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TINCION DE GRAM

FUNDAMENTO

Esta es una técnica que presenta 4 pasos fundamentales: tinción, fijación con el mordiente,
decoloración y contratinción. Por tanto, esta técnica además de colorear a las bacterias,
también permite diferenciarlas.

El cristal violeta es el primer colorante utilizado. El mismo tiene afinidad por el


peptidoglicano y teñirá de morado a todas las bacterias presentes, posteriormente se coloca
el lugol, que actúa como mordiente, es decir, inducirá a la formación de complejos insolubles
de cristal violeta-yodo – proteínas ribonucleares dentro de la célula.

Las bacterias Gram positivas, al tener una pared gruesa de peptidoglicano, forman más
complejos (cristal violeta-yodo), por tanto retienen el colorante.

Además también influye que la pared de las bacterias Gram positivas contienen mayor
cantidad de ácidos no saturados, los cuales muestran gran afinidad por los agentes
oxidantes (Lugol).

Mientras, las bacterias Gram negativas poseen una capa delgada de peptidoglicano, lo que
hace que las bacterias formen menos complejos que las Gram positivas.

Posteriormente viene el paso de la decoloración, donde las bacterias Gram positivas y


Gram negativas se comportan de manera diferente.

Las bacterias Gram negativas contienen una membrana externa rica en lipopolisacáridos
que forma parte de su pared celular. Las grasas son destruidas por el contacto con el
alcohol acetona, por lo que la membrana externa se desestabiliza, siendo liberado el cristal
violeta.
Es así como luego es contrateñida con la safranina o fucsina básica, tomando el color rojo.

En el caso de las bacterias Gram positivas, resisten la decoloración porque el decolorante


actúa cerrando los poros, lo que impide que el complejo cristal violeta/yodo pueda salirse.

Por tanto, se mantiene estable la coloración con el cristal violeta, y no hay cabida para la
safranina o la fucsina. Por esto estas bacterias se tiñen de azul intenso o morado.

PROCEDIMIENTO

1. Preparar la extensión del cultivo: En un portaobjetos limpio, libre de grasa, y con un asa
bacteriológica colocar una pequeña cantidad de la colonia bacteriana.

a) Muestra solida: colocar solución salina previamente a colocar la colonia, igual en


muestra semisólida.

b) Muestra liquida: colocar la colonia directamente.

2. Dejar secar al aire, luego fijar la preparación pasando la placa rápidamente por el
mechero (2 o 3 veces).

3. Agregar violeta cristal durante 20 a 30 segundos, el cual tiene afinidad con el


peptidoglicano de la pared bacteriana (Colorante primario), enjugar con agua
seguidamente.

4. Agregar yodo gram durante 40 a 60 segundos que sirve como mordiente (compuesto
químico intensificador del color) e impide la salida del cristal violeta por la formación de un
complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared
bacteriana. Enjuagar con agua seguidamente.
5. Agregar alcohol acetona y enjuagar con agua inmediatamente (decoloración, disuelve
lípidos de la pared de Gram negativas). Esta mezcla de alcohol-acetona, deshidrata la
pared bacteriana y

cierra los poros de la misma, también destruye la membrana externa de las bacterias Gram
negativas debido a que ésta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla
de alcohol acetona.

6. Agregar safranina durante 20 segundos, enjuagar con agua seguidamente. La safranina


funciona como un colorante secundario o de contra tinción y sirve para teñir las bacterias
que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo.