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RAM-136; No. of Pages 9 ARTICLE IN PRESS

Rev Argent Microbiol. 2016;xxx(xx):xxx---xxx

R E V I S T A A R G E NT I NA D E
MICROBIOLOGÍA
www.elsevier.es/ram

ARTÍCULO ORIGINAL

Presencia de estafilococos ambientales coagulasa

positivos, su relación clonal, factores de resistencia
y capacidad para formar biofilm
Norma Velázquez-Guadarramaa,∗ , Alma L. Olivares-Cervantesa, Eva Salinasb,
Leticia Martínezb, Magdalena Escorciac, Ricardo Oropezad, Irma Rosasb,∗

a Laboratorio de Infectología, Hospital Infantil de México Federico Gómez, México, DF 06720, Mexico
b Centro de Ciencias de la Atmosfera, Universidad Nacional Autónoma de México, México, DF 04510, Mexico
c Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónoma de México, México, DF 04510, Mexico
d Instituto de Biotecnología Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca Mor, Mexico

Recibido 11 de diciembre de 2015; aceptada el 30 de agosto de 2016

Las venas de estafilococos coagulasa positivos (EPOC) abstractas patógenos oportunistas portadores de
PALABRAS CLAVE mecanismos var-ious o resistencia que tienen un gran número de factores de virulencia, y cuya
Multifarmacorresis capacidad para inducir la enfermedad se asocia con el huésped. El objetivo de este estudio era
tente; Biofilm investigar los estafilococos positivos para el Presidente o la coagulasa ambiental, su perfil de
susceptibilidad, su relación clonal y su capacidad para formar biofilm. Los Oblatos de 16S rRNA de los
Electroforesis en
aislados de la EPOC fueron Ana-lyzed, y su susceptibilidad a los antibióticos se evaluó utilizando el
gel de campo método de dilución de agar de acuerdo con las pautas del Instituto de estándares clínicos y de
pulsado; laboratorio. El perfil clonal se obtuvo en la electroforesis de gel de campo pulsado (PFGE) y la
Estafilococos formación de biofilm se hizo con la presión de un ensayo de retención de color violeta cristalino. Un
coagulasa total de 72 cepas de Staphylococcus SPP fueron aisladas de aire, superficies metálicas y fosas nasales
positivos; de seres humanos, perros, gatos y aves. Se identificaron tres especies: Staphylococcus aureus (17%),
Staphylococcus intermedius (63%), y Staphylococcus Pseudintermedius (21%). 93 por ciento (93%) Si las
Ambiental cepas fueron resis-tant a por lo menos uno o 13 antibióticos probados. Las cepas de S.
Pseudintermedius eran las únicas resistentes a la meticilina, mientras que la mayoría de estos aislados
eran multirresistentes, tenían una capacidad de visión-nificantemente mayor para formar biofilm y
PFGE agrupados en los diferentes patrones, sin mostrar dispersión clonal Entre animales y aislados
ambiental. Este estudio firma que los perros, el gato y el aire son fuentes ambientales potencialmente
portadoras de múltiples fármacos resistentesS. Pseudintermedius, que sobrevive en diferentes
ambientes a través de la formación de biofilm y

∗C Autores correspondientes.
Direcciones de correo electrónico: normave@himfg.edu.mx (N. Velázquez-Guadarrama), iarp@atmosfera.unam.mx (I. rosas).

http://dx.doi.org/10.1016/j.ram.2016.08.006
0325-7541/© 2016 asociacio ́n Argentina de Microbiolog ́ıa. Publicado por Elsevier espan, S.L. Este es un artículo de acceso abierto bajo
la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Please cite this article in press as: Velázquez-Guadarrama N, et al. Presence of environmental coagulase-positive
staphylococci, their clonal relationship, resistance factors and ability to form biofilm. Rev Argent Microbiol. 2016.
http://dx.doi.org/10.1016/j.ram.2016.08.006
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2 N. Velázquez-Guadarrama et al.

Resistencia a múltiples fármacos, características que pueden transmitirse horizontalmente a

otras bacterias y exacerbar el problema o la resistencia a los antibióticos en humanos.
© 2016 asociación a Argentina de Microbiología. Publicado en Elsevier espan, COMPERA S.L.U.
Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND
(http://creativecommons.org/licenses/by-NC-nd/4.0/).

PALABRAS CLAVE Presencia de estafilococos coagulasa positiva ambientales, su relación clonal,

Resistente a múltiples factores de resistencia y habilidad para formar biopelícula
antibióticos;
Resumen Los estafilococos coagulasa-positiva (CoPS) son patógenos oportunistas, portan
Biopelícula;
varios mecanismos de resistencia, tienen un gran número de factores de virulencia y su capaci-
Electroforesis en gel
dad para inducir la enfermedad está asociada con el hospedero. El objetivo de este estudio fue
de campo pulsado;
investigar la presencia de CoPS en el medio ambiente, su perfil de sensibilidad a los antibióti-
Estafilococos
cos, su relación clonal y su capacidad para formar biopelícula. De los aislamientos de CoPS
coagulasa-positiva; se analizaron los genes 16S ARNr y se evaluó la sensibilidad a los antibióticos mediante el
Ambiental método de dilución en agar según el CLSI. El perfil clonal se obtuvo por electroforesis en gel
de campo pulsado (PFGE) y la formación de biopelícula se analizó por retención de cristal
violeta. Se aislaron 72 cepas de Staphylococcus spp. a partir de aire, superficies metálicas
y narinas de humanos, perros, gatos y aves. Se identificaron tres especies: Staphylococcus
aureus (17%), Staphylococcus intermedius (62%) y Staphylococcus pseudintermedius (21%). El
93% de las cepas fueron resistentes al menos a uno de 13 antibióticos probados. Los aislamientos
de S. pseudintermedius fueron los únicos resistentes a meticilina y la mayoría fueron resistentes
a múltiples fármcos, tuvieron una capacidad significativamente mayor para producir biopelícula
y la PFGE los agrupó en 7 diferentes patrones, sin mostrar dispersión clonal entre los aislamien-
tos de animales y de medio ambiente. Este estudio sugiere que los perros, los gatos y el aire
son fuentes ambientales potencialmente portadoras de S. pseudintermedius resistente a múlti-
ples antibióticos. Este agente sobrevive en diferentes entornos en virtud de la formación de
biopelículas y la resistencia a múltiples antibióticos, características que pueden transmitirse
horizontalmente a otras bacterias y, por ende, exacerbar el problema de la resistencia a los
antibióticos en humanos.
© 2016 Asociación Argentina de Microbiologı́a. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Este es un
artı́culo Open Access bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-
nc-nd/4.0/).

Introducción La epidemiología de los estafilococos ha cambiado en

Los estafilococos son cocci gram-positivos positivos para la
catalasa. Las diferentes especies pueden distinguirse por
su capacidad para fermentar azúcares y producir
coagulasa. Siete especies de estafilococos coagulasa
positivos (COP) han sido identificadas: Staphylococcus
aureus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus
schleiferi subsp. coagulans, Staphylococ-CUS Hyicus,
Staphylococcus lutrae, Staphylococcus delphini y
Staphylococcus pseudintermedius7. Los policías
comúnmente colonizan la piel y las membranas mucosas;
Además, los estafilococos tienen la capacidad de
sobrevivir en casi cualquier ambiente. Los policías son
patógenos oportunistas; tienen un gran número de
factores de virulencia, y su capacidad para inducir
enfermedades suele asociarse con el huésped. Los policías
llevan varios mecanismos de resistencia. Particularmente,
S. aureus se convirtió en resistente a la meticilina al
adquirir una isla genómica de resis-tancia conocida como
casete cromosómico MEC (SCCmec I-VII), y es un elemento
genético variable. La isla está presente con-stitutivamente
en el gen orfX, y dependiendo del tipo, tiene una
recombinasa CCR específica, que permite transportar
otros genes de resis-tancia albergado en plásmidos
pequeños o transposons12.
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http://dx.doi.org/10.1016/j.ram.2016.08.006
los últimos años, ya que pueden causar infeccio-ciones
nosocomiales y comunitarias, y la importancia de S. aureus
ha aumentado porque puede causar muchas afecciones
patológicas corrieron de infecciones simples de la piel a
invasivas procesos como la neumonía y la osteomielitis.
Por otra parte, Staphylococcus epidermidis se considera
una bacteria comensal inofensivo de la piel humana,
incluso un pathogen16 accidental. Sin embargo, en la
actualidad, esta bacteria es reconocida como un agente
patógeno humano importante y es una de las principales
causas asocia-Ted con dispositivos médicos tales como las
infecciones relacionadas con catéter intravenoso central o
periférico. También causa Kera-titis y endoftalmitis,
contaminación de lentes de contacto, infecciones por
catéter urinario, bacteriemia, mediastinitis y otras
infecciones. Ambas especies se reportan que tienen altas
tasas de resistencia a la meticilina, y hay un número de
increas-Ing de informes sobre su susceptibilidad reducida a
vancomycin5, 20, 21.
Se sabe que las especies estafiloccales exhiben la
especie de huésped, y las especies de especímenes de
policías clínicos difieren de las aisladas de los animales,
que también difieren entre las especies anfitrionas. Por
ejemplo, la especie predominante en rumiantes,
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Estafilococos ambientales coagulasa positivos
cerdos, perros y palomas son S. aureus, S. Hyicus, S.
pseud-intermedius y S. intermedius respectively6, 23. Sin
embargo, estudios recientes consideran a S.
Pseudintermedius como un incipiente zoonótico agent17,
29.
Aunque hay gran variabilidad clonal entre los staphylo-cocci,
no se entiende por qué algunos clones de Staphylococcus tienen
una mayor diseminación o por qué algunas especies son más
frecuentes que otras. Además, muchas de estas especies dessemi-
nadas que se distribuyen en todo el mundo pueden incluso
reemplazar a los clones nativos, aunque sólo algunas de las
especies dis-seminadas se han divulgado para causar infección. En
los Estados Unidos, se ha observado que los clones USA300 y
USA400 pertenecientes a las secuencias ST8 y ST1, res-tivamente,
causan la mayoría de las infecciones de S. aureus adquiridas por
la comunidad, y el clon USA100 de S. aureus se disemina en
environments26 hospi-tal. Además, Pseudintermedius se puede
propagar en los seres humanos y sus mascotas. En 2006, el primer
caso de infección por este microorganismo en humanos fue de
reported27, y de 2010 a 2012, S. Pseudintermedius fue responsi-
ble por causar un brote en un hospital veterinario para perros y
gatos de difícil control28, 29. Además, se ha observado la
propagación de clones ST71 en Europa y ST68 en América entre
pets8, 24.
El objetivo de este estudio era investigar la presencia
de estafilococos coagulasa positivos en el medio ambiental
como portadores de factores de resistencia, su relación
clonal y capacidad para formar biofilm
Metodos
Los aislados bacterianos
A Las bacterias aerotransportadas fueron recolectadas en 10 áreas
diferentes del hospital de enseñanza veterinaria (ciudad de
México, D.F. Mex-ICO) usando un sampler Andersen de dos etapas
(Graseby Andersen, Atlanta, GA), con un caudal de aire constante
de 28 l/min durante 15 min. los Samplers fueron cargados en
placas de Petri contienen agar sangre y agar de soja tripticasa
(Difco Laboratories, Detroit, MI). Un total de 10 muestras de
superficie de mesas de acero sin manchas dentro de 5 cm2 áreas
fueron recogidos utilizando una técnica de hisopado. Las muestras
de animales fueron tomadas de las fosas nasales (de 20 perros, 13
gatos y 16 aves), fueron col-seleccionada usando una técnica de
hisopado y cultivadas en los mismos medios; también se
recogieron 10 muestras de exudado nasal humano. Todas las
placas de agar fueron incubadas durante 24---48 h en 37 ◦ C. Las
colonias típicas de estafilococos se transfirieron al medio
selectivo de agar de sal de manitol (laboratorios Difco). La prueba
de coagulasa se realizó con plasma de conejo en organismos de
manitol positivo. Las cepas bacterianas (coagulasa y manitol-
positivas) fueron identificadas por 16S rRNA sequenc-Ing.
Se recolectan muestras humanas, animales, aéreas y
superficiales al mismo tiempo y desde el mismo espacio.
(Sitio: Hospital para perros, gatos y aves.)
La amplificación de PCR de genes de 16S rDNA
Las secuencias de genes de 16S rDNA parciales se
amplificaron mediante PCR utilizando imprimaciones
universales 27F y 1492r. Primer 27F fue 5J-AGA GTT TGA
TCM TGG CTC AG-3J, y primer 1429R fue 5J-TAC GGY TAC
CTT GTT ACG ACT T-3J. La mezcla de reacción PCR
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3
incluyó 2 μl de ADN bacteriano, 35,4 μL de ddH2O, 5 μl de
10 tampón, 1,5 μl de MgCl2 (1,5 mM), 1 μl de dNTPs (10
mM), 0,1 μl de Taq (20 μl) y 2,5 μl cada imprimación (10
μmol) en un volumen final de reacción de 50 μl. las
amplificaciones se realizaron de la siguiente manera : 94 ◦
C durante 1 min; 94 ◦ c durante 1 min, 56 ◦ C durante 30 s,
72 ◦ C durante 1 min 30 s (35 ciclos); 72 ◦ C durante 5 min;
y luego una retención en 4 ◦ C. Los productos de PCR
fueron examinados para el tamaño y el rendimiento
usando geles de agarosa 1,2% (p/v) en buffer TAE. Después
de una amplificación exitosa, los productos obtenidos
fueron secuenciados usando un secuenciador automatizado
PRISM 3730 (Applied Biosystem Inc.).
EL Analisis de secuencia
Las secuencias de ADN fueron editadas y ensambladas
usando los programas SEQ-Man y Edit SEQ (DNA Star, laser
gene 6, USA). El análisis de similitud de secuencia se
realizó utilizando el programa BLAST
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
La susceptibilidad antimicrobiana
La susceptibilidad antimicrobiana de las cepas aisladas de
Staphylococcus se probó usando las tarjetas Vitek I GPS-119
(bioMérieux, Inc., Durham, NC). La resistencia fue verificada por
la concentración inhibitoria mínima (MIC), empleando el método
de dilu-ción de agar como se describe en las pautas del Instituto
de normas clínicas y de laboratorio (CLSI 2014) 4. Los Antibi-ótica
utilizados fueron: penicilina-G (MP Biomedicals), oxacilina (Sigma-
--Aldrich, St. Louis, MO), ampicilina (MP Biomedi-CALS, Solon,
OH), clindamicina (Sigma---Aldrich), eritromicina (MP biomédica),
gentamicina (MP Biomedicals), levofloxacina ( Sigma---Aldrich),
moxifloxacina (Sigma---Aldrich), tetracy-Cline (Sigma---Aldrich),
trimethropim (MP Biomedicals), sulfametoxazol (MP Biomedicals),
y vancomicina (MP biomédica). Se utilizó la cepa de referencia de
S. aureus ATCC® 29213 (colección de cultivo de tipo Amer-ICAN,
Manassas, VA, EE.UU.). Los aislados que exhiben resistencia a la
oxacilina también fueron confirmados por la presencia del gen
mecA utilizando imprimadores previamente descritos y Terms30.
Ensayo para la formación de biofilm
La cuantificación de la formación de biofilm se realizó utilizando
placas de microtitulación de poliestireno de 96-Well (placas de
fondo plano de los cotos con tapas) de acuerdo con el método de
Stepanovic con leve modification25. Brevemente, las células
bacterianas se cultivaron durante la noche en TSB, ya sea de una
sola Colonia cultivada en agar TSB o de un − caldo de glicerol
mantenido en 70 ◦ C. Las células se diluyeron 1:100 en 200 μL de
TSB o TSB + glucosa (1%). Cada cepa BAC-terial fue atacada en
cuatro pozos replicados. Las placas de microtitulación fueron
incubadas a 37 ◦ C. Después de 24 h de incubación, el crecimiento
total de la célula se midió basándose en la densidad óptica (OD) a
570 nm utilizando un lector de microplacas Bio-Tek Elx808 con el
software Kc4. Las células planktónicas fueron desechadas, y la
placa fue tratada con 200 μL de volúmenes
× de los siguientes
reactivos: después de enjuagar tres veces con PBS 1, el biofilm
restante fue fijado con metanol (100%), manchado con cristal vio-
Let (2%), y enjuagado con agua tres veces. El tinte se solubilizó
con ácido acético (33%). Finalmente, el OD570nm fue
determinado usando un lector de microplacas. La cantidad de
biofilm formada se reporta como la relación de
OD570nm/OD620nm
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4 N. Velázquez-Guadarrama et al.
Table 1 Frecuencia de estafilococos coagulasa positivos aislados de diversas fuentes en un hospital escolar veterinario
en México.
Source, n (%)
S. aureus
Air = 8 (11) 2 (2.7)
Surface = 3 (4) 3 (4.1)
Human = 2 (3) 2 (2.7)
Dog = 50 (69) ---
Cat = 3 (4) ---
Bird = 6 (8) 5 (6.9)
Total = 72 (100) 12 (16.7)
Valores, que corresponde a una expresión simplificada de
la relación utilizada en estudios 15 anteriores.
Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE)
El análisis PFGE se realizó para los aislados S. Pseudintermedius y
S. intermedius. Los procedimientos y tampones utilizados para la
preparación de ADN cromosómico, macro-restricción de ADN, y
PFGE fueron modificados de un report14 anterior. Brevemente: la
digestión se realizó en un volumen de 200 μL con 1 Tampón
enzimático y 25 U SmaI fueron incubados a 25 ◦ C durante la
noche. Se preparó
× un gel de agarosa al 1% (WT/vol) en
0,5 buffer TBE (AMRESCO, Solon, OH). PFGE se realizó utilizando
un programa multiestado y un sistema de CHEF Mapper (Bio-Rad,
Hercules, CA). Los parámetros de funcionamiento eran los
siguientes: 200 V (6 V/cm); temperatura 14 ◦ C; bloque uno:
interruptor inicial 2 s, interruptor final 7 s, duración 10 h; bloque
dos: interruptor inicial 8 s, interruptor final 45 s para 14 h.
Después de que se completó el funcionamiento de la
electroforesis, el gel se manchó en una solución de bromuro de
etiidium de 1,5 μg/ml (AMRESCO X328, 10 mg/ml; Amresco, Inc.,
Solon, OH) durante 20 min en un recipiente cubierto y se destella
en agua destilada fresca por 45 min. Se usó un lambda DNA
(BioLabs de Nueva Inglaterra) como estándar de tamaño
molecular.
El análisis estadístico
El paquete de estadísticas para el programa de ciencias sociales
(SPSS, versión 10) se usó para la prueba paramétrica de Student.
Las variables categóricas se describieron como porcentajes, y los
valores mediano, mínimo y máximo se utilizaron para las variables
cuantitativas con-tinuous.
El análisis de datos PFGE se realizó considerando la presencia o
ausencia de bandas específicas para obtener una estimación de
similitud para cada par de aislados. Los Pat-los charranes de
huellas dactilares de gel se analizaron utilizando bionumerics
versión 6,0 (Maths aplicadas). Después de la resta de fondo y la
normaliza-ción de gel, patrones de huellas dactilares fueron
sometidos a escribir basado en la similitud de bandas y la
dessimilitud utilizando el coeficiente de la manera similar de dice
y el método de grupo de par no ponderado con media aritmética
(UPGMA) clustering . La relación fue apoyada por el coeficiente
de correlación cofenética usando mantel y una prueba de
bootstrap con 10 000 randomizations22. Los métodos estadísticos
multivariados se realizaron utilizando el programa NTSYS-PC
(versión 2,0; Exeter software). 13
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Frequency of isolation (%)
S. intermedius S. pseudintermedius
1 (1.4) 5 (7)
--- ---
--- ---
43 (59.7) 7 (9.7)
--- 3 (4.1)
1 (1.3) ----
45 (62.5) 15 (20.8)
Resultados
Aislamiento e identificación de Staphylococcus spp.
Un total de 72 cepas de CoPS fueron aisladas e
identificadas. Todos los aislados fueron confirmados
mediante la secuenciación del gen de identificación de ITS
16S. 50 (50) las cepas de CoPS fueron aisladas de 10 de 20
perros; 3 policías fueron aislados de un gato; 6 policías
fueron aislados de dos pájaros; dos policías fueron aislados
de un humano, y 8 y 3 policías fueron aislados del aire y
las superficies, respectivamente. La tabla 1 muestra las
frecuencias de las especies observadas; las especies
predominantes fueron S. inter-medius (45/72), S.
Pseudintermedius (15/72) y S. aureus (12/72). Las cepas
obtenidas de S. aureus no se aislaron de perros o gatos, y
no hubo diferencias entre los aislados de S. aureus y S.
Pseudintermedius (12 y 15, respectivamente). Tres
especies diferentes de policías (S. pseudin-termedius, S.
aureus y S. intermedius) fueron aisladas del aire. Sólo S.
aureus fue aislado del paciente humano y de las
superficies.
La susceptibilidad antimicrobiana
Los patrones de susceptibilidad antimicrobiana observados se
presentian en la tabla 2. Un total de 92% (66/72) de las cepas de
estafilococos mostraron resistencia a al menos un antibiótico, y el
30% fueron Staphylococcus resistente a tres o más familias de
antibióticos DIF-aferentes (MDR). Se observó resistencia a la
penicilina, eritromicina, sulfametoxazol/trimetoprim, tetraciclina
y levofloxacina (86, 47, 40, 40 y 39%, respectivamente). Sólo el
14% (14/72) eran resistentes a la oxacilina y llevaban el gen
mecA. S. intermedius fue la especie más comúnmente aislada y
exhibió resistencia a múltiples fármacos en 16 casos, seguido por
S. Pseudintermedius con 14 casos. Ninguno de los aislados de S.
aureus mostraron resistencia a múltiples fármacos, y fue la única
especie que fue sensible a todos los antibióticos probados en 4 de
los 12 aislados. La figura 1 muestra que la especie S.
Pseudintermedius era resistente a la mayoría de los antibióticos
probados, y todos los aislados mostraron resistencia a la
ampicilina.
Ensayo para la formación de biofilm
La formación de biofilm se evaluó después de un período de
incubación de 24 h, y se obtuvieron valores promedio de
OD570nm (Figura 2).
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Estafilococos ambientales coagulasa positivos 5
Tabla 2 Patrones de resistencia a los antibióticos entre los estafilococos coagulasa positivos aislada de diversas fuentes en
un hospital escolar veterinario en México.

Source Resistance

S. aureus S. intermedius S. pseudintermedius

Air = 8 --- 1 PEN 1 OXA, AMP, CLI, ERI,
LEV, TMS
4 OXA, AMP, CLI, ERI,
GEN, LEV, TMS
Surface = 3 1 PEN --- ---
Human = 2 2 PEN, TET --- ---
Dog = 50 ---- 15 PEN 1 AMP, PEN
7 PEN, TET 2 OXA, AMP, CLI, ERI,
4 ERI, TET LEV, TMS
1 CLI, ERI, PEN, TET 4 OXA, AMP, CLI, ERI,
1 ERI, PEN, TET, TMS GEN, LEV, TMS
10 ERI, LEV, PEN, TET,
TMS
2 ERI, MOX, PEN, TET,
TMS
1 AMP, CLI, ERI, LEV,
PEN, TET, TMS
1 CLI, ERI, QUI, PEN,
TET, TMS
Cat = 3 --- --- 3 OXA, CLI, ERI, LEV, TMS
Bird = 6 5 PEN --- ---
Total = 72 8 43 15
Ampicilina (AMP), clindamicina (CLI), eritromicina (ERI), gentamicina (GEN), levofloxacina (LEV), moxifloxacina (MOX), oxacilina
(OXA), penicilina-G (pluma), quinolona (QUI), tetraciclina (TET), trimetoroprim-sulfametoxazol (TMS)

100 3.10
2.90 1
90
2.70
80
2.50
70 2.30
% resistance

60 2.1
Optical density

50 1.90
40 1.70
1.50
30 2
1.30
20 12
1.10
10 .90
0 .70
AMP CLI ERI GEN LEV MOX OXA PEN TET TMS .50
Antibiotic .30
S. intermedius n=45 S. pseudintermedius n=15 S. aureus n=12 .10

S. intermedius S. pseudintermedius
Figura 1 porcentajes de resistencia a los antibióticos entre
los estafilococos coagulasa positivos aislados de diversas Figura 2 ensayos de biofilm de S. Pseudintermedius y
fuentes en un hospital escolar veterinario en México. S. intermedius se aísla cuando se cultiva a partir de la fase de
crecimiento post-exponencial. Curiosamente, una mayor formación de
biofilm (p = 0,0001) se observó en S. pseudinter-medius en comparación
Todas las cepas en este estudio (CoPS) formaron un con S. intermedius. Prueba t del estudiante.
biofilm (OD570nm < 0,120 se considera no adherente, >
0,240 es consid-Ered fuertemente adherente, y > 0,120 a <
0,2340 se considera adherente). La cepa de E. coli
Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE)
BW25113 se usó como un control negativo. Las cepas de S.
Pseudintermedius formaron la cantidad más grande de Figure 3 muestra: (A) el perfil clonal de las cepas de S.
biofilm y mostraron una diferencia estadísticamente Pseudintermedius y (B) el perfil clonal S. intermedius, los rangos de
significativa en las capacidades de formación de biofilm en coeficiente de similitud de los dados fueron del 97,1 al 60,4% y
comparación con los otros policías (S. intermedius y S. 40,9 al 96,9% respectivamente. Los patrones de bandas producidos en
aureus). No hubo una diferencia significativa entre las S. Pseudintermedius aislados de perros y gatos diferían
capacidades de formación de biofilm entre los aislados de
S. intermedius y S. aureus.
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6 N. Velázquez-Guadarrama et al.

A Dice coefficient
Staphylococcus pseudintermedius

Strain Cluster Pulsotype Source Antibiotic

100
70

80

90
26 A 1 Dog 5 1,2,3,5,6,9,10
97.1 28 A 1 Dog 5 1,2,3,5,6,9,10
25 A 2 Dog 5 1,2,3,5,6,9,10
82.9
27 A 2 Dog 5 1,2,3,5,6,9,10
326 B 1 Cat 12 1,2,3,5,9,10
67.5 327 B 1 Cat 12 1,2,3,5,9,10

86.7 328 C 1 Cat 12 1,2,3,5,9,10

21HC D 1 Air 1 1,2,3,4,5,9,10
75.5
15HM E 1 Air 2 1,2,3,4,5,9,10
60.4
89.7 9HC E 1 Air 1 1,2,3,4,5,9,10
15HC E 2 Air 1 1,2,3,4,5,9,10
218 F 1 Dog 20 1,2,3,5,9,10
66.7 219 F 1 Dog 20 1,2,3,5,9,10
17HC G 1 Air 1 1,2,3,5,9,10
CCCr=0.9077 P=.02

B Dice coefficient
Staphylococcus intermedius
Strain Cluste Pulsotype Source Antibiotic
100
60

80

56 A 1 Dog 13 3,5,10
57 A 1 Dog 13 3,10
58 A 1 Dog 13 3,5,10

95.8 59 A 1 Dog 13 3,5,10

62 A 2 Dog 13 3,5,10
76.9
52 B 1 Dog 13 3,5,10
60 B 1 Dog 13 3,5,10
96.9
53 B 2 Dog 13 3,5,10
64.0
104 C 1 Dog 15 10

93.8
105 C 1 Dog 15 10
103 C 2 Dog 15 10
77.1
101 D 1 Dog 15 10
61.4
102 D 1 Dog 15 10
11 E 1 Dog 2 10
13 E 1 Dog 2 10
81.3
58.4
10 F 1 Dog 2 10
65.4
47 G 1 Dog 10 10
48 G 1 Dog 10 2,3,10
12 H 1 Dog 2 10
54.0
19 I 1 Dog 3 10
20 I 1 Dog 3 10
95.3
14 I 2 Dog 3 10
40.9
60.3 16 I 2 Dog 3 10
22A J 1 Dog 4 10
23A J 1 Dog 4 10
384 K 1 Bird 6 Sensible
CCr=0.937 P=.002

Figura 3 :Análisis de dendrograma de los patrones PFGE de S. Pseudintermedius (A) y S. intermedius (B). El análisis del
perfil clonal se realizó utilizando el coeficiente de similitud de los dados en asociación con el algoritmo UPGMA como
método de agrupamiento. El dendrograma se evaluó obteniendo el coeficiente de correlación cofenética con la prueba de
mantel, que produjo un valor r (CCCr). Los valores de bootstrap se dan en el nodo.

en cuatro bandas, lo que significa que hay una relación Susceptibilidad se observaron en S. intermedius aislados
entre ellos. Observamos que la susceptibilidad de la muestra de perro número 13. Finalmente, los
antimicrobiana también se compartía y difería con patrones de PFGE Ana-lyzed se agruparon en 7 y 12
respecto a aminoglyco-Side (gentamcin). Dos clústeres con patrones diferentes para las cepas S. Pseudintermedius y
el mismo patrón de S. intermedius, respectivamente.
Please cite this article in press as: Velázquez-Guadarrama N, et al. Presence of environmental coagulase-positive
staphylococci, their clonal relationship, resistance factors and ability to form biofilm. Rev Argent Microbiol. 2016.
http://dx.doi.org/10.1016/j.ram.2016.08.006
+Model
RAM-136; No. of Pages 9 ARTICLE IN PRESS
Estafilococos ambientales coagulasa positivos
Discusion
Varios estudios han reportado la circulación de policías entre las
mascotas y sus owners9, 27. S. aureus es la especie que tiene el
mayor impacto en la salud humana; sin embargo, otras especies
de CoPS pueden tener un impacto importante, como la
S. intermedius Group, incluidos S. intermedius, S. pseud-
intermedius y S. delphini, que están estrechamente related7. En
general, S. intermedius fue considerado como el estafilococos
pre-dominante en perros; sin embargo, la evidencia reciente ha
demostrado que todos o la mayoría de los aislados de perros y
gatos identificados anteriormente como S. intermedius son
realmente S. pseudintermedius1. En este estudio, la
secuenciación de genes de 16S rDNA se realizó para identificar y
diferenciar las especies debido a los problemas derivados del uso
de pruebas bioquímicas convencionales que han conducido a
reportar incorrectamente todos los aislados como S. aureus. Se
observaron resultados similares en un estudio en humanos con
mordeduras de perro, donde las infecciones de S.
Pseudintermedius fueron diagnosticadas incorrectamente como S.
aureus3.
S. Pseudintermedius y S. intermedius son agentes patógenos
oportunos notificados en la piel de los perros y también se han
notificado ocasionalmente en infecciones zoonóticas graves en
humans11. En general, el Pioderma o las infecciones cutáneas son
elementos comunes en la práctica médica en perros y gatos. En
esta obra, S. Pseudintermedius y S. intermedius fueron aislados
de perros, gatos, pájaros y el aire, pero no de los humanos. Esto
demuestra que S. intermedius y
S. Pseudintermedius son miembros de la flora normal de los gatos
y los perros, que es la razón por la cual estas bacterias se
reportan com-monly en un gran número de condiciones clínicas en
animals2.
En todo el mundo, ha habido crecientes informes de la aparición
de bacterias resistentes a múltiples Antibi-ótica. En la práctica
médica en los seres humanos, los organismos reguladores se han
establecido con respecto al uso de antibióticos para con-trol o
reducir este problema. Sin embargo, en la agricultura y el
ganado, no hay regulaciones. La falta de regulación de los
antibióticos de amplio espectro en la clínica veterinaria añade
presión de selección sobre las bacterias normales de la flora, y les
permite volverse resistentes a múltiples antibióticos. Los
resultados obtenidos en este estudio confirmaron las mencionadas
averiguaciones: se observó que diferentes cepas identificadas
como S. Pseudintermedius eran resistentes a múltiples
antibióticos en el 90% de la población del estudio. Por el
contrario, S. aureus ISO-lates eran sensibles a múltiples
antibióticos en más de 90% de la población del estudio.
Sorprendentemente, las cepas de S. pseudin-termedius mostraron
una sensibilidad del 100% a la tetraciclina, y S. aureus fue un 58%
resistente a la penicilina. En un estudio, S. pseud-intermedius
aislado de diversas enfermedades en gatos mostraron mayor que
90% resistencia a los antibióticos probados, incluir-Ing
tetracycline10. Además, el análisis de perfil clonal de PFGE es
discriminativo y muy sensible a la microvariación que existe en
una colección de cepas; mientras tanto, las secuencias de tipo
están diseñadas para rastrear clones o líneas clonales de
poblaciones bacterianas. Los datos comunicados por Vigo et
al., 201528, mostraron la gran variabilidad de una
colección de cepas de S. Pseudintermedius aisladas de
procesos infecciosos en perros. Observaron 27 tipos
clonales diferentes de 28 aislados. Por nuestra parte,
hemos observado que cada animal o sur-cara analizada
tiene su propio clon de S. Pseudintermedius o
S. intermedius, y el mismo animal podría ser colonizado
por
Please cite this article in press as: Velázquez-Guadarrama N, et al. Presence of environmental coagulase-positive
staphylococci, their clonal relationship, resistance factors and ability to form biofilm. Rev Argent Microbiol. 2016.
http://dx.doi.org/10.1016/j.ram.2016.08.006
7
Clones diferentes. También observamos coeficientes de similitud
de más del 80%, entre el gato y el perro o el gato y la superficie,
presup-posando una relación entre ellos. Sin embargo, una
limitación de este trabajo no es conocer la secuencia de tipo de
nuestras cepas, que se compara con los reportados en otras
partes del mundo. Un ejemplo de esto, es el trabajo de Perreten
et al., 201010, 18, quien reportó dos clones dispersos
geográficamente distantes de S. Pseudintermedius: clon ST71-J-
T02-II-III en Europa y clon ST68-C-T06-V en Norteamérica. Ambos
clones fueron aislados de diversas condiciones clínicas, incluyendo
animales sanos. El clon de ST71 fue reportado como un alto
productor de biofilm y multidrug-resistant9, 17, características
también mostradas por nuestras cepas de S. pseudintemedius.
Estas características son relevantes y no están presentes en el
S. intermedius cepas en este trabajo. La formación de biofilm es
un factor de virulencia muy importante y es una característica
muy variable entre las especies de Staphylococcus. Sin embargo,
la capacidad de formación de biofilm no se ha caracterizado por
completo en S. Pseudintermedius. Los estudios realizados por
Zhou et al., 201331 y Pinheiro et al., 201419 mostraron una
asociación entre el biofilm y la presencia del gen mecA y el
operón ICA ADBC y nuestras cepas de S. pseudintemedius eran las
únicas donde se identificó el gen mecA. Además, la resistencia a
la MUL-tidrug también está asociada con el biofilm, ya que se ha
reconocido que los antibióticos tienen una diffu-Sión limitada,
actuando sólo sobre la superficie bacteriana, y además, los
antibióticos pueden reaccionar con otros componentes de la
matriz de biofilm.
El objetivo principal de este estudio fue identificar posibles
fuentes de contaminación ambiental por bacterias patógenas
oportunistas en los seres humanos o sus mascotas. También es
NEC-ajustes considerar que los microorganismos multirresistentes,
como S. Pseudintermedius, sobreviven en diferentes ambientes a
través de la formación de biofilm y la resistencia a múltiples
fármacos, características que pueden transmitirse
horizontalmente a otros bacterias y exacerban el problema de la
resistencia a los antibióticos en los seres humanos.
Las divulgaciones éticas
Protección de sujetos humanos y animales. Los autores
declaran que no se realizaron experimentos en humanos o
animales para este estudio.
Confidencialidad de los datos. Los autores declaran que no
aparecen datos de pacientes en este artículo.
Derecho a la privacidad y consentimiento informado. Los
autores declaran que no aparecen datos de pacientes en
este artículo.
Las contribuciones de los autores
ES, LM, ME participó en el diseño del estudio, condujo el
procesamiento y análisis de muestras en el laboratorio,
Ana-lyzed los datos, y ayudó a redactar el manuscrito.
ALO, RO contribuyó a la escritura manuscrita. El NVG y el
IR contribuyeron a la conceptualización del estudio y la
escritura manuscrita. Todos los autores leen y aprueban el
manuscrito final.
+Model
RAM-136; No. of Pages 9 ARTICLE IN PRESS
8 N. Velázquez-Guadarrama et al.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Juan Carlos Vigueras Galindo la
revisión del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por
recursos federales (HIM/2013/009 SSA 1081) de la SSA.
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