Dra. Sandra L.

Cabrera Hilerio
Cada proteína tiene características que la hacen
única como:

 Tamaño
 Carga
 Solubilidad
 Actividad Biológica

Considerando lo anterior se realiza purificación de

proteínas haciendo uso de diferentes técnicas.
Considerando lo anterior se realiza purificación de proteínas haciendo uso de
diferentes técnicas. Para purificar una proteína debe considerarse antes de iniciar:

• Localización de la proteína
Exógena
Endógena
En el Citoplasma
Dentro de un organelo

En caso de ser una proteína endógena

• Fuente de la proteína debe realizarse la lísis celular eligiendo el
• Rendimiento de la fuente método más adecuado y evitando la
• Accesibilidad de la fuente desnaturalización de la proteína de interés

.
 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN CONSIDERANDO EL TAMAÑO DE LA
PROTEÍNA

 Ultrafiltración
 Diálisis
 Cromatografía de exclusión molecular

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN CONSIDERANDO LA CARGA DE LA

PROTEÍNA

 Cromatografía de Intercambio iónico (Para eluír a las proteínas se usa un

gradiente de fuerza iónica en lugar de uno de pH para evitar la
desnaturalización proteica).
 Electroforesis

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN CONSIDERANDO LA SOLUBILIDAD

DE LA PROTEÍNA

* Punto isoeléctrico
* Salado
* Cambio de solventes
 Ultrafiltración

 Se utilizan membranas que pueden estár

formadas por polímeros muy finos que varía
entre 0.2 y 10 nm, montado sobre una capa
de soporte gruesa (0.05-0.25 mm de
espesor), con poros muy grandes.
 Estas membranas pueden utilizarse para
procesos de concentración (empleando una
membrana a través de la cual sólo pase
agua), y de eliminación de sales en
preparaciones para cromatografía, y
fraccionamiento por tamaño molecular.
 Ultrafiltración
 La velocidad de flujo a través de
estas membranas es tan baja que
debe aplicarse presión (aire
comprimido o nitrógeno, hasta a 5
atmósferas).

 La molécula sedimenta hasta que

se localiza en una zona cuya
densidad es igual a la suya.

 El peso molecular se detecta

midiendo la velocidad del
movimiento de la muestra, ésta se
mide en unidades Svedberg (1 S =
1 X 10-13 segundos) y se considera
entre otros parámetros la velocidad
Por lo general, para utilizar estas
angular del rotor, distancia recorrida
membranas se necesitan soportes
por la muestra, fuerza de fricción y
especiales
la densidad del solvente.
 Diálisis
Diálisis
• La diálisis es uno de los métodos de filtración
molecular más utilizados
• Se coloca una solución acuosa que contiene
moléculas de distintos tamaños dentro de una bolsa
de diálisis que se encuentra a su vez sumergida en un
gran volumen de un buffer determinado
• Las moléculas pequeñas del soluto (excepto aquellas
que se encuentran fuertemente cargadas) pasan
libremente a través de la membrana, hasta alcanzar el
equilibrio.
• Reemplazando la solución externa repetidas veces,
puede lograrse reducir la concentración de las
moléculas pequeñas a valores prácticamente
despreciables.
• El agua pasa también libremente a través de la bolsa,
ocasionando así concentración o dilución,
dependiendo de si la solución interna se encuentra
más o menos concentrada que la externa (efecto
osmótico).
Diálisis
 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN o
FILTRACIÓN EN GEL

 El gel debe estabilizarse al pH del

buffer utilizado durante la
separación para mantener el
tamaño del poro constante.

 Las moléculas más grandes

atraviesan la columna utilizando
los espacios que dejan las villas
del gel haciendo su recorrido en
poco tiempo mientras, que las
moléculas más pequeñas “caen”
al interior de las villas lo que
retarda su movimiento en la
columna.
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
En esta técnica se mantienen unidos los aminoácidos a la
resina, debido a la formación de enlaces de tipo iónico; el
orden de fijación dependiente de la carga e intensidad de
la misma es:
o Polares básicos
o No polares
o Polares sin carga
o Polares ácidos

Para lograr la elución (salida) de los aminoácidos es

necesario hacer pasar por la resina soluciones buffer de pH
creciente y de manera continua. El orden de elución es
inversa a la de fijación.
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
Para esta cromatografía se
usa una resina con grupos
cargados negativamente.

Debido a que se parte del

hidrolizado ácido, todos los
aminoácidos tienen carga
positiva y se fijan a la
columna desplazando a iones
sodio de la siguiente manera:
 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
a.a.+

O O
-
S O +Na -
S O +a.a.
O O
O O
-+ -+
S O Na S O Na
O O
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
 ELECTROFORESIS
Tipos de Electroforesis

TIPOS DE ELECTROFORESIS
• PAGE Nativa
• PAGE SDS
• PAGE + condiciones reductoras
• Isoelectroenfoque
• Bidimensional
PAGE-SDS
PAGE SDS

 Permite el cálculo de parámetros

moleculares, pues los complejos SDS-
proteína se separan estrictamente
según su tamaño molecular.
 El SDS interacciona con las proteínas
formando complejos de características
comunes independientemente de las
de cada proteína.
 Las proteínas unen una molécula de
SDS por cada dos aminoácidos, lo que
implica que las cargas propias de las
proteínas quedan enmascaradas o
anuladas
 Medios de soporte para realizar la electroforesis

Papel: sencillo, pero con elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo
de la celulosa.

Acetato de celulosa: los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la

adsorción; baja tinción de fondo; es posible transparentarla o disolverla
para detectar y recuperar los componentes separados.

Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un tampón

caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por
la poliacrilamida.

Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar

al agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica
formando un gel, de alta porosidad.

Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerización química de una

mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración de
ambas y su proporción se consiguen distintas porosidades, siempre
menores que la de los geles de agarosa.
Agarosa+poliacrilamida: porosidad intermedia.

Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate) es un

detergente aniónico que se une a las proteínas, desnaturalizándolas en una
conformación extendida recubierta de moléculas de SDS. Como consecuencia, el
tamaño de la molécula de proteína es directamente proporcional a su longitud en
aminoácidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la
recubre, que es también proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad
electroforética de la proteína depende exclusivamente de su masa molecular.

H-(CH2)12-SO4−
En cuanto a la composición del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un solo
tipo de gel) y electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composición ligeramente
diferente).
 Isoelectroenfoque
Se trata de una variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un
gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo en su preparación
moléculas ionizables con valores de pK diferentes. Como consecuencia, al avanzar los
componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en entornos de pH
diferente, y eventualmente alcanzan una región en la cual el pH es igual al punto
isoeléctrico de la molécula muestra y, en consecuencia, ésta detiene su avance. Se
alcanza, pues, un equilibrio y se consigue la separación de los componentes de la
muestra de acuerdo con su punto isoeléctrico, que además se puede medir, pues se
conoce el gradiente de pH del gel.
Isoelectroenfoque
 Electroforesis bidimensional
Tras realizar una primera separación su resultado se somete a otra de diferente
mecanismo en dirección perpendicular. Generalmente la primera es un
isoelectroenfoque en un gel cilíndrico estrecho que luego se coloca como muestra para
una SDS-PAGE. Se obtienen así mapas complejos de bandas, muy característicos de cada
muestra, cuya utilidad principal es la comparación con el obtenido de otra muestra
similar pero conocida
Bidimensional
 TÉCNICA DE SALADO

Está técnica se basa en el uso de sales la

cual va a reaccionar con la proteína y hará
que se precipiten en función del número
de residuos hidrofilicos que tengan ya que
son estos los que en lugar de
interaccionar con el agua interaccionan
con la sal.

Sulfato de amonio es una sal divalente, hace que una mayor

cantidad de moléculas de agua para solvatar los iones de sal
presentes. De esta manera existe una menor cantidad de
moléculas de agua disponibles para interactuar con la proteína y
las interacciones proteína-proteína aumentan y la hacen
precipitar.
 TAREA

 Repasar, aprender e identificar cada fundamento de las

técnicas empleadas en la purificación de proteínas
 Mapa conceptual