realizó de acuerdo a lo especificado en las normas oficiales


mexicanas NOM-035-SSA1-1993 Bienes y Servicios Quesos de Suero Especificaciones
sanitaria. NOM-121-SSA1-1994 Bienes y Servicios Quesos Frescos, Madurados y
Procesados. NOM-142-SSA1-1995. Bienes y Servicios. Bebidas Alcohólicas
Especificaciones Sanitarias Etiquetado Sanitario y Comercial. NOM-091-SSA1-1994,
Bienes y Servicios. Leche pasteurizada de vaca. Disposiciones y especificaciones
sanitarias.

De las 105 muestras resultaron no aptas de acuerdo a las normas, 73 muestras (76%)
para Mesófilos, 85 muestras (17,85%) para Coliformes, 66 muestras (13,86%) para
Staphylococcus, 10 muestras (2,1%) para Mohos y Levaduras.

Lo que demuestra que nuestros resultados fueron muy parecidos en cuanto a mesofilos
encontrados en ambos análisis experimentales.

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VII. CONCLUSIONES

 Se contabilizo la presencia de mesofilos en cada dilución contando las unidades


formadoras de colonias y se comprobó que en cada dilución la concentración de
estas colonias disminuyo progresivamente.

 El queso que se analizó presento una contaminación no apta para el consumo


humano ya que supero el límite de unidades formadoras de colonias
establecidas en la normativa nacional.

 El método utilizado para analizar el queso fue muy práctico ya que nos permitió
contabilizar de forma más rápida el nivel de inocuidad del alimento.

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VIII. BIBLIOGRAFIA

http://www.uaq.mx/investigacion/difusion/veranos/memorias-
2010/9%20Verano%20Ciencia%20UAQ/UAQ%20Garcia%20Chaparro.pdf

http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBA/microalimentos.pdf

http://www.analizacalidad.com/docftp/fi189arm2004-4(2).pdf

http://www.foodnewslatam.com/inocuidad/2499-%C2%BFque-son-los-aerobios-
mesofilos.html

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