Enriquecimiento de la comunidad microbiana del suelo en la

biorremediación de un suelo contaminado con petróleo modificado con paja

de arroz o aserrín

Resumen

Se aplicaron dos desechos orgánicos comunes de la agricultura (paja de arroz) y

la silvicultura (aserrín) a un suelo contaminado con petróleo para estimar su
efectividad en la eliminación de los hidrocarburos totales de petróleo (TPH) y los
hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP). La paja de arroz fue la enmienda más
efectiva que los otros tratamientos para reducir el contenido de TPH y la adición
de aserrín resultó en una disminución significativa en la eliminación de HAP,
particularmente HAP de alto peso molecular (anillo 5e6). El análisis de
coordenadas principales (PCoA) indica que el tratamiento con paja de arroz
separó solo a la comunidad bacteriana, pero el aserrín afectó en gran medida a las
comunidades bacterianas y fúngicas del suelo. Además, la abundancia de algunos
degradadores de petróleo como las bacterias Sphingomonas, Idiomarina y
Phenylobacterium y los hongos Humicola, Wallemia y Graphium se promovieron
mediante los aportes de los dos desechos agrícolas y forestales. Estos resultados
resaltan el potencial de las aplicaciones de residuos en la aceleración de la
biodegradación de hidrocarburos que puede atribuirse al enriquecimiento de
taxones clave que muestran fuertes asociaciones positivas con la degradación de
hidrocarburos.

Introducción

El rápido desarrollo de la industria petrolera ha estado acompañado de una

creciente preocupación por las consecuencias ambientales de la contaminación
por petróleo (Oleszczuk et al., 2017). La remediación de suelos contaminados con
hidrocarburos de petróleo ha sido ampliamente estudiada debido a sus
componentes tóxicos y cancerígenos, como los hidrocarburos aromáticos
policíclicos (HAP) que amenazan el medio ambiente y la salud humana (Johnston
et al., 2015; Zeng et al., 2016).

Ha aumentado el interés en el desarrollo y la implementación de tecnologías

innovadoras para la limpieza de suelos contaminados (de Boer et al., 2016).
Métodos de biorremediación tales como bioparpamiento, bioestimulación y
bioaugmentación están recibiendo mayor atención en comparación con las
tecnologías de remediación física y química debido a su costo relativamente bajo y
la alteración limitada del sitio (Liu et al., 2013; Lu et al., 2014).

Los factores clave en la biorremediación microbiana son el contenido de nutrientes

del suelo, el estado de oxígeno y el contenido de humedad (Galdames et al.,
2017). Sin embargo, los suelos contaminados con residuos de petróleo a menudo
tienen baja porosidad y capacidad de retención de agua y esto afecta la eficiencia
de la degradación microbiana. Numerosos estudios recientes informan que los
desechos agrícolas y forestales pueden ayudar a mantener la calidad del suelo y
lograr una alta eficiencia de eliminación de compuestos de hidrocarburos
(Shahsavari et al., 2013; Zhang et al., 2015). Por ejemplo, Callaham et al. (2002)
han atribuido una mayor actividad biológica en respuesta a la aplicación de paja
de trigo a un aumento en la porosidad del suelo que facilita la transferencia de
oxígeno.

Además, los desechos agrícolas y forestales tienen cierta capacidad para retener
agua y, por lo tanto, mantener el metabolismo de los microorganismos indígenas
(Dong et al., 2013). Todas estas medidas se utilizan para proporcionar un hábitat
adecuado para que los microbios mejoren la biodegradación.

Se ha informado que la paja y el aserrín aumentan la porosidad del suelo y la

capacidad de retención de agua, y las grandes cantidades de celulosa y lignina
que contienen también pueden servir como sustratos para el crecimiento de
microorganismos que utilizan hidrocarburos (Ali et al., 2011; Dashti et al., 2017)
Estos microorganismos generalmente tienen un sistema enzimático extracelular
que oxida la lignina de manera eficiente al producir enzimas como lacasa,
peroxidasa de lignina, peroxidasa de manganeso y peroxidasa versátil (Mathieu et
al., 2013). Por lo tanto, los desechos agrícolas y forestales pueden mejorar la
actividad de enzimas específicas para aumentar la eficiencia de la biodegradación
de hidrocarburos.

Aunque numerosos estudios han encontrado que ambos materiales remedian los
suelos contaminados con petróleo individualmente, pocos estudios se han
centrado en los diferentes componentes de los dos materiales que pueden ejercer
diferentes efectos en la comunidad microbiana, lo que resulta en distintas
eficiencias y residuos de degradación del petróleo. Se requieren más
investigaciones sobre los cambios en la abundancia y la estructura comunitaria de
los microorganismos en la degradación del petróleo para comprender mejor cómo
los dos aditivos influyen en la biodegradación de los contaminantes en los suelos.
La estructura de la comunidad microbiana indígena se considera un factor clave
para una bioremediación exitosa (Varjani et al., 2015). La mayoría de los estudios
informan variaciones en la abundancia y la estructura comunitaria de los
degradadores de petróleo durante la degradación del petróleo monitoreada por el
análisis DGGE (Koshlaf et al., 2016) o T-RFLP (Giebler et al., 2014). Sin embargo,
estos métodos moleculares generalmente dan una baja resolución taxonómica de
las comunidades microbianas del suelo que responden a la biodegradación de
contaminantes orgánicos. La secuenciación de alto rendimiento se ha convertido
recientemente en una técnica popular porque proporciona la cantidad máxima de
datos con alta resolución a bajo costo (Hou et al., 2015).

Se realizó un experimento de maceta con dos desechos agrícolas y forestales

comunes (paja de arroz y aserrín) con un suelo contaminado con petróleo
envejecido para dilucidar aún más los mecanismos por los cuales los desechos
agrícolas y forestales pueden mejorar la biorremediación del petróleo, y
particularmente las relaciones entre las comunidades bacterianas y fúngicas y
hidrocarburos de petróleo. La eficiencia de eliminación de hidrocarburos de
petróleo totales (TPH) y HAP mediante fertilización sola y fertilización con paja de
arroz o aserrín se estudió utilizando FT-IR y GC-MS. La secuenciación Illumina
MiSeq se usó para monitorear las comunidades bacterianas y fúngicas del suelo
para ayudar a dilucidar las relaciones entre los dos aditivos y el proceso de
biodegradación.

2. Materiales y métodos.

2.1. Muestras de suelo y residuos agrícolas y forestales.

El suelo degradado contaminado con petróleo se recolectó cerca de un pozo de

producción de petróleo durante 20 años en el campo petrolero Daqing, provincia
de Heilongjiang, noreste de China. Las muestras de suelo se secaron al aire y se
pasaron a través de un tamiz de 2 mm. Las muestras de suelo se mezclaron a
fondo y se almacenaron a 4 ° C hasta su uso. Las propiedades físicas y químicas
del suelo original fueron: pH 8,29, disponible N 126 mg kg 1, disponible P 10 mg
kg 1, disponible K 13,2 mg kg 1; y contenido de materia orgánica 55.0 mg kg 1. La
paja de arroz se obtuvo de tierras agrícolas en la provincia de Hunan y el aserrín
se compró en un mercado local (se muestra en la Fig. 1). La paja de arroz se cortó
en trozos de 2 cm de largo.

Fig. 1. Los dos aditivos mencionados en los Materiales y métodos: (a) paja
de arroz (b) aserrín.

2.2. Experimento de la olla

El diseño experimental consistió en tres tratamientos con tres repeticiones. Los

tratamientos fueron (1) solo fertilizante (Control), (2) paja de arroz þ fertilizante
(RF); y (3) aserrín þ fertilizante (SF).

Cada maceta contenía 1 kg de suelo secado al aire y el contenido de agua del

suelo se mantuvo a aproximadamente el 60% de la capacidad de campo durante
el período experimental. La aireación se realizó cada dos semanas en todos los
tratamientos. Los tratamientos de adición de desechos incluyeron paja de arroz o
aserrín (0.2% en peso seco). Se agregaron nutrientes inorgánicos en forma de
(NH4) 2SO4 y K2HPO4 a todos los tratamientos para obtener tasas finales de 250
mg N kg 1 y 100 mg P kg 1. El experimento de la maceta se realizó en un
invernadero iluminado por el sol sin iluminación adicional durante cinco meses.

Al final del experimento de la maceta, parte de cada muestra de suelo se liofilizó

en un secador por congelación al vacío para detectar las concentraciones de TPH
y PAH. El resto se almacenó a 20 ° C para el análisis microbiano del suelo.

2.3. Cuantificación de TPH y PAH

Las muestras de suelo liofilizado se pasaron a través de un tamiz de 0.25 mm

antes del análisis de TPH y PAH. Los TPH extraídos de las muestras de suelo se
determinaron mediante análisis infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR). En
resumen, se extrajeron alícuotas de tierra de 5 g usando 25 ml de
tetraclorometano mediante extracción ultrasónica durante 30 minutos y luego los
extractos se centrifugaron. Los sobrenadantes se filtraron a través de papel de
filtro y se hicieron hasta 50 ml en tubos de vidrio para centrífuga. Las muestras de
suelo se extrajeron ultrasónicamente con 10 ml de tetraclorometano y se filtraron
nuevamente. Los extractos se hicieron hasta un volumen constante de 50 ml y se
homogeneizaron. Los extractos de hidrocarburos se pasaron a través de columnas
de 20 cm que contenían sulfato de sodio anhidro y florisil. Los primeros 5 ml de los
eluidos fueron descartados. El resto de los eluidos se utilizó para el análisis
utilizando un espectrómetro de aceite Modelo F2000-ⅡK FT-IR (Ou Yier, Jilin,
China). La configuración de las calibraciones estándar externas y el análisis de
cantidad siguieron el método HJ 637e2012 (China Standards Press, 2012).

Los HAP se determinaron por cromatografía de gases-espectrometría de masas

(GC-MS). Se mezclaron alícuotas de 3 g de la muestra de suelo con 3 g de sulfato
de sodio anhidro y se extrajeron usando 70 ml de diclorometano en un extractor
Soxhlet durante 24 h. Los extractos se evaporaron por rotación y los residuos se
disolvieron en 2 ml de ciclohexano.

Se pasó una parte alícuota de 0,5 ml de la solución de ciclohexano a través de

una columna de 0,5 cm (i.d.) de 20 cm que contenía 1 g de gel de sílice activado
(tamaño de malla 200e325) de arriba a abajo. La fracción de hidrocarburo
aromático policíclico se eluyó en 3 ml de una mezcla 1: 1 de diclorometano /
hexano de la columna. Los primeros 0,5 ml de eluyente se descartaron porque
contenían hidrocarburos saturados no polares y el gel de sílice retuvo menos que
los HAP. Los eluidos se concentraron a 2 ml para el análisis de GCeMS.

El análisis de GCeMS se realizó utilizando un modelo 7890 GC-5975 MSD (Agilent

Technologies, Santa Clara, CA) equipado con una columna capilar DB-5 ms
(Restek Corporation, Bellefonte, PA), 30 m 0.25 mm i.d., 0.25 mm. El gas portador
fue He a 1,4 ml min 1; la temperatura de inyección fue de 280 ° C; y el programa
de temperatura fue: 50 C (mantenido durante 3 min) a 40 C a 2 C min 1 y luego a
300 C (mantenido durante 5 min) a 25 C min 1. La configuración de las
calibraciones estándar externas y el análisis cuantitativo de diferentes fracciones
se siguieron con el método WSDE (Departamento de Ecología del Estado de
Washington, 1997).

2.4. Análisis bacteriano y fúngico

Las nueve muestras fueron enviadas a Genewiz, Inc. (Suzhou, este de China)
para el análisis de bacterias y hongos en los diferentes tratamientos.

Se extrajo el ADN de las submuestras del suelo utilizando un kit de ADN del suelo
TIANamp (Tiangen Biotech, Beijing, China). Las muestras de ADN se cuantificaron
utilizando un fluorómetro Qubit 2.0 (Invitrogen, Waltham, MA). Para la comunidad
bacteriana, se usaron 30e50 ng de ADN para generar amplicones usando un kit de
preparación de biblioteca MetaVx ™. Se seleccionaron las regiones hipervariables
V3 y V4 del ADNr 16S procariótico para generar amplicones y análisis taxonómico
posterior.

Genewiz diseñó un panel de cebadores patentados destinados a regiones

relativamente conservadas que bordean las regiones hipervariables V3 y V4 de
ADNr bacteriano y archaeal16S. Las regiones V3 y V4 se amplificaron utilizando
cebadores directos que contienen la secuencia
"CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" y cebadores inversos que contienen la
secuencia "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC". Los productos de la primera
ronda de PCR se utilizaron como plantillas para la segunda ronda de PCR de
enriquecimiento de amplicón. Los adaptadores indexados se agregaron
simultáneamente a los extremos de los amplicones de ADNr 16S para generar
bibliotecas indexadas listas para la secuenciación NGS aguas abajo en la
plataforma Illumina Miseq.

Para la comunidad fúngica, se usaron 50e100 ng de ADN para generar

amplicones usando un panel de cebadores diseñado por Genewiz. Los cebadores
de oligonucleótidos se diseñaron para recocer las secuencias relativamente
conservadas que abarcan las regiones ITS fúngicas. La región ITS2 se amplificó
usando un cebador directo que contiene la secuencia "GTGAATCATCGARTC" y
un cebador inverso que contiene la secuencia "TCCTCCGCTTATTGAT". Además
de las secuencias específicas del objetivo ITS, los cebadores también contenían
secuencias adaptadoras que permitían la amplificación uniforme de la biblioteca
con alta complejidad lista para la secuenciación NGS en la plataforma Illumina
Miseq. Las bibliotecas de ADN se validaron con un bioanalizador Agilent 2100
(Agilent Technologies, Palo Alto, CA) y se cuantificaron con un fluorómetro Qubit
2.0. Las bibliotecas de ADN se multiplexaron y cargaron en un instrumento
Illumina MiSeq de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Illumina, San
Diego, CA). La secuenciación se realizó usando una configuración de 2 300 pares
de extremos (PE). El análisis de la imagen y la llamada a la base se realizaron con
el software de control MiSeq (MCS) integrado en el instrumento MiSeq.

2.5. Análisis de los datos

El paquete de análisis de datos QIIME se utilizó para el análisis de datos 16S

rRNA e ITS rRNA. Las lecturas directas e inversas se unieron y asignaron a
muestras basadas en códigos de barras y se truncaron cortando la secuencia de
códigos de barras y cebadores. Se realizó un filtrado de calidad en las secuencias
unidas y se descartaron las secuencias que no cumplían los siguientes criterios:
longitud de secuencia <200 pb, sin bases ambiguas, puntuación de calidad media
20. Luego, las secuencias se compararon con la base de datos de referencia
(base de datos RDP Gold) utilizando el algoritmo UCHIME para detectar
secuencias quiméricas y luego se eliminaron las secuencias quiméricas. Las
secuencias efectivas se utilizaron en el análisis final. Las secuencias se agruparon
en unidades taxonómicas operativas (OTU) utilizando el programa de agrupación
VSEARCH (1.9.6) contra la base de datos Silva 119 y la base de datos UNITE ITS
preagrupada con una identidad de secuencia del 97%. El clasificador del programa
de base de datos ribosomal (RDP) se utilizó para asignar una categoría
taxonómica a todas las OTU con un umbral de confianza de 0,8. El clasificador
RDP utiliza la base de datos UNITE ITS que tiene categorías taxonómicas
predichas al nivel de especie. Las secuencias fueron enrarecidas antes del cálculo
de las estadísticas de diversidad alfa y beta. Los índices de diversidad alfa Ace,
Chao, Shannon y Simpson se calcularon usando QIIME. Los índices de riqueza
Ace y Chao se analizaron de acuerdo con Chao et al. (1993) y Chao (1984),
respectivamente. Los índices de diversidad Shannon y Simpson se analizaron
según Shannon (1948) y Simpson (1949), respectivamente. La diversidad beta se
calculó utilizando UniFrac ponderado y no ponderado y se realizó un análisis de
coordenadas principales (PCoA).

2.6. análisis estadístico

Se analizaron diferencias significativas entre los tratamientos utilizando la prueba

de rango múltiple de Duncan a p <0.05. Todos los análisis de datos se realizaron
utilizando el paquete de software estadístico SPSS para Windows versión 19.

3. Resultados

3.1. Eliminación de TPH y PAH

Los TPH y PAH en las muestras de suelo recolectadas de los tres tratamientos
fueron monitoreados después de cinco meses. La concentración de TPH en el
suelo contaminado original fue de 2278 mg L 1. Las eficiencias de eliminación de
TPH fueron 23.9, 45.2 y 27.5% en los tratamientos de Control, RF y SF,
respectivamente. La concentración final de TPHs fue menor en RF pero no hubo
diferencias significativas entre el control y SF (Fig. 2 a). El contenido de HAP en el
suelo contaminado original fue de 13.0 mg kg 1. Los HAP disminuyeron un 26,9,
30,3 y 66,3% en los tratamientos de Control, RF y SF, respectivamente.

La concentración final de HAP fue significativamente menor (P <0.05) en SF que

en el control o RF (Fig. 2 b). Las 16 especies de huellas dactilares de HAP se
dividieron en cinco grupos según el número de anillos aromáticos. La figura 3
muestra las concentraciones de diferentes números de anillos de HAP en los
diferentes tratamientos y todos los niveles de HAP en el tratamiento con aserrín
fueron significativamente más bajos que en el control.

Además, las concentraciones finales de HAP con 5e6 anillos disminuyeron más
que las de 2, 3 o 4 anillos en el tratamiento de SF (43.9, 49.1 y 54.0%,
respectivamente), disminuyendo en 60.6 y 64.8%, respectivamente, en
comparación con el control .

Fig. 2. El contenido residual de (a) TPH y (b) PAH en los diferentes

tratamientos.

Suelo original no tratado; Control, solo fertilizante; RF, paja de arroz þ

fertilizante; y SF, aserrín þ fertilizante. Las barras de error muestran la
desviación estándar (n = 3). Los valores medios seguidos de la misma letra
no son significativamente diferentes por la prueba de rango múltiple de
Duncan al nivel del 5%.

Fig. 3. Las concentraciones de grupos individuales de HAP con diferentes

números de anillo en los diferentes tratamientos. Control, solo fertilizante;
RF, paja de arroz þ fertilizante; y SF, aserrín þ fertilizante. Las barras de error
muestran la desviación estándar (n = 3). Los valores medios seguidos de la
misma letra no son significativamente diferentes por la prueba de rango
múltiple de Duncan al nivel del 5%.

3.2. Pirosecuenciación y análisis de secuencia

Se obtuvieron un total de 384,438 secuencias bacterianas y 463,077 de hongos

después del proceso de optimización de secuencia con un número promedio de
42,715 secuencias por muestra (que van de 34,884 a 65,190) y 51,453 secuencias
por muestra (que van de 38,609 a 64,128), respectivamente.
Los índices calculados de riqueza y diversidad de la comunidad bacteriana indican
diferencias en la comunidad microbiana del suelo entre los diferentes tratamientos
(Tabla 1). Los índices de riqueza Ace y Chao fueron significativamente más altos
en los tratamientos de RF y SF que en el control. El índice de Shannon fue
significativamente mayor en SF que en el control, pero el índice de Simpson no
mostró diferencias significativas entre los tratamientos. Los índices calculados de
riqueza y diversidad de la comunidad fúngica tampoco mostraron diferencias
significativas en los índices ACE, Chao, Shannon y Simpson entre los diferentes
tratamientos (Tabla 2).

El análisis de coordenadas principales (PCoA) en las matrices de disimilitud de

Bray-Curtis de las OTU al 97% de corte se realizó utilizando Rstudio versión
1.1.383 para revelar diferencias a nivel comunitario entre los diferentes
tratamientos y el control. Como se puede ver en la Fig. 4, las comunidades
bacterianas en los tratamientos modificados con paja de arroz y aserrín se
separaron del control y las muestras dentro del mismo tratamiento se agruparon.
En el caso de las comunidades fúngicas, el tratamiento de aserrín formó un grupo
separado del control y el tratamiento de la paja de arroz que se colocaron
relativamente cerca el uno del otro.

Fig. 4. Comparación de las comunidades de ADNr bacteriano 16s y ADN

fúngico ITs en los diferentes tratamientos utilizando el análisis de
coordenadas principales. Los porcentajes entre paréntesis indican las
proporciones de variación por cada eje de ordenación. Control, solo
fertilizante; RF, paja de arroz þ fertilizante; y SF, aserrín þ fertilizante.

3.3. Análisis de composición taxonómica.

La figura 5 muestra que la abundancia relativa de bacterias que degradan el

petróleo pertenecientes a los géneros Sphingomonas, Phenylobacterium y
Rhizobium aumentó en los tratamientos de SF mientras que el género Idiomarina
aumentó en el tratamiento con paja de arroz en comparación con el control. La
abundancia relativa de hongos degradantes del petróleo también mostró algunos
cambios y la abundancia relativa de Humicola y Graphium aumentó
significativamente en el tratamiento con aserrín. Específicamente, la abundancia
de Humicola fue significativamente mayor en SF que en el control o el tratamiento
con RF.

4. Discusión

La biorremediación es un método efectivo que se ha utilizado ampliamente para

remediar suelos contaminados con materiales derivados del petróleo, incluido el
petróleo crudo (Cai et al., 2016) y HAP (Rostami et al., 2016).
Los resultados de la degradación muestran que el tratamiento solo con fertilizante
eliminó el 23.9 y el 26.9%, respectivamente, de TPH y PAH del suelo
contaminado. Esto puede deberse en parte a la adición de (NH4) 2SO4 y KH2PO4
como nutrientes suplementarios. Los desechos agrícolas y forestales se han
utilizado ampliamente con gran éxito en los últimos años para eliminar los
contaminantes orgánicos de los suelos contaminados (Wu et al., 2011; Alotaibi et
al., 2018). En el presente estudio, encontramos que dos enmiendas comunes de
desechos agrícolas y forestales aumentaron la disipación de TPH y PAH de los
microcosmos del suelo.

La adición de paja de arroz aumentó la eficiencia de eliminación de TPH en

comparación con el control y SF (Fig. 2 a). Un estudio anterior informó que la
degradación de TPH en el suelo puede promoverse modificando las propiedades
fisicoquímicas del suelo (Akbari et al., 2015). Por lo tanto, planteamos la hipótesis
de que la disipación de la TPH en nuestro estudio puede atribuirse a la estructura
hueca de la paja que puede permitirle aumentar la aireación del suelo. Esta
estructura podría hacer que el suelo modificado sea un hábitat más adecuado para
los microorganismos que degradan los TPH. Alotaibi y col. (2018) concluyeron que
la paja de trigo cuando se aplica al suelo contaminado con petróleo crudo tiene un
importante efecto estimulante sobre la respiración microbiana del suelo y la
mineralización orgánica de C.

Fig. 5. La abundancia relativa de taxones degradantes del petróleo (a)

bacterianos y (b) fúngicos a nivel de género en los diferentes tratamientos.
Las barras verticales muestran la desviación estándar (n = 3). Las columnas
con la misma letra no son significativamente diferentes por la prueba de
rango múltiple de Duncan al nivel del 5%. Control, solo fertilizante; RF, paja
de arroz þ fertilizante; y SF, aserrín þ fertilizante.

Los HAP son fuertemente hidrófobos y poco solubles en agua y, por lo tanto, son
más resistentes a la degradación (Balachandran et al., 2012). En nuestro estudio
hubo una mayor tasa de degradación de HAP en el tratamiento con aserrín (Fig. 2
b). Esto puede deberse a diferencias en la composición de los dos materiales de
desecho. La paja y el aserrín son materiales lignocelulósicos y los estudios
anteriores muestran que el contenido de lignina del aserrín es un 15% mayor que
el de la paja común (Sheng, 2006). Llado y col. (2013) informaron que se logró
una disminución en los HAP mediante la adición de materiales ricos en lignina
porque las enzimas ligninolíticas como LiP, MnP y lacasa tienen capacidades
excepcionales para la transformación de HAP y pueden contribuir a la disipación
de HAP en el suelo a través de mecanismos co-metabólicos. Estas proteínas
están involucradas en la hidroxilación de los anillos aromáticos, que contribuyen a
la oxidación de los intermedios resultantes y son responsables de la escisión de la
estructura del anillo terminal (Haritash et al., 2009). Esto es consistente con
nuestro estudio en el que se produjo una mayor tasa de degradación de los HAP
en el tratamiento con aserrín. Los compuestos con las estructuras más complejas,
que contienen cinco o más anillos de benceno en sus moléculas, es decir, HAP de
alto peso molecular, se consideran los más tóxicos, mutagénicos y cancerígenos
(Alagic et al., 2016). En nuestro estudio, se observó una disminución mucho mayor
en los HAP del anillo 5e6 que en los compuestos del anillo 2e4 en el suelo SF
(Fig. 3).

La disipación de los hidrocarburos del petróleo generalmente se atribuye a los

microbios indígenas (Wloka et al., 2017). El análisis de la comunidad microbiana
se realizó mediante secuenciación de alto rendimiento para alcanzar una mejor
comprensión de los procesos biológicos de degradación del petróleo después de
la biorremediación. El análisis de PCoA (Fig. 4) basado en la composición de OTU
muestra que la comunidad bacteriana estaba claramente diferenciada entre el
control y las enmiendas de desechos agrícolas y forestales (RF y SF). Además,
los índices de riqueza y diversidad de bacterias (Tabla 1) muestran que los índices
Ace y Chao y el índice de Shannon aumentaron en RF y SF en comparación con
el control. Sin embargo, solo el tratamiento de adición de paja de arroz mostró una
disminución significativa en la degradación de TPH en comparación con la adición
de aserrín. Observamos un cambio entre diferentes géneros de bacterias y hongos
y varios grupos de bacterias y hongos parecían enriquecerse en el tratamiento de
la paja de arroz. La figura 5 muestra la abundancia relativa de taxones bacterianos
y fúngicos que degradan el petróleo a nivel de género en los diferentes
tratamientos. Lysobacter dominó la g-proteobacteria fue enriquecido en el
tratamiento de paja de arroz. Se ha informado que esta bacteria es un degradante
de hidrocarburos de petróleo (CervantesGonzalez et al., 2009). Algunos otros
géneros que pertenecen a las g-proteobacterias como Luteimonas, Arenimonas e
Idiomarina también son potenciales degradadores del petróleo (Kim et al., 2018; Ni
et al., 2017; Gomes et al., 2018). Se ha informado que Idiomarina muestra un gran
potencial tanto para la biodegradación de los hidrocarburos (Bayat et al., 2016)
como para la emulsificación o reducción de la tensión superficial (Malavenda et al.,
2015). Brevundimonas pertenece a una proteobacteria involucrada en la
degradación de hidrocarburos (Phillips et al., 2008). Se informó que la abundancia
relativa de hongos que degradan el petróleo enriquecidos en el tratamiento de RF
como Penicillium, Wallemia y Acremonium tienen la capacidad de degradar
hidrocarburos (Khan et al., 2016; Zheng et al., 2003; Ma et al., 2015 )

Por lo tanto, nuestros resultados destacan la importancia de estos taxones

microbianos en la descomposición del petróleo, mientras que la diversidad de la
comunidad del suelo no tiene conexión directa con la disipación de hidrocarburos.
Esto está de acuerdo con Hou et al. (2015), quienes encontraron que la eficiencia
de eliminación no estaba relacionada con la diversidad bacteriana, pero ciertos
microorganismos fueron estimulados selectivamente y jugaron un papel importante
en la disipación del petróleo.

En el caso de los hongos, el tratamiento de adición de aserrín se diferenciaba

significativamente del control y el tratamiento con paja de arroz, pero las
comunidades fúngicas en el control y la RF no divergían significativamente (Fig.
4). Los índices calculados de riqueza y diversidad de la comunidad fúngica no
muestran diferencias significativas en términos de los índices Ace, Chao, Shannon
y Simpson en los diferentes tratamientos (Tabla 2). El tratamiento con aserrín tuvo
la mayor eficiencia de degradación de los HAP (66.3%) que fue significativamente
mayor que el control (26.9%) o el tratamiento con paja de arroz (30.3%). El
análisis de la composición de la comunidad muestra que varios microbios
degradantes del petróleo aumentaron en el tratamiento con aserrín en
comparación con el control y la RF. Por ejemplo, se ha informado que las
bacterias Thermomonas, Sphingomonas, Gemmatimonas, Phenylobacterium y
Rhizobium están asociadas con la descomposición del petróleo (de la Cueva et al.,
2016; Zhao et al., 2017; Freire et al., 2017; Zhang et al., 2016; Ni et al., 2017).
Además, Sphingomonas y Phenylobacterium están fuertemente asociadas con
afecciones que exhiben una mayor eliminación de HAP (Bacosa et al., 2015;
Singleton et al., 2016). Se ha informado que los hongos Humicola, Scedosporium,
Trichocladium y Graphium son potenciales degradadores del petróleo (Cerniglia et
al., 2010; Morales et al., 2017; Alegbeleye et al., 2017; Chandra et al., 2013). La
abundancia relativa de Humicola en los Agaricomycetes fue significativamente
mayor en el tratamiento de aserrín con un valor máximo de 18.59%. Se sabe que
Humicola degrada los HAP con tres o más anillos (Cerniglia et al., 2010). En
particular, el tratamiento con aserrín tuvo una mayor eficiencia de eliminación de
HAP. La abundancia enriquecida de Humicola puede haberse asociado con la
disminución del contenido de HAP. Además, se ha informado que Trichocladium
produce enzimas ligninolíticas (Silva et al., 2010) que pueden transformar los HAP
a través de mecanismos cometabólicos.

5. Conclusiones

Un residuo agrícola y uno forestal se aplicaron para remediar un suelo

contaminado con petróleo en un experimento de maceta. La adición de paja de
arroz o aserrín resultó en una disminución significativa en TPH y PAH,
respectivamente. Además, los HAP del suelo disminuyeron claramente en
comparación con el suelo original. Las eficiencias de remoción de HAP fueron
26.9, 30.3 y 66.3% en los tratamientos de control y RF y SF, respectivamente. El
análisis de coordenadas principales (PCoA) indica que las comunidades
bacterianas dentro de los diferentes desechos eran distintas y que ambos
tratamientos eran claramente diferentes del control, mientras que la comunidad
fúngica en el tratamiento con aserrín se diferenciaba significativamente del control
y el tratamiento con paja de arroz.

La eficiencia de eliminación no se relacionó con la diversidad bacteriana, sino más

bien con el efecto selectivo de comunidades microbianas específicas en la
biorremediación. El análisis de composición de la comunidad muestra que la
abundancia de taxones que degradan el petróleo, como las bacterias
Sphingomonas, Phenylobacterium y los hongos Humicola y Graphium, aumentó
después de la adición de paja de arroz y aserrín. Por lo tanto, el estudio actual
destaca el potencial de estos taxones microbianos en la disipación de petróleo
para aprovechar su potencial para una mayor efectividad de remediación en
condiciones de campo.