ATLA 44, 239-253, 2016 239

Más de 70 años de detección de pirógenos: Perspectivas estado actual y futuro

Stefan Fennrich, Ulrike Hennig, Leila Toliashvili, Christian Schlensak, Hans Peter Wendel y Sandra Stoppelkamp

Laboratorio de Investigación Clínica, Clínica de Tórax, Cirugía Cardiaca y Vascular, Hospital de la Universidad de Tubinga, Alemania

Resumen - En el control de calidad de productos médicos, pruebas de esterilidad son esenciales. Para los productos farmacéuticos parenterales, evitando la
presencia de pirógenos es crucial. Estas sustancias fiebre inducida por endotoxinas (y no-endotoxinas) no son eliminados por procesos de esterilización
estándar, y son biológicamente activos una vez en el torrente sanguíneo, causando riesgos para la salud humana, que van desde reacciones leves (por
ejemplo, fiebre) a un shock séptico y la muerte. Por lo tanto, para las formulaciones inyectables, pruebas de pirógenos es obligatorio. Con los años, se han
introducido diversos métodos de prueba de pirógenos, a saber: en la década de 1940, la prueba de pirógenos en conejos, que es una

en vivo prueba que mide la reacción de la fiebre como un punto final; en la década de 1970, el Limulus Lisado de amebocitos de prueba (LAL), que es
una in vitro prueba (con la hemolinfa del cangrejo de herradura) que detecta específicamente endotoxina; y en 2010, el Test de monocitos-activación
(MAT), que es un no animal basado in vitro ensayo de pirógenos que representa un reemplazo completo de la prueba de conejo. Debido a la ubicuidad
y la importancia biológica de pirógenos, actualmente estamos desarrollando aún más la MAT para que pueda ser utilizado para otras aplicaciones.
Más específicamente, nuestra atención se centra en la detección de la contaminación pirogénica en dispositivos médicos, así como en la medición de
la calidad del aire. Además, mejoras adicionales para permitir el uso de sangre criopreservados en el MAT, para superar las limitaciones en la
disponibilidad de sangre extraída recién de donantes humanos, están en curso.

palabras clave: endotoxinas, sustancias que inducen fiebre, LAL, ensayo de Limulus lisado de amebocitos, MAT, monocitos de activación de prueba,
ensayo de pirógenos.

Dirección para la correspondencia: Sandra Stoppelkamp, ​Klinisches Forschungslabor, Klinik für Thorax-, Herz und Gefäßchirurgie,
Universitätsklinikum Tübingen, Calwerstrasse 7/1, D-72076 Tübingen, Alemania.
Email: sandra.stoppelkamp@klinikum.uni-tuebingen.de

Introducción liberación sive de moléculas de LPS representa un período crítico al

Los pirógenos son sustancias que inducen fiebre que, cuando se
introduce en el torrente sanguíneo, pueden causar fiebre o síntomas
más graves, tales como shock séptico y la muerte, en los seres
humanos y otros mamíferos. Como grupo, los pirógenos consisten en
una amplia gama de sustancias, principalmente de origen microbiano.
Dado que estos pirógenos no son inherentes en el cuerpo humano, que
fueron nombrados pirógenos exógenos (1, 2). La mejor ca- racteriza de
estos son las endotoxinas (caminatas lipopolysaccha- [LPS] de la pared
celular externa de las bacterias Gram-negativas; 3-6). Sin embargo, los
no-endotoxinas, tales como ácido lipoteicoico (7), péptidos de muramilo
y doglycans pepti- de bacterias Gram-positivas (8, 9), fúngicas y
componentes virales (10-13), y parásitos (14,
15) también son capaces de causar reacciones pirogénicas. Incluso
estructuras no microbianas, tales como proteínas no hospedantes y
sustancias químicas o sustancias abióticos (objetos ficiales arti- o caucho),
pueden ser pirógeno (16). Las endotoxinas son los pirógenos más potentes
actual- mente conocidos. Estas moléculas de LPS por lo general no se
secretan al igual que otras exotoxinas bacterianas, pero pueden ser
liberados por las células muertas o vesículas de membrana desprendidas
de bacterias que viven en su entorno durante la división celular (17, 18). El
repentino y Mas-
comienzo de la terapia con antibióticos de los pacientes sis SEP (19).
Como ya se mencionó, las endotoxinas son bien caracterizados, y la
mayor parte del conocimiento actual sobre el mecanismo de las
reacciones pirogénicas origina a partir de experimentos realizados con
moléculas de LPS purificados de origen natural y endotoxinas en
mamíferos o voluntarios humanos (20-
22).
contaminación pirogénica, reconocido por monocitos de la sangre
periféricas y macrófagos, estimula la liberación de citoquinas
pro-inflamatorias. Estos fueron nombrados originalmente pirógenos
endógenos, pero con un mayor conocimiento, las citoquinas
pirogénicas o citoquinas pro-inflamatorias se convirtieron en los
términos aceptados (revisado por Dinarello [21]). La existencia de las
citoquinas pro-inflamatorias en relación con la contaminación
pirogénica fue descrito por primera vez en 1948 por Beeson, que se
encendió para identificar los llamados 'Cyte-pirógenos leuko-' como
mediadores de la fiebre (23). Un bien investigado y importante de
citoquinas pirogénicas es la interleuquina 1 β ( IL-1 β; 22, 24); otras
citoquinas pirogénicas, tales como TNF e IL-6, también se han
identificado (22, 24). Las tres citoquinas pirogénicas juegan un papel
clave en la patogénesis de la fiebre, y se capa- ble de inducir
reacciones pirogénicas en ausencia de
240 S. Fennrich et al.

pirógenos exógenos (22, 24-26). Estos estudios (21- Figura 1: La fisiopatológico

26) reveló el mecanismo detrás de la fiebre reac- ción: pirógenos mecanismo de la fiebre
exógenos estimulan a las células fagocíticas, o células endoteliales
sistémicos, a través de receptores de tipo Toll (TLRs), que inician la
producción y liberación de citoquinas pirogénicas. Estos cito
pro-inflamatoria - kines entonces alcanzar el sistema nervioso central a pirógeno exógeno pirógeno exógeno
través de la corriente sanguínea y son reconocidos por citoquinas tors
recep- en la terminalis organum vasculosum láminas (OVLT; 22, 24,
27), donde la expresión de oxi cyclo - genase (COX ) -2 es inducida.
Circulantes pirógenos exógenos (por ejemplo, endotoxinas) son
Las citoquinas
capaces de inducir la expresión COX-2 a través de TLR-2 / -4 en el células endoteliales
pro-inflamatorias secretadas por
OVLT de forma independiente de citoquinas (21). Sub sequently, Hipotálamo
fagocitos
COX-2 inicia la síntesis de la prostaglandina (PGE 2),

que a su vez se une a la EP 3 receptor en el OLVT del hipotálamo.

Estos eventos son fundamentales para el desarrollo de la fiebre en
respuesta a la PGE 2, LPS o IL-1 β ( 27). La Figura 1 ilustra los
procesos implicados en la inducción de fiebre.

Los métodos de prueba utilizados para la detección de

pirógenos proteínas de fase Prostaglandina (PGE 2)
aguda síntesis de cAMP
Debido a las reacciones patológicas descritas a piro- contaminación
génica, es de suma importancia que se evite la contaminación durante
el proceso de fabricación de productos farmacéuticos parenterales y
dispositivos médicos, y se identifica si se produce. Por lo tanto, la La liberación de cAMP
detección de pirógenos es crucial para la garantía de calidad y
seguridad de los productos en la producción de medicamentos
inyectables, dispositivos médicos, productos biológicos y otras
sustancias que serán, directa o indirectamente, introducidos en el unidad de termorregulación
torrente sanguíneo. de hipotálamo aumenta la
temperatura
punto fijo

El conejo prueba de pirógenos

producción de calor /
El conejo prueba de pirógenos (RPT) se estableció como el
mecanismo de conservación
método tradicional para la evaluación de la contaminación
pirogénica en productos parenterales (revisado por Schindler et al.
[ 25]). En este clásico
en vivo prueba, que se introdujo en 1942, los conejos se colocan y
se asegura en cajas estrechas, donde se les permite aclimatarse Fiebre
Adaptado de Dinarello (21).
antes de inyectar la sustancia de ensayo en la vena de la oreja
superior de al menos tres conejos por cada dilución de sustancias.
Su temperatura corporal se controla por vía rectal, y un aumento
sustancias que no pueden ser inyectados por vía intravenosa (tales como
indica la presencia de inación contami- pirógeno en la sustancia de
formulaciones lipídicas) no pueden ser probados, ni pueden proteínas y
ensayo. Mientras que la RPT potencialmente puede detectar toda
soluciones de proteína (por ejemplo, productos de la sangre), ya que
contaminación pirogénica, tiene varias desventajas. La restricción
podría causar una respuesta láctico anaphy-. Especialmente durante la
esencial animal durante esta prueba, así como las condi- ciones en
implantación de dispositivos médicos en los conejos, que aún se realiza a
las que viva los animales, pueden influir en el resultado, y pueden
veces como un procedimiento de prueba de la calidad en lugar de la
conducir a resultados inexactos (28). Las especies de conejo
utilizado también desempeña un papel, ya que hay diferencias utilización de materiales eluidos, reacciones locales en el procedimiento

específicas de la especie en la sensibilidad a pirógenos / de implantación que no están aso- ciados con la contaminación, puede
endotoxinas (29). Además, el RPT tiene otras limitaciones ocurrir (30 ). Debe tenerse en cuenta que esta prueba animal nunca se
inherentes: validó formalmente y sus resultados no son directamente
perspectivas del estado actual y futuro de la detección de pirógenos para productos médicos 241

transferibles a los seres humanos. A pesar de sus deficiencias Figura 2: Cronología de ensayo de pirógenos
mencionadas y su incompatibilidad con algunos productos desarrollo
farmacéuticos modernos (debido a la interferencia acterised unchar-),
todavía se ve como el 'patrón oro' para la detección de pirógenos
(31). 1940
prueba de pirogenicidad de
El RPT es probable que cause estrés a los animales debido al alto
conejo estandarizada
nivel de restricción (por períodos de tres horas) y la invasividad
1942-1943
involucrados en el procedi- miento. Cada año, más de 10.000 conejos
todavía se utilizan para las pruebas de drogas por vía parenteral en
Europa (26,
1950
32). A pesar de las desventajas conocidas, el RPT tiene una ventaja
sobre otras pruebas de endotoxina, es decir, su capacidad para
detectar no sólo las endotoxinas, sino también pirógenos coagulación de

uncharacterised en líquido sam- ples. La Figura 2 muestra la línea de Limulus hemolinfa 1956
tiempo de la desa- rrollo de pirógenos y ensayo de endotoxina.
1960

los Limulus Lisado de amebocitos de prueba (LAL)

Con la identificación de endotoxinas como los pirógenos más hemolinfa 1968 Enfermedad bacteriana provoca la
1970
potentes (33, 34), esta clase particular de sustancias convirtió en el
prueba estándar LAL 1971
centro de control de calidad. El descubrimiento por Bang (en 1956),
que las bacterias Gram-negativas causan la coagulación de
cangrejo de herradura ( Limulus polyphemus) sangre (hemolinfa), y la
posterior identificación de LPS como el componente estructural
responsable de esta reacción, condujeron al desarrollo de la Limulus 1980
Lisado de amebocitos (LAL) de prueba (35, 36).

activación (MAT) 2001-2005 LPS provoca la coagulación de Limulus

La Figura 3 ilustra los principios básicos de la cascada de FDA directriz final sobre LAL prueba 1987
coagulación, en el que una serie de zimógenos (pro-enzimas) se
activan consecutivamente (37, 38) para culminar en la formación de 1990

una proteína similar a un gel llamado coagulina. El contacto con

endotoxina pone en marcha la cascada de coagulación con la
In vitro desarrollo de la prueba de pirógenos 1995
activación de tres proenzimas: Factor C, Factor B y por último, la
enzima de coagulación de la pro- (38, 39). Este último realiza una
etapa de proteolisis ITED limi- en la parte interna de coagulógeno, y
2000
los péptidos restantes están unidas por puentes disulfuro a la In vitro validación ensayo de pirógenos monocitos prueba de
coagulina insoluble. moléculas coagulina finalmente se asocian para
formar una masa gelatinosa (39, 40). Coagulógeno no se limita a Limulus,
y es una proteína importante en la linfa haemo- de muchos
invertebrados. Su papel como Strate sub- en la formación del
coágulo fue descrita extensamente por Nakamura (40, 41) y 2010
MAT está incluido en el
Mosesson (42). La prueba de LAL tiene un mayor nivel de Farmacopea Europea 2010
sensibilidad (0.005EU / ml [unidades de endotoxina por ml]; 43) En
comparación con el RPT, por ejemplo, en 0.5-3EU / ml (31). Sin
embargo, también se coagula hemolinfa in vitro en presencia de otras
sustancias que son inofensivas para los seres humanos, tales como
sales con cationes divalentes, quelantes, ácidos, antibióticos y
Nueva generación
proteínas (44, 45). Los antibióticos que son conocidos por interferir
ensayo de endotoxina: Un mayor desarrollo de LAL (pruebas RFC). ensayos de pirógenos: El
con la prueba incluyen tetraciclina, aminoglucósidos, macro - lides y desarrollo adicional de la estera (formato del mismo día / pruebas para dispositivos médicos
clindamicina, y ejemplos de interferir proteínas incluyen albúmina y de calidad / aire).
la trombina (43, 46,

47). Además, como la enzima proclotting puede ser activado a
través de una ruta alternativa por algunos no
Adaptado de Flint (122). Fuentes de las imágenes: UKT, Dr. med Stefan
RM Fennrich, PW Fofonoff, GM Ruiz, B. Steves y JT Carlton. 2003.
California no nativo de estuario y organismos marinos (Cal-NEMO) del
sistema. http://invasions.si.edu/nemesis; Ojo de Ciencia, D-72766
Reutlingen, Alemania (www.eyeofscience.de).
242
Figura 3: La activación mediada por endotoxinas de la cascada de coagulación LAL con alterno
ruta de activación glucano
endotoxina
Factor C
Factor C
(activada)
Factor B
Factor B
(activada)
enzima
Proclotting
Adaptado de Ding y Ho (38), y Novitsky (123).
endotoxinas, tales como β- RE- glucano (a través del receptor específico Factor
G), se pueden producir resultados falsos positivos (48).
El método LAL original se lleva a cabo como una prueba de
gel-coágulo por Levin (35), y su método clínico que ahora se conoce
como el gel-coágulo o prueba de gel (35,
36, 49). El método de gel-coágulo LAL permite una detección
semicuantitativa de la endotoxina en una muestra, a través de una
serie de dilución de una endotoxina de referencia, y se basa en la
conversión del lisado a un gel sólido en presencia de endotoxina
bacteriana. La sensibilidad del método de gelificación varía de
0,03 a 0.25EU / ml (52, 58). Este método fue posteriormente
refinado con la introducción de la posibilidad de cuantificar los
resultados con técnicas fotométricas: como formas de gel
insolubles, la turbidez de las muestras aumenta, un efecto que
puede ser fotométricamente Sured medi- (50). La versión
turbidimétrico del ensayo o bien se puede realizar como un único
punto final o como una medición cinética, con límites de
sensibilidad de 0.001EU / ml (51, 52).
El descubrimiento de que la endotoxina activada por LAL es
capaz de escindir pequeños péptidos cromogénicos, condujo al
desarrollo de los métodos de ensayo LAL cromogénico (37, 53,
54). En la versión cromogénico de la prueba de LAL, coagulógeno
se sustituye completa- mente, o en parte, con un sustrato sintético
que tiene un cromóforo terminal ( paraca- nitroanilina [ pag NA]) (54,
55). El sustrato sintético tiene
S. Fennrich et al.
β- D-glucano
Factor G
Factor G
(activado)
enzima de coagulación
coagulógeno coagulina
sitios de corte similares a las de coagulógeno (53), y por lo tanto
también se escinde por la enzima de coagulación en presencia de
endotoxina. El cromóforo unido es incoloro, pero una vez escindida
del sustrato, que tiene un color amarillo con pico de absorbancia a
405 nm. Cuanto mayor sea la concentración de endotoxina en la
muestra, más rápida será la mación de lucro pag N / A. De manera
similar al ensayo LAL turbidimétrico, esta prueba cromogénico
puede estar formada también per- como un único punto final o
prueba cinética (19, 56, 57). La ventaja de este método reside en
su alta sensibilidad, de hasta 0.001EU / ml (52,
58).
La historia de la validación de la prueba LAL ha sido revisado por
Liebsch (34). En todos los enfoques descritos anteriormente, material de
origen animal aún se necesita, a saber, la hemolinfa del cangrejo del
zapato de caballos. El impacto que la captura y procedimientos de ING
bleed- tienen sobre los animales ha sido de relativamente poca
preocupación. Sin embargo, un reciente estudio ha evaluado los efectos
de esta práctica en las poblaciones de cangrejo zapato por caballos (59).
Aunque los animales ahora se manejan con mucho más cuidado que
antes, la tasa de mortalidad sigue siendo entre el 10-30%, y los animales
que sobreviven sufren impedimentos (como una disminución de la
actividad, la velocidad y la hemocianina lev- els) que puede disminuir sus
probabilidades de supervivencia para un máximo de seis semanas
después de la captura y el sangrado procedimien- tos. Además, los
efectos en la población
perspectivas del estado actual y futuro de la detección de pirógenos para productos médicos 243

nivel puede ser exacerbado por el hecho de que la mayoría de los Figura 4: Prueba de principio detrás de la
cangrejos siendo capturadas son las hembras se acercan a las ensayo de Factor C recombinante (rFC)
playas para desovar. Por lo tanto, una gran mejora fue el desarrollo
de una nueva ver- sión del ensayo LAL, basado en el punto de
partida de la cascada de coagulación, el Factor C. Con la posi-
bilidad de producir una forma recombinante de la tein pro-, Factor endotoxina
recombinante C (rFC), se eliminó la necesidad de la hemolinfa del
cangrejo de herradura. Dado que la prueba rFC omite los otros
factores zimogénicas, y conduce directamente a la detección
fluorogénico (Figura 4), que reconoce específicamente endotoxinas
bacterianas y no se ve influenciada por otras sustancias que rFC rFC (activada)
activan la vía alternativa (es decir, Factor G). Tales ensayos rFC
están actualmente disponibles en Lonza (pyrogène ™) y Hyglos
(EndoZyme ® y EndoLISA ®), con prácticas en tiempo y sensibi- lidad
de detección de endotoxinas similares que van desde
sustrato fluorescencia

0.005EU / ml (60, 61).

Tanto pyrogène y EndoZyme combinan las ventajas de las pruebas
de endotoxina altamente sensible y libre de productos animales sin
resultados positivos falsos de β- RE- glucano interferencia, sino que
están diseñadas principalmente para muestras acuosas simples y no
son capaces de tratar con mezclas de muestras complejas. Esta
limitación fue dirigida por el desarrollo de otro método significativa: la
prueba LAL de dos fases (EndoLISA). Esta prueba se une inicialmente
endotoxinas en la mezcla de muestra complejo a las proteínas de
bacteriófagos inmovilizadas (62). A continuación, la mezcla de
muestra se lava, y la detección de las endotoxinas unidas se lleva a
cabo de acuerdo con el prin- cipio rFC (61). De manera similar al
ensayo rFC, EndoLISA produce un menor número de resultados falsos
positivos (causada, por ejemplo, por β- RE- glucano, proteasas o
fosfolípidos), sino que también produce un menor número de
resultados falsos negativos, porque las sustancias que interfieren en la
mezcla de PLE sam- se eliminan. Con un rango de detección de 0,05
a 500EU / ml, la prueba tiene una muy amplia gama de linealidad (61).
permitido un rendimiento mucho más alto de pruebas, con una
sensibilidad más alta, y la posibilidad de la cuantificación en los
análisis de rutina. Esto era de hecho una gran mejora, ya que la
prueba LAL es más Están- dardised que la RPT, y es una in vitro ensayo
que se basa sólo parcialmente en material de origen animal
(cangrejo de herradura hemolinfa). El ensayo cromogénico fue
incluso automatizado como 'tem prueba portátil sis-' un (PTS) de
Charles River (Endosafe ®), para permitir la prueba de endotoxinas en
el lugar sin la necesidad de equipos de laboratorio extensa. La
tecnología PTS ™ se basa en la prueba de LAL cromogénico
cinético. El sistema consta de un Trometer SPEC- móvil con
cartuchos de un solo uso que proporcionan todos los reactivos
necesarios (Strate sub- cromogénico y endotoxina estándar para
spiking); los cartuchos están disponibles en un forma- to autorizado
por la FDA. Hands-on-tiempo para este sistema de ensayo se
reduce a aproximadamente 15-20 minutos, y la dad sensibili- se
pueden seleccionar, a partir de 0.005EU / ml a 10EU / ml,
dependiendo del tipo de cartucho (52).

La introducción de las pruebas de LAL en las directrices de la FDA A pesar de las mejoras y ventajas descritas, todos los métodos
para el control de calidad de los medicamentos Cal farmacéu-, de ensayo LAL anteriores pueden evaluar muestras solamente
biológicos y dispositivos médicos (63) líquidos (aunque en com-

Tabla 1: Una comparación de varias pruebas de pirógenos

LAL 2
LAL 1 (Cromógeno / rFC
RPT (Gel-coágulo) turbidimétrico) rFC EndoLISA ® ESTERA

Espectro de pirógenos todos LPS LPS LPS LPS todos

Sensibilidad (EU / ml) 0,5-3,0 0.03 0,005 / 0,001 0,005 0.05 0,03-0,1

factores de interferencia - β- glucanos β- glucanos - - -

Tipo de ejemplo líquido/ único líquido único líquido único líquido complejo líquido/
sólido muestras muestras muestras muestra líquida sólido

El material animal utilizado sí sí sí no no no

Tabla 2: Una visión general de los puntos fuertes y las limitaciones de varias pruebas de pirógenos 244

LAL 1 LAL 2 (cromógeno / rFC rFC (EndoLISA ®,

RPT (Gel-coágulo) turbidimétrico) (homogéneo) heterogéneo) ESTERA

Aplicabilidad parenteral parenteral parenteral parenteral parenteral productos farmacéuticos parenterales

productos farmacéuticos productos farmacéuticos productos farmacéuticos productos farmacéuticos productos farmacéuticos Fluidos en general
Fluidos en general Fluidos en general Fluidos en general Fluidos en general Fluidos en general Las superficies de los aerosoles de
materiales (de calidad del aire) a través de
la membrana de filtro

fortalezas Hoy en día ninguno -Endotoxina específica
Alta sensibilidad
técnicamente sencillo
procedimiento
-Endotoxina específica
Muy alta sensibilidad
Amplio rango dinámico
-Endotoxina específica
Muy alta sensibilidad
Amplio rango dinámico
No hay interferencia por
glucanos
No fuente animal
Bajo lote a lote
variación
-Endotoxina específica todos los pirógenos
Alta sensibilidad -Específica humana
Amplio rango dinámico Alta sensibilidad
No hay interferencia por glucanos Fluidos y ensayo de materiales
Reducción de los efectos de matriz de sustitución animales completa
No fuente animal
Bajo lote a lote
variación

limitaciones Sólo experimento con animales de endotoxinas y sólo por endotoxinas y sólo por endotoxinas Sólo para endotoxinas Disponibilidad de sangre humana
glucanos glucanos muestras líquidas (eluates) muestras líquidas (eluidos) cadena de frío Cryoblood
muestras líquidas (eluates) muestras líquidas (eluidos) Variación de líneas celulares humanas
El material animal El material animal requiere La interferencia de inmunogénica
necesario sustancias farmacológicas

Validación Regulado Validado y regulada Validado Validado y regulado, aún no Validado, aún no Validado y regulado
estado regulado regulado
S. Fennrich et al.
perspectivas del estado actual y futuro de la detección de pirógenos para productos médicos 245

plex mezclas) y se limitan a la detección de endotoxinas
bacterianas. Por otra parte, los ensayos LAL utilizar un sistema
que es totalmente diferente de la que está presente en los
mamíferos y pueden, como consecuencia, no reflejan la verdadera
TiAl poten- pirogénica de la muestra (64, 65). Otras desventajas
de este método son que los frag- mentos más pequeños LPS no
son detectados por la prueba, y que la cantidad de LPS medido no
se correlaciona con su actividad biológica (66). Esta falta de
reconocimiento pirógeno es la razón por la cual la prueba LAL
REPRESENTA más de un complemento de la RPT, en lugar de
una (parcial) reemplazo. Además, tanto
el RPT y las pruebas LAL no puede totalmente pre reacciones humanas
dict a las sustancias de ensayo. Tabla 1 y la Tabla 2 proporcionan una
visión general de las pruebas de toxinas y pirógenos endo disponibles
en la actualidad y resumen rangos de detección, las características,
fortalezas y estado de validación.
La Prueba de monocitos-activación (MAT)
se utilizó El conocimiento de las bases moleculares de la reac- ción fiebre
de desarrollar un método de ensayo libre de pirógenos-animal que es
más-fácilmente transferibles a humanos en vivo reacciones.

Figura 5: El principio detrás de la Prueba de monocitos de activación, y sus aplicaciones

células
sanguíneas
humanas

La incubación con el
muestra

Dispositivos
parenterales Calidad del aire
médicos

vial de reacción vial de reacción Filtro / incubación

sistema
Muestra
humana

medio de medio de muestra

sistema de
dilución dilución filtros
incubación celular

Sangre humana Sangre humana

colección Aerosol
Células Células

Líquido Sólido Los aerosoles

fluidos generales por ejemplo, por ejemplo stent a través de la tecnología de filtro

la detección de citoquinas
- La interleucina-1 β ( IL-1 β)
- La interleucina-6 (IL-6)
- TNF α
246
El MAT, que representa la nueva generación de prueba de
pirógenos, permite la evaluación de la contaminación génica piro-
mediante el uso de sangre entera humana (31, 67, 68).
Originalmente fue desarrollado como una in vitro ensayo de
pirógenos (IPT) de la Universidad de Konstanz, Alemania, en la
década de 1990 (68, 69). La prueba se basa en la producción de
citoquinas pro-inflamatorias a partir de sangre entera humana al
contacto con el pirógenos (Figura 5) - por lo tanto, imita in vitro la
reacción del sistema inmune innato humano.
Después de su validación exitosa, el MAT se incluyó en el Farmacopeaéxito-totalmente utilizarse en una validado in vitro modelo.
Europea en 2010 (8ª Edición, Capítulo 2.6.30; 70) como una
verdadera alternativa al RPT. El MAT se puede realizar en uno de
los tres montajes de prueba: a) con sangre entera humana (frescos
o crioconservados); b) con células monocíticas aislaron de sangre
entera (frescos o crioconservados); y c) con las líneas celulares
monocíticas. Estas hormigas variabilidad prueba ya eran conocidos
y establecidos para uso en investigación antes de la validación del
método (70-72).
De lo posible, las salidas de lectura Pharma Europea - copoeia menciona
reemplazo alternativa no animal a la RPT (25, 71). Sin embargo, el ensayo
tres citocinas proinflamatorias bien establecidos (detectado a través
de un ELISA): IL-1 β, IL-6 y TNF. Un kit de ensayo comercial, que
utiliza la sangre agrupada criopreservados humana entera (73) y la
IL-1 β como la lectura, se ofrece actualmente Merck Millipore (el
sistema PyroDetect). El operador puede elegir entre tres variantes de
prueba: detección semicuantitativa pirógenos, de detección de
pirógenos cuantitativa, y una prueba para detectar sustancias
interferentes. No se especifica el límite de detección para el MAT, ya
que depende de los controles con- negativos utilizados en cada
prueba en particular (PyroDetect Manual del usuario, Merck
Millipore); Sin embargo, un mínimo de
0.25EU / ml está garantizada por el fabricante. Además de ser
capaz de detectar la gama completa de contaminantes pirógenos
en una muestra, incluyendo los pirógenos no caracterizados y
no-endotoxinas (74), la estera tiene otra ventaja esencial en
comparación con otras pruebas de pirógenos sin animales. El uso
de sangre entera, con todos sus componentes del suero y tipos de
células inmunes, hace que este sistema de prueba más propensos
a reproducir el en vivo
reacción a sustancias pirógenas. Por otra parte, la estera también
puede ser utilizado para probar materiales sólidos, tales como
plásticos, metales, implantes y dispositivos médicos, por la presencia
de conta- minación pirogénica, en lugar de tener que usar muestras de
eluato de los materiales sólidos que se está probando (como se usa en
la prueba LAL).
A pesar de ciertas ventajas, la estera tiene algunos puntos débiles
en comparación con los ensayos RFC. la variabilidad de los donantes
introduce ligeras desviaciones en assay- sensibilidad a ensayo y el
rango de detección de la MAT es más estrecha que la de los ensayos
RFC. Sin embargo, a diferencia del RPT, la cuantificación de pirógenos
es posible con el MAT. La disponibili- dad de sangre completa humana
fresca es también una limitación,
S. Fennrich et al.
pero esto puede ser resuelto mediante el uso de sangre
criopreservados o PBMCs. De hecho, no es necesario el uso de todo el
cuerpo humano para determinar con éxito la reacción sistémica. Como
han demostrado los estudios de validación (71, 75), sangre entera tiene
todos los componentes innecesa- nece- del sistema inmune para
reaccionar a pirógenos, con la secreción de moléculas tory
pro-inflamaciones que se producen de una manera dependiente de la
concentración. Aunque el modelo aemia endotox- humano todavía se
utiliza para resolver cuestiones de investigación complejos (76), en el
caso de la estimulación de pirógenos en contacto con la sangre, el
mecanismo molecular ahora se ha elucidado (20, 21, 77) y
La aplicación de los métodos de pruebas a dispositivos
médicos
Originalmente, el MAT fue desarrollado para las pruebas de seguridad de
los medicamentos inyectables, es decir, como una prueba de pirógenos
para los productos farmacéuticos parenterales, y se ha validó como un
de otras muestras y materiales para conta- minación pirógeno también es
posible mediante el uso de la estera.
Desde 2001, la Asociación para el Avance - ción de la
Instrumentación Médica (AAMI) ha especificado un estricto control
de los procesos de fabricación de dispositivos médicos (ver
también la norma ISO 10993-
11). productos médicos que están en contacto directo con la sangre o
la linfa tienen que estar libres de piro- gen. A pesar de las medidas
de seguridad en su lugar Duran- el proceso de fabricación, todavía se
puede producir contaminación. La introducción de un dispositivo
contaminado en el organismo humano puede causar reacciones
inflamatorias severas. Con respecto a las diferencias de tamaño,
geometría y naturaleza del mate- rial, dispositivos médicos pueden
presentar un reto a las pruebas de pirógenos.
Además de la contaminación pirogénica, otras sustancias
potencialmente pueden ser liberados por los dispositivos médicos, por
ejemplo, los productos químicos y las partículas que no son de origen
bacteriano, y por lo tanto no son detectados por el ensayo de LAL. La
serie ISO 10993 de normas recomienda la evaluación de productos
médicos, no sólo para la biocompatibilidad y pirogenicidad, sino también
para la presencia de sustancias extraíbles. Las directrices de la ISO
recientemente modificadas cubren las pruebas de los dispositivos
médicos (materiales) para pirogenicidad inducida por endotoxina (DIN
EN ISO 10993-11), indicando específicamente el uso de la MAT para la
aceptación de nuevos productos (véase abajo). Sin embargo, estas
líneas directrices no especifican un límite de endotoxina - que se toma de
la Farmacopea Europea y dada en EU / ml de eluido - que es una
agravación debido a la baja proporción de recuperación de endotoxina en
los eluidos (78). En esta situación, las directrices de la FDA a menudo
son consultados, donde se especifica un límite de endotoxina de 20Eu
por dispositivo (63).
perspectivas del estado actual y futuro de la detección de pirógenos para productos médicos
A pesar de sus limitaciones de sólo endotoxinas de detección, y el
requisito para la preparación de los eluidos, el ensayo LAL es aún
ampliamente utilizado para la detección de la contaminación de dispositivos
médicos. Como ción adiciones recientes a las directrices sobre el control de
seguridad (ISO 10993-
11), el in vitro método (MAT) para detectar citoquinas
pro-inflamatorias liberadas por los monocitos / macrófagos está ahora
también mencionado como una alternativa a la RPT, aunque todavía
no ha sido validada de fecha para dispositivos médicos.
Dado que el proceso de elución no puede garantizar una
recuperación completa de los contaminantes pirógenos de dispositivos
médicos, basándose únicamente en la comprobación de dichos eluatos
es probable que subestimar la contaminación real (79). Por otra parte,
la activi- dad biológica de los contaminantes unidos a las superficies o
en solución difiere (80, 81). Esto se demostró para el ácido lipoteicoico
(LTA), donde se encontró un mayor LTA potencia para estar presente
en la superficie del dispositivo que estaba presente en la solución (82).
También se encontró que los pirógenos adsorbidos sobre las
superficies de dispositivos Cal camentos no podían ser eliminados
adecuadamente por ción elu-, lo que significa que no podían ser
detectados por el ensayo de LAL y RPT, ya que en estas pruebas
únicas soluciones (eluates) pueden ensayar (78, 80, 83). Otra
posibilidad sería la de inyectar el eluato directamente en los conejos, o
implantar el material de ensayo en los animales. Sin embargo, este
último enfoque es mucho más invasiva, y la destrucción del tejido
durante la implantación podría dar lugar a reacciones inflamatorias no
necesariamente causados ​por pirógenos en el material de prueba.
Como se ha discutido, tanto la prueba de LAL y el RPT tienen
desventajas cuando se utilizan para el ensayo de dispositivos médicos.
Ambos son incapaces de reflejar la reacción humana a diversas
especies de endotoxinas y otros pirógenos (80). El MAT ofrece una
alternativa mejor, debido a que los dispositivos médicos a ensayar se
pueden incubar directamente en la sangre y no se requiere una etapa
de elución. Además, el uso de sangre humana permite la detección de
todos los posibles sustancias pirógenas a sujetos humanos. El uso de
la estera para dispositivos médicos sólidos se ha desarrollado a través
de su aplicación a los clips de aneurisma (30) y lentes de intraoc- Ular
(83), definiendo así la MAT como un reemplazo para el RPT y el
ensayo LAL para garantizar la seguridad de médico dispositivos (79).
Una gama de dispositivos médicos se fabrican a partir de biomateriales
naturales, por ejemplo, quitina, pectina, algi- nate, látex, etc. Materiales
de origen natural son especialmente propensos a la infestación
microbiana y pueden ser fácilmente contaminados con
microorganismos. Algunos de estos dispositivos médicos son
absorbido por completo reab- por el cuerpo humano; por ejemplo,
alginato de calcio como un material de apósito para heridas (84) o
microcápsulas de alginato como vehículos de fármacos. Aunque
todavía hay poca información sobre contamina- ción pirógenos en
dispositivos médicos hechos de mate- bioma- naturales, pone de
relieve la necesidad de una atención especial.
247
La aplicación de los métodos de pruebas a
aerotransportadas pirógenos
Bioaerosoles o polvos orgánicos son partículas en el aire de origen
biológico (85). Pueden consistir en microorganismos pletar com- o
fragmentos de bacterias, virus, esporas, hongos, mohos, o cualquier
otro componente orgánico o metabolito. Las altas concentraciones de
polvo orgánico tienden a ocurrir en entornos profesionales, como
granjas, se niegan instalaciones de reciclaje o la industria del
algodón, pero también en mentos nacionales ambientes (como en
habitaciones con aire acondicionado; 86). Una amplia gama de
efectos adversos para la salud se ha discutido en relación con la
contaminación del aire. El mayor impacto en la salud humana se
atribuye a endotoxinas (86), que representan el componente
inflamatorio y tóxico más potente de polvo orgánico (87-89). La
exposición a bioaerosoles y la inhalación de endotoxinas se ha
asociado con una serie de efectos en la salud respiratoria, tales como
fiebre, dolores de cabeza, tos, falta de aire y la inflamación de la vía
aérea (90, 91), con este último conduce a enfermedades respiratorias
(92). Más específicamente, micro- componentes de la pared celular
bial y productos del metabolismo
- por ejemplo, LTA, peptidoglicanos, micotoxinas y β- 1,3-glucanos
- son posibles activadores de macrófagos alveolares, lo que
resulta en la liberación de quimiocinas y citoquinas y en el
reclutamiento de otras células inflamatorias en el tracto respiratorio
(93, 94). La exposición ocupacional de los agricultores a bio -
aerosoles pueden conducir al desarrollo de asma bronquial,
bronquitis crónica, alveolitis exógeno-alérgica y síndrome tóxico de
polvo orgánico (95,
96). La razón de un brote de alergias es a menudo que se
encuentran en la exposición a hongos y mohos (97), que también
se ha relacionado con ciertas enfermedades respiratorias tales
como neumonitis por hipersensibilidad o asma (97, 98). Este
último también se ha atribuido a la exposición a sustancias
biológicas purificadas (por ejemplo, enzimas microbianas), que
son potentes alérgenos que pueden causar asma, dermatitis y
rinitis (99-101), y se utilizan en la comida Processing y las
industrias químicas . En este contexto, los fluidos de corte (MWF)
son sustancias especialmente problemáticos. Se utilizan
ampliamente en las industrias de la ingeniería y la metalurgia
mecánicas y representan un ambiente excelente para el
crecimiento de una gama de microorganismos, incluyendo hongos
y mohos (102-
105). Por otra parte, el reciclaje ción continua / recirculación de
MWF conduce a la acumulación de contaminantes (104, 106) -
hipersensibilidad neumonitis, también conocido como 'pulmón del
operador de la máquina' se ha asociado con Mycobacterium
inmuno genum contaminación en MWF (107-110). Para fines de
evaluación de riesgos, la endotoxina lev- els en aerosoles están
siendo medido con el ensayo LAL. Como se describió
anteriormente, el ensayo LAL es limita- das a la detección de
endotoxinas, y no puede evaluar la actividad biológica / potencia
inflamatoria en
248 S. Fennrich et al.

el organismo mamífero. Como se muestra por Fennrich
et al. ( 111), endotoxinas purificadas de diferentes especies rial
bactericidas mostraron diferentes potencias en el ensayo LAL y el
MAT. Se obtuvieron resultados similares cuando se comparan Pseudomonas los casos fatales de transfusión asociaciones TED complicaciones (116, 117).
y Neisseria
especies aisladas del aire ambiente en las casas de animales; en
este caso, la diferencia de actividad biológica entre las especies fue resultante. La prueba de esterilidad permite una afirmación sólo por la ausencia de
menos pronunciado en el MAT que en el ensayo de LAL (112).
Suma - aliado, el ensayo LAL requiere la elución de piro- materiales
génicas de los filtros (o, alternativamente, desde el aire por el
choque, que recoge con aire las partículas de polvo directamente
soportadas en agua libre de pirógenos). De hecho, la Sociedad
Americana para Pruebas y Materiales utiliza una variación del
ensayo LAL para cuantificar las concentraciones de endotoxina en el
aire en los aerosoles MWF para fines de exposición ocupacional
(113).
En contraste, el MAT permite el contacto directo entre la sangre
y las muestras aspirando aire a un filtro de membrana de teflón
(PTFE) (Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI, EE.UU.) y la incubación
en el interior del dispositivo de recogida. Mediante el uso de
monocitos de sangre humana y un material de referencia estándar
apropiado, ofrece la posibilidad de medir el potencial inflamatorio
de pirógenos en el aire en ambos entornos laborales y de vida.
La aplicación de los métodos de pruebas a
bacteriana asociada a la transfusión o contaminación pirogénica sin duda
representan un riesgo para los receptores. La presencia de endotoxinas, como
resultado de la contaminación bacteriana Gram-negativa, representó la mayor parte de
Preservación de com- ponentes de las bacterias Gram-negativas sigue siendo un factor
de riesgo para la adquisición de transfusión Transmitir- Ted sepsis y la muerte
bacterias feration-proli- competente; que no garantiza la ausencia completa de
componentes bacterianos o de aquellas bacterias que son difíciles de cultivar en el
producto entero. Además, la contaminación podría estar bajo el umbral de detección en
el momento de la prueba, lo que lleva a un resultado falso negativo. Por lo tanto, una
prueba lidad Steri no garantiza que los productos biológicos son microbiológicamente
seguros, y se necesitan otros métodos de prueba de pirógenos rápidos y fiables. El RPT
fue empleado durante muchos años en las pruebas de seguridad de los productos
biológicos y otras terapias. Sin embargo, no se puede utilizar para todos los productos
biológicos, debido a que la inyección de material de célula humana o las vacunas
pueden causar una reacción adversa (por ejemplo, una tem- peratura alza) en el conejo.
Cuando sea factible, algunas vacunas se ensayaron para determinar la contaminación
pirogénica con el RPT y / o para la contaminación de endotoxina con el ensayo LAL. Sin
embargo, se demostró que los aditivos vacuna podría interferir con el ensayo LAL,
afectando críticamente los resultados (118). Como men- ciona anteriormente, en
general, el ensayo LAL se limita a la detección de sólo endotoxinas y no puede detectar
pirógenos pertinentes para los seres humanos. Un estudio ha demostrado que y se
necesitan otros métodos de prueba de pirógenos rápidos y fiables. El RPT fue
empleado durante muchos años en las pruebas de seguridad de los productos
biológicos y otras terapias. Sin embargo, no se puede utilizar para todos los productos
biológicos, debido a que la inyección de material de célula humana o las vacunas
pueden causar una reacción adversa (por ejemplo, una tem- peratura alza) en el conejo.
Cuando sea factible, algunas vacunas se ensayaron para determinar la contaminación
pirogénica con el RPT y / o para la contaminación de endotoxina con el ensayo LAL. Sin

Biológicos: Terapéutica celulares embargo, se demostró que los aditivos vacuna podría interferir con el ensayo LAL,
afectando críticamente los resultados (118). Como men- ciona anteriormente, en

El microbiana, o pirógeno, la seguridad de los productos biológicos general, el ensayo LAL se limita a la detección de sólo endotoxinas y no puede detectar

plantea un reto para los fabricantes así como a los usuarios finales. Una pirógenos pertinentes para los seres humanos. Un estudio ha demostrado que y se necesitan otros métodos de

garantía de seguridad no puede ser ded disposi- para la mayoría de los
productos biológicos - y esto es particularmente el caso de la terapia
celular. terals paren- biológicos, tales como la terapia celular, vacunas,
sangre y productos sanguíneos, comprenden un grupo ous
heterogeneidad de productos médicos que son propensos a la
contaminación con microorganismos (incluyendo pirógenos), con la
contaminación por lo general derivados de la adquisición y procesamiento
de la material básico. En contraste con los productos farmacéuticos
clásicos, la terapia celular (por ejemplo, células madre) rara vez se iso se
precisan en una forma que está libre de conta- minación bacteriana, las
células son mucho más complicados de manejar porque son sistemas
que no pueden ser Ste- rilised con los vivos métodos comunes (calor,
filtración o radiación). Otros factores como las condiciones de
conservación de algunas terapias celulares, plantean otros problemas.
Por ejemplo, existe un alto riesgo de conta- minación para los
componentes celulares de la sangre (por ejemplo pla- telet concentrados),
debido a que deben ser almacenados a temperatura ambiente. A pesar
de la de control de seguridad de componentes de la sangre durante la
producción de los materiales de base, 0,06% de concentrados de
plaquetas está representada la contaminación bacteriana (114) y las
células rojas de la sangre Cyte-agotado leuko- mostró una tasa de
contaminación de 0,029% (115).
tipo B (Hib) lotes de vacunas contenían un contenido de endotoxina ble
pero inconsistente considera-. Como un ejemplo adicional, se informó de
que una vacuna trivalente que contiene los componentes de las bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas ensayadas negativamente en el ensayo
LAL, mientras que el MAT mostró una fuerte liberación de IL-6 en algunas
muestras de sangre específicos del donante (119) . Estas diferencias se
deben a gens piro no de endotoxina, tales como los toxoides de Corynebacterium
diphtheriae y Clostridium tetani. Estos resultados muestran la necesidad de
controlar la contaminación de los lotes de vacunas para garantizar la
seguridad y la calidad, con el fin de reducir o incluso eliminar algunos de
los efectos adversos observados en los receptores de la vacuna. El
fracaso para detectar pirógenos distintos de endotoxinas muestra que,
para esta apli- cación, la prueba de LAL no es una adecuada (parcial) cemento
repla- método. En conclusión, en la actualidad, sólo el MAT es una
adecuada reemplazo alternativa para su uso en el ensayo de productos
biológicos de contamina- ción pirógeno.
panorama

Durante los últimos setenta años, la RPT y la prueba de LAL se

desarrollaron para pirógenos y / o endotoxinas
perspectivas del estado actual y futuro de la detección de pirógenos para productos médicos
ensayo de una variedad de productos médicos. Una gran cantidad de
optimizaciones se introdujeron, para abordar aspectos específicos de
calidad y hacer las pruebas más viable, pero sus limitaciones básicas no
podía ser superado - ambos se limitará a las muestras líquidas, y no son
específicos para la especie humana.
Además, tanto el RPT y la LAL clásicas de prueba animales /
materiales de origen animal, que no es de conformidad con el
concepto Tres Rs de
Reducción, Reemplazo y Refinamiento del uso de animales labo-
ratorio, como se ha descrito por primera vez por Russell y Burch (120,
121). Por lo tanto, ambas pruebas se consi- Ered a ser obsoletas
respecto a las tres R, debido a la existencia de alternativas fiables. El
ensayo de células de sangre humana, o su derivado (el MAT), es el
método de prueba actual estado de la técnica para la detección de
una amplia gama de pirógenos, y para la detección específica de la
endotoxina, la tecnología RFC es el animal moderno exento / animal
opción libre de material.
Con la MAT humano, el avance de Exámenes de la especie correcta
(y pertinentes) se convirtió en una realidad y un aspecto importante en
la mejora de la garantía de cali- dad. El uso de células inmunes
humanas aisladas, o sangre entera, significa que una variedad de
mues- tras excepto los productos medicinales, por ejemplo, líquidos y
gases (es decir, aire de respiración) podría ser probado en contacto
directo con células sanguíneas en un sis- humano específico TEM.
Actualmente, el MAT, con sus muchas ventajas, representa una opción
innovadora y completa
reemplazo método. Un paso muy importante en términos de
bienestar animal de la seguridad y la paciente fue tomada en 2010
por la aplicación de la MAT en el
Farmacopea Europea, de modo que pueda ser utilizado ofi- cialmente como un r
completa eplacement método de ensayo de pirógenos.
Sin embargo, algunos problemas tienen que ser tratados, con el
fin de hacer que la nueva MAT incluso más versátil. Un objetivo que
se persigue en la actualidad, es la reducción del tiempo necesario
para realizar la prueba, a partir de dos días hábiles a unas pocas
horas ( 'formato en el mismo día'). Otro desafío que queda es
aumentar la aceptación del MAT, y para acelerar la tran- sición del
hecho de ser visto como un método alternativo a su ser visto como
la mejor opción de prueba posible (humanos relevantes). Esto
podría conseguirse mediante el uso de fuentes de células sensibles
fácilmente disponibles (por ejemplo, células de sangre primaria
criopreservados o sangre entera) que son menos propensos a lote
dad variabilidad. Por otra parte, la validación de la MAT para ciertos
tipos de dispositivos médicos en contacto directo con las células
adecuadas, crearía un uniformes experimentos valores de
configuración y de referencia mentales, Farmacopea Europea. Estudios
más amplios en diversos dispositivos médicos podrían entonces ser
llevadas a cabo, con el fin de obtener los límites de endotoxina de
referencia y pirógenos que coincida más estrechamente el tipo real
de dispositivo y su aplicación. Posteriormente, los dos valores de
referencia y los procedimientos experimentales
249
podrían ser introducidos en las directrices de la ISO, siendo un
escenario similar también prevé para el aire cali- dad.
Expresiones de gratitud
Los autores están muy agradecidos por el puerto SUP- constante
por Animalfree Investigación durante el desa- rrollo de la MAT como
alternativa completa a la prueba con animales (RPT) después de su
primer contacto con la Farmacopea Europea. En especial,
quisiéramos agradecer a la Dra Dr. Stefanie Schindler, que era un
contacto indispensable en la organización, y que proporcionaron
información, el apoyo y la literatura Ance guid-.
Recibido 11.27.15; recibido en su forma final 24/3/16; aceptado para su
publicación 12.04.16.
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