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Trabajo Práctico #4: Cinética Enzimática Ii Fundamentos Teóricos
Trabajo Práctico #4: Cinética Enzimática Ii Fundamentos Teóricos
FUNDAMENTOS TEÓRICOS
LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y SU DEPENDENCIA CON LAS CONCENTRACIONES DE
SUSTRATO Y ENZIMA
Recordemos que las reacciones catalizadas por enzimas pueden ser expresadas como:
k 1 k 2
E + S [E S ] (1 ) [E S ] E + P (2 )
k -1 k -2
De acuerdo a la ecuación (2) la velocidad inicial (Vo) de una reacción catalizada por enzimas
estaría determinada por la desaparición del ES y, por lo tanto, es proporcional a su concentración:
Sin embargo, k2 y [ES] son difíciles de determinar directamente por lo que Michaelis y Menten
V o = k 2 [E S ] (3 )
derivaron la ecuación (3) en términos de otras variables que pueden ser medidas
experimentalmente:
V m ax [S ]
V o = (4 )
K m + [S ]
Vo
Vmáx
-K m
1
[S]
En la Figura 1 observamos que a bajas [S], V0 incrementa casi linealmente con el incremento de la
[S] (1). A concentraciones mayores de sustrato, los incrementos de velocidad inicial en respuesta a
los incrementos de la concentración de sustrato son cada vez menores (2). Finalmente alcanzamos
un punto donde los aumentos de velocidad son despreciables frente a los incrementos de S. En
este momento decimos que la reacción enzimática tiende a velocidad máxima (3). La curva es una
hipérbola rectangular que pasa por el origen y, cuyas asíntotas son [S] = -Km y Vo = Vmáx.
Las constantes en la ecuación (4) son Vmáx y Km. La Vmáx depende únicamente de la concentración
de enzima y Km es independiente de la concentración de enzima y de la concentración de sustrato.
Km se define (en la deducción de la ecuación 1 y 2) como el cociente entre la suma de las
constantes de disociación del complejo [ES] y las constantes de formación de dicho complejo.
k -1 + k 2
K m = (5 )
k 1
V m ax V m ax [S ]
= K m + [S ] = 2 [S ] K m = 2 [S ] - [S ] (6 )
2 K m + [S ]
(A) (B)
Vo Vmax Vo Vmax
Sustrato 1 Enzima 1
ato 2
Sustr
Vmáx Vmáx
2 2 Enzima 1 : Hexoquinasa
a 2 Enzima 2 : Glucoquinasa
Enzim
Enzima: Hexoquinasa Sustrato : glucosa
Sustrato 1: glucosa K m1= 0,1 mM
Sustrato 2: fructosa K m2= 10 mM
Figura 2: Curvas de sustrato. (A)Una enzima con dos sustratos. (B)Dos enzimas con el mismo sustrato.
[Et]. La kcat, denominada también número de recambio, es una constante de velocidad de primer
orden con unidades de tiempos inversos y es equivalente al número de moléculas de sustrato
convertidas en producto en una unidad de tiempo, por una sola molécula de enzima, cuando la
misma está saturada de sustrato.
Vmáx es proporcional a la [Et]. Entonces, Vmáx = cte. x [Et]. Dicha cte. es kcat = Vmáx / [Et]
1 1 K m 1
= + x (8 )
V o V m ax V m ax [S ]
Al graficar 1/Vo en función de 1/[S] se obtiene la Figura 4B. De la intersección de la recta con la
ordenada se obtiene 1/Vmáx y de la intersección de la recta con la abscisa se obtiene –1/Km.
Km
Vmax Pendiente =
Vmax
2
1
Vmax
Km [S] 1 1
Km [S]
La ventaja del uso del método de la doble recíproca respecto a los otros métodos gráficos radica en
la determinación más precisa de V máx y como veremos más adelante será de utilidad en el análisis
de la inhibición enzimática.
En la actualidad se usan métodos de regresión no lineal que están disponibles en diversos
programas para PC, los que por aproximaciones matemáticas sucesivas (iteraciones) encuentran
los valores de los parámetros cinéticos. Cabe aclarar que todas las técnicas de cálculo por métodos
gráficos son menos precisas que los métodos de regresión no lineal.
INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
Los inhibidores de enzimas son moléculas que interfieren con la catálisis disminuyendo la velocidad
de las reacciones. Varias sustancias pueden inhibir la actividad enzimática, tales como: análogos de
sustratos, toxinas, drogas, complejos metálicos, anticoagulantes, etc.
Los estudios sobre inhibición enzimática nos dan información sobre las vías metabólicas, una visión
acerca de los mecanismos de acción de drogas y toxinas, y una mejor comprensión de los
mecanismos de las reacciones enzimáticas. La determinación de Km y Vmáx tiene gran importancia y
utilidad al trabajar con inhibidores, pues en base a los valores obtenidos se puede determinar la
presencia y tipo de inhibidor.
Los inhibidores de enzimas se dividen en dos clases: reversibles e irreversibles.
4
INHIBIDORES REVERSIBLES
1- INHIBICIÓN COMPETITIVA
Un inhibidor competitivo, compite con el sustrato por el sitio activo de la enzima e impide la unión
del sustrato.
Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen estructuralmente al
sustrato y que se combinan con la enzima formando el complejo [EI]. Debido a que el inhibidor se
une de manera reversible a la enzima, se puede cambiar el sentido de la competición en favor del
sustrato simplemente añadiendo más sustrato. Cuando hay suficiente sustrato se minimiza la
probabilidad de que se fije una molécula de inhibidor por lo que la reacción muestra la misma V máx
que la reacción sin inhibidor, pero Km aumenta en presencia del inhibidor (K´m) (Figura 5).
Vo V (A ) (B )
m ax 1
r
Vo
do
ib i
r
do
in h
id o r or bi
ib h ib id hi
n
in n
in h n i
Co
n C on Si
Si
V m ax
2
1
V m ax
K m K ´m [S ] 1 1 1
K m K ´m [S ]
FFigura
i g u r a 95:: E f e c t o d e u n i n h i b i d o r c o m p e t i t i v o e n u n a r e a c c i ó n e n z i m á t i c a . ( A ) C u r v a d e s u s t r a t o e n p r e s e n c i a
y e n a u s e n c i a d e l i n h i b i d o r. ( B ) D o b l e r e c í p r o c a e n p r e s e n c i a y e n a u s e n c i a d e l i n h i b i d o r.
2- INHIBICIÓN NO COMPETITIVA
Un inhibidor no competitivo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato. La fijación
del inhibidor puede o no bloquear la fijación del sustrato, pero si este último se une al sitio activo
no se puede transformar a P o lo hace a menor velocidad. El inhibidor disminuye de manera
efectiva la concentración de enzima activa por lo que disminuye la V máx aparente (V´máx).
Frecuentemente el efecto sobre Km es nulo (Figura 6).
V o V m ax (A ) 1 (B )
V
r
id o
o
ib
r
b id o r do
in h
in h i bi
hi
n
S in
Co
in
n
V ḿ a x 1 Si
id o r
n in h ib V m´ a x
V m ax Co
2
1
V ḿ a x V m ax
2
K [S ] 1 1
m
K m [S ]
FFigura
i g u r a 1 6:
0 : E fe c to d e u n in h ib id o r n o c o m p e t it iv o e n u n a r e a c c i ó n e n z im á tic a . ( A ) C u r v a d e s u s t r a to e n p re s e n c ia
y e n a u s e n c ia d e l in h ib id o r. ( B ) D o b le r e c í p r o c a e n p r e s e n c i a y e n a u s e n c ia d e l in h ib id o r.
3- INHIBICIÓN ACOMPETITIVA
En este caso el inhibidor se une al complejo [ES], con lo cual el valor de Km disminuye (como si la
enzima tuviera más afinidad por el S). También disminuye la V máx ya que el complejo [SEI] es
inactivo (Figura 7).
5
Vo V m ax (A ) (B )
1
Vo
r
id o r do
in h ib h ib i
S in n i
n
id o
r
V ḿ a x C o n h ib
ib id o r n i
n in h Si
V m ax
Co 1
2 V ḿ a x
V ḿ a x
2 1
V m ax
K [S ] 1 1 1
K ´m m
K K
ḿ m [S ]
F i g u r a 7:1 1 : E f e c t o d e u n i n h i b i d o r a c o m p e t i t i v o e n u n a r e a c c i ó n e n z i m á t i c a . ( A ) C u r v a d e s u s t r a t o e n p r e s e n c i a
Figura
y e n a u s e n c ia d e l in h ib id o r. ( B ) D o b l e r e c í p r o c a e n p r e s e n c i a y e n a u s e n c ia d e l in h ib id o r.
INHIBIDORES IRREVERSIBLES
Con el uso de inhibidores irreversibles es frecuente la formación de un enlace covalente entre
un inhibidor y la enzima. Los inhibidores irreversibles son muy útiles para estudiar los mecanismos
de reacción. Estos juegan un papel central en los métodos modernos para obtener nuevos agentes
farmacéuticos, proceso que se denomina diseño racional de fármacos. Debido a que el inhibidor se
ha diseñado para una enzima específica y no es reactivo hasta que se encuentre en el sitio activo
de la enzima, los fármacos basados en este método son con frecuencia muy efectivos y tienen
pocos efectos secundarios.
PARTE EXPERIMENTAL
IMPORTANTE: repasar todos los conceptos del práctico Nº3 (Cinética Enzimática I) y los
resultados obtenidos y discutidos en el laboratorio. Traer delantal, papel milimetrado,
calculadora, marcador indeleble para tubos, lápiz, regla, y goma de borrar a la clase de
laboratorio.
Curva de sustrato
H 2N N H 2-C H 2-C O O H
C = N H
G lic in a
H 2N
G u a n id in a
7
TUBO UREA Inhibidor BUFFER ENZIMA Incubar Reactivo Reactivo Incubar Abs.
pH: 7 dil X 37oC A B 37oC 540 nm
5 mM X mM
B -------- 0,1 ml 0,7 ml 0,2 ml 10 ' 2 ml 2 ml 20 '
1 0,1 ml " 0,6 ml " " " " "
2 0,2 ml " 0,5 ml " " " " "
3 0,3 ml " 0,4 ml " " " " "
4 0,4 ml " 0,3 ml " " " " "
5 0,5 ml " 0,2 ml " " " " "
6 0,6 ml " 0,1 ml " " " " "
7 0,7 ml " 0 ml " " " " "
GlDH
NH3 + NADH + H+ + 2-oxoglutarato L-glutamato + NAD+ + H2O
La actividad de la ureasa es proporcional al consumo de NADH, que se sigue por disminución de
la absorbancia a 340 nm.
PROCEDIMIENTO
a) Determinación de la actividad de ureasa. 1- Llevar a cero el espectrofotómetro con un blanco
de agua destilada. Equilibrar los reactivos a la temperatura de trabajo (37ºC). 2- En una cubeta
colocar 1 ml de Reactivo de Trabajo y medir la abs. 340 nm. 3- Agregar 20 l de sustrato, mezclar
inmediatamente y disparar simultáneamente un cronómetro. 4- Tomar una lectura de absorbancia
inmediatamente (T0) y continuar tomando los valores de absorbancia cada 1 min durante 10 min.
5- Graficar los valores de absorbancia en función del tiempo y calcular la Vo a partir de la
pendiente, usando el coeficiente de extinción mmolar del NADH (NADH: 6,22 mM-1 cm-1).
Comparar y discutir las ventajas y desventajas de este procedimiento con respecto al método de
punto final para la determinación de actividad de la ureasa de soja (por cuantificación de
amoníaco formado) utilizado en los Trabajos Prácticos Nº 3 y 4.
b) Efecto de inhibidores. Se sabe que los anticoagulantes que contienen fluoruros inhiben la
acción de la ureasa. Probaremos el efecto inhibitorio del mismo repitiendo una reacción como la de
a) en la que se agrega 100 mM NaF antes del agregado de urea. Comparar con la reacción no
inhibida mediante gráficos y numéricamente.
Reactivos (almacenar en refrigerador (2-10ºC) hasta la fecha de vencimiento):
Sustrato: solución de urea 15 mM.
Buffer: solución de buffer Goods 100 mmol/l, pH 7,9.
Liofilizado: viales conteniendo 2-oxoglutarato, NADH, ureasa y glutamato deshidrogenasa
(GlDH).
Para preparar el Reactivo de Trabajo disolver el contenido de un vial de liofilizado en un frasco de
buffer. Mezclar suavemente por inversión hasta disolución completa, evitando la formación de
espuma, y fechar. Una vez preparado el Reactivo de Trabajo es estable 30 días en refrigerador (2
a 10ºC). El Reactivo de Trabajo se deteriora y debe descartarse cuando las lecturas de
Absorbancia a 340 nm contra agua son inferiores a 1.
El método cinético continuo que ensayamos en el práctico es una adaptación del que se utiliza en los laboratorios de análisis clínicos para la
determinación de urea en suero o plasma (Urea cinética AA. Wiener Laboratorios SAIC. Riobamba 2944, 2000, Rosario, Arg. www.wiener-
lab.com.ar).