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CUARTA PARTE

ANALISIS DE COMUNIDAD: EXTRACCION Y


DERIVATIZACION DE ACIDOS GRASOS TOTALES

PERFILES DE ACIDOS GRASOS derivados de los fosfolípidos de membranas celulares de


microorganismos pueden ser utilizados para estimar biomasa microbiana (Figura 1).
Además, estos perfiles proveen información sobre la estructura taxonómica, diversidad
funcional y estatus nutricional de comunidades microbianas. Por ejemplo, perfiles de
ácidos grasos han sido usados para distinguir entre comunidades microbianas de suelos
sujetos a diferentes tratamientos agrícolas. Finalmente, extracción y análisis de ácidos
grasos de organismos puros cultivados bajo condiciones estándares proveen
información suficiente para el reconocimiento e identificación a nivel de especies o
subespecies (Figura 2).

Materiales & Equipos:

• Tubos de ensayo
• Pipetas Pasteur y de 1 ml
• Viales para GC
• Baños de agua a 80 y 100 oC
• Bloque térmico
• Vortex
• Cromatógrafo de gas
• Centrífuga
ACIDOS GRASOS TOTALES 2

Reactivo 1. 45 g NaOH
150 ml metanol
150 ml agua destilada

Reactivo 2. 325 ml 6N HCl


275 ml alcohol metílico

Reactivo 3. 200 ml hexano


200 ml metil ter-butil eter

Reactivo 4. 10.8 g NaOH


900 ml agua destilada

Figura 1: Ejemplo de ácidos grasos típicos encontrados en las


membranas de microorganismos.

=
C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C

-
OH
Acido Graso 18:0
O

=
C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
- OH-CH3
18:0 metil éster
= O
C-C-C-C-C-C-C-C-C=C-C-C-C-C-C-C-C-C
-

OH
18:1 cis 9 (ó trans 9)
O
=

C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
-
-
-

C OH
19:0 ciclopropano
O
=

C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
-

C-C-C OH
19:0 anteiso
O
=

C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
-
-

C-C-C OH OH
19:0 iso 3OH
OH
=

C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
-

H
16:0 aldehído
O-CH3
-

C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C
O-CH3
-

16:0 dimetil acetal


ACIDOS GRASOS TOTALES 3

METODOLOGIA

1. Colecte asépticamente muestras de suelo de varios lugares. Tambien, podría utilizar


muestras de suelo provenientes de su experimento de mineralización de
hidrocarburos. Añade 2.0 g de suelo (5.0 g de suelo bajo en materia orgánica) o
biomasa bacteriana (de una placa de cultivo) a un tubo con tapa revestida de teflón.
2. Añade 2.0 ml de reactivo de saponificación (Reactivo 1).
3. Vortex brevemente y saponifica a 100 oC por 30 minutos. Permite que los tubos se
enfrien a temperatura ambiente.
4. Metila ácidos grasos añadiendo 4.0 ml de Reactivo 2.
5. Vortex brevemente e incuba a 80oC por 10 minutos en baño de agua.
Inmediatamente enfría los tubos a temperatura ambiente después de incubación.
6. Los ácidos grasos se extraen añadiendo 1.25 ml de 1:1 hexano:metil-ter butil eter
(Reactivo 3). Mezcla invirtiendo los tubos por 10 minutos. La fase orgánica
(sobrenadante) es removida con una pipeta Pasteur a un tubo limpio (13 X 100 mm).
7. Repite la extracción (paso #6) y combina fases orgánicas en el mismo tubo.
8. Lava extracto orgánico añadiendo 3.0 ml de Reactivo 4. Mezcla gentilmente por 5
minutos. Centrifuga a 4,000 rpm por 5 minutos para obtener una buena interfase.
Transfiere la fase orgánica a un nuevo tubo.
9. Repite el lavado (paso #8). Transfiere la fase orgánica al vial de cromatografía.
10. Análisis de ácidos grasos metilados por cromatografía de gas.

Figura 2: Perfil típico de ácidos grasos observados por cromatografía de


gas

4 Staphylococcus aureus

7 Nombre Area%
1. C14:0 ISO 4.52
3 2. C14:0 2.10
3. C15:0 ISO 9.96
4. C15:0 ANTEISO 37.97
5. C16:0 3.05
6 6. C17:0 ISO 6.33
1 9 7. C17:0 ANTEISO 20.02
2 5 8. C18:0 1.48
8 9. C19:0 ANTEISO 5.70
10 10. C20:0 0.70

0 10 20
MINUTOS
ACIDOS GRASOS TOTALES 4

Figura 3: Representación esquemática de los pasos envueltos en la


extracción y derivatización de ácidos grasos.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
COSECHA

Cultivo Fresco
(Transfiere del Cuatro Transferencias a Tubo de Ensayo
tercer cuadrante)

SAPONIFICACION

Vortex Vortex
Añade 1.0 ml 5-10 seg 100o C 5-10 seg 100o C
Reactivo #1 5 min 20 min
METILACION

Añade 2.0 ml Vortex 80o C


Reactivo #2 5-10 seg 10 min

EXTRACCION Retenga
Fase de
Arriba

Añade 1.25 ml 10 min


Reactivo #3 Remueva Fase Inferior

LAVADO Transfiera a
Vial de
Cromatografía
10 min de Gas

Remueve 2/3
Añade 3.0 ml Partes de la Selle
Reactivo #4 Fase Superior
ACIDOS GRASOS TOTALES 5

Datos & Análisis:

Hábitat:

Fecha colección de muestras:

Observaciones (tipo y abundancia relativa


de los ácidos grasos presentes en la
muestra):

PREGUNTAS...

1. ¿Por qué es importante crecer los cultivos puros bajo condiciones estándares para
propósitos de identificación?

2. ¿Por qué se metilan los ácidos grasos antes de su análisis por cromatografía de gas?