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DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS EN SUELOS CONTAMINADOS CON

HIDROCARBUROS A TRAVÉS DE LA COLUMNA DE WINOGRADSKY EN CAMANÁ


AREQUIPA-2019

Yauri V. Elisha, Chalco P. Conrad, Ccori Z. Madelyn, Delgado C. Danitza, Huarilloclla


C. Erick

La contaminación de los suelos por hidrocarburos genera un impacto ambiental bastante


grave, dicha situación se da por la explotación de petróleo sin medidas ambientales que
certifiquen una futura restauración del suelo o por sucesos inciertos que no se han
solucionado, gracias a investigaciones pasadas se tiene el conocimiento de que ciertos
microorganismos son capaces de soportar medios extremos y asimismo degradar
contaminantes restaurando dicho medio, a lo que hoy en dia se le conoce como
biorremediación. La biorremediación es una alternativa para la recuperación de los suelos,
empleando organismos simples, como las bacterias y los hongos que pueden destruir la
estructura de los hidrocarburos para convertirlos en los componentes no tóxicos de dióxido
de carbono, agua y biomasa. Considerando que la columna de Winogradsky es un método
relativamente simple que permite conocer qué microorganismos se encuentran en un
determinado medio y debido a su estructura tubular que contiene agua salobre o
contaminada que al ser expuesta al sol por un determinado tiempo nos permite observar
estratos y cada estrato representa un consorcio de microorganismos.

El petróleo es considerado el contaminante más extendido en la biosfera y su explotación,


transporte y refinación generan problemas ambientales, especialmente por derrames
accidentales y de prácticas inadecuadas de eliminación de fuentes, como industrias y
refinerías de petróleo, sin embargo, las bacterias son potencialmente degradadoras de
petróleo(Echeverri et al. 2011). Varios estudios sugieren métodos de biorremediación de
medios contaminados con hidrocarburos mediante la inoculación de microorganismos como
biodegradador potencial, como es el caso de la columna de winogradsky que tiene ventajas
tales como menor coste, no interfiere en las operaciones y es natural (Hosomi T. 2011)​.
Moreno et al. (2012) ​realizan identificaciones de microorganismos de muestras tomadas de
ambientes extremófilos empleando la columna de winogradsky, según ellos es una técnica
sencilla y fácil de construir.

La columna de Winogradsky es una demostración clásica de cómo los microorganismos


ocupan “microespacios”, los cuales se caracterizan por ser altamente específicos de
acuerdo con sus tolerancias medioambientales y lo que a sus necesidades vitales se refiere
(Jiménez et al. 2017)​. S. Cabrera y T. Orrego (2014) ​utilizan bacterias reductoras de sulfato,
productoras de metabolitos que precipitan los metales pesados neutralizando a la vez el pH
del agua por la producción alcalina de bicarbonato en la oxidación del donador de
electrones. Para el cultivo de estas bacterias realiza un enriquecimiento en columnas de
winogradsky. Jorge Arturo Rengel (2018)2 en su estudio recupera microalgas a partir de
columnas de Winogradsky con determinados tiempos de estabilización donde comprueba
que los estan con mayor tiempo de estabilización son clorofitas que diatomeas, dichas
clorofitas son sometidas a aguas residuales para comprobar su tolerancia, los cuales dan un
resultado de 100%.
Años atrás no se daba solución a un suelo contaminado con hidrocarburos, sin embargo
más adelante muchos investigadores se dieron cuenta de que existen microorganismos
capaces de vivir en ese medio contaminado e incluso capaces de destruir la estructura de
los hidrocarburos y realizaron técnicas para saber qué microorganismos sobreviven a esos
medios y asu vez realizaron técnicas de remediación ya sea por cultivo u otros formas como
es el caso la columna de winogradsky, el cual es un método valorado por algunos por su
fácil aplicación, este método en su mayoria lo usan solo para ver qué microorganismos se
puede observar de una muestra de agua, sin embargo hay investigadores que han realizado
distintos estudios para biorremediación, ecotoxicidad, entre otros y demuestran que dicha
técnica es eficiente y muy accesible y lo más importante es natural.

El derrame de petróleo cuando se da por un accidente en algún determinado lugar no se


toma interés por el mismo hecho de ser un accidente. En zonas costeros, donde el suelo es
arenoso el petróleo se infiltra poco a poco o puede permanecer siglos en ese mismo lugar
siendo los más afectados los macroorganismos. Sin embargo este problema se puede
solucionar por biorremediación aplicando la columna de winogradsky por ser más accesible,
para acelerar este proceso remediación.

En base a esto se pretende evidenciar, aislar e identificar microorganismos en un suelo


contaminado con petróleo cercano al mar utilizando la columna de winogradsky por ser
efectivo, económico y además cumple con el cuidado del medio ambiente evitando usar
aparatos electrónicos o descartables para la determinación de microorganismos, y así
mismo tomar en cuenta que los organismos identificados servirán para un futuro estudio de
biorremediación.

1. OBJETIVOS

- Objetivo general

● Determinar los microorganismos presentes en suelos contaminados por


hidrocarburos por medio del uso de la columna de Winogradaky

- Objetivos específicos

● Caracterizar taxonómicamente los componentes microbianos de cada estrato de la


columna de Winogradaky

● Determinar la contribución relativa de cada estrato a la diversidad microbiana


encontrada.

2. MATERIALES Y METODOS

● MATERIALES:
○ MUESTRAS :
Muestras de tierra contaminada _( 300-500 g de sedimento superficial)

○ MATERIAL DE LABORATORIO:
■ Balanza digital
■ 1 litro de agua Destilada
■ 2 recipientes altos de boca ancha, de paredes transparentes, rectas y
sin bordes. Se sugiere que sean recipientes de vidrio y que al menos
sean tres veces más altos que anchos
■ 4 g de CaCO3 (o cáscara pulverizada de un huevo), CaSO4 (tiza) y
CaHPO4
■ 4 Placas Petri
■ 1 yema de huevo cocido
■ Papel periódico finamente cortado
■ 8 portaobjetos
■ Pipetas Pasteur
■ 1 espátula
■ Tiras de papel film
● ÁREA DE ESTUDIO

La provincia de Camaná se encuentra localizada al suroeste de Sudamérica, en el


departamento de Arequipa entre las latitudes y las longitudes . El punto de muestreo
estará ubicado en la quebrada del toro en el km 360, distrito Samuel Pastor (Figura 1).

Fig 1. Distrito Samuel Pastor (Camaná), con el punto de muestreo en la quebrada del toro

- METODOLOGÍA DE MUESTREO

● Tamaño del área de muestreo:


Para áreas de contaminación de forma regular menores a 1 000 m2
y que tenga forma regular de un cuadrado, el número de muestras y distribución,
será de una muestra en cada pared (4) y una en el fondo (1), total 5 muestras.
(MINAM, 2014)

Fig 2.: Localización de Puntos de Muestreo en el Área de


Excavación regular: forma de cuadrado

● Profundidad de la toma de muestras:


Para la toma de muestras superficiales se pueden aplicar sondeos manuales. Este
sistema es relativamente fácil, rápido de usar y de bajo costo, siendo poca la
cantidad de suelo que se puede extraer con esta técnica, será necesario obtener
muestras compuestas de varios sondeos. El espesor de las capas con respecto al
uso del suelo se indica en la siguiente tabla.

Tabla N° 1 . Profundidad del muestreo según uso del suelo


Usos de suelo Profundidad del muestreo

suelo agrícola 0-30 cm


30-60 cm

suelo residencial/parques 0-10 cm


10-30 cm

suelo comercial/industrial/extractivo 0-10 cm


Fuente : MINAM 2014

De la categoría mostrada en la tabla se opta por la tercera, donde el suelo de este


punto es considerado como y de uso industrial.

- METODOLOGÍA DE CULTIVO

● COLUMNA DE WINOGRADSKY

1. Colectar una cantidad de suelo contaminado. Remover las piedras, ramas o


partículas grandes del material en estudio.
2. Adicionar al suelo 1 g de cada una de las sales, el papel finamente cortado y
el huevo desmenuzado. Mezclar hasta homogeneizar completamente.
3. Colocar la mezcla en un recipiente adecuado hasta ocupar 1/3 del volumen
total. Compactar el suelo con la ayuda de una espátula a fin de eliminar las
burbujas de aire (Figura 3).
4. Añadir el agua a la muestra de suelo hasta llegar a una altura de
aproximadamente de 3 a 5 cm abajo del borde. Tener cuidado de no
resuspender la muestra compactada, para ello inclinar la botella y resbalar el
agua lentamente por las paredes.
5. Agitar la solución con una varilla de vidrio para eliminar burbujas de aire.
6. Registrar el aspecto final de la columna (color del sedimento y del líquido).
7. Marcar el nivel de agua y cubrir la boca de la botella con el plástico
autoadherible. Hacer algunas perforaciones para reducir la evaporación.
Puede ser necesario reponer agua para mantener el nivel original.
8. Incubar a temperatura ambiente (25 a 30°C) cerca de una ventana para que
reciba la luz solar.
9. Observar la columna y registrar, en el Cuadro 1( ANEXO 1), los cambios
físicos producidos con respecto al aspecto inicial

Fig 3. Columna de Winogradsky instalada

● AISLAMIENTO EN MEDIOS DE CULTIVO

1. PARA HONGOS Y LEVADURAS


Medio Agar Dextrosa Papa (PDA):
Fundamento: ​El agar papa dextrosa es un medio de cultivo que
aporta los elementos nutricionales necesarios para el desarrollo de
hongos filamentosos y levaduras. La combinación de la infusión de
papa con la glucosa proporciona la fuente de energía perfecta para
que exista un crecimiento satisfactorio de los hongos. Mientras que el
agar es quien brinda la consistencia al medio. El medio por sí solo no
inhibe el crecimiento de las ​bacterias​, por tanto es un medio no
selectivo. Para hacerlo selectivo necesita el agregado de sustancias
inhibidoras como el ácido tartárico o los antibióticos.

Preparación del medio: En primer lugar, se lavan muy bien las


papas quitando la tierra que posean. Se cortan en rodajas finas con
todo y concha. Se pesarán 40 gr de papas y se hervirá en 100ml de
agua destilada en un matraz de 500ml, durante media hora.
Terminado el tiempo se filtra o cuela todo el preparado a través de
una gasa en un vaso de precipitado.

El líquido obtenido se completa con agua destilada hasta llegar a 200


ml. A la infusión se le adicionaran 4 gr de agar-agar y 4 gr de
dextrosa, el medio queda a un pH de 5.6 ± 0.2, sin embargo, se
añadirá ácido tartárico al 10% o antibiótico para bajar el pH a 3,1 o 3,5
± 0.1 con la finalidad de inhibir el crecimiento bacteriano. Se mezcla
bien y se traslada a un envase de vidrio y se lleva a autoclave a
121°C, a 15 libras de presión por 15 minutos.

Dejar enfriar hasta 50°C y servir en placas de Petri estériles. Las


placas preparadas se conservan en nevera a 2 o 8 °C hasta gelificar.

Siembra: Para el procesamiento se toma 10 gs de suelo en 90 mL de


agua estéril en un matraz y se realizará diluciones seriadas en tubos
de ensayo con 9 mL agua peptonada estéril, se toma 1mL de muestra
del matraz y se coloca en el primer tubo de ensayo con 9 mL de agua
peptonada y de este mismo tubo se saca 1ml de muestra para el
segundo tubo y así sucesivamente hasta llegar al tubo 5. Para la
siembra en nuestro medio de cultivo de PDA se obtendrá 100 ul de
cada tubo con una micropipeta y se colocara en el centro de la placa
petri y se expande con una asa de drigalsky por toda la superficie del
medio de cultivo. Temperatura: 25°C, Atmósfera: Aeróbica, Tiempo de
cultivo: De 2 a 7 días

2. PARA BACTERIAS
Medio Agar Nutritivo (NA):
Fundamento: ​El medio contiene extracto de carne, peptona y agar,
siendo una formulación suficiente para el desarrollo de los
microorganismos. El extracto de carne proporciona al medio fuente de
carbohidratos, de nitrógeno y vitaminas. Está compuesto
principalmente de extracto de carne o extracto de levadura, peptonas
o digesto pancreático de gelatina, agar-agar, cloruro de sodio.

Preparación: Para 200 mL de agar nutritivo se debe pesar 6.2 gr del


medio deshidratado. Se colocará en una fiola y se disolverá en un 200
mL de agua destilada. Después de 5 minutos de agitación, se calienta
sobre una fuente de calor y se mezcla constantemente hasta que
hierva por 5 minutos. El pH del medio preparado debe quedar
ajustado a 7,3 ± 0,2, si está muy bajo se le agregara un basificador
Luego se lleva a autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante 15
minutos.
Enfriar aproximadamente a 45ºC. Vaciar en cajas de Petri estériles.
Conservar en refrigeración a 2 a 8ºC hasta gelificar.

Siembra: Los inóculos se tomarán de las dilusiones ya hechas, el


cual se explica anteriormente. Para la siembra en nuestro medio de
cultivo de NA se obtendrá 100 ul de cada tubo con una micropipeta y
se colocara en el centro de la placa petri y se expande con una asa
de drigalsky por toda la superficie del medio de cultivo. Temperatura:
35 a 37°C, Atmósfera: Aeróbica y Anaeróbica, Tiempo de cultivo: De 2
a 7 días

ANÁLISIS POR MICROSCOPÍA ÓPTICA

Para visualizar muestras de cada estrato de la columna de Winogradaky se tomarán


muestras de diferentes niveles y; observarán los microorganismos sin teñir con los objetivos
de 10x y 40x. Posteriormente fijar con alcohol-ácido acético (8:2) durante 5 minutos a
temperatura ambiente y teñir con azul de metileno o safranina. Observar con el objetivo de
inmersión, esquematizar o fotografiar los microorganismos observados y registrar en el
Cuadro 2 (ANEXO 2) . Puede ser necesario modificar las técnicas de fijación y coloración
dependiendo del tiempo transcurrido.

Referencias de Literatura:

1. Echeverri J., Manjarrez P.,y Cabrera O. (2011). Aislamiento de bacterias


potencialmente degradadoras de petróleo en hábitats de ecosistemas costeros en la
Bahía de Cartagena, Colombia NOVA - Publicación Científica En Ciencias
Biomédicas - Vol.8 No. 13: 1- 120 pp

2. Rengel J. A. (2018). Aislamiento de microalgas mixotróficas a partir de columnas de


Winogradsky, con posible aplicación en la remoción de materia orgánica y color en
aguas residuales no domésticas pos tratadas. Pontificia Universidad Javeriana -
Colombia.

3. Moreno J. R., Gorriti M. F., Flores M. y R.Albarracín V. H. (2012). Microbiología


ambiental y ecología microbiana en el estudio de microorganismos en ambientes
extremos. Tucuman - Argentina. Reduca (Biología). Serie Microbiología. 5 (5):
94-109 pp.
4. Cabrera V. y Orrego Z. (2014). “Eficiencia de la producción de sulfuro para la
precipitación de hierro en drenaje ácido por consorcios bacterianos sulfato
reductoras tolerantes a la acidez” Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo Facultad
De Ciencias Biológicas- Lambayeque - Perú.

5. Jiménez S. M., Parra S. L., Buriticá H. H. (2017). Identificación de microorganismos a


partir de la elaboración de la columna de Winogradsky. Docente programa de
Microbiología. Universidad libre Pereira.

6. Hosomi T. K. (2011). Análise Ecotoxicológica Utilizando Colunas De Winogradsky


Contaminadas Por Óleo Lubrificante Usado e Biodiesel. Universidade Estadual
Paulista “Júlio De Mesquita Filho” Instituto de Biociências - Rio Claro

7. http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/DiversidadMicrobianaColumnaWinograds
ky_21554.pdf​ )

ANEXOS

1. Cuadro 1. Observaciones físicas de la columna de winogradsky durante 5


semanas de incubación
2. ​Cuadro 2. Observaciones microscópicas de las primeras 3 semanas de incubación
de la columna de Winogradsky

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