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2.2.25. Espectrofotometría de absorción en el ultra... REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.

ª edición

4000 cm-1 y 670 cm-1 (2,5 μm a 15 μm) operando en las mis- Tabla 2.2.24.-1.- Mínimos de transmisión (y tolerancias aceptables) de
mas condiciones. Los mínimos de transmisión (máximos de una película de poliestireno
absorción) del espectro obtenido con la sustancia a exami-
nar, corresponden en posición y tamaño relativo a los del 3060,0 (± 1,5) cm-1
2. Métodos

2849,5 (± 1,5) cm-1


analíticos

espectro obtenido con la sustancia de referencia (SQR).


1942,9 (± 1,5) cm-1
Cuando los espectros registrados de la sustancia en estado 1601,2 (± 1,0) cm-1
1583,0 (± 1,0) cm-1
sólido revelan diferencias en las posiciones de los mínimos 1154,5 (± 1,0) cm-1
de transmisión (los máximos de absorción), tratar la sustan- 1028,3 (± 1,0) cm-1
cia a examinar y la sustancia de referencia en las mismas
condiciones, de manera que cristalicen o se presenten bajo
la misma forma, o proceder como se indica en la monogra- Método. Preparar la sustancia a examinar siguiendo las ins-
fía y seguidamente registrar los espectros. trucciones que acompañan a la obtención del espectro de
referencia. Con las mismas condiciones experimentales que
se han utilizado para el control del poder de resolución,
IDENTIFICACIÓN MEDIANTE ESPECTROS registrar el espectro de la sustancia a examinar y superpo-
DE REFERENCIA nerlo a las bandas de poliestireno a 2849,5 cm-1 (3,51 μm), a
Control del poder de resolución. Registrar el espectro de 1601,2 cm-1 (6,25 μm) y a 1028,3 cm-1 (9,72 μm). Comparar
una película de poliestireno de 0,04 mm de espesor. La dife- los 2 espectros y las bandas del poliestireno indicadas ante-
rencia x (ver figura 2.2.24.-1) entre el porcentaje de transmi- riormente. Utilizando las posiciones de las bandas del
tancia en el máximo de transmisión A a 2870 cm-1 (3,48 μm) poliestireno como referencias, las posiciones de las bandas
y en el mínimo de transmisión B a 2849,5 cm-1 (3,51 μm) significativas en el espectro de la sustancia a examinar y en
debe ser superior a 18. La diferencia y entre el porcentaje de el espectro de referencia, deben corresponderse dentro
de un margen del 0,5 por ciento en la escala de número de
transmitancia en el máximo de transmisión C a 1589 cm-1
onda. Los tamaños relativos de las bandas deben ser concor-
(6,29 μm) y en el mínimo de transmisión D a 1583 cm-1 (6,32
dantes en los 2 espectros.
μm) debe ser superior a 12.

IMPUREZAS EN LOS GASES


Para el análisis de las impurezas utilizar una cubeta transpa-
rente a la radiación infrarroja y que permita un recorrido
óptico apropiado (por ejemplo de 1 m a 20 m). Llenar la
cubeta como se indica en «Gases». Para la detección y
determinación cuantitativa de las impurezas proceder como
se indica en la monografía.

2.2.25. ESPECTROFOTOMETRÍA DE
ABSORCIÓN EN EL ULTRAVIOLETA
Y EN EL VISIBLE

Determinación de la absorbancia. La absorbancia (A) de


una disolución es el logaritmo decimal de la inversa de la
transmitancia (T) para una radiación monocromática. Se
expresa según la ecuación:

Número de onda cm-1

Figura 2.2.24.-1.- Espectro característico del poliestireno utilizado


A = log10
( ) 1
T
= log10
( )
I0
I
para controlar el poder de resolución

Comprobación de la escala de números de onda. La T= I/I0.


comprobación de la escala de números de onda puede reali-
zarse mediante una película de poliestireno, que presenta I0 = intensidad de la radiación monocromática incidente,
unos mínimos de transmisión (máximos de absorción) a los
números de onda (expresados en cm-1) indicados en la tabla I= intensidad de la radiación monocromática transmi-
2.2.24.-1. tida.

34 Véase la nota informativa sobre Monografías generales


REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición 2.2.25. Espectrofotometría de absorción en el ultra...

En ausencia de otros factores físico-químicos, la absorban- Control de la absorbancia. Controlar la absorbancia


cia medida (A) es proporcional al recorrido óptico (b) de la mediante filtros adecuados o una disolución de dicromato
radiación y a la concentración (c) de la sustancia disuelta, de potasio R a las longitudes de onda señaladas en la tabla
según la ecuación: 2.2.25.-2. Para cada longitud de onda se indica el valor

2. Métodos
analíticos
exacto y los límites permitidos de la absorbancia específica.
Se admite una tolerancia para la absorbancia de ± 0,01.
A = ε·c·b
Para el control de la absorbancia utilizar una disolución de
dicromato de potasio preparada de la siguiente manera.
ε = coeficiente de absorción molar, si b se expresa en centí- Disolver de 57,0 mg a 63,0 mg de dicromato de potasio R,
metros y c en moles por litro. previamente desecado a 130 °C hasta peso constante, en
ácido sulfúrico 0,005 M y diluir hasta 1000,0 ml con el
1 por ciento
mismo ácido.
La expresión A 1 cm que representa la absorbancia
específica de una sustancia disuelta, se refiere a la absorban-
Tabla 2.2.25.-2
cia de una disolución de 10 g/l en una cubeta de 1 cm y a
una longitud de onda determinada, de donde:
Longitud Absorbancia específica Tolerancia
de onda (nm) 1 por ciento máxima
A 1 cm

= 10ε
1 por ciento
A1 cm 235 124,5 122,9 a 126,2
Mr 257 144,5 142,8 a 146,2
313 48,6 47,0 a 50,3
350 107,3 105,6 a 109,0
Salvo que se indique lo contrario, medir la absorbancia a la
longitud de onda prescrita utilizando un recorrido óptico de
1 cm a 20 ± 1 °C y efectuar las medidas con relación al
mismo disolvente o mezcla de disolventes. La absorbancia Límite de luz difusa. La luz difusa se puede detectar a
del disolvente, medida con relación al aire y a la longitud de una longitud de onda dada mediante disoluciones o filtros
onda prescrita, no debe ser en ningún caso mayor que 0,4 y apropiados; por ejemplo, la absorbancia de una disolución
debe ser, preferentemente, menor que 0,2. Representar el de 12 g/l de cloruro de potasio R en una cubeta de 1 cm
espectro de absorción señalando en ordenadas los valores de aumenta bruscamente entre 220 nm y 200 nm y es mayor
absorbancia o cualquier función de ésta y en abscisas la lon- que 2 a una longitud de onda entre 198 nm y 202 nm em-
gitud de onda o cualquier función de ésta. pleando agua como líquido de compensación.
Resolución (para análisis cualitativo). Cuando se prescriba
Cuando la monografía indique un único valor para la posi- en una monografía, medir la resolución de los aparatos del
ción de un máximo de absorción, se admite que el valor modo siguiente: registrar el espectro de una disolución al
obtenido puede diferir como máximo en ± 2 nm. 0,02 por ciento V/V de tolueno R en hexano R. En la mono-
grafía se indica la relación mínima entre la absorbancia
Aparatos. Los espectrofotómetros empleados para el medida en el máximo a 269 nm y la determinada en el míni-
estudio de las regiones ultravioleta y visible del espectro mo a 266 nm.
disponen de un sistema óptico capaz de proporcionar una
Anchura de la rendija espectral (para análisis cuantitati-
radiación monocromática, en la región de 200 nm a 800
vo). Para evitar errores debidos a la anchura de la rendija
nm y de un dispositivo apropiado para la medida de la
absorbancia. espectral, cuando se utiliza un instrumento en el que ésta es
variable a la longitud de onda seleccionada, la anchura de la
rendija tiene que ser pequeña comparada con la mitad del
Control de las longitudes de onda. Verificar la escala de ancho de la banda de absorción, pero debe ser lo mayor
longitudes de onda utilizando los máximos de absorción posible para obtener un valor alto de I0. Por tanto, la anchu-
obtenidos con la disolución de perclorato de holmio R, la ra de la rendija debe ser siempre tal que una reducción pos-
línea de una lámpara de hidrógeno o de deuterio o las líneas terior no implique un cambio en la lectura de absorbancia.
de un arco de vapor de mercurio que se indican en la tabla
2.2.25.-1. Se admite una tolerancia de ± 1 nm para la región Cubetas. Se admite una tolerancia en el recorrido óptico
ultravioleta y de ± 3 nm para la región visible. de las cubetas empleadas de ± 0,005 cm. Si se llenan con el
mismo disolvente, las cubetas destinadas a contener la diso-
lución a examinar y el líquido de compensación, deben pre-
sentar la misma transmitancia. Si no fuera así, se debe reali-
Tabla 2.2.25.-1.- Máximos de absorción para el control zar una corrección adecuada.
de la escala de longitudes de onda
Las cubetas deben limpiarse y manejarse con cuidado.
241,15 nm (Ho) 404,66 nm (Hg)
253,7 nm (Hg) 435,83 nm (Hg)
287,15 nm (Ho) 486,0 nm (Dβ) ESPECTROFOTOMETRÍA DERIVADA
302,25 nm (Hg) 486,1 nm (Hβ)
313,16 nm (Hg) 536,3 nm (Ho) La espectrofotometría derivada implica la transformación
334,15 nm (Hg) 546,07 nm (Hg) de los espectros de absorción (orden cero) en espectros de la
361,5 nm (Ho) 576,96 nm (Hg)
365,48 nm (Hg) 579,07 nm (Hg)
primera derivada, segunda derivada o derivadas de órdenes
superiores.

Las Normas generales (1) son aplicables a todos los textos y monografías 35
2.2.26. Cromatografía en papel REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA, 2.ª edición

El espectro de la primera derivada es una representación Procedimiento. Preparar la disolución de la sustancia a


gráfica del gradiente de la curva de absorción (velocidad de examinar ajustando el instrumento de acuerdo con las ins-
la variación de la absorbancia con la longitud de onda trucciones del fabricante y calcular la cantidad de la sustan-
dA/dλ) con respecto a la longitud de onda. cia a determinar según las indicaciones de la monografía.
2. Métodos
analíticos

El espectro de la segunda derivada es una representación


gráfica de la curvatura del espectro de absorción con respec-
to a la longitud de onda (d2A/dλ2). La segunda derivada de 2.2.26. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
cualquier longitud de onda λ se relaciona con la concentra-
ción mediante las siguientes ecuaciones:
CROMATOGRAFÍA ASCENDENTE
d2A d2A11 cm
por ciento c’b d2Aε cb
= × = × Equipo. Está constituido por una cámara cromatográfica
dλ2 dλ2 10 dλ2 10 de vidrio cuyas dimensiones son adecuadas a las del papel a
emplear. Está provista de una tapa de vidrio que asegura un
cierre hermético y en su parte superior de un dispositivo que
permite mantener suspendido el papel cromatográfico, dis-
c´ = concentración del soluto absorbente en gramos por litro.
positivo que puede bajarse sin abrir la cámara. Al fondo de
Aparatos. Utilizar un espectrofotómetro que cumpla los ésta se encuentra una cubeta para la fase móvil en la que
requisitos anteriormente expuestos y equipado con un puede descender el papel. El papel cromatográfico emplea-
módulo analógico de diferenciación resistivo-capacitivo o do es un papel de filtro adecuado, cortado en tiras de longi-
con un diferenciador digital u otro dispositivo que permita tud suficiente y de anchura de 2,5 cm como mínimo, de
obtener espectros derivados. Algunos dispositivos para manera que la migración de la fase móvil se efectúe en el
obtener el espectro derivado de segundo orden producen un sentido de las fibras del papel.
desplazamiento de la longitud de onda respecto al espectro Procedimiento. Verter en la cubeta una capa de 2,5 cm
de orden cero lo cual hay que tener en cuenta, si es necesa- aproximadamente de la fase móvil indicada en la monogra-
rio. fía y, si ésta lo prescribe, verter la fase estacionaria entre las
Poder de resolución. Cuando se prescriba en una mono- paredes de la cámara y la cubeta. Colocar la tapa, dejar repo-
grafía, registrar el espectro de la segunda derivada de una sar a 20-25 °C durante 24 h y mantener a la misma tempera-
disolución de 0,2 g/l de tolueno R en metanol R, utilizando tura todo el tiempo que requieran las operaciones cromato-
metanol R como líquido de compensación. El espectro gráficas. A 3 cm de uno de los extremos del papel, trazar
muestra un mínimo negativo pequeño situado entre 2 míni- con un lápiz una línea fina y paralela al borde del papel. Con
mos negativos mayores a 261 nm y 268 nm respectivamen- una micropipeta, depositar sobre esta línea el volumen de
te, como muestra la figura 2.2.25.-1. Salvo indicación con- disolución señalado en la monografía. Si la mancha alcanza
traria en la monografía, la relación A/B (ver figura 2.2.25.-1) un diámetro superior a 10 mm, depositar la disolución en
no es menor que 0,2. distintas fracciones dejando evaporar el disolvente en cada
ocasión. Si se emplea la misma tira de papel para más de un
cromatograma, se deben depositar las distintas disoluciones
a lo largo de la línea a una distancia mínima de 3 cm las
unas de las otras. Seguidamente introducir el papel en la
cámara, taparla y dejar reposar durante 1 h 30 min. Poner en
contacto el papel con la fase móvil y retirarlo cuando la fase
móvil ha recorrido la distancia prescrita o cuando ha trans-
currido el tiempo señalado en la monografía. Secar al aire.
Durante el tiempo de desarrollo, mantener el papel protegi-
do de la luz intensa.

CROMATOGRAFÍA DESCENDENTE
Equipo. Está constituido por una cámara cromatográfica
de vidrio de borde esmerilado y cuyas dimensiones están en
relación con las del papel a emplear. Está provista de una
tapa de vidrio que asegura un cierre hermético y posee un
orificio central de 1,5 cm de diámetro, aproximadamente;
dicho orificio está obturado por una placa de vidrio esmeri-
lado o por un tapón. En la parte superior de la cámara y en
el interior de ésta se halla, sobre unos soportes, la cubeta de
la fase móvil provista de un dispositivo que permite fijar la
parte superior del papel cromatográfico. Dos varillas de
vidrio situadas en los 2 lados de la cubeta, paralela y ligera-
mente por encima de sus bordes superiores, actúan como
soporte del papel cromatográfico e impiden que su extremo
libre toque ningún punto de la cámara cromatográfica. El
papel cromatográfico es un papel de filtro adecuado, corta-
do en tiras de longitud suficiente y de anchura comprendida
Figura 2.2.25.-1 entre 2,5 cm y la longitud de la cubeta, de manera que la

36 Véase la nota informativa sobre Monografías generales

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