Práctica Nº 5: Cromatografía en Capa Fina 33

PRÁCTICA NUMERO 05
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

I. OBJETIVOS:
 Aprendizaje de la técnica de cromatografía en capa fina
 Conocimiento de conceptos cromatográficos: polaridad, fase móvil, fase
estacionaria, factor de retención, etc.
 Determinación de los componentes orgánicos presentes en una muestra usando
sustancias patrón.
II. FUNDAMENTO TEORICO:
La cromatografía es una técnica de análisis químico utilizada para separar sustancias
puras de mezclas complejas. Esta técnica depende del principio de adsorción
selectiva. La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso, de origen italiano,
Mikhail Tswett en 1906, pero su uso no se generalizó hasta la década de 1930.
Tswett separó los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas
verdes en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el
interior de una probeta. A medida que la solución va filtrándose por la columna,
cada componente de la mezcla precipita a diferente velocidad, quedando la columna
marcada por bandas horizontales de colores, denominadas cromatogramas. Cada
banda corresponde a un pigmento diferente.
La cromatografía es probablemente la más versátil de las técnicas de separación: es
aplicable a cualquier mezcla soluble o volátil. De hecho las técnicas de separación
suelen dividirse en dos grandes grupos: cromatográficas y no cromatográficas. La
elección de una técnica cromatográfica concreta dependerá de la naturaleza y
cantidad de la muestra, del objetivo de la separación y de las limitaciones del tiempo
y equipo asequible.
Podemos distinguir 3 tipos de cromatografía dependiendo si la fase estacionaria/fase
móvil es sólido/líquido, líquido/líquido o líquido/gas:
Si es sólido/líquido, cabe distinguir entre:
 Cromatografía de adsorción: El sólido adsorbe al componente que
inicialmente estaba en fase móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van Der
Waals).
 Cromatografía de intercambio iónico: el sólido es un cambiador de iones
(fuerzas electrostáticas).
 Cromatografía de exclusión (o de geles): el sólido es un gel formado por
polímeros no iónicos porosos que retienen a las moléculas de soluto según su
tamaño.
 Cromatografía de afinidad: es un tipo especial de cromatografía de adsorción,
utilizada especialmente en bioquímica, en la que un sólido tiene enlazado un
llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo, un indicador
enzimático o un anticuerpo.
Si es líquido/líquido, cabe distinguir:
 Cromatografía de partición: el soluto se reparte entra la fase móvil (líquido o
gas) y la fase estacionaria.

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Si es líquido/gas, cabe distinguir entre:

 Cromatografía gas-liquido (CGL), que es una cromatografía de partición.
 Cromatografía gas-sólido (CGS), que es una cromatografía de adsorción.
Si es un fluido supercrítico, (fluido calentado a una temperatura superior a la
temperatura crítica, pero simultáneamente comprimido a una presión mayor que
su presión critica), se trata de la cromatografía de fluidos supercríticos (CFS), que
puede ser de partición o de adsorción.

Las técnicas cromatográficas, según el dispositivo utilizado para conseguir la

separación entre la fase móvil y la estacionaria, pueden ser: en columna y plana.
Cromatografía en columna: Se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se coloca
la fase estacionaria y a su través se hace pasar la fase móvil. El flujo de la fase móvil
(líquido o gas) a través de la estacionaria se consigue:
1) por presión,
2) por capilaridad,
3) por gravedad.
Cromatografía plana: La fase estacionaria está colocada en una superficie plana
que en realidad es tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida,
por lo que puede considerarse bidimensional. Se divide en dos tipos generales:
1. -Cromatografía en papel: en la que el papel absorbente actúa como soporte de la
fase estacionaria (cromatografía de partición). Una muestra líquida fluye por una
tira vertical de papel absorbente, sobre la cual se van depositando los componentes
en lugares específicos.
2. -Cromatografía en capa fina: en la que un sólido actúa como fase estacionaria
(cromatografía de partición), se extiende en una capa delgada sobre una placa,
generalmente de vidrio.
El uso de la cromatografía está ampliamente extendido en el análisis de alimentos,
medicinas, sangre, productos petrolíferos y de fisión radiactiva.
TABLA 1
DISOLVENTES Y REVELADORES EMPLEADOS FRECUENTEMENTE EN
CROMATOGRAFÍAS EN PAPEL Y CAPA FINA DELGADA
Compuesto Sistema disolvente (fase móvil) Reveladores de manchas
Mezclas de ácido fórmico o
Azul de bromofenol o verde de
Ácidos orgánicos acético con etanol, 2-propanol, n-
bromo cresol en alcohol
butanol o cetonas
Derivados
hidroxámicos de ácidos Ácido isobutírico-fenol Solución de cloruro férrico
orgánicos
Fenol, fenol-amoníaco, Solución 0,1% de ninhidrina en
Aminoácidos
ter-butanol etanol

2,4-
dinitrofenilhidrazonas
Éter-hexano, acetonahexano Solución al 10% de KOH
de compuestos
carbonílicos

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Solución de ninhidrina o de
Aminas 1-butanol-amoníaco.
yodo
Fluoroborato de p-nitro
Derivados fenólicos 1-butanol-ácido acético
fenildiazonio
2,4-dinitrobenzoatos de
Metanol-acetona, metanol-hexano Solución al 5% de KOH
alcohol
Solución de nitrato de plata,
1-butanol-ácido acético, acetato de
Azúcares solución 0,3% de ácido hipúrico
etilo-piridina-agua
etanol

III. MATERIALES Y REACTIVOS:

Dicromato de sodio 04 placas cromatográficas
Ácido Sulfúrico concentrado 02 vasos de precipitado de 10ml
Silica Gel 02 placas petri
Tetracloruro de carbono 04 varillas de vidrio
Hidróxido de sodio concentrado 02 probetas de 10ml
Cristales de yodo 08 capilares
Éter de petróleo 02 pipetas de 2, 5 y 10 ml
Benceno 02 tapones monohoradado
Cloroformo 02 soporte universal
n-butanol
Ácido Acético
Acetato de etilo
Etanol
Acetona
Benzofenona
Anisaldehído
n-hexano

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

1. Preparación de la placa de Silica Gel:
Como soporte de la fase estacionaria se utilizará un vidrio plano doble (2 o 3mm
de espesor) de 6 X 9cm. Desengráselos en un frasco con mezcla crómica
(solución sobresaturada de dicromato de sodio en ácido sulfúrico al 80%) o
utilizando acetona. Lávelos bien y déjelos secar. La fase estacionaria se puede
embadurnar con aplicadores especiales para obtener capas de espesor constante
de 1 o 2mm. Se obtiene resultado similar tomando el portaobjetos o el vidrio
por una esquina inmergiéndolo dentro de una suspensión concentrada de la fase
estacionaria (usualmente 30g de gel de silica G (Merck), en tetracloruro de
carbono (60ml), sacando la placa, limpiando una de sus caras, mientras que en
la otra se deja evaporar el disolvente para que quede la fase estacionaria
formando una capa delgada. A la placa se introduce en una estufa, donde se deja
de 30 a 60 minutos y de 80 a 100ºC. Esto seca y activa a la fase estacionaria.
Con un alfiler se traza una línea de origen a 1,5 o 2cm de un extremo de la placa.
En la línea de origen se colocan una o dos manchas (de 0,3 a 0,5cm de diámetro)
(si son dos se dejan separadas) de la solución que se desea cromatografiar. La
aplicación se hace con subcapilares, procurando que la concentración de cada

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componente sea de 10 a 60 microgramos. Si la solución fuera muy diluida se

puede repetir la aplicación dos o tres veces (hay que dejar de evaporar el
disolvente antes de repetir una aplicación). La placa seca se introduce en una
frasco de boca ancha (8 a 12cm de diámetro) y de unos 12cm de altura en la cual
se ha colocado una mezcla de disolventes de un centímetro de altura (no debe
tocar el punto donde empieza la mancha). La pared del frasco se cubre con un
cilindro de papel filtro, para acelerar la homogenización de la fase de vapor.
Como tapa se usa un vidrio plano o de reloj. Se deja ascender el frente del
disolvente unos 8 a 9cm y antes de que llegue a la parte superior, se saca. Con
un alfiler se marca la altura máxima alcanzada. Se seca la placa. Se buscan
manchas coloridas y se marca con el alfiler su posición.
Se puede observar bajo la luz ultravioleta, marcando la posición y color de las
manchas. La placa se puede introducir, con precaución, en una frasco en le que
previamente se introdujeron unos cristales de yodo. La mayoría de las manchas
incoloras se tornan cafés con el yodo. Saque la placa y rápidamente marque su
posición y mida las distancias recorridas por las manchas y divide entre la
distancia recorrida por el frente de disolvente y determine los Rf.
En la cromatografía en capa delgada se pueden usar las mismas combinaciones
de disolventes empleados en la cromatografía en papel, además de muchas otras
combinaciones en que no vaya agua. Los reveladores son los mismos para
ambos métodos cromatográficos, además de otros corrosivos como el ácido
sulfúrico.

2. Secuenciación de la técnica cromatográfica:

1) Preparar o cortar, en su caso, una placa de 2) Disolver una pequeña cantidad de la

tamaño adecuado. muestra y, mediante un capilar de vidrio,
pinchar en la parte inferior de la placa a
cierta distancia del borde

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3) Introducir la placa en un recipiente con el 4) Cerrar el recipiente y dejar que el

disolvente adecuado. Dicho recipiente debe líquido ascienda por capilaridad.
presentar una atmósfera saturada en el vapor
del disolvente por lo que se pone trozo de
papel de filtro en la parte posterior y
disponer de un sistema de cierre.

5) Revelar la placa para poner de manifiesto 6) Determinar las posiciones relativas de

donde se encuentran los puntos. los puntos mediante el cálculo del Rf

3. Ejemplos de empleo de la cromatografía:

Aplique en el punto de partida, una mancha de cualquiera de las tintas de escribir
o mezclas de colorantes de alimentos sintéticos en el experimento de
cromatografía en papel; use los mismos disolventes; anote sus resultados.
Extracto de beta-caroteno: en un vaso de precipitado de 100ml se colocan 5g de
pasta de zanahorias (puede usarse la empleada para alimentos de niños tipo
Gerber); se añaden 25ml de etanol, se cubre el vaso con el fondo de un matraz
balón de 100ml lleno de agua helada (para que sirva de refrigerante) y se calienta
la mezcla del vaso durante 5 minutos (de preferencia use una parrilla eléctrica
con resistencia cubierta). La mezcla caliente, se filtra en un Buchner de 4,5cm
de diámetro. El filtrado se guarda en una matraz erlenmeyer de 125ml, y el
sólido residual se regresa a vaso de precipitados donde se le añaden 15ml de
cloroformo. La suspensión se calienta durante 5 minutos y se filtra en caliente.
El filtrado se guarda y el residuo se vuelve a extraer dos veces con cloroformo,
y posteriormente se filtra. Las soluciones clorofórmicas se juntan. Tome una o

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dos gotas la cromatografía en capa delgada de gel de Sílice-G. El resto del

caroteno se puede separar por cromatografía en columna.
Extracto de licopeno: Use la técnica anterior empleando 5g de pasta de tomate.
Aplique en el punto de partida, una o dos manchas del extracto de hojas de
espinaca o de tomate o zanahoria según la técnica anterior. Como disolventes
pruebe alguno de los siguientes, hasta que encuentre el más adecuado. Éter de
petróleo (30º a 60ºC); benceno-cloroformo (3:1) (v/v). Si fuera necesario ensaye
otras combinaciones. Una de las más generales tiene n-butanol-acetato de etilo-
ácido acético (4:3:1) (v/v). Los carotenoides se isomerizan fácilmente dando
compuestos incoloros; marque su posición en cuanto saque la placa de la cámara
con disolventes; anote sus observaciones.

V. RESULTADOS:
Describir las observaciones realizadas en cada procedimiento, anotar los cambios
respectivos y esquematizar los resultados. Realizar todas las reacciones químicas.
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VI. DISCUSIÓN:
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VII. CONCLUSIONES:
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VIII. CUESTIONARIO:
1. La técnica de cromatografía en capa fina (TLC) es una de las más comunes
empleadas en un laboratorio de Química Orgánica. Entre otras cosas permite:
 Determinar el grado de pureza de un compuesto
 Comparar muestras
 Realizar el seguimiento de una reacción
 Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografía de
columna
Explicar con ejemplos cada una de estas aplicaciones.
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2. En cuanto tiempo se realiza la TLC, influye el disolvente, porque. Comparar.

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IX. BIBLIOGRAFIA:

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