Jueves 3, Septiembre 2015

Grupo:
Álvarez A. Samantha
Cantarino P. Xochiquetzatl
Gutiérrez L. Ernesto S.
Ruedas B. Susana
Vazquez T. Montserrat

Curvas Estándar y Concentración

Curvas estandar y concentración

Concentración: Una Solución es una mezcla homogénea

de dos o más sustancias.
La concentración es la relación existente La sustancia disuelta se denomina
entre la cantidad de soluto y la cantidad soluto y la sustancia donde se disuelve
de disolvente. se denomina disolvente. Existen 3 tipos
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 de soluciones:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒  Solución No Saturada
En el ámbito químico, la concentración  Solución Saturada
puede ser expresada de tres maneras  Solución Sobresaturada
diferentes:
Métodos:
Molaridad (M):
Bradford: Consiste en la formación de un
𝑀𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑆𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 compuesto de adsorción de coloración
𝑀𝑜𝑙𝑎𝑟𝑖𝑑𝑎𝑑 = azul, entre los residuos de aminoácidos
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 (𝐿)
básicos de las proteínas y el colorante
Molalidad (m): azul de Coomassie. La absorbancia se
lee a 595 nm y la intensidad de la
absorción depende del contenido de
𝑀𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 aminoácidos básicos.
𝑀𝑜𝑙𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 =
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒 (𝑘𝑔) Lowry: Es un método colorimétrico de
Fracción Molar (X): valoración cuantitativa de las proteínas.
A la muestra se añade un reactivo que
𝑀𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑆𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 forma un complejo coloreado con las
𝐹𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑀𝑜𝑙 =
𝑀𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 proteínas, siendo la intensidad de color
proporcional a la concentración de
(F, Alonso. Concentraciones. 2015. [1 P.],
proteínas, según la ley de Lambert-Beer
[En línea], Disponible en:
http://www.alonsoformula.com/inorganica/con A= ε.l.c
centraciones.htm)
Biuret: Esta reacción la producen los
péptidos y las proteínas, pero no los
aminoácidos ya que se debe a la
presencia del enlace peptídico CO-NH
que se destruye al liberarse los
aminoácidos. El reactivo de Biuret lleva
sulfato de Cobre (II) y sosa. El Cu, en un
medio fuertemente alcalino, se une con
los enlaces peptídicos formando un
complejo de color violeta, cuya
intensidad de color depende de la
concentración de proteínas.
Curvas estándar:
Metodología
Curva de proteína por el método
Bradford
Para empezar la práctica pedimos el
material que requerimos, 3 micropipetas
de 10, 100 y 1000 L, 10 tubos
eppendorf, una celda de plástico para el
espectrofotómetro, un espectrofotómetro,
solución de 0.5 mg/ml de albúmina sérica
bobina (BSA), agua y buffer Bradford.
Antes de comenzar con el procedimiento
prendimos es espectrofotómetro para
que se fuera calentando mientras
procedíamos con los demás pasos del
experimento. Lo primero que hicimos fue
enumerar los tubos eppendorf del 0-7 y
los dos tubos restantes los llenamos de
agua, con ayuda de las micropipetas de
10 y 100L agregamos a cada tuvo la
cantidad necesaria de agua requería, la
cual tomamos de los tubos eppendorf
que la contenían; en seguida de
agregarles el agua procedimos a agregar
el BSA con la micropipeta de 10L
debido a que cada tubo necesitaba una
cantidad pequeña de BSA, ya que tenían
La curva estándar son gráficos que
muestran la respuesta de un método
analítico, en función de cantidades
conocidas de concentraciones. En las
curvas estándar es importante conocer la
absorbancia, que es a relación
logarítmica entre la intensidad de la luz
que incide sobre una muestra y la
intensidad de esa misma luz que es
transmitida a través de esa muestra.
(Anónimo, Absorbancia y detección. 2004 [3
P.], [En línea], Disponible en:
http://www.bmglabtech.com/es/tecnologico/m
odos-de-deteccion/absorbancia/)
los tubos el agua junto con el BSA
agregamos el buffer Bradford con ayuda
de la micropipeta de 1000L e
inmediatamente mezclamos por
inmersión cada tubo, teniendo ya los
tubos preparados los dejamos reposar
cada tubo de 5 a 10 min. a temperatura
ambiente. Después de que transcurrió el
tiempo de reposo nos dispusimos a
medir la absorbancia de cada solución,
para esto tomamos el tubo 0 y
agregamos la solución a la celda y la
colocamos en el espectrofotómetro este
tubo nos sirvió como el punto de partida
de absorbancia (cero), una vez que
obtuvimos la lectura de ese tubo,
vaciamos el contenido de la celda al tuvo
0 e inmediatamente agregamos a la
celda el contenido del tubo uno y
medimos su absorbancia en el
espectrofotómetro, así sucesivamente
repetimos el procedimiento para los 6
tubos restantes; en el tubo 8 la maestra
agrego una cantidad de proteína
diferente, entonces antes de medir la
absorbancia de ese tubo enjuagamos la
celda con agua, la dejamos escurrir y
posteriormente nos dispusimos a medirle
la absorbancia. Una vez obtenidos los Imagen1. Absorbancia de BSA con
resultados de la absorbancia, vaciamos reactivo de Bradford
los datos a una hoja de Excel en la cual
sacamos una curva de absorbancias de Conociendo la ecuación general de la
cada tubo a excepción del tubo 8, a ese recta, obtenida de la gráfica de la
tubo con base a los datos que teníamos, curva estándar, se puede despejar la
que era los mililitros de agua, Bradford y incógnita x para conocer su valor y
la cantidad de proteína le calculamos la así hacer los cálculos necesarios
concentración. Una vez terminados los
para conocer la cantidad de proteína
cálculos la maestra nos puso un
(µg) de la solución problema.
problema en el cual teníamos que
resolver con base a la concentración Primero, de la ecuación y = mx + b,
obtenida. se despeja la incógnita x quedando
Resultados de la siguiente manera: x= (y-b)/m,
donde “y” es el valor de la
Tabla 1 Absorbancia de muestras absorbancia de las muestras
problema, “b” es la ordenada al
Tubo µl H2Oµl Bradfordµl A
de origen y “m” es la pendiente. El valor
BSA de x serán los µg de proteína
0 0 200 800 0
obtenida para los µL de la solución
1 2 198 800 0.263
2 4 196 800 0.387 problema.
3 6 194 800 0.504
4 8 192 800 0.722
5 10 190 800 1.188 *Proteína problema: µg proteína =
6 12 188 800 1.189 𝐴𝑏𝑠−𝑂𝑟𝑑. 𝑂𝑟𝑖𝑔𝑒𝑛 0.915−0.0163
*7 20 180 800 0.915 Pendiente
= 0.1036 = 8.9893 µg
8.9893µg
5.2µl
= 1.72µg
µl

Se sabía que del tubo problema el H2O

curva de proteína por el era de 5.2 µl
método de Bradford Dilución 1:100 = 8.989x100 = 898.9 µg
1.4
Conclusiones
1.2 y = 0.1036x - 0.0163
R² = 0.9335 NOTA: Ver conclusiones individuales al final
1
absobancia (Ad)

de la práctica.
0.8
Cuestionario
0.6
1. ¿Qué se necesita para realizar una
0.4
curva estándar?
0.2
En la práctica para construir la curva de
0
0 5 10 15
calibración se utilizan disoluciones que
cantidad de BSA (µg)
contienen concentraciones conocidas de
analito, llamadas disoluciones patrón o
estándar. Los estándares o disoluciones
patrón para construir la recta de
calibrado deben ser preparadas en forma
independiente, a partir de una o varias
soluciones madre; el número de puntos a
escoger dependerá del uso que se dé a
la recta de calibrado. Cabe mencionar
que en la práctica es muy importante
efectuar la medida del “blanco”
(disolución que contiene todos los
reactivos y disolventes usados en el
análisis, pero sin el analito). Los blancos
miden la respuesta del procedimiento
analítico a las impurezas o especies
interferentes que existan en los reactivos
o, simplemente, a las especiales
características del instrumento de
medida. La etapa de calibración analítica
se realiza mediante un modelo de línea
recta que consiste en encontrar la recta
de calibrado que mejor ajuste a una serie
de “n” puntos experimentales, donde
cada punto se encuentra definido por una
variable “x” (variable independiente,
generalmente concentración del analito
de interés) y una variable “y” (variable
dependiente, generalmente respuesta
instrumental). La recta de calibrado se
encuentra definida por una ordenada al
origen (b) y una pendiente (m), mediante
la ecuación y = mx + b.
A partir de la curva de calibración
(conjunto de concentraciones que
describen el intervalo en el cual se
deberá cuantificar el compuesto por
analizar) y a fin de asegurar que la recta
encontrada con los puntos
experimentales se ajuste correctamente
al modelo matemático de la ecuación se
calculan los valores de la ordenada al
origen, la pendiente y el coeficiente de
determinación (r2).
En forma gráfica se representa como:
2. ¿Para qué sirve una curva estándar?
La calibración incluye la selección de un
modelo para estimar los parámetros que
permitan determinar la linealidad de esa
curva y, en consecuencia, la capacidad
de un método analítico para obtener
resultados que sean directamente
proporcionales a la concentración de un
compuesto en una muestra, dentro de un
determinado intervalo de trabajo. En el
procedimiento se compara una propiedad
del analito con la de estándares de
concentración conocida del mismo
analito (o de algún otro con propiedades
muy similares a éste).
A partir de la ecuación de la recta
obtenida con la curva de calibración de
los diferentes estándares es posible
calcular la concentración del analito en
una muestra de concentración
desconocida. Para ello se requiere
efectuar la medida de la señal
correspondiente y despejar el valor de la
concentración en la ecuación de la recta.
Independientemente de la técnica
instrumental responsable de la señal
analítica (cuyas características se
estudian en forma particular) los
parámetros que se determinan a partir de
las curvas de calibración obtenidas con
cualquiera de ellas son:
 la linealidad
 la sensibilidad
 el límite de detección
 el límite de cuantificación
 el intervalo analítico
3. ¿Qué ocurre en los tubos 6 y 7 de la
curva estándar?
4. ¿Qué rango de datos se toman en
cuenta para calcular la ecuación de la
recta?
Se considera que es el comprendido
entre el límite de cuantificación hasta la
concentración en la cual se pierde la
linealidad de la curva.
5. ¿Qué se puede hacer si el valor
obtenido en los tubos problema no cae
dentro de la parte recta de la curva?
Sí es un solo valor el que no se ajusta,
podemos ignorarlo, sin embargo si son
más de dos valores se recomienda
repetir el experimento para obtener
mejores resultados.
6. ¿Cómo podemos explicar que la
pendiente de la gráfica se acueste al
aumentar demasiado la concentración de
proteína?
BIBLIOGRAFÍA
 Dosal, M. A; Villanueva, M.
(2008). Introducción a la
metrología química: Curvas de
calibración en los métodos
analíticos. En Antología de
química analítica experimental
(18-26). México: U.N.A.M.