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UNIVERSIDAD JOSE CARLOS MARIATEGUI

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AMBIENTAL


PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL

PRÁCTICA NO 1
NORMAS Y MEDIDAS DE SEGURIDAD PARA EL TRABAJO EN EL
LABORATORIO
INTRODUCCIÓN
El laboratorio es un ambiente donde los alumnos aprenden la parte práctica del
curso a través de experimentos necesarios y útiles para su desenvolvimiento
profesional realizando trabajos de investigación biológica para ello se requiere que
los alumnos aprendan las normas y medidas de seguridad para poder trabajar en
un laboratorio evitando de esta manera futuros accidentes que vayan en perjuicio
de la salud de los alumnos y del personal que labora en el laboratorio.
A continuación, detallo las normas y medidas de seguridad que deben tener en
cuenta los alumnos a la hora de ingresar al laboratorio:
1.-El ingreso al laboratorio es a la hora programada por el docente, se darán 5
minutos de tolerancia para que los alumnos puedan ingresar al laboratorio
pasado ese tiempo se cerrara la puerta.
2.-El ingreso al laboratorio es con mandil de mangas largas y de color blanco que
tape hasta la rodilla y con todos sus implementos de seguridad (gorra,
mascarilla, guantes descartables y en algunos casos lentes). Además los
alumnos también deben de portar un campo de 30x30cm con nombre bordado
para la limpieza de su zona de trabajo.
3.-No traer el mandil ni sus implementos de seguridad será motivo para que el
alumno no ingrese al laboratorio.
4.-Los alumnos deberán colocarse en los mesones en grupos de trabajo para la
realización de la práctica.
5.-las mochilas y otros materiales deberán ser colocadas en el mueble preparado
para ello. Solo llevar a los mesones su libreta de apuntes, su guía de prácticas
con la práctica anterior para su revisión y un lápiz o lapicero para apuntar las
indicaciones del docente.
6.-El ingreso se hará en silencio guardando compostura sin correr ni gritar.
7.-Ningún alumno podrá abandonar el laboratorio sin autorización del docente.
8.-Queda prohibido comer, fumar o beber en el laboratorio

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9.-En el momento del desarrollo de la práctica el alumno debe prestar atención a


las indicaciones del docente para que de esta manera no haya ningún accidente
en el transcurso de la práctica.
10.-Está prohibido que el alumno manipule los equipos sin la indicación del
docente para evitar que estos sean dañados.
11.- El alumno debe de trabajar con cuidado sin ensuciar el pozo de trabajo y sin
desperdiciar los reactivos proporcionados por el docente.
12.- No dejar las llaves del agua abierta para evitar que se desperdicie este líquido
elemento.
13.- Al terminar la práctica el alumno deberá limpiar su área de trabajo, dejándola
igual como la encontró.
14.- Al terminar la práctica el alumno deberá recoger su guía de práctica ya
revisada por el docente.
15.- El alumno debe entregar a la siguiente semana su guía de prácticas con el
tema que se realizó la semana anterior para su revisión y calificación.
OBJETIVOS:
 Establecer una disciplina de trabajo en los laboratorios de ingenierías
 Qué los alumnos conozcan las Normas y Medidas de seguridad para el
trabajo en el laboratorio.
 Lograr una eficiencia y eficacia en el empleo de los materiales y equipos del
laboratorio.
 Qué los alumnos conozcan los principales símbolos de peligrosidad.
MATERIALES:
PRODUCTOS QUIMICOS:
 Frasco de formaldehído
 Frasco de Metanol
 Frasco de ácido nítrico
 Frasco de hipoclorito de sodio
COLORANTES:
 Colorante azul de metileno
 Colorante Fucsina básica
 Batería de Gram
 Colorante Ziehl-Neelsen

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PROCEDIMIENTO
Colocar los productos químicos y los colorantes en los mesones e identificar cada
uno de ellos. Copiar en tu cuaderno el nombre del producto su fórmula, su estado,
su grado de peligrosidad y el símbolo que muestra el frasco.
RESULTADOS OBTENIDOS
Anotar los resultados y entregar el informe de prácticas en la siguiente sesión.
Nombre del Formula Estado de Grado de Símbolo
producto presentación peligrosidad

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CUESTIONARIO:
1.- ¿Qué precauciones debes tener al momento de trabajar con productos
inflamables?
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2.- Nombra 3 accidentes que pueden ocurrir en el laboratorio por no escuchar las
indicaciones del docente.
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3.- ¿Qué procedimientos debes hacer en caso de que alguien ingiera un producto
tóxico?
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4.- Da 2 ejemplos de sustancias corrosivas
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5.- Da 2 ejemplos de sustancias extremadamente inflamables
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PRÁCTICA NO 2
RECONOCIMIENTO DE LOS MATERIALES Y EQUIPOS DE
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
INTRODUCCIÓN
Para trabajar en el laboratorio se requiere del uso de una gran cantidad de
materiales y equipos que se encuentran presentes en el laboratorio como el uso
de material volumétrico pipetas, buretas, matraces, probetas etc. Material no
volumétrico como los tubos de ensayo, tubos de centrífuga, vasos de precipitado,
Matraces Erlenmeyer, Pipetas Pasteur, embudos, cristalizadores etc. Instrumentos
de análisis, Centrifugas, baño María, Autoclave, Estufa etc.
El conocimiento de estos materiales y equipos por los alumnos y personal que
trabaja en el laboratorio es fundamental para el buen desenvolvimiento de las
prácticas. El cuidado y protección de los mismos y su conservación en buen
estado permitirán un trabajo eficiente dentro del laboratorio.
OBJETIVOS:
 Al finalizar la práctica el alumno será capaz de identificar los materiales y
equipos más usados en el laboratorio.
 El alumno podrá manipular los materiales y equipos dándoles sus cuidados
específicos.
MATERIALES
Los materiales del Laboratorio son todos aquellos instrumentos que cumplen
funciones determinadas para la realización de las prácticas, trabajos de
investigación, experimentos especiales con animales, para la toma de muestras
biológicas, realizar pruebas bioquímicas, siembras de cultivos microbiológicos etc.
Los tipos de materiales a partir de los cuales están fabricados estos elementos son
muy variados, encontramos materiales de vidrio, de porcelana, metal, plástico,
madera, y de goma.

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CENTRÍFUGA
La centrífuga es un equipo de laboratorio que
genera movimientos de rotación, es utilizada en
cómo proceso de la separación de la
sedimentación de los componentes líquidos y
sólidos.

ESTUFA
La estufa en el laboratorio se usa para secar y
esterilizar. La esterilización se hace con calor
seco a 180oC durante dos horas

BAÑO MARÍA
El Baño María está conformado por un
recipiente lleno de agua caliente, se
utiliza para incubar muestras en agua a
una temperatura constante durante un
largo periodo de tiempo

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MICROSCOPIO
Es un instrumento que nos permite observar
microorganismos que no pueden ser vistos a
simple vista. Esto se logra mediante un sistema
óptico compuesto de lentes que forman y
amplifican la imagen del objeto que se está
observando

AUTOCLAVE
Sirve para esterilizar material de laboratorio,
utilizando vapor de agua a alta presión y
temperatura, el objetivo es coagular las
proteínas de los microorganismos debido a la
alta presión y temperatura con una temperatura
de 121 grados centígrados y a una presión de
15 a 20 minutos

BALANZA
Son instrumentos de laboratorio que
mide la masa de un cuerpo o sustancia
química utilizando la fuerza de gravedad
que actúa sobre el cuerpo indispensable
en operaciones químicas, analíticas y de
formulación en industrias y en
laboratorios de calidad.

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EQUIPO SOXHLET
Es utilizado para la extracción continua de
compuestos, su funcionamiento consiste en
hacer hervir en el matraz el disolvente con el
cual se va a extraer el compuesto. Los
vapores del disolvente ascienden por el
extractor y se condensan en el refrigerante
cayendo gota a gota sobre el cartucho. La
parte soluble pasa por gravedad al matraz

HORNO MUFLA
El horno mufla está destinado para la
cocción de materiales cerámicos y para
la fundición de metales a través de la
energía térmica, dentro del laboratorio se
utiliza para calcinación de sustancias,
secado de sustancias, fundición y
procesos de control.

BOMBA DE VACIO
Es un equipo diseñado para la extracción
de gases del interior de recipientes, redes
de tuberías o en cualquier proceso donde
se quiera reducir la presión interna de un
sistema a valores inferiores a la atmosfera

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PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS
Colocar los materiales y equipos utilizados para la práctica sobre los mesones,
copiar y dibujar en su cuaderno los nombres de cada uno de los materiales y
equipos presentados por el docente, anotar en su cuaderno las funciones de cada
uno de ellos y presentar el informe de la práctica en la siguiente sesión.

NOMBRE FUNCION DIBUJO

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CUESTIONARIO
1.- Defina Micropipeta
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2. ¿Qué materiales de laboratorio se pueden someter al calor sin que se
rompan?
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3.-Defina masa y qué diferencia hay entre masa y peso
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4.- ¿Cuál es la función del equipo autoclave?
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5.- ¿Cuál es la función del equipo Baño maría?
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PRÁCTICA NO 3
MICROSCOPÍA: ESTUDIO DE LAS PARTES, MANEJO DEL
MICROSCOPIO

INTRODUCCIÓN
El microscopio es un instrumento óptico, compuesto por unos lentes que están
encargados de ampliar las imágenes que se enfocan y que son muy pequeñas
para ser vistas por el ojo humano. El primero en observar a estos organismos fue
en Anton van Leeuwenhoek. Con el tiempo se han ido perfeccionando y ahora
tenemos diferentes tipos de microscopios como lo detallo a continuación:
Microscopio simple, compuesto, de fluorescencia, de luz ultra violeta, en campo
oscuro, petrográfico, de contraste de fase, de luz polarizada, confocal, electrónico,
electrónico de transmisión, electrónico de barrido, de iones de campo, de sonda
de barrido, de fuerza atómica, de efecto túnel, virtual y antimateria.
Con la invención del microscopio, la observación de los primeros organismos y su
información obtenida gracias al empleo del microscopio permitió que otras ciencias
y disciplinas avancen notablemente en el hallazgo de curas a afecciones y también
en las mejoras de la salud.
PARTES EL MICROSCOPIO
1.- Los Oculares: Son dos binoculares donde posamos los ojos y su función es la
de ampliar la imagen de los objetivos. Son ajustables para mejor comodidad del
observador.
2.- Los objetivos: Son los lentes que están más cerca de la muestra, son de
diferentes medidas de 4x, 10x, 40x y 100x (El objetivo de 100x solo se utiliza con
aceite de inmersión). Estos lentes nos permiten ver con claridad las muestras
biológicas vistas al microscopio.
3.- Condensador: Es el lente que concentra la luz para una mejor visibilidad de las
muestras.
4.- El diafragma: Regula la cantidad de luz que entra al condensador.
5.- Foco: Fuente de luz que dirige los rayos hacia el condensador.
6.-Soporte: Es a base del microscopio, sobre él se arma el equipo.

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7.- Platina: Lugar donde se coloca la muestra. La platina presenta dos dispositivos
el primero mueve la platina hacia adelante y hacia atrás y el otro dispositivo mueve
la platina hacia la izquierda y hacia la derecha permitiendo de esta manera
acomodar la muestra en el haz de luz para una mejor observación de la muestra
en estudio.
8.- Cabezal: Contiene los sistemas de oculares.
9.- Revolver: Es donde se alojan los objetivos y estos pueden ser de 4x, 10x, 40x,
y de 100x
10.- Macrométrico: Tornillo de enfoque para acercamiento y alejamiento rápido. Se
usan para los aumentos de 4x y 10x
11.- Micrométrico: Tornillo de enfoque para acercamiento y alejamiento sutil.
Permite observar mejor la muestra en estudio. Se usan para los aumentos de 45x
y 100x

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OBJETIVOS
 El objetivo de esta práctica es que el alumno aprenda a usar correctamente
el microscopio, sus partes y su funcionamiento.
 Realizar preparados con muestras biológicas y llevarlas a observación al
microscopio
 Identificar bacterias, protozoarios y diferentes tejidos de plantas y animales
MATERIALES
 Muestras Biológicas: Catáfilo de la cebolla, hoja de geranio, agua de río
estancada, sarro dental.
EQUIPO
 Microscopio
PROCEDIMIENTO
1.- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DEL CATÁFILO DE LA CEBOLLA
Cortar la cebolla en dos partes, sacar la capa delgada y traslucida de la parte
interna de la cascara de la cebolla, cortar un pequeño cuadradito y colocarlo en el
centro del portaobjetos, agregar un agota de agua destilada y una gotita de azul
de metileno, colocarle el cubreobjetos en un ángulo de 45o limpiar la base del
portaobjeto con su campo con mucho cuidado y llevar a observación al
microscopio con el objetivo de 10 y 40 x. Dibujar y anotar las observaciones en su
cuaderno.
2.- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE LA HOJA DE GERANIO
Hacer una incisión en el envés de la hoja de geranio, y extraer una delgada capa
traslúcida de tejido la cual se pondrá en el portaobjetos con una gota de agua
destilada, se colocará el cubreobjetos en un ángulo de 45 o y llevar a observación
al microscopio con el objetivo de 10 y 40 x. Dibujar y anotar las observaciones en
su cuaderno.
3.- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE AGUA DE RÍO ESTANCADA
Colocar en el centro del portaobjetos una gota de agua de río, colocar el
cubreobjetos en un ángulo de 45o y llevar a observación al microscopio con el
objetivo de 10 y 40 x. Dibujar y anotar las observaciones en su cuaderno.
4.- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE SARRO DENTAL
Agregar una gota de agua destilada en el centro del portaobjetos. Hacer un
raspado con un palillo dental sin lastimarse, extraer un poco de sarro dental y

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Colocar la muestra en el agua destilada, hacer un ligero movimiento con el palillo


para que la muestra se homogenice. Agregar una gota de Azul de metileno,
colocar el cubreobjetos en un ángulo de 45o y llevar a observación al microscopio
con el objetivo de 10 y 40 x. Dibujar y anotar las observaciones en su cuaderno.
RESULTADOS
1.- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DEL CATÁFILO DE LA CEBOLLA

10X 40X
Interpretación de los resultados:
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2.- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE LA HOJA DE GERANIO

10X 40X
Interpretación de los resultados:
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3.- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE AGUA DE RÍO ESTANCADA

10X 40X
Interpretación de los resultados:
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4.- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE SARRO DENTAL

40X 100X
Interpretación de los resultados:
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CUESTIONARIO
1.- ¿Cuáles son los principales cuidados que se deben tener en cuenta en el uso
del microscopio?
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2.- ¿Qué ocurre si bajo el condensador del microscopio al observar una
preparación?
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3.- ¿Cuántos objetivos tiene el microscopio que está utilizando?
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4.- ¿Qué tipos de bacterias observas en la muestra de sarro dental?
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5.- ¿Para qué sirve el aceite de inmersión?
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PRÁCTICA NO 4
EXAMEN EN FRESCO Y COLORACIONES SIMPLES

INTRODUCCIÓN
La preparación en fresco es uno de los procedimientos más simples para poder
observar microorganismos vivos y en movimiento, basta con echar una gota de
muestra fresca y llevar a observación al microscopio.
La técnica consiste en saber dejar una gota de agua en el centro del porta y colocar
el cubre sobre él. Para colocar el cubre primero colocamos un lado del cubre sobre
la gota a unos 45º respecto al portaobjetos y lo dejamos caer. Éste, por capilaridad
hará que la gota de agua se expanda por toda la superficie entre el porta y el
cubreobjetos.
Para hacerlo en el portaobjetos esmerilado necesitamos una técnica un poco más
cuidadosa. Primeramente, colocamos una gota de la muestra sobre el
cubreobjetos, a continuación, mojamos con agua destilada los lados del círculo
excavado por donde va a tocar el cubre y colocamos el cubreobjetos sobre la zona
excavada del porta. Se nos tiene que quedar una gota suspendida entre el cubre
y el portaobjetos. De ahí proviene el nombre de “gota pendiente”.

Las coloraciones se utilizan para visualizar la morfología. Las coloraciones simples


utilizan un solo colorante (Azul de Metileno, Azul de Lactofenol, Violeta de
Genciana). Ya que los microorganismos se caracterizan por tener tamaños muy
pequeños. La dimensión de una bacteria se calcula en unidades de micrómetro
(1um=0.001).
Las bacterias tienen tres tipos de formas: Esféricas o cocos, alargadas o bacilos y
espirilos o espiroquetas. Cuando observamos en el microscopio dos cocos juntos
se denominan diplococos, si están en cadena se llaman estreptococos y si están
en racimos estafilococos. Estas características morfológicas son la base principal
para su sistematización morfológica.
Los hongos pueden presentar forma redondeada como la levadura o forma
filamentosa como los mohos. En cuanto a los virus su forma es muy pequeña solo
pueden ser visualizados por un microscopio electrónico ya que tienen un tamaño
menor de 300 nanómetros

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OBJETIVOS:
 Describir las características morfológicas y de locomoción de
microorganismos que se encuentran en muestras naturales.
 Utilizar colorantes para visualizar mejor la forma de las bacterias
 Realizar frotis fijos y tinciones simples.
MATERIALES Y EQUIPOS:
 Muestra de sarro dental
 Palillos para extraer la muestra
 Agua destilada.
 Portaobjetos.
 Cubre objetos
 Mechero
 Microscopio óptico.

PROCEDIMIENTO:
MUESTRA EN FRESCO DE SARRO DENTAL
 Sacar muestra de sarro dental de su compañero con un palillo con cuidado
sin lastimarlo.
 Extender la muestra en el centro del porta objetos agregar una gota de agua
destilada. Cubrir la muestra con un cubreobjetos en un ángulo de 45o
 Llevar la preparación a observación al microscopio.
 Enfocar con el objetivo de 4x y observar con los objetivos de 10x, y 40x
 Anota los resultados en tu cuaderno.
MUESTRA COLOREADA DE SARRO DENTAL
 Extraer muestra de sarro dental, colocar la muestra en el centro del
portaobjetos extendiendo la muestra.
 Pasar el porta objetos con la muestra por el mechero para fijar la muestra
(tres veces), hacerlo con cuidado sin quemar la muestra,
 Agregar una gota de azul de metileno y dejar reposar por un minuto.
 Pasado ese tiempo lavar a chorro suave, colocar el cubreobjetos en un
ángulo de 45o y llevar a observación al microscopio.
 Enfocar con el objetivo de 4x y observar con los objetivos de 10x, y 40x
 Anota los resultados en tu cuaderno

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RESULTADOS:
MUESTRA EN FRESCO DE SARRO DENTAL

10X 40X
Interpretación de los resultados:
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MUESTRA COLOREADA DE SARRO DENTAL

10X 40X
Interpretación de los resultados:
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CUESTIONARIO:
1.- Explique cómo se realizan una preparación en fresco y una en gota pendiente
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2.- ¿Cuál es la finalidad de teñir una muestra?

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3.- Defina los siguientes términos: colorante ácido, colorante básico y mordiente.

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4-. Nombre los diferentes tipos de formas que presentan las bacterias

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5.- En que consiste la tinción negativa

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Técnica de la gota pendiente

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PRÁCTICA NO 5
TINCIÓN DIFERENCIAL
(TINCIÓN DE GRAM)

INTRODUCCIÓN
Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en
la aplicación de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso
intermedio que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o
entre determinadas células dentro de una población.

La diferenciación puede ser provocada por un agente químico o físico, permitiendo


observar dos tipos de respuestas diferentes a la tinción en una misma muestra.
Las dos tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología son la tinción de
Gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia.
TINCIÓN DE GRAM
La técnica de coloración de Gram, es una de las tinciones de más uso en
bacteriología. Es de gran utilidad, ya que permite diferenciar las bacterias en Gram
positivas y Gram negativas. Casi la mitad de las bacterias, son Gram positivas y el
resto Gram negativas. El método fue descubierto por Christian Gram (Danés), en
1884, quien observó que en cortes histológicos que contenían bacterias
coloreadas con violeta de genciana y tratadas con solución acuosa de yodo, con
el empleo de alcohol este colorante podría ser removido del corte histológico, pero
no de las bacterias. Posteriormente descubrió que no todas las bacterias retenían
al violeta de genciana, sino que algunas eran decoloradas por acción del alcohol.
A las primeras las llamó Gram positivas y a las segundas Gram negativas. Éstas
que quedan incoloras son teñidas luego mediante el empleo de un colorante de
contraste como la safranina, para hacer posible su observación.

Hay bacterias cuya composición las sitúa en el límite entre Gram positivas y Gram
negativas y por lo tanto reaccionan de maneras diferentes, por lo cual se
denominan Gram variables, pero su verdadero carácter de Gram puede
establecerse en cultivos muy jóvenes obtenidos en medios específicos como agar
sangre y controlando cuidadosamente todas las condiciones incluyendo, desde
luego, los detalles de la manipulación.

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Finalmente, los factores que afectan a la pared celular como el envejecimiento o


el daño físico, alteran el Gram de las bacterias positivas lo mismo que el medio
ácido.
OBJETIVO:
 Distinguir las bacterias Gram positivas de las Gram negativas
MATERIALES Y EQUIPOS:
 Muestra de sarro dental
 Palillos para extraer la muestra
 Agua destilada.
 Portaobjetos.
 Cubre objetos
 Mechero
 Microscopio óptico.

PROCEDIMIENTO:
1. Preparar un frotis y fijar a la llama
2. Cubrir la preparación con cristal violeta y dejar actuar el colorante durante 1
minuto. Lavar con abundante agua del grifo.

3. Cubrir la preparación con lugol y dejarlo actuar durante 1 minuto lavar el


exceso del lugol con abundante agua de grifo

4. Decolorar con alcohol al 95 ó 96%, aproximadamente 10 segundos o hasta


Que la muestra este transparente.
7. Lavar con agua corriente.
8. Añadir el colorante de contraste (safranina) y dejar actuar por 1 minuto. Lavar
el exceso del colorante

9. Secar la preparación al aire o colocándola entre 2 capas de papel absorbente.


11. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación y observar al
Microscopio con objetivo de 100x utilizando aceite de inmersión.

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RESULTADOS:
1.- Preparación de la tinción diferencial de Gram

100x

Interpretación de los resultados:


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CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el fundamento de la tinción diferencial de Gram?

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2. Explicar la función que desempeñan el lugol y el alcohol en esta coloración.

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3. Escribir el nombre científico (género y especie), de 5 bacterias Gram positivas


y Gram negativas.

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4. Describir la técnica de otra tinción diferencial.

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5. Diferencias entre una bacteria Gram positiva y una Gram negativa

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Representación esquemática del procedimiento de la tinción de Gram.

Tinción de Gram de Bacillus cereus


(bacilos gram positivos). Microcopia de
campo claro (100x)

Tinción de Gram de Escherichia coli (bacilos


gram negativos). Microscopía de campo claro
(100x).

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PRÁCTICA NO 6
TINCION ACIDO ALCOHOL- RESISTENTE
Método De Ziehl-Neelsen

INTRODUCCIÓN
Procedimiento de tinción diferencial, que tiene gran relevancia por su aplicación
clínica. Permite distinguir aquellos microorganismos cuya coloración resiste la
acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol resistente) de otros que no
resisten la decoloración (no ácido-alcohol resistente).
Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes
patógenos: Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae,
microorganismos responsables de la tuberculosis y la lepra respectivamente.
Estas bacterias pertenecen al Phyllum Actinobacteria, un grupo grande y complejo
de bacterias gram positivas, que incluye a la Familia Mycobacteriaceae
caracterizada por contener en sus paredes celulares un alto contenido lipídico,
ceras con una gran diversidad de ácidos micólicos, moléculas de 60 a 90 átomos
de carbono. La presencia de estos lípidos, en la cara externa de la pared, hacen
que estas bacterias sean muy resistentes a la acción de compuestos químicos
presentes en su entorno, característica que se utiliza para aislar estos
microorganismos: uno de los medios más frecuentes es el Loewenstein-Jensen
con verde malaquita que permite el crecimiento selectivo de estos
microorganismos.
OBJETIVO:
 Diferenciar las bacterias ácido-alcohol resistente (AAR) de las que no lo
son. Usando, para ello, la tinción diferencial de Ziehl-Neelsen.
MATERIALES Y EQUIPOS:
 Papel de filtro.
 Portaobjetos.
 Asa de siembra.
 Mechero Bunsen.
 Mechero.
 Gradilla.
 Puente de tinción.
 Pipeta Pasteur.
 Frasco lavador.

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 Torunda.
 Vaso de precipitado.
 Microscopio.
 Aceite de inmersión.
 Suero salino.
 Alcohol.
 Muestra de Mycobacterium.
 Fucsina básica
 Alcohol ácido.
 Azul de metileno
PROCEDIMIENTO
1. Preparar todo el material necesario en la mesa de trabajo.
2. Encender el mechero Bunsen justo antes de empezar con la práctica.
3. Coger un portaobjetos y poner una gota de suero salino en el centro.
Esterilizar el asa de siembra por flameado. Abrir la placa de Petri, antes de
tomar un poco de muestra de la placa de Petri, enfriar en un lateral del
medio de cultivo donde no haya microorganismos en la placa, tomar un
poco de muestra, cerrar la placa de Peri y depositar la muestra en el
portaobjetos. Homogeneizar la muestra. Esterilizar el asa de siembra por
flameado y dejarla en la gradilla.
4. Fijar la muestra por calor con la ayuda del mechero Bunsen. Aplicar calor
hasta que la muestra esté seca. Apagar el mechero Bunsen.
5. Poner la muestra en el puente de tinción y preparar todas las tinciones.
6. Aplicar Fucsina fenicada sobre la muestra con una pipeta Pasteur, cubrirla
por completo. Llenar un vaso de precipitado con alcohol e impregnar la
torunda con alcohol y encenderla. aplicar calor a la muestra con la torunda,
cuando veamos salir vapor dejar de aplicar calor, si vemos que se evapora
el colorante, volver a rellenar con el colorante y dejar actuar durante 5
minutos.
7. Escurrir la muestra y aclarar con agua destilada.
8. Poner alcohol-clorhídrico sobre la muestra durante 2 min. Escurrir y lavar.
9. Aplicar azul de metileno sobre la muestra durante 2 minutos y escurrir y
lavar la muestra.
10. Dejar secar al aire o con la ayuda del secador.
11. Visualizar con el microscopio óptico con el objetivo de inmersión.

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RESULTADOS:
1.- Preparación de la tinción diferencial de Ziehl-Neelsen.

100x
Interpretación de los resultados:
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CUESTIONARIO
1. ¿Qué papel cumple el colorante fucsina básica en la coloración Ziehl-Neelsen.
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2. ¿Qué especies de Mycobacterium son los causantes de la tuberculosis?
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3. ¿Qué especie de Mycobacterium es el responsable de la lepra
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4. ¿Qué función tiene el alcohol en la técnica de tinción?


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5. Para que me sirve la tinción de ácido-alcohol resistente
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Procedimiento de la tinción acido-alcohol resistencia.

Tinción de ácido-alcohol resistencia


(Ziehl-Neelsen) de Mycobacterium phlei.
Las flechas señalan estos bacilos ácido-
alcohol resistentes teñidos de rojo.
Microscopía de campo claro (100x).

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PRÁCTICA NO 7
ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO Y CALOR HÚMEDO
INTRODUCCIÓN
Hay diferentes métodos físicos de esterilización y de inhibición del crecimiento
microbiano como pueden ser el calor, la filtración y la radiación, de todos ellos el
más usado es el calor ya sea húmedo o seco el cual tiene diferente penetrabilidad.
A medida que la temperatura aumenta por encima de la temperatura del
crecimiento bacteriano se produce la muerte de las bacterias por el calor húmedo
La muerte de las bacterias por el calor húmedo es consecuencia de la
desnaturalización de sus proteínas, en tanto que en una atmósfera seca se debe
a la oxidación de los constituyentes de la célula.
Los enlaces intracelulares e intermoleculares (puentes de hidrógeno), de las
proteínas de los cuales depende su funcionalidad, son más lábiles cuando las
proteínas están hidratadas que cuando no lo están, de tal manera que el "calor
húmedo" es más efectivo en la desnaturalización de enzimas y otros componentes
proteínicos importantes para la célula que el "calor seco".

Es por eso que se dice que el calor húmedo tiene mayor "penetrabilidad" que el
calor seco.

El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal


bacteriano y se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y substancias,
con el propósito de matar a las bacterias que ellos contengan.

Este proceso se llama "esterilización" y al material, cultivo o medio de cultivo


sometido a éste, se le denomina entonces "estéril", es decir, desprovisto de toda
forma viviente.

OBJETIVO
 Diferencia entre el efecto del calor seco y calor húmedo en la esterilización
bacteriana

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MATERIALES Y EQUIPOS:
 02 tubos de ensayo conteniendo material contaminado
 02 tubos de ensayo con agar estéril
 Gradillas para los tubos
 Vaso de precipitados para colocar los tubos rotulados
 Mechero Bunsen
 Cerillos o encendedor
 Asa bacteriológica
 Autoclave
 Horno de calor seco
 Masking tape
PROCEDIMIENTO:
1. Colocar en ambos tubos un hisopo con muestra contaminada, luego escribir
en uno la palabra estufa y al otro la palabra autoclave, anotar el nombre del
alumno para su identificación.
2. Colocar un tubo en la estufa y otro tubo en el autoclave a temperatura de
121oC a 15 minutos, pasado este tiempo sacar los tubos y añadir agar
nutritivo estéril. Incubar a 37oC por 24 – 48 horas.
3. Pasado este tiempo observar los tubos si ha hubo crecimiento o no de algún
microorganismo.
4. Anotar los resultados en tu cuaderno
MANEJO DEL AUTOCLAVE:

1. Verificar que haya un buen nivel de agua en el equipo de autoclave. De lo


contrario agregar agua hasta que llegue a la parrilla inferior.
2. Colocar el material que se va a esterilizar en las rejillas del equipo de tal forma
que quede bien colocado, cerrar la puerta ajustándola bien. La tapa debe quedar
herméticamente cerrado.
3 Luego abrir la válvula de salida del vapor y encender el equipo.

4. A medida que van pasando los minuto la temperatura del agua va a ir elevando
(ver el termómetro), empezará a salir una mezcla de vapor-aire por la válvula de
salida de vapor, dejar que escape esta mezcla hasta que sólo salga un flujo
continuo de vapor y el aire haya sido eliminado; a ésto se le llama purgar el
autoclave.

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5. Una vez que se ha purgado el autoclave, cerrar la válvula de salida de vapor y


dejar que la presión suba hasta 15 libras por pulgada cuadrada hasta llegar a una
temperatura de 121oC. En este momento se empieza a contar el tiempo.

7. Transcurridos los 15 minutos a 15 libras de presión, apagar el equipo y dejar


que el autoclave se enfríe (por ningún motivo abrir la válvula de salida de vapor)
hasta que la presión haya bajado a o libras de lo contrario podría ocurrir un
accidente.
8. Una vez frio el autoclave sacar el material de trabajo estéril, tapar con cuidado
el autoclave y dejarlo tal como lo encontró.

NOTA: La eliminación de los microorganismos patógenos es debido a la elevada


temperatura que alcanza el vapor de agua cuando se somete a presión en el
equipo.
MANEJO DE LA ESTUFA (CALOR SECO)
1. Encender el equipo y con el uso del termostato elevar a temperatura hasta
121oC y mantenerlo constante.
2. Introducir el material de laboratorio que se va esterilizar en orden, cerrar la
puerta
3. Esterilizar a 121oC por 15 minutos.
4. Pasado este tiempo abrir la estufa, sacar el material esterilizado. Si todavía
está caliente usar guantes de protectores para evitar quemarse.
CUESTIONARIO:
1. Describa las diferencias entre un equipo autoclave y una Estufa
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2. ¿Qué tipo de material se puede esterilizar en el horno de calor seco y en el
equipo autoclave? Dar ejemplos
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3. ¿Cuál es la temperatura y el tiempo que se requiere para lograr la
esterilización en la estufa?
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4. ¿En qué consiste el método de Pasteurización?
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5. Defina esterilización
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Autoclave Estufa

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PRÁCTICA NO 8
MEDIOS DE CULTIVOS
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en
condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una
amplia gama de nichos ecológicos. Entre los requerimientos nutricionales para su
desarrollo están el carbono, oxigeno, nitrógeno, dióxido de carbono e hidrogeno.
Sin embargo, muchas bacterias necesitan otros requerimientos nutricionales como
suero, sangre y extracto de levadura entre otros
Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el
desarrollo y reproducción de los microorganismos que se van a sembrar bajo
condiciones de laboratorio. Estos medios de cultivo pueden ser: líquidos, sólidos o
semisólidos.
Clasificación de los medios de cultivos:
Los medios de cultivo pueden ser naturales y sintéticos
1.- Naturales: Están formados por sustancias naturales como la papa, leche,
huevos, sangre etc.
2.- Sintéticos: Formados por sustancias que son manipuladas por el hombre en el
laboratorio.
Estos a su vez se clasifican en:
A. Los que tienen composición química definida: Son preparados exclusivamente
con sustancias de composición química conocida.

B. Composición química indefinida: Aquellos que están hecho con sustancias


químicas cuyos componentes no pueden analizarse o es difícil de establecer su
composición

Caldo nutritivo:

Es el más usado en bacteriología, no es más que una infusión de carne magra (sin
grasa, tendones, aponeurosis, etc.). La carne puede ser de cualquier músculo
incluyendo el corazón. En ocasiones y con el objeto de que tenga más productos

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nutritivos, se le agregan infusiones de cerebro, hígado, etc., que contienen ciertos


factores nutritivos en mayor cantidad.

Caldos peptonados:

También son muy usados en los cuales la carne o leche es sometida a hidrólisis
ácida o enzimática, obteniéndose entonces péptidos y aún aminoácidos en
diversas proporciones incrementando de esta manera estos componentes que son
más fácilmente metabolizados.

Los caldos nutritivos pueden solidificarse con diversos agentes capaces de ser
convertidos de "sol" a "gel" y viceversa. Uno de los más usados es un polisacárido
complejo inatacable por las bacterias, muy higroscópico y que es extraído de
ciertas algas rojas que existen en el Océano Pacífico, Este producto se llama agar.
Una cantidad de 1.5 g agregados a 100 ml de caldo es suficiente para convertirlo
en una masa de consistencia gelatinosa, más bien dura. Para que el agar sea
disuelto necesita temperaturas de casi 100°C y al irse enfriando permanece en
esta forma de "sol" hasta los 40°C. Por debajo de esta temperatura se transforma
en una masa sólida ("gel") que es estable así por tiempo indefinido.

Cultivo semisólido:

Son aquellos medios líquidos a los que se adiciona agar en bajas concentraciones:
0.4 a 0.8%. Éstos son útiles para determinar la movilidad de los microorganismos.

Medios selectivos:

Estos medios han sido diseñados para inhibir el desarrollo de un grupo de


organismos, mientras que permiten el desarrollo de otro grupo proveniente de una
flora mixta. La inhibición puede deberse a la alteración del pH de un medio sólido,
También se pueden incluir en un medio sólido substancias inhibidoras que dejen
crecer ciertos tipos de bacterias, pero no otras, sensibles a tal agente, teniendo
entonces un medio que puede ser moderada o altamente selectivo.

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Medios enriquecidos

Son aquellos a los que se les pueden agregar substancias para enriquecerlo, como
por ejemplo gelosa nutritiva a la que se le agrega sangre, se denomina agar
sangre, el cual puede ser utilizado en el aislamiento de bacterias muy exigentes
en sus requerimientos nutricionales. Son ejemplos de medios enriquecidos: medio
de suero de Loeffler para bacilos diftéricos, medio de Lowenstein-Jensen, para
bacilos tuberculosos, caldo selenita cisteína y caldo tetrationato.

Medio diferencial.

Es aquel en el que se ha añadido alguna clase de indicador, generalmente un


colorante, que permite diferenciar entre distintas reacciones químicas que se
producen durante el crecimiento Ej. E.M.B. (eosina-azul de metileno), que se utiliza
para el aislamiento de enterobacterias Gram negativas. La presencia del azul de
metileno inhibe a las bacterias Gram positivas.

Medios de ensayo

Son aquellos útiles en la identificación y clasificación de los microorganismos de


acuerdo a sus actividades metabólicas particulares. Por ejemplo, agar con harina
de maíz para ayudar a identificar a Cándida albicans; leche con indicador para
observar la actividad proteolítica y fermentativa, así como la reducción del
indicador.

Medios deshidratados

Son los que se encuentran en el comercio en forma de polvos secos. La mayoría


de los medios comúnmente utilizados en microbiología son de este tipo. Estos
productos deshidratados se transforman fácilmente en medios de cultivo por
adición de agua y esterilización.

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MATERIALES

 Frasco de agar nutritivo


 02 Matraces Erlenmeyer de 250ml
 06 tubos de ensayo estériles
 06 caja de placa Petri estériles
 02 Vasos de precipitado
 Varilla de vidrio
 Cuchara de metal
 Papel aluminio
 Balanza
 Cocina eléctrica
 Autoclave
 Agua destilada
 Gasa y algodón

PROCEDIMIENTO

 Pesar las cantidades correspondientes para preparar 75ml de agar nutritivo,


disolver la cantidad pesada en el volumen correspondiente de agua
destilada, utilizar los matraces Erlenmeyer.
 El matraz con el agar colocarlo encima de una cocina a fuego suave para
que se termine de disolver y el agar no tenga ningún grumo y este
transparente, luego llevar a autoclavar el medio para que esté totalmente
estéril a 121oC por 15 minutos.
 Pasado este tiempo sacar con cuidado del autoclave los matraces
conteniendo el medio de cultivo y con ayuda de un guante de protección
verter 5 ml de agar estéril en los tubos de ensayo, taparlos con el tapón
formado con el algodón y la gasa. Dejar enfriar los tubos a temperatura
ambiente, inclinados de tal manera que cuando seque el agar este inclinado
y permita la siembra.

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 De igual forma verter agar estéril en las placas Petri, no llenarlos del todo
dejando un espacio para el desarrollo de los microorganismos. Dejar a
enfriar a temperatura ambiente.
 Una vez fríos los tubos y las cajas Petri proceder a hacer la siembra de los
microorganismos seleccionados.

RESULTADOS:

Esquematiza todo el procedimiento señalado para la preparación del medio del


cultivo

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CUESTIONARIO

1. ¿Porque es necesario preparar los medios de cultivo con agua destilada?

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2. ¿Cuál es la fórmula básica de los medios de cultivo?

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3. ¿Cómo se clasifican los cultivos según su forma física?

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4. Defina medio de cultivo agar sangre

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5. Defina Agar salado-manitol o Chapman

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PRÁCTICA NO 9
OBTENCION DE CULTIVOS PUROS
INTRODUCCIÓN
Técnica de aislamiento por agotamiento de estrías

Se trata de un método simple y rápido de agotamiento progresivo y continuo del


inoculo sobre un medio sólido, generalmente contenido en una placa de Petri. El
objeto es obtener a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido
de ellas distribuidas individualmente a lo largo de la superficie de la placa. Al
incubar esta, cada una de las bacterias originara una colonia. Las colonias
individuales constituyen cada una un cultivo puro.

Procedimiento:

1.-Esterilizar el asa flameándola en el mechero hasta conseguir un rojo


incandescente.

2.- Enfriar el asa en la proximidad de la llama. Tomar un inoculo de la muestra.

3.- Transferir el inoculo a un área pequeña de la superficie de la placa, próxima al


borde. Extender. Entender el inoculo formando estrías muy junta sobre la
superficie de una porción pequeña de la placa.

4.-flamear de nuevo el asa enfriarla. Tomando como inoculo el obtenido mediante


el rozamiento el asa de siembra con las estrías sembradas la primera vez, realizar
sobre una porción virgen de la placa una segunda tanda de estrías que no toque
la primera.

5.- Flamear y enfriar el asa. Repetir exactamente la operación descrita en el punto


4 pero empleando como inoculo la segunda tanda de estrías.

6.- Flamear y enfriar el asa. Repetir de nuevo el punto 4, pero empleando como
inoculo la tercera tanda de estrías. Las nuevas series de estrías no deben tocar
ninguna de las series anteriores.

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7.- Flamear el asa y tapar la placa Petri. Esta se incubará a temperatura adecuada
en posición invertida ya que, de otra manera, el agua de condensación que se iría
depositando sobre la superficie del agar impediría la obtención de colonias
aisladas.

Para realizar el agotamiento por estrías, la placa Petri puede mantenerse sobre la
mesa de trabajo en posición normal y levantando la tapa con la mano izquierda,
realizar las estrías con la derecha. Aun mejor, es posible hacerlo colocando la
placa en posición invertida sobre la mesa de trabajo y, tomando la parte que
contiene el medio de cultivo, levantarla hasta la altura de la llama del mechero. Allí,
con ella en posición casi vertical, realizar las sucesivas tandas de estrías.

Para realizar las estrías, oscile el asa de siembra sobre la superficie del agar
mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca. No haga más presión sobre
el agar que la debida al propio peso del asa y su mango.

Aislamiento por agotamiento de estrías

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Método de aislamiento en placa por diluciones sucesivas

Este método consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en


condiciones de esterilidad con objeto de sembrar después cantidades conocidas
de las mismas en una serie paralela de placas Petri. Evidentemente, alguna de las
diluciones será tal que al distribuir una parte de ella en la placa, originara colonias
separadas. Conocidos el número de colonias, la cantidad sembrada y la dilución
correspondiente, esta técnica permite evaluar el número de gérmenes viables en
la muestra original.

Material:

Pipetas estériles, Suero salino estéril, Tubos estériles, gradilla y muestra

Procedimiento:

Coloque el material enfrente suyo sobre la mesa de trabajo de tal forma que pueda
alcanzarlo fácilmente, encienda el mechero y proceda del modo siguiente:

1.-Tome una pipeta estéril de 10ml sin tocar con las manos más que el extremo
que se ha de llevar a la boca. Flamear ligeramente la punta, abrir el recipiente que
contiene el suero salino estéril, flamear la boca del mismo y tomar 9.0ml de su
contenido. Flamear de nuevo la boca del recipiente y taponarlo.

2.-Transferir los 9.0ml a uno de los tubos estériles, flameando la boca del tubo
después de retirar el tapón y antes de volverlo a colocar. Recuerde que los tapones
han de mantenerse en la mano y no dejarse sobre la mesa durante la operación.
No deje tampoco la pipeta sobre la mesa al finalizar y evite que su punta toque
algún objeto. Trabaje siempre en la proximidad de la llama.

3.-Con la misma pipeta transferir d nuevo 9.0 ml de suero salino estéril a otro tubo
siguiendo las instrucciones 1 y 2

4.- repetir 3 tantas veces sea necesario.

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4.- Con una pipeta estéril, tomar 1 ml de muestra original y transferirlos al primero
de los 5 tubos con 9.0 ml de suero estéril, marcar el tubo con 1/10.

6.- Agitar el tubo con la primera dilución haciéndola girar entre las palmas de las
manos y con una nueva pipeta estéril, transferir 1ml de esta primera dilución al
segundo tubo con 9.0 de suero salino. Desechar la pipeta y agitar el tubo. Marcarlo
1/100

7 repetir 6 tantas veces como sea necesario.

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PRÁCTICA NO 10
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE UN CULTIVO MIXTO
Y OBTENCIÓN DE UN CULTIVO AXÉNICO

INTRODUCCIÓN
Si se toma un asa bacteriológica cargada con una muestra que contenga bacterias
y se van haciendo estrías de ésta sobre una placa de agar nutritivo de tal manera
que el material se vaya "diluyendo" sobre la superficie, llegará un momento en que
las bacterias depositadas en la estría estén bien separadas unas de otras,
reproduciéndose cada una en progresión geométrica (1, 2, 4, 8, 16, 32, ·64, etc.).
Dependiendo del tiempo de generación, que varía según la especie bacteriana,
después de cierto tiempo, cada una se habrá multiplicado muchas veces,
formando sobre la superficie del medio un pequeño promontorio constituido por
células bacterianas llamado "colonia", que se obtiene generalmente en unas 24-
48 horas.
Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamaño, color,
Consistencia etc., y pueden ser diferenciadas sobre estas bases. Cada colonia
aislada está constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se supone que es la
descendencia de una sola célula y por tanto, un cultivo puro. Para estudiar las
características físicas, químicas, fisiológicas, etc., de una bacteria, se necesita que
ésta sea aislada en cultivo puro y el aislamiento en caja de Petri es el primer paso
para ello, siendo el segundo paso la siembra de una porción de una colonia en un
medio de cultivo en tubo, verificando su pureza después de la incubación
apropiada, mediante observación al microscopio.
La morfología de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto y debe
Familiarizarse el alumno con ella. La terminología mencionada a
Continuación sobre algunas de las características más constantes de una colonia
Bacteriana es muy útil:

FORMA:
Puntiforme, circular, irregular, alargada, filamentosa, rizoide, etc.

TAMAÑO:
Estimar el diámetro en mm.

SUPERFICIE:
Lisa, rugosa, cerebrifome, en anillos concéntricos, etc.

ELEVACIÓN:
Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, etc.

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BORDE:
Entero o continuo, ondulado, lobulado, festoneado, filamentoso, etc.

ESTRUCTURA INTERNA:
Amorfa o granulosa.

COLOR:
Según sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de
Color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.

OPACIDAD:
Transparente, opaca, etc.

CONSISTENCIA:
Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Usar el asa bacteriológica
Para determinar la consistencia.

OBJETIVO:

 Aislar dos microorganismos por la técnica de siembra de dilución por


estría en placa de agar y obtener un cultivo axénico o puro.

MATERIAL Y SUBSTANCIAS:

 Caja de Petri conteniendo agar nutritivo estéril


 2 Tubos de ensayo conteniendo agar inclinado
 Tubos de ensayo conteniendo cultivo mixto
 Lápiz graso
 Asa bacteriológica
 Mechero Bunsen
 Cerillos o encendedor
 Gradilla

TÉCNICA:

1. Con el lápiz graso dividir la caja de Petri en 3 sectores, de tal manera que al
Destaparla para proceder a la inoculación, se tenga como se indica en la figura:

El sector No. 1 es más pequeño y sirve para descargar el asa.

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2. Usando la técnica ya conocida, tomar el cultivo bacteriano y en condiciones


asépticas obtener una asada del material.

3. Una vez cerrado el tubo, colocarlo en una gradilla.

4. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la caja de Petri y


descargar el material en el sector 1, trazando una serie de zig-zags muy
cerrados a todo lo ancho del sector. Cerrar la caja.

5. Esterilizar el asa flameándola y mientras que se enfría, girar la caja 90° hasta
que el sector 1 quede abajo y el 2 en el lado izquierdo.

6. Trazar unos 5 zig-zags menos cerrados en el sector 2 invadiendo el sector 1


para llevar un poco de material al sector 2 y trazar los siguientes zig-zags sin
tocar el sector 1. En esta forma se diluye el material quedando unas bacterias
separadas de las otras. Cerrar la caja.

7. Esterilizar de nuevo el asa, girar la caja 90° y ahora el sector 2 estará abajo y
el 3 a la izquierda.

8. Trazar unos 5 zig-zags cada vez más abiertos en el sector 3 invadiendo el


sector 2 y los siguientes zig-zags sin tocar el sector 2, como se muestra en el
dibujo:

9. Incubar a 37 "C por 24-48 horas.

10. Observar si hubo o no, aislamiento de colonias.

NOTA:
En el sector 1 generalmente no se obtienen colonias aisladas, pero en 2 y 3 sí.

11. Anotar las características de las colonias aisladas.

12. A partir de cada una de las diferentes colonias aisladas preparar frotis y teñir
Con la técnica de Gram.

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13. Observar al microscopio con objetivo de inmersión para verificar la morfología


y reacción al Gram y determinar la pureza de las colonias, considerando
puras a las que muestren un solo tipo de bacteria.

14. A partir de las colonias puras efectuar una segunda resiembra en caja de
Petri en 3 campos y una nueva verificación de pureza por observación
microscópica en la forma indicada anteriormente.

15. Una vez determinada la pureza de las colonias, a partir de cada una de ellas
inocular por estría en tubos de aqar inclinado, para obtener cultivos puros.

16. Incubar a 37 "C por 24-48 horas.

17. Después de este período observar si efectivamente hubo crecimiento de un


solo tipo de microorganismos.

18. Preparar un frotis, teñir con la técnica de Gram y observar al microscopio con
objetivo de inmersión para confirmar su pureza.

19. Dibujar las observaciones hechas al microscopio.

20. Guardar los cultivos puros en el refrigerador para su posterior identificación.

Nota:

• Siguiendo la misma técnica, la caja de agar se puede dividir en más de 3


Sectores, obteniendo una dilución mayor, como se muestra en el dibujo:

• Existen otras técnicas de aislamiento en placa, como pueden ser la siembra


en superficie y la de placa vertida.

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CUESTIONARIO
1. Describir una técnica de aislamiento bacteriano a partir de una fuente natura.
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2. Describir dos técnicas de aislamiento en tubo.


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3. ¿Qué es un cultivo axénico o puro?


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4. ¿Qué importancia tiene la obtención de un cultivo puro?


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PRÁCTICA NO 11
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MOHOS DEL AIRE

INTRODUCCIÓN

l. OBJETIVO·
Aislar mohos del aire y conocer sus características morfológicas y estructurales
Para lograr su identificación.

INTRODUCCIÓN
La mayoría de los hongos viven libres en el suelo o en el agua y obtienen su
energía por respiración o fermentación de materiales orgánicos solubles presentes
En estos ambientes. El aire no es un medio en el que pueden desarrollarse los
microorganismos pero es el portador de aerosoles biológicos como polvo, gotitas
de agua y otros, que pueden estar cargados de los diversos grupos de
microorganismos.

De las capas de aire se han encontrado esporas de hongos que proceden


principalmente del suelo, de la vegetación y del mar. Algunos de los géneros más
Comúnmente aislados del aire san Penicillium, AspergilIus, Rhizopus, Mucor y
Cladosporium, entre otros.

Todos los hongos se reproducen por esporulación. Cuando la espora se encuentra


en un medio nutritivo adecuado, se hincha y germina emitiendo uno o más tubos
Germinativos que se alargan distalmente hasta constituir filamentos delgados y
Largos que se denominan "hilas", las cuales pueden ramificarse después.

En algunas especies se forman septos a lo largo de la hifa, quedando entonces


dividida en pequeños compartimentos como una caña de bambú llamándose
entonces hifa septada, otras veces no hay septación y el protoplasma fluye
continuamente a lo largo de la hila, describiéndose entonces como hita no septada
o cenocítica. En la mayoría de los hongos las hilas son septadas.

A medida que las hilas se siguen dividiendo se forma un crecimiento algodonoso


o filamentoso de hilas entrelazadas llamado micelio.

El conjunto de micelio se conoce como talo. En algunas formas superiores las Hifas
se unen formando cuerpos fructíferos grandes y de estructura compleja como es
el caso de las setas.

La parte del micelio que penetra en el substrato y absorbe substancias nutritivas


se llama micelio vegetativo, la parte que se proyecta sobre la superficie del
substrato origina el micelio aéreo, que a su vez da origen a esporas asexuales

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tales como conidias en Aspergillus spp. y Penicillium spp. y esporangiosporas en


Rhizopus y Mucor, entre otras, cuya misión es la de dispersar el hongo a nuevos
hábitats.

Algunos hongos también producen esporas sexuales formadas como resultado de


la reproducción sexual. Las que están encerradas en una especie de saco (Asea)
se llaman ascosporas y las que se forman en el extremo de una hifa o basidio se
denominan basidiosporas.

Las propiedades de las esporas sexuales son un criterio importante en la


clasificación e identificación de los hongos.

Aunque los hongos constituyen un grupo grande y diverso, prácticamente hay tres
grupos importantes: Los mohos, las levaduras y las setas.

Los mohos son hongos filamentosos que están ampliamente distribuidos en la


naturaleza y son habituales en pan viejo, queso o frutas. Presentan una gran
variedad de formas y tamaños. Cada filamento crece fundamentalmente en el
ápice, por extensión de la célula terminal.

Las levaduras son hongos unicelulares y la mayoría son Ascomycetes.


Normalmente tienen forma ovalo cilíndrica y su principal forma de reproducción es
la gemación, se desarrollan bien en hábitats con abundante azúcar tales como
frutas, flores, e incluso la corteza de los árboles.

Las levaduras tienen gran importancia biotecnológica en la industria cervecera y


de la panificación y en la producción de proteína de origen unicelular (biomasa). El
principal agente de la fermentación alcohólica es Saccharomyces cerevisiae.
Las setas son hongos filamentosos pertenecientes a los Basidiomycetes que
forman cuerpos fructíferos denominados "setas" y que producen basidiosporas
como esporas sexuales.

Una actividad ecológica muy importante de los Basidiomycetes, es la


descomposición de la madera, papel, ropa y otros derivados de productos
naturales. Estos Basidiomycetes, por tanto, son capaces de producir celulasas con
actividades degradantes de Iignina que utilizarán como fuente de carbono y
energía.
Debido a que muchas setas como Pleurotus ostreatus, son comestibles, su
producción en gran escala es una actividad económicamente importante. Aunque
las hay también venenosas como Amanita virosa y Amanita phalloides.

Cada hongo tiene ciertas características macro (morfología colonial, pigmentación)


y microscópicas (tipos de hifas, de conidias, etc.), que permiten clasificarlo.

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OBJETIVO:

 Aislar mohos del aire y conocer sus características morfológicas y


estructurales para lograr su identificación.

MATERIAL Y SUBSTANCIAS:

 Caja de Petri conteniendo medio de agar de Sabouraud dextrosa (SDA)


 Asa bacteriológica
 2 Cajas Petri, conteniendo cada una un portaobjetos, un cubreobjetos y un
trozo de papel filtro, estériles
 Caja de Petri conteniendo medio de SDA en capa muy delgada
 Bisturí
 Pinzas de disección
 Agua destilada estéril
 Lacto-fenol-azul de algodón
 Esmalte de uñas
 Masking tape
 Mechero Bunsen
 Cerillos o encendedor
 Portaobjetos
 Cubreobjetos
 Microscopio

TÉCNICAS:

A. AISLAMIENTO DE HONGOS DEL AIRE:

1. Tomar una placa de medio de SDA.

2. Abrir la placa y exponerla al aire en cualquier sitio por espacio de media hora y
Colocar de nuevo la tapa en su sitio.

3. Incubar por 48-72 horas o más a temperatura ambiente.

4. Observar la presencia de colonias filamentosas de diversos tipos y colores.

5. Describir las observaciones hechas.

6. Anotar las características de las colonias seleccionadas para hacer los


microcultivos, ya que esta información es un criterio importante para la
Identificación del moho.

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B. OBSERVACIÓN DE LAS ESTRUCTURAS DE LOS HONGOS.

Si bien la estructura microscópica es decisiva para la clasificación, para el


micólogo experimentado las características visibles son muy importantes debido a
que, a simple vista, el aspecto de las colonias es a veces tan característico que le
permite identificar enseguida el tipo de hongo. Sin embargo, es indispensable para
la clasificación final determinar las peculiaridades del hongo al nivel microscópico
que presentan estos microorganismos.

Generalmente por medio de una aguja de disección o un asa bacteriológica con


un pequeño ganchito en la punta es posible desprender pequeñas porciones de la
colonia para su estudio microscópico.

Sin embargo, quizá el mejor método para el estudio mícroscópico es el microcultivo


que permite observar cuidadosamente y a intervalos las estructuras microscópicas
intactas, mientras que en la técnica de desprender una porción del cultivo se altera
muy seriamente la arquitectura microscópica tanto que a veces es imposible
reconocer el hongo.

OBSERVACIÓN DIRECTA

1. De las colonias de hongos aislados, tomar nota de sus características:


Forma, aspecto del micelio (algodonoso, aterciopelado u otro), pigmentación,
elevación, consistencia, etc.

2. Seleccionar una de las colonias aisladas y con el asa bacteriológica con un


pequeño ganchito en la punta, desprender una pequeña porción.

3. Extender el material obtenido en una gota de agua puesta sobre un


portaobjetos y colocar con cuidado un cubreobjetos sobre éste.

4. Examinar al microscopio con objetivo seco débil buscando estructuras


Representativas.

6. Cambiar al objetivo seco fuerte para observar mejor las estructuras


seleccionadas, procurando que éstas presenten la arquitectura completa del
hongo para facilitar su identificación.

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7. Dibujar las observaciones hechas:

10x 40x

MICROCULTIVO

1. Tomar una caja de Petri que contenga dentro un círculo de papel filtro del
diámetro de la caja, un portaobjetos y un cubreobjetos estériles.

2. Con el asa estéril y en ángulo recto, cortar en cuadritos de aproximadamente 3


a 5 mm por lado el medio de SDA en capa delgada contenido en una caja de
Petri, tomar un cuadrito y colocarlo en condiciones asépticas en el centro del
portaobjetos, levantando la tapa de la caja sólo lo suficiente.

3. En condiciones asépticas, tomar una pequeña porción del cultivo por estudiar
con el asa bacteriológica en ángulo recto y depositarla cuidadosamente sobre
el cuadrito de agar en el portaobjetos dentro de la caja de Petri.

4. Levantando con la mano izquierda la tapa de la caja de Petri y con unas pinzas
ligeramente flameadas en la mano derecha, tomar el cubreobjetos y colocarlo
sobre el cuadrito de agar inoculado. Procurando que quede bien centrado y
aprisionándolo ligeramente para que se adhiera.

5. Con un gotero que contenga agua estéril depositar las gotas necesarias sobre
el papel filtro hasta lograr que éste se humedezca completamente.

6. Cerrar la caja y sellarla con un poco de masking tape.

7. Incubar a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas.

8. Observar el cultivo a simple vista y no hacer ninguna observación microscópica


hasta que haya desarrollo visible fuera del cuadrito del agar. Tener mucho
cuidado, para evitar destruir la estructura del hongo.

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9. Cuando esto suceda, abrir la caja, sacar la preparación, secarla con gasa por
debajo del portaobjetos sí está húmedo, y observarlo al microscopio con objetivo
seco débil y el condensador muy bajo para reducir la cantidad de luz.

10.Cambiar al objetivo seco fuerte para distinguir mejor la estructura del hongo.

11. Dibujar lo observado:

10x 40x

12.-Comparar la estructura observada con las mostradas en dibujos y láminas.

13. Sí se desea hacer una preparación permanente, hacer fluir cuidadosamente


entre porta y cubreobjetos un poco de lacto-fenol-azul de algodón o lacto-fenol-
Fucsina ácida, hasta que se haya llenado todo el cubreobjetos.

14. Flamear ligeramente inclinando la preparación para eliminar las burbujas de


aire atrapadas.

15. Dejar enfriar la preparación y sellarla dando pinceladas de esmalte de uñas


alrededor del cubreobjetos.

CUESTIONARIO

1. Dibujar las estructuras de 5 hongos de diferente género.

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2. Describir otra técnica de aislamiento de hongos.


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3. Consultar en qué consiste el medio de Micosel y cuál es su utilidad.


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4. Consultar la técnica para la obtención de una colonia gigante de hongo.


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5. Mencionar la importancia de los hongos en microbiología ambiental.


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Estructuras de algunos hongos filamentosos

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PRÁCTICA NO 12
RECUENTO DE BACTERIAS MESÓFILAS AEROBIAS EN AGUA. PARA
CONSUMO HUMANO

INTRODUCCIÓN
Muchas veces el agua puede ser completamente transparente, incolora e inodora,
pero estar aún contaminada, por lo que, es importante determinar su calidad
sanitaria. La potabilidad del agua sólo se puede determinar mediante análisis
químicos y bacteriológicos.

Los procedimientos bacteriológicos de rutina son: recuento de bacterias mesófilas


aerobias, coliformes totales, coliformes fecales, estreptococos fecales y clostridios
sulfitos reductores.

Los recuentos de mesófilos aerobios en placa son útiles para determinar la


potabilidad de un agua, así como también la eficiencia de las operaciones para
eliminar microorganismos, como la sedimentación, filtración y cloración.

Las cuentas se deben hacer antes y después del tratamiento específico. Los
resultados indicarán la medida en que ha sido reducida la población microbiana.
Lo usual es que el agua de buena calidad, para consumo humano, tenga cuentas
bajas: < 100 UFC por mililitro.

La determinación del conteo de bacterias mesófilas aerobias en una muestra de


agua se realiza, normalmente, por siembra en una placa, de un volumen
determinado de agua, por incubación a una temperatura concreta y en un tiempo
determinado y por recuento posterior de las colonias desarrolladas y con la
aceptación implícita de que cada colonia es originada por una bacteria de la
muestra inicial, por lo tanto, el número de colonias equivaldrá al número de
bacterias en el volumen sembrado.

OBJETIVO
 Determinar la presencia de bacterias mesófilas aerobias en una muestra de
agua potable por la técnica de placa vertida.

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MATERIALES Y SUBSTANCIAS:
 Muestras de agua potable de diferente origen (grifo, purificada y
embotellada u otro), de un volumen mínimo de 100 mL obtenida en
recipiente estéril y con 0.1 ml de tiosulfato de sodio al 10%
 3 tubos de ensayo conteniendo cada uno 9 mL exactos de agua de dilución
estéril
 9 tubos de 20 x 160 mm, con tapón de rosca conteniendo cada uno de 15-
20 ml de agar cuenta estándar estéril, manteniéndolo a 45-47 OC en baño
de temperatura constante
 Gradilla
 Pipetas estériles de 1 mL graduadas en décimas
 9 cajas de Petri estériles
 Mechero Bunsen
 Cerillos o encendedor
 Incubadora
 Contador de colonias

TÉCNICAS

En condiciones asépticas:
,
1. Agitar vigorosamente la muestra de agua, para homogeneizar.

2. Pipetear 1 ml de muestra y verterlo en el primer tubo que contiene 9 ml de agua


de dilución estéril, quedando una dilución de 101.

3. Agitar para homogeneizar y tomar 1 mL de esta dilución (101) y verterlo en el


segundo tubo que contiene 9 ml de agua de dilución estéril, quedando una
dilución de 102.

4. Agitar para homogeneizar y tomar 1 ml de esta dilución (10 2) y verterlo en el


tercer tubo que contiene 9 ml de agua de dilución estéril, quedando una dilución
de 103.

5. Utilizando pipeta estéril, tomar 1 ml, de la dilución 101 y verterlo en la caja de


Petri estéril marcada previamente con 101, distribuyéndolo bien en el fondo de
la caja de Petri vacía. Efectuar esta misma operación por triplicado.

6.-De la misma manera, tomar 1 ml de la dilución 102 Y verterlo en la caja de


Petri marcada con 102. Efectuar esta misma operación por triplicado.

7. Hacer lo mismo con el tubo de la dilución 103 y la caja marcada con 103.Efectuar
esta misma operación por triplicado.

Es recomendable usar una pipeta estéril para cada dilución,

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8. Antes de que pasen 10 minutos, agregar a cada caja de Petri el medio de cultivo
contenido en un tubo, a una temperatura máxima de 47 "C (todavía líquido).

NOTA:

Si la temperatura del agar es superior a 47°C al vaciarlo a las cajas, puede


producirse la destrucción total o parcial de las bacterias sembradas.

9. Antes de que el medio de cultivo solidifique homogeneizar cada caja mediante


movimientos de translación y rotación en una superficie plana aproximadamente
durante 1 minuto evitando que se mojen la tapa y los costados de la caja, de
esta manera el agua y el agar son mezclados uniformemente.

10. Dejar reposar las cajas el tiempo necesario para que solidifique el agar.

11. Una vez solidificado el agar en las cajas, incubar en posición invertida con
objeto de que el agua de condensación del agar no caiga sobre la superficie
del cultivo. Las condiciones de incubación son: 37 "O (± 1 OC) durante 24
horas (± 3 h). Ahora bien, si se desea conocer la flora bacteriana total de la
muestra las condiciones serán: 22 "C (± 2 OC), durante 72 horas (± 4 h).

12.Transcurrido el tiempo de incubación contar las colonias que se han


desarrollado en cada una de las placas, usando un cuenta colonias para efecto
de facilitar la lectura.

NOTA:
Si la investigación de mesófilos se practica a otro tipo de muestra de agua que no
sea potable, se procede a preparar las diluciones necesarias, dependiendo del
origen de la misma, pero solo se trabajará con las últimas tres diluciones,
procediendo de la misma forma descrita anteriormente pero incubando durante
48 horas a 37 "C (±1 OC).

Al hacer el recuento, tener en cuenta las siguientes consideraciones:

• Seleccionar sólo las cajas que contengan entre 25 y 250 colonias y descartar las
otras.
• Si son varias las que entran en este intervalo, contar todas y seleccionar las del
grado de dilución por triplicado que represente menor margen de error en el
recuento y como resultado, tomar el promedio de las tres cajas y referirlo al
volumen real de muestra sembrado para efectos del cálculo correspondiente.
• Si no hay ninguna caja con un recuento dentro del intervalo mencionado, se hará
de aquella que tenga el valor más próximo a cualquiera de los dos extremos. En
estos casos los resultados se tomarán como aproximados, excepto en los casos
de siembra de muestra directa donde se efectuará, también el recuento en cajas
con menos de 25 colonias.

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• Si el recuento no se hace en el mismo momento de sacarlas de la incubadora,


se pueden conservar las cajas dentro del refrigerador entre 5 y 10°C, durante
un período máximo de 24 horas.

CÁLCULO Y PRESENTACIÓN DE RESULTADOS

Una vez efectuado el recuento de las cajas correspondientes, los resultados


obtenidos se elaboran de la siguiente manera:

 Si la cantidad de agua sembrada ha sido de 1 mL la expresión del resultado


es directa.
 Si la cantidad de agua sembrada ha sido de 0.1 mL, el número de colonias
contadas habrá de dividirse entre el volumen de muestra sembrada, es
decir, entre 0.1, para obtener el número de colonias por mililitro.

En general se tiene:

Bacterias mesófilas aerobias/ml = Número de colonias en volumen real de muestra


sembrada, en ml.

Los resultados se expresarán así:

NÚMERO DE BACTERIAS MESÓFILAS AEROBIAS:____UFC/ml

NOTA:
Si no se observan colonias en ninguna de las cajas sembradas, el resultado no
será de O (cero) UFC/ml, sino que será referido al menor grado de dilución
sembrado. En el presente experimento éste es de 10-1, por lo tanto el resultado
sería: <10 UFC/ml.

CUESTIONARIO:

1. Consultar el significado de cuenta viable.


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2. ¿Cuáles son las bacterias mesófilas aerobias?


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3. ¿En qué otro tipo de muestras, además de agua, se puede investigar la


presencia de mesófilas aerobias? Dar ejemplos.
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4. De acuerdo a la normatividad peruana vigente, ¿Cuál es el límite máximo


permisible para bacterias mesófilas aerobias en. Agua purificada y embotellada?
Dar el número de norma.
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5. Explicar con un ejemplo: La investigación de otro tipo de microorganismos


utilizando esta misma técnica.
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Preparación de diluciones decimales y procedimiento para el recuento de bacterias
mesófilas aerobias

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