1.
FUNFAMENTOS La energía total emitida en forma de luz es siempre menor
En la espectroscopia de fluorescencia, las especies son
las primeras en ser excitadas mediante la absorción de un
fotón, desde su estado electrónico fundamental, a uno de
los diversos estados vibratorios en el estado electrónico
excitado. La molécula luego vuelve a declinar a uno de los
varios niveles de vibración del estado electrónico
fundamental emitiendo un fotón en el proceso. Como las
moléculas pueden decaer en cualquiera de los varios
niveles vibratorios en el estado fundamental, los fotones
emitidos tendrán entonces diferentes energías, y de este
modo diferentes frecuencias.
El paquete de software (programa de computador)
FluSpec es una herramienta educativa que contiene una
serie de experimentos en espectroscopia de fluorescencia
que se pueden simular bajo ciertas condiciones. El
procedimiento que se debe seguir para cada uno de los
experimentos a simular esta contenido también en el
paquete de datos del programa y de la misma forma se
encuentra un paquete con los resultados que se pueden
obtener con dicho software.
La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia,
que caracteriza a las sustancias que son capaces de
absorber energía en forma de radiaciones
electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en
forma de radiación electromagnética de longitud de
onda diferente.1
a la energía total absorbida y la diferencia entre ambas es
disipada en forma de calor. En la mayoría de los casos la
longitud de onda emitida es mayor -y por lo tanto de menor
energía- que la absorbida, sin embargo, si la radiación de
excitación es intensa, es posible para
un electrón absorber dos fotones; en esta absorción
bifotónica, la longitud de onda emitida es más corta que la
absorbida, sin embargo en ambos casos la energía total
emitida es menor que la energía total absorbida.
En general las sustancias fluorescentes absorben energía
en forma de radiación electromagnética de onda corta (p
ej radiación gamma, rayos x, UV, luz azul, etc), y luego la
emiten nuevamente a una longitud de onda más larga, por
ejemplo dentro del espectro visible; los ejemplos más
notables de fluorescencia ocurren cuando la luz absorbida
se encuentra dentro del rango ultravioleta del espectro -
invisible al ojo humano- y la luz emitida se encuentra en la
región visible.
El mecanismo de fluorescencia típico implica tres pasos
secuenciales, llamados respectivamente absorción (1),
disipación no radiativa (2) y emisión (3).
El ciclo completo es muy breve, transcurre en tiempos del
orden de los nanosegundos, por lo que puede
considerarse prácticamente instantáneo. Es este tiempo
tan corto lo que diferencia a la fluorescencia de otro
conocido fenómeno luminoso, la fosforescencia. El
mecanismo de fluorescencia también se encuentra muy
relacionado con el proceso de quimioluminiscencia.
Las sustancias que son capaces de emitir luz al ser
excitadas por diferentes tipos de radiación se
denominan fluoróforos. Es posible obtener una amplia
variedad de colores por fluorescencia, dependiendo de la
longitud de onda que emita el compuesto fluorescente.
El fenómeno de fluorescencia posee numerosas
aplicaciones prácticas, entre las que se encuentran por
ejemplo análisis en mineralogía, gemología, sensores
químicos (espectroscopia fluorescente), pigmentos y
tintas, detectores biológicos y lámparas fluorescentes.
* Fluorómetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz
incidente y la luz fluorescente.
* Espectrofluorómetros. Usan monocromadores de
retículo de difracción para aislar la luz incidente y la luz
fluorescente.
Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente
esquema. La luz de una fuente de excitación pasa a
través de un filtro o monocromador, e incide sobre la
muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por
la muestra, y algunas de las moléculas de la muestra
producen una fluorescencia. La luz fluorescente es
emitida en todas las direcciones. Parte de esta luz
fluorescente pasa a través de un segundo filtro o
monocromador y llega a un detector, el cual muy a
menudo se encuentra a 90° con respecto al haz de luz
incidente para minimizar el riesgo de que la luz
incidente reflejada o transmitida llegue al detector.
Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como
fuentes de excitación, incluyendo el láser, fotodiodos y
lámparas; arcos de xenón y lámparas de vapor de
mercurio. Un láser sólo emite luz de alta irradiancia en
un intervalo muy estrecho de longitudes de onda, por
lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el
monocromador de excitación o el filtro. La desventaja
de este método es que la longitud de onda de un láser
no se puede cambiar mucho. Una lámpara de vapor de
mercurio es una lámpara lineal, lo que significa que
emite luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el
contrario, un arco de xenón tiene un espectro de
emisión continuo con intensidad casi constante en el
rango de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para
las mediciones hasta justo por encima de 200 nm.
En los fluorímetros pueden usarse filtros y/o
monocromadores. Un monocromador transmite luz de
una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo
más común de monocromador utiliza un retículo de
difracción; es decir, la luz colimada entra en una rejilla
y sale con un ángulo diferente dependiendo de la
longitud de onda. El monocromador puede entonces
seleccionar qué longitudes de onda transmite. Para
permitir mediciones de anisotropía se añaden dos
filtros de polarización: uno después del monocromador
de excitación o filtro, y otro antes del monocromador
de emisión o filtro.
 2. CONCEPTOS
Fluorescencia: Es un proceso de emisión en el cual
las moléculas son excitadas por la absorción de
radiación electromagnética y al relajarse al estado
basal liberan el exceso de energía en forma de fotones.
Espectrofotometría de Fluorescencia: también
llamada espectrofotometría es un tipo
de espectroscopia electromagnética, la cual analiza la
fluorescencia de una muestra. La cual consiste en
medir la cantidad de energía radiante que absorbe una
molécula en razón a una longitud de onda incidente.
ESPECTROSCOPIA:
La espectroscopia o espectroscopia es el estudio de la
interacción entre la radiación electromagnética y la
materia, con absorción o emisión de energía radiante.
Tiene aplicaciones
en astronomía, física, química y biología, entre
otras disciplinas científicas
El análisis espectral se basa en detectar la absorción o
emisión de radiación electromagnética a
ciertas longitudes de onda, en relación con los niveles de
energía implicados en una transición cuántica.
Existen tres casos de interacción con la materia:
 choque elástico: existe sólo un cambio en el impulso
de los fotones (por ejemplo, los rayos X, la difracción
de electrones y la difracción de neutrones);
 choque inelástico: por ejemplo, la espectroscopia
Raman;
 absorción o emisión resonante de fotones.
3. PROCEDIMIENTO
UN EXPERIMENTO SIMULADO CON
ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
Para la simulación de experimentos en
espectroscopia de fluorescencia se utilizó el
programa o software educativo FluSpec que contiene
una serie de experimentos que son posibles ser
desarrollados mediante un proceso de simulación.
En primera instancia se reconoce el programa a utilizar, y se hace
un recorrido y explicación acerca de dicho software. Luego se
asigna a uno de los experimentos que eran posibles simular.
Se investigó entonces, el efecto de la excitación de longitud de
onda sobre el espectro de emisión de excitación a 280, 300,
375 y 390 nm.
De este modo se registraron los valores de longitud de onda para
los cuales en el espectro se presentaba un mayor valor de
intensidad de luz.