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“AÑO DE LA CONSOLIDACION DEL MAR DE GRAU”

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE CHOTA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

Tema

Espectrofotometría

Autores

Copia Fernández Joel

Vásquez Sánchez Alcides

Docente

Ing. Carlos Ramos José Alberto

Chota-Perú
2016

QUIMICA ORGÁNICA Página 2


INDICE
DEDICATORIA ......................................................................................................................................... 03

INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................................... 05

OBJETIVOS .............................................................................................................................................. 06

CAPITULO I

1. ESPECTOFOTOMETRIA. ..................................................................................................................... 08
1.1 DEFINICIÓN DE ESPECTROFOTOMETRÍA. .............................................................................. 08
1.2 PRINCIPIOS DE OPERACIÓN ..................................................................................................... 08
1.2.1 Ley de Lambert ............................................................................................................................. 11
1.2.2 Ley de Beer ..................................................................................................................................... 12
 Transmitancia (T) ................................................................................................................. 13
 Absorbancia(A) ...................................................................................................................... 13
1.2.3 Transmitancia y absorción de las radiaciones.................................................................. 16

1.3 APLICACIONES ............................................................................................................................... 17


1.4 TIPOS DE ESPECTROFOTOMETRÍA ........................................................................................ 17
1.4.1 Espectrofotometría de absorción y emisión atómica .................................................... 18
1.4.2 Espectrofotometría de emisión atómica con llama ........................................................ 19
1.4.3 Espectrofotometría con atomizadores electro térmicos .............................................. 20
1.4.4 Espectrofotometría de emisión con plasma ...................................................................... 20
1.4.5 Espectrofotometría de fluorescencia molecular .............................................................. 21
1.4.6 Espectrofotometría de absorción molecular VIS-UV ..................................................... 22
1.4.7 Espectrofotometría de absorción molecular IR ............................................................... 24

CAPITULO II

2.1 EL ESPECTROFOTÓMETRO .......................................................................................................... 26


2.2 UTILIDADES DEL ESPECTROFOTÓMETRO ............................................................................. 27
2.3 PROPÓCITO DEL EQUIPO ............................................................................................................. 28
2.4 COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO ....................................................................... 28
2.4.1 Fuente luminosa .............................................................................................................................. 29
2.4.2 Monocromador ................................................................................................................................. 29
a) Prismas ....................................................................................................................................... 30
b) redes de difracción ................................................................................................................. 30
2.4.3 Portador de muestras .................................................................................................................... 31
2.4.4 El sistema detector (transductor .............................................................................................. 32

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2.4.5 Sistema de lectura ........................................................................................................................... 33
2.5 TIPOS DE ESPECTROFOTÓMETROS.......................................................................................... 34

REFERENCIAS .......................................................................................................................................... 39

ANEXOS ...................................................................................................................................................... 40

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DEDICATORIA

Dedicamos este trabajo a nuestro profesor de química orgánica. José Alberto Carlos ramos quien
fue un gran apoyo emocional durante el tiempo en que hacíamos este trabajo. A nuestros padres
también quienes nos apoyaron todo el tiempo.

A mis maestros quienes nunca desistieron al enseñarme, aun sin importar que muchas veces no
ponía atención en clase, a ellos que continuaron depositando su esperanza en mí.

A todos los que nos apoyaron para hacer y concluir este trabajo.

Para ellos es esta dedicatoria de trabajo de espectrofotometría, pues es a ellos a quienes se las
debemos por su apoyo incondicional.

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INTRODUCCIÓN

La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección


específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su aplicabilidad a
moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc.) y estado de agregación
(sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la espectrofotometría son
relativamente sencillos. Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en
forma de energía interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre
ellos el de la fotosíntesis en plantas y bacterias. La Mecánica Cuántica nos dice que la luz está
compuesta de fotones cada uno de los cuáles tiene una energía:

E fotón = h⋅ν = h⋅c/λ

Donde c es la velocidad de la luz, ν es su frecuencia, λ su longitud de onda y h= 6.6 10 -34 J⋅s es la


constante de Planck. Cuando decimos que una sustancia química absorbe luz de longitud de
onda λ, esto significa que las moléculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de
onda.

En este trabajo estudiaremos la absorción de luz en el ultravioleta cercano (λ≈325-420 nm) y en


el visible (λ≈420-900 nm). Cuando una molécula absorbe un fotón en este intervalo espectral, se
excita pasando un electrón de un orbital del estado fundamental a un orbital excitado de energía
superior. De esta manera la molécula almacena la energía del fotón:

A + h⋅ν → A*

E(A*) = E(A) + Efotón

Como la energía se conserva, la diferencia de energía entre el estado fundamental de la molécula


(A) y su estado excitado (A*) debe ser exactamente igual a la energía del fotón. Es decir, una
molécula sólo puede absorber fotones cuya energía h⋅ν sea igual a la energía de un estado
molecular excitado. Cada molécula tiene una serie de estados

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OBJETIVOS

 Conocer y aplicar la ley de beer y Lambert.


 Determinar la concentración de una solución por espectrofotometría.
 Establecer los factores que ocasionen desviaciones a la ley de Lambert y beer.
 Establecer la relación entre la transmitancia y la absorbancia con la concentración de
una solución.

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CAPITULO I

1. ESPECTOFOTOMETRIA.
1.1 DIFINICION DE ESPECTROFOTOMETRIA
La espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe
o transmite un sistema químico en función de la longitud de onda; es el método de
análisis óptico más usado en las investigaciones químicas y bioquímicas. El
espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o
transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una
que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, el cual es una curva que
muestra la cantidad de energía radiante. Absorbida,(absorbancia) por la sustancia
en cada longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, a una determinada
Longitud de onda de la energía radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de
radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto.

1.2
principios de operación
Como principio básico se considera que la luz es una forma de energía
electromagnética, que en el vacío tiene una velocidad constante
[C] y universal de aproximadamente 3 x 108 m/s. En cualquier otro medio
(transparente) por el que pase la luz, su velocidad será ligeramente inferior y podrá
calcularse mediante la siguiente ecuación:

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Dónde:
v = velocidad a través del medio por el que pasa la luz
n = índice de refracción del medio, cuyo valor oscila, por lo general, entre 1,0 y 2,5

La energía electromagnética dispone de una muy amplia gama de longitudes de onda.


Algunos ejemplos se muestran en la siguiente tabla1:

La luz, al pasar o interactuar con diversos medios, presenta una serie de fenómenos, entre los
que destacan la reflexión, refracción, difracción, absorción, difusión, polarización y otros que son
utilizados en diversos instrumentos y dispositivos. La siguiente tabla muestra los rangos de
longitud de onda en donde se utiliza el espectro luminoso para realizar pruebas de
espectrofotometría.

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Con respecto a la interacción de la luz con la materia, el siguiente esquema ayuda a
entender la complejidad de los fenómenos que ocurren:

INTERACCION DE LA LUZ CON LA MATERIA

El esquema muestra que la radiación incidente [Io] sufre una serie de


transformaciones. Parte de la misma se refleja [Ir], parte se transmite [It], parte se
difunde [Id] y parte se absorbe e incide directamente en fenómenos como la
fluorescencia [If]. Los fenómenos en los que se basa la espectrofotometría son
principalmente la absorción y la transmisión.

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El método espectrofotométrico se rige por dos leyes fundamentales: Ley de Lambert
y Ley de Beer.
1.2.1 LEY DE LAMBERT:
Esta ley establece que cuando pasa luz monocromática por un medio homogéneo,
la disminución de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al
espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad de la luz transmitida
disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente el espesor del medio
absorbente.

La siguiente relación matemática da cuenta


de esta ley:

P / P0 = e –kb
Dónde:
Po : Intensidad de la luz incidente
P : Intensidad de la luz transmitida
B : Espesor del medio absorbente
K : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud
de onda de la luz incidente, del espesor del medio absorbente y de la
naturaleza del medio.
1.2.2 LEY DE BEER :
La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al
aumentar aritméticamente la
Concentración de la sustancia absorbente, cuando este haz pasa a través de un
medio homogéneo.

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La relación matemática que da cuenta de esta ley se muestra a continuación:

P / P0 = e -k’c
Dónde:

Po: Intensidad de la luz incidente

P : Intensidad de la luz transmitida

C : Concentración de la solución

K: Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de


onda de la luz incidente, de la concentración de la solución, y
frecuentemente, de la naturaleza del medio.

 Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer

Log P0 / P = a b c Ó A=abc

A = log P0 / P = - log T
Dónde:

A : Absortividad

B : Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta)

C : Concentración de la solución
P/Po= T : Transmitancia

Con relación a la ley en mención hay implícitos dos conceptos: transmitancia [T] y absorbancia
[A].

Los términos absorbancia y transmitancia son definidos a continuación

 Transmitancia (T): Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P) por una muestra
y la energía o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energía radiante incidente como la
transmitida deben ser medidas a la misma longitud de onda.

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T = P / P0 = 10-abc Ó %T = 100 P / P0

Dónde:

T: transmitancia P: intensidad de la luz trasmitida.


Po: intensidad de la luz incidente a= absortividad
b= longitud o espesor del medio c= concentración de la solución

 Absorbancia(A): Se define como la cantidad de energía radiante absorbida por una sustancia
pura o en solución. Matemáticamente, corresponde al logaritmo negativo de la transmitancia,
transmitancia expresada como fracción decimal %T, transmitancia expresada como
porcentaje.

Esta ecuación indica que la absorbancia es una función lineal de la concentración, donde a es una
constante de proporcionalidad llamada absortividad. La magnitud de a depende de las unidades
de b y c. Si la concentración c está expresada en moles por litro y la longitud de la cubeta b en
centímetros, la constante a recibe el nombre de absortividad molar (ξ).Luego

El siguiente esquema explica el fenómeno de la absorbancia A:

FENOMENO DE ABSORBANCIA

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Las curvas que se presentan a continuación muestran cómo varía la absorbancia [A]
y la transmitancia [T] en función de la concentración
[C], de acuerdo con la ley de Beer Lambert, en la que se basa la espectrofotometría.

GRAFICA DE LA TRANSMITANCIA

 Como conclusión puede inferirse que, a medida que aumenta la concentración


de una sustancia, la transmitancia disminuye y que, al aumentar la
concentración de la sustancia, aumenta la absorbancia.

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La linealidad de la ley de Beer Lambert se ve afectada, si se presentan las
siguientes condiciones:
1. Corrimientos en el equilibrio químico de la muestra como una función de la
concentración.
2. Desviaciones en los coeficientes de absortividad, concentraciones mayores
de 0,01 M debido a la interacción electrostática entre moléculas cercanas.
3. Cambios en el índice de refracción a altas concentraciones del analito.
4. Difusión de la luz debido a partículas en la muestra.
5. Fluorescencia o fosforescencia de la muestra.
6. Radiación no monocromática.
1.2.3 Transmitancia y absorción de las radiaciones
Por las leyes mencionadas anteriormente, al hacer pasar una cantidad de
fotones o de radiaciones hay una pérdida que se expresa con la ecuación:

It/Io=T-kdc''

Donde:
 It es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la
celda fotoeléctrica (llamada radiación o intensidad transmitida); Io
es la intensidad con la que sale al atravesar la celda (radiación
intensidad incidente), y la relación entre ambas (T) es la
transmitancia.

 En el exponente, el signo negativo Se debe a que la energía


radiante decrece a medida que el recorrido aumenta. El superíndice k
es la capacidad de la muestra para la captación del haz del campo
electromagnético, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometría
que recorre la radiación, y c es la concentración del soluto en la
muestra ya ubicada en la cubeta.

La ecuación simplificada de la ley de Beer y Lambert

A = ε.d.c

Comprende la mínima ecuación que relaciona la concentración


 (A), el espesor recorrido por la radiación

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 (ε). El factor de calibración relaciona la concentración y la
absorbancia de los estándares.
 (d) el factor de calibración
 (c), la absorbencia de la muestra

Las ecuaciones mencionadas de la ley son válidas solo y solo si:


 La radiación incidente es monocromática.
 Las especies actúan independientemente unas de otras durante la
absorción.
 La absorción ocurre en un volumen de sección trasversal uniforme.
1.3 Aplicaciones

Las aplicaciones principales son:

 Determinar la cantidad de concentración en una solución de algún compuesto


utilizando las fórmulas ya mencionadas;
 Ayudar en la determinación de estructuras moleculares;
 La identificación de unidades estructurales específicas, ya que estas tienen
distintos tipos de absorbancia (grupos funcionales o isomerías);
 Determinar constantes de disociación de indicadores ácido-base.
1.4 Tipos de espectrofotometría
En la tabla siguiente se muestra una clasificación de los principales tipos de
Espectrofotometrías agrupadas según el tipo de interacción luz-molecular
(Absorción o emisión) y según la zona del espectro en la que se trabaja.
Y a continuación se describen las características principales de cada tipo, los
Instrumentos utilizados y las aplicaciones analíticas más importantes.
Clasificación:

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1.4.2 Espectrofotometría de absorción y emisión atómica.

Permite la determinación (cuantificación) de unos 70 elementos químicos en


concentraciones que oscilan entre ppb a ppm. La medida de los elementos
químicos se hace en estado atómico mediante una atomización de la muestra
en estado gaseoso. Estos Átomos experimentan absorción, emisión o
fluorescencia de radiaciones VIS, UV o rayos X, debidos a transiciones
electrónicas entre orbitales atómicos. Esta técnica no da información sobre
enlaces moleculares en absoluto y nos da información específica sobre un
elemento químico.
La principal diferencia con las otras espectrometrías es la atomización,
proceso por el cual la muestra se introduce en un mechero, junto con el
combustible, y se quema a elevada temperatura. Las moléculas del analito se
rompen totalmente liberando los elementos químicos en estado atómico, y
estos pueden experimentar fenómenos de absorción, emisión o fluorescencia.
En la figura siguiente se muestra un esquema de estas posibilidades.
Según el sistema de atomización, y la temperatura a la que se produce, se
tienen los siguientes métodos de espectrofotometría atómica: llama, electro
térmicos, plasma, arco voltaico y chispa eléctrica.
Espectrofotometría de absorción atómica con llama.
Es el método más utilizado de la espectrofotometría atómica. Muy adecuado
para la determinación de ppm de Fe, Cd, Au, Pb, Zn, Cu, Mn en disoluciones
acuosas de aguas, fertilizantes, suelos, extractos vegetales, etc.
Los Átomos en la llama absorben radiación de determinadas  (VIS y UV según
su naturaleza, por lo que es una técnica muy específica para cada elemento.

Como fuente de radiación se usa una lámpara de catado hueco que


contiene el mismo metal que se va a analizar y que emite una radiación
con una banda de entorno a la que se va a absorber.
En lugar de una cubeta o recipiente para poner la muestra lleva un
mechero donde se produce la llama con la que se atomiza la
muestra. Esta llama suele ser de propano, acetileno o hidrógeno y
oxígeno u óxido nitroso (N2O). Las temperaturas que alcanza varían entre
1500 y 3000°C.

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1.4.3 Espectrofotometría de emisión atómica con llama.

Es una técnica muy utilizada para la determinación de metales


alcalinos y alcalino- térreos: Una, K, Li, Ca, etc., en concentraciones del orden
de ppm. Se utiliza con los mismos materiales ya comentados: aguas,
fertilizantes, suelos, material, vegetal, alimentos, contaminantes, etc.
Se basa en el mismo principio que la absorción, pero en este caso la
temperatura de la llama es suficiente para que haya una excitación atómica y
una emisión posterior.

Los instrumentos utilizados en esta técnica se denominan


Espectrofotómetros de Emisión Atómica (EEA) y en ingles con las siglas
AES. A diferencia de los anteriores (absorción) no tienen fuente de
radiación. El resto de componentes es igual, así como el procedimiento de
calibración y cálculo de resultados.

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1.4.4 Espectrofotometría de emisión atómica con llama.

Se utiliza para determinar concentraciones muy pequeñas (ppb) de


metales contaminantes: Pb, Cd, Cr, Zn, Cu, Co, Mn, Pt, Hg, etc.
En las técnicas anteriores el rendimiento de la atomización (moléculas
atomizadas con respecto al total) es muy bajo: aproximadamente del 0,1%.
Esto hace que la sensibilidad de la técnica sea baja. El atomizador electro
térmicos consta de un pequeño mini horno, que es un cilindro de
grafito de 50mm×10mm que se calienta con una resistencia eléctrica hasta
3000ºC. Con una pequeña cantidad de muestra (varios mi) se obtiene una
gran cantidad de partículas atomizadas (eficiencia del 100%) y una gran
señal que da una gran sensibilidad a la técnica. Por el contrario la
precisión no es tan buena y hay un gran número de interferencias. El
proceso de calibrado es muy delicado y solo es útil en determinaciones de
concentraciones muy bajas de algunos metales.
El instrumento utilizado se llama Espectrometría con Horno de Grafito o
GFS (Graphit Furnace Spectrometry).
1.4.5 Espectrofotometría de emisión con plasma.
Se consigue una llama de altísima temperatura que transforma la mezcla de
combustible y muestra al estado de plasma: una mezcla gaseosa con
una concentración muy alta de cationes y electrones. Esto permite una
elevada eficiencia en la atomización, una intensa emisión de los átomos y
la determinación de una gran cantidad de elementos químicos metálicos (y
algunos no metales) con algo menos de sensibilidad que el Horno de
Grafito, pero con más precisión. Además la combinación de esta
técnica con un sistema informático potente, permite la determinación de
la concentración de varias decenas de elementos químicos en unos segundos.

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Los diferentes aparatos se basan en la fuente de energía para obtener el
plasma en el mechero. Los más comunes son:
 DCP: plasma generado por una corriente continua.
 ICP: (induced coupled plasm) plasma acoplado por inducción de un
generador de radiofrecuencias.
 plasma generado por frecuencias de microondas.
Entre los no metales que pueden ser determinados por esta técnica se
encuentra el P y el B. Se obtienen límites de detección entre 0,1 y 100
ppm.
1.4.6 Espectrofotometría de fluorescencia molecular.
Se basa en el fenómeno que experimentan algunas moléculas de absorber
una radiación determinada y en el proceso de relajación, liberar parte
de la energía como calor (radiación térmica) y otra parte como radiación
electromagnética de una longitud de onda mayor a la incidente.
Este fenómeno se produce en un intervalo de tiempo muy pequeño después
de la absorción (10-5 s) a diferencia de la fosforescencia que puede durar
minutos y horas.
Este fenómeno permite una técnica muy sensible ya que no todas las
moléculas fluorescente y las l pueden cambiar según las condiciones. Los
límites de detección son inferiores a la absorción molecular VIS-UV.
El instrumento más usado es el espectrofluorómetro, y la técnica más
común se denomina Fluorescencia de Rayos X, ya que son estos los utilizados
como fuente de energía. Tiene una gran aplicabilidad en la cuantificación
de moléculas orgánicas en productos alimenticios, farmacéuticos, clínicos y
naturales.
1.4.7 Espectrofotometría de absorción molecular VIS-UV.
Hay un proceso de absorción de radiación por parte de las moléculas pasando
a un estado excitado.

Absorción
M + h. V M*
Y en un tiempo muy breve se produce la relajación con emisión de energía en
forma de calor.
Relajación
M* M + calor

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El aumento de energía interna conlleva transiciones electrónicas. Estas
transiciones son de electrones compartidos que forman enlaces o de
electrones de orbitales atómicos externos (no compartidos).
Los principales tipos de moléculas que experimentan este fenómeno son:
 compuestos orgánicos con grupos no saturados (dobles y triples enlaces),
donde hay electrones de enlace que pueden saltar a otros orbitales de
enlace.
Estos grupos funcionales que absorben en VIS o UV se llaman cromóforos.
 compuestos de coordinación (complejos) de metales de transición. Ej. Fe
(SCN)2- rojo intenso.
 iones de metales de transición, de lantánidos y de actínidos. Ej. Color azul
de la disolución de Cu2+.
Generalmente la absorción de estos compuestos se produce en varias  o
amplias bandas de absorción, por lo que no hay picos bien definidos. Sobre
todo cuando hay interacciones con el disolvente. Esto confiere poca
selectividad a la técnica para identificación de especies, siendo más útil en
análisis cuantitativo.
El instrumento utilizado en la técnica es el espectrofotómetro visible-
ultravioleta. Que permiten trabajar con una gran cantidad de  , incluso hay
algunos que hacen un barrido en una región del espectro dando un gráfico del
espectro de absorción de una sustancia. Estos aparatos constan de un selector
de  , y una cubeta transparente de 1 cm de lado y 3 cm de alto donde se
coloca la disolución a medir.
Normalmente hay dos huecos para dos cubetas, uno para la muestra y otra
para una disolución de referencia o blanco, frente a la cual se hacen todas las
medidas.
Cuando la especie química a medir absorbe en el visible (y la disolución tiene
color) la técnica se llama vulgarmente colorimetría. Y los aparatos utilizados
se llaman
Colorímetros. También se comercializan kits de análisis rápidos que tienen
unas tablas de comparación de colores (o disoluciones prepararadas y de
color estable) en lugar de un aparato como el descrito. La disolución
problema se mezcla con los reactivos adecuados en un pequeño tubo de
ensayo y se compara con la tabla de colores. En esta tabla está asignada la
concentración de analito que corresponde a cada color, con lo cual se puede

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determinar la concentración en el problema. Este método no tiene una gran
exactitud pero en muchas aplicaciones es suficiente
(Cloro en piscinas, nitratos en aguas de embalses, NaCl en aguas para riego,
etc.).
En muchos casos la especie estudiada no absorbe en el VIS-UV, pero sí un
complejo formado con otro compuesto. Por ej. el ion fosfato no absorbe en el
VIS, pero forma un complejo con el ión molibdato y el vanadato
(fosfomolibdovanadato) que tiene una gran intensidad de absorción a 430 nm
(azul), y se emplea para análisis de fósforo en aguas, suelos, etc. En estos
casos la determinación espectrometría no es directa, sino que previamente se
hace reaccionar la muestra con unos reactivos adecuados (reacción
colorimétrica) y posteriormente se mide la absorbancia de la mezcla.

Ventajas y aplicaciones.
 Gran aplicabilidad, ya que hay muchas especies absorbentes y
posibilidades de formar complejos con las que no lo son.
 Elevada sensibilidad, se pueden determinar con hasta 10-5 M
 Selectividad media, interacciones cuando hay grupos que absorben a la
misma 
 Permite automatización del proceso, se usa en sistemas de análisis continuo
sistema no destructivo en medidas directas
Como principal desventaja de la técnica las interacciones por partículas que
interfieran el paso de luz. Las disoluciones han de ser exentas de sólidos en
suspensión.
1.4.8 Espectrofotometría de absorción molecular IR.

La absorción molecular de radiaciones de esta zona del espectro


produce transiciones vibraciones y rotacionales. Por lo tanto, todas

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las moléculas absorben en IR, excepto algunas diatónicas (O2, N2, Cl2) de
elevada simetría.
Las bandas de absorción son muy estrechas y corresponden a enlaces
muy específicos, y a menudo dependen de los átomos más próximos. Un
espectro de IR es como una “huella dactilar” de la molécula y esto implica que
es una técnica idónea para identificar compuestos orgánicos o inorgánicos
puros, pero no es tan adecuada para cuantificar. CA
PITULO II
2.6 EL ESPECTROFOTÓMETRO
La palabra espectrofotómetro se deriva de la palabra latina spectrum, que significa
imagen, y de la palabra griega phos o photos, que significa luz. El espectrofotómetro,
construido mediante procesos avanzados de fabricación, es uno de los principales
instrumentos diagnósticos y de investigación desarrollados por el ser humano. Utiliza
las propiedades de la luz y su interacción con otras sustancias, para determinar la
naturaleza de las mismas. En general, la luz de una lámpara de características
especiales es guiada a través de un dispositivo que selecciona y separa luz de una
determinada longitud de onda y la hace pasar por una muestra. La intensidad de la luz
que sale de la muestra es captada y comparada con la intensidad de la luz que incidió
en la muestra y a partir de esto se calcula la transmitancia de la muestra, que depende
de factores como la concentración de la sustancia.

Es un instrumento usado en la física óptica que permite comparar la radiación


absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de
soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia en función de
la longitud de onda.

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ESPECTROFOTÓMETO MODERNO ESPECTROFOTÓMETRO CLÁSICO

Es el nombre genérico de todos los aparatos basados en esta técnica. A este término se
le añaden los adjetivos adecuados a la subtècnica adecuada, ej.
Espectrofotómetro de absorción atómica.

El espectrofotómetro tiene un generador de radiación lumínica (poli crómica), un


separador para obtener la radiación adecuada y luego mide la potencia radiante
obtenida.
2.7 UTILIDADES DEL ESPECTROFOTÓMETRO
 Los espectrofotómetros son útiles debido a la relación de la intensidad del color en
una muestra y su relación a la cantidad de soluto dentro de la muestra.
Por ejemplo si utilizáramos una solución de colorante rojo de alimento en agua, y
medimos la cantidad de luz azul absorbida cuando pasa a través de la solución, una
fluctuación mensurable del voltaje puede ser inducido en una fotocélula en el lado
opuesto. Si ahora la solución del tinte rojo es diluida por la adicción del agua, el color
será menos intenso.
Así hay una relación entre el voltaje y la cantidad de tinte en la muestra.
 El espectrofotómetro tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a
través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra.
Esto le permite al experimentador realizar dos funciones:
1. Nos da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto
podemos lograrlo midiendo la absorbancia a distintos largos de onda, formando un
espectrograma. Como cada sustancia tiene propiedades espectrales únicas,
distintas sustancias tienen un arreglo de átomos tridimensionales particulares que
hace que cada sustancia tengan características únicas.

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2. Nos dice cuanta cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la
muestra, la concentración es proporcional a la absorbancia, según la ley de Beer-
Lambert a mayor cantidad de moléculas presentes en las muestra, mayor será la
cantidad de energía absorbida por los electrones.
 El espectrofotómetro mide la absorbancia de una muestra en los espectros de luz
ultravioleta y visible (200 a 880 nm).
El largo de onda es determinado por un prisma que descompone el rayo de luz de
acuerdo al largo de onda escogido. Luego la luz pasa por una hendidura que
determina la intensidad del haz este haz atraviesa la muestra y llega a un tubo
fotográfico, donde es medido.

 una característica del instrumento es la necesidad de “blanquear” al aparto antes de


cada lectura. Esto se hace colocando una cubeta con una solución control que tenga
todos los componentes de la reacción, menos la sustancia que va a ser medida en el
instrumento y ajustando la lectura a cero absorbancia.
El propósito de esto es eliminar el registro de absorbancia (background) que pueda
presentar los demás componentes de la reacción a ese largo de onda particular. Todas
las moléculas presentan absorbancia porque todas interfieren con el paso de la luz
solo que la absorbancia será optima aun largo de onda de luz específica para cada tipo
de sustancia.
2.8 PROPÓCITO DEL EQUIPO
El espectrofotómetro se usa en el laboratorio con el fin de determinar la concentración
de una sustancia en una solución, permitiendo así la realización de análisis cuantitativos.
2.9 COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO.
El esquema que se presenta a continuación describe la interrelación de los diversos
componentes de un espectrofotómetro. Los más importantes son los siguientes:
1. La fuente luminosa
2. El monocromador
3. El portador de muestras
4. El sistema detector
5. El sistema de lectura
Los componentes mencionados corresponden a los básicos o generales de este
instrumento y no a los que hayan sido incorporados por diversos fabricantes como
consecuencia del avance tecnológico. Una breve explicación de los mismos se encuentra
a continuación del esquema.

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COMPONENTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO

2.9.1 Fuente luminosa

Dependiendo del tipo de espectrofotometría, la fuente luminosa puede ser una


lámpara con filamento de tungsteno para luz visible, o una lámpara de arco de
deuterio para luz ultravioleta. Algunos fabricantes han diseñado
espectrofotómetros con lámparas intermitentes de xenón de alta duración que
emiten luz en el rango de la luz visible y ultravioleta. La lámpara o lámparas
vienen montadas de fábrica en una base que permite asegurar una determinada
posición, para que se mantengan las condiciones de ajuste óptico y enfoque
cuando está en operación o se requiere reemplazarla. La energía radiante típica
que emite una lámpara de tungsteno está entre los 2 600 y los 3 000 °K (grados K

2.9.2 Monocromador o selector de  :


Tiene como objetivo controlar la pureza de la radiación emitida consiguiendo el
menor ancho de banda de longitud de onda posible. Consta de un conjunto de
lentes, espejos y rendijas para dispersar y separar, enfocar y restringir la
radiación no deseada.

Los componentes de las monocroma dores son:

a) PRISMAS
Producen la refracción de la luz, siendo el Angulo de refracción mayor
cuanto menores la  de la radiación.
Después del prisma hay una rendija por donde se hace pasar la radiación
deseada.

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Según el tipo de radiaciones se usan prismas de vidrio (VIS), cuarzo o sílice
(UV) y cristales de NaCl para IR.

b) REDES DE DIFRACCION:
Es una lámina metálica (Al) altamente pulida sobre la que se han hecho una
gran cantidad de estrías (líneas paralelas). Estas estrías actúan como
centros de dispersión de todas las radiaciones incidentes. Hay una
dispersión lineal de las  de una determinada banda cromática, por lo tanto
se puede usar en todas las regiones del espectro. Funciona mejor que el
prisma en el IR.

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ELEMENTOS VENTAJAS DESVENTAJAS

Fotoceldas Económicas Longitud de onda limitada entre


400 y 750 nm.

Pequeñas Baja sensibilidad.

Robustas Respuesta lenta a cambio de


intensidad lumínica.

No requieren fuentes de energía ni Agotamiento.


amplificadores de señal.
La señal es muy dependiente de
la temperatura

Fototubos Se fabrican para que sean sensibles Requieren calibraciones,


entre los 190 y los 650 nm. También dependiendo de la temperatura
entre los 600 y los 1000 nm. del ambiente en que se
encuentra instalado el equipo.

Se agotan con altos niveles de


iluminación.

Fotodiodos Carecen de partes mecánicas


móviles.
Adquieren datos espectrales de
forma simultánea.
Disponen de un rango dinámico
amplio.
Brindan excelente reproducibilidad
de la longitud de onda.

Fotomultiplicadores Son más sensibles que los fototubos Pueden quemarse, si la luz
y las fotoceldas. diurna penetra cuando están
trabajando.

Trabajan en rangos más amplios de Son costosos.


longitudes de onda.

Tienen respuestas más rápidas a los Necesitan fuente de alto voltaje.

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cambios de intensidad luminosa.

No se agotan como las fotoceldas. Se usan solo en


Pueden ser fabricados con espectrofotómetros
sensibilidad a la luz en todo el rango especializados.
de la luz ultravioleta y visible.

2.9.3 Portador de muestras:


Está diseñado para sostener la muestra que se quiere analizar dentro del rayo de
luz de longitud de onda determinada por el Monocromador.
El elemento que contiene la muestra es una celda o cubeta, por lo general,
rectangular. Las celdas o cubetas se fabrican de vidrio, si se requieren efectuar
estudios en el rango de los 340 a los 1 000 nm y de sílice, si el análisis está en el
rango comprendido entre los 220 y los 340 nm. También hay celdas en
materiales plásticos como estireno o poli estireno. El portador de muestras lo
diseñan los fabricantes de acuerdo al tipo de espectrofotómetro y de muestra a
analizar, por ello se encuentran portadores de muestra con micro celdas, aunque
también tubos de ensayo y otras variantes como las celdas de flujo continuo.
2.9.4 El sistema detector (transductor):

El sistema de detección puede estar diseñado con fotoceldas, fototubos,


fotodiodos o fotomultiplicadores.

Esto depende de los rangos de longitud de onda, de la sensibilidad y de la


velocidad de respuesta requeridas. El sistema de detección recibe la energía
lumínica proveniente de la muestra y la convierte en una señal eléctrica
proporcional a la energía recibida. La señal eléctrica puede ser procesada y
amplificada, para que pueda interpretarse a través del sistema de lectura. En la
tabla que se incluye a continuación, se presenta un resumen de las ventajas y
desventajas de los dispositivos normalmente usados en los sistemas de
detección.

Los detectores también dependen de la región de  en la que se trabaja:

 FOTOTUBO:
Para la zona del VIS y UV. Con el mismo principio de funcionamiento que la
célula fotoeléctrica.

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Al golpear un fotón en el cátodo, este emite un electrón hacia el Ánodo, lo cual
provoca un flujo de corriente eléctrica que es medida por un voltímetro. La
respuesta del material foto emisivo depende de la , por tanto se usan diferentes
tipos de fototubos según la  en la que se trabaja.

Cuando se utilizan radiaciones de baja intensidad la señal eléctrica es muy débil y


sujeta a un gran error. En este caso se utiliza el “TUBO FOTOMULTIPLICADOR”,
que incluye varios fototubos en serie. En este caso, el choque de un fotón forma
una cascada de electrones que dan una señal más intensa.

 FOTODIODO ARRAY:
Sobre un semiconductor se fabrican diodos en serie paralelos, de manera que al
incidir sobre Él una radiación difractada, se puede tener una señal instantánea
para un amplio rango de .
 INFRAROJOS:
Los detectores de infrarrojos se basan en la propiedad térmica de estas
radiaciones y traducen el calor asociado a la radiación transmitida en una señal
eléctrica. Los más utilizados son los TERMOPARES y BOLOMETROS, formados
por metales cuya resistencia eléctrica cambia con la temperatura.

2.9.5 Sistema de lectura


La señal que sale del detector recibe diversas transformaciones. Se amplifica y se
transforma para que su intensidad resulte proporcional al porcentaje de

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transmitancia/absorbancia. Existen sistemas de lectura de tipo análogo (muestra
la magnitud leída sobre una escala de lectura) o digital (muestra la magnitud
leída en una pantalla).
Los indicadores de tipo análogo reciben tradicionalmente el nombre de metros.
Su exactitud depende, entre otros factores, de la longitud de la escala y del
número de divisiones que tenga.
(Mientras más divisiones, más exacto). Su principal desventaja es que pueden ser
mal leídos, por la fatiga de los operadores o errores, cuando disponen de varias
escalas, al tratar de identificar las escalas sobre las que deben realizar la lectura.
Los indicadores digitales usualmente presentan los resultados en una pantalla,
en forma de caracteres alfanuméricos luminosos. Esto los hace menos propensos
a que se cometan errores de lectura.
2.10 TIPOS DE ESPECTROFOTÓMETROS
 Absorción atómica
 De emisión
 Ultravioleta
 Infrarrojo
 etc.
Ejemplos de distintos tipos de espectrofotómetro.
2.10.1 espectrofotómetro Smart espectro.
Es portátil e ideal para análisis de agua. Selección automática de longitud de
onda, 40 test pre- programados y memoria para 25 test adicionales.
Especificaciones:
 Rango de longitud de onda: 350 a
1000nm.
 Exactitud de longitud de onda:
2nm.
 Resolución: 1nm.
 Monocromador: red de difracción de
1200 líneas/nm.
 Fuente de luz: lámpara halógena.
 Detector: fotodiodo de silicio.
 Rango fotométrico: -0,1 a 2,5 ABS.
 Exactitud fotométrica: 0,005 ABS.
 Modo de medición: % T, ABS y
concentración.

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 Admite celdas de 25 nm de diámetro y cubeta de 10 nm.
 Dimensiones: 35x, 28x 17cm
 Peso: 4.68 kg
2.10.2 Espectrofotómetro de absorción atómica
 Rango de longitud de onda: 190 a 860 nm.
 Paso de banda espectral: 0,2nm a 200 nm.
 Dispersión lineal reciproca: a 200nm – 0,1nm/mm. A 800nm –
0,4nm/mm.
 Efecto zeeman, longitudinal inverso atomización: calentamiento
transversal del horno de grafito, calentamiento eléctrico.
 Rango de medida de absorbancia: 0,5 a 2000.
 Concentración: 0,0001 a 9999 unidades de concentración.
 Factor de expansión: 0,01 a 100.
 Tiempo de lectura: 1 a 60 segundos.
 Tiempo de demora: 0 a 60 segundos.

2.10.3 Espectrofotómetro UV-visible UV mini 1240.


 Modo fotométrico para longitud de onda fija
Con el método fotométrico, Ud. puede medir la absorbancia o la transmitancia en la
longitud de onda fija, análisis cuantitativo fijo.
 Modo espectro para barrido de longitud de onda.
Con ese modo estándar Ud. Puede lograr espectro UV – visible completo de muestras
de 190nm a 1100 nm. Barrido repetido le permite a Ud. Medir automáticamente
cualquier cambio espectral en todo el rango.
 Modo cuantificación para análisis de longitud simple.

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Este método le permite a Ud. Preparar curva de calibración para determinaciones
fáciles de concentraciones de muestras desconocidas. Están disponibles modos de 1,3
y 3 longitudes de onda.

2.10.4 Espectrofotómetro UV – vis TU 1800 UV-vis espectro photometer.


 El TU 1800/1800 S es el más popular espectrofotómetro de P- General.
Su óptica adopta el sistema de medición SPLIT – BEAD con un detector formado
por dos fotodiodos de estudio solido de alta sensibilidad.
 Las operaciones del instrumento están controladas a través de un microchip
interno en conjunto con una pantalla de cristal líquido (LCD) y un teclado soft –
touch con salida para impresora su comportamiento es para 8 celdas y además
posee una fuente de luz accesible.
 El TU 1800/1800 S efectúa mediciones fotométricas, mediciones espectrales y
cuantitativas es fácilmente operable con características sobresalientes, escaneo
de longitudes de onda automático.

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2.11 LOS INSTRUMENTOS MÁS UTILIZADOS SON:
a) Espectrofotómetros NIR.
Similares al VIS-UV, pero con componentes diferentes. Hacen un
barrido de y recogen el espectro. Los más utilizados son los
llamados NIR (near infra red) que trabajan con zonas del espectro en el
infrarrojo cercano.
b) Espectrómetros de transformada de Fourier.
Recoge datos de una zona del espectro simultáneamente y en
varias pasadas, posteriormente por un proceso matemático muy
complejo se resuelven los picos del espectro con una gran
sensibilidad. Son los más usados actualmente.
c) Fotómetros de filtro.
Con un filtro adecuado se selecciona una deseada. Sirven para
monitorizar la concentración de una especie química en un punto fijo.
Se usan mucho para contaminantes atmosféricos: CO, nitrobenceno,
cloruro de vinilo, HCN, piridina, etc. En algunos instrumentos se usan
para determinar CO2, SO2, etc.
Aplicaciones.
Se usa en la identificación de compuestos en investigación de medicamentos,
bioquímica, biología, fisiología. En la industria farmacéutica, pesticidas,
alimentación, contaminantes, etc.
2.12 DEFINICIONES BÁSICAS.
 Absorción.
Fenómeno que se presenta cuando los átomos o moléculas de una sustancia
absorben luz. La energía incidente interactúa con la estructura de la materia,
transfiriéndole energía que la lleva a un estado energético superior. (Los
electrones de la sustancia son promovidos a órbitas de mayor nivel energético).
Dependiendo de la longitud de onda de la luz incidente, se producen efectos
distintos. Por ejemplo: la luz ultravioleta promueve los electrones a órbitas de
mayor nivel energético; la luz infrarroja produce vibración atómica y las
microondas, rotación atómica.
La energía absorbida se pierde por calor o radiación.
 Nanómetro.
Unidad de longitud que corresponde a 10-9 m (una mil millonésima de metro).
Se identifica por el símbolo [nm]. Se usa para medir longitudes de onda de luz
visible o ultravioleta.

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 Refracción.
Fenómeno de cambio de dirección que se presenta cuando un rayo de luz llega a
la superficie de separación de dos medios.
 Difracción.
Fenómeno por el cual los rayos de un movimiento ondulatorio se desvían de la
línea recta, aunque el medio sea homogéneo, cuando las ondas encuentran en su
camino algún obstáculo por cuyo lado pueden continuar propagándose.
 Espectrofotometría.
Estudio cuantitativo del espectro lumínico. Sirve para efectuar análisis de
sustancias orgánicas o inorgánicas, dentro de rangos de longitud de onda
determinados. En general, cuando la luz pasa a través de una solución una parte
de la misma será absorbida por esta, mientras que otra parte pasará o será
transmitida a través de la solución. La luz absorbida depende de la longitud de
onda, la concentración de la solución y la longitud de la trayectoria. La luz
transmitida permite determinar propiedades como la concentración de las
sustancias, aspecto que en el campo de la salud básica sirve para efectuar
multitud de análisis necesarios para determinar el estado de salud de un
paciente.
 Longitud de onda.
Distancia existente entre dos picos de una onda. La longitud de onda mantiene
una relación inversa con la frecuencia, que puede entenderse como el número de
picos que pasa por un punto en un tiempo determinado.

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CONCLUCIONES
 Se conoció y aplico la ley de beer y Lambert.
 Se determinó la concentración de una solución por espectrofotometría.
 Se estableció los factores que ocasionen desviaciones a la ley de Lambert y beer.
 Se estableció la relación entre la transmitancia y la absorbancia con la concentración de
una solución.

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REFERENCIAS:
 http://www.espectrometria.com/tipos_de_espectrometra
 http://www.calibracion.com.mx/espectrofotometro.html
 http://www.bmglabtech.com/es/tecnologico/modos-de-
deteccion/absorbancia/
 http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/transmitancia-
y-absorbancia
 http://perso.wanadoo.es/sergioram1/espectrofotometria.htm
 http://www.misdocs.com/es/document/espectrofotometria
 http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/quimbiotec/F
Qpractica4.pdf
 http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/cineticapractica6_19
764.pdf
 http://www.misdocs.com/es/document/espectrofotometria
 http://www.metrologiaindust.com.ar/Servicios/Capacitacion/Curs
o2/Material/Diapositivas/5-Espectrofotometria.pd

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EJERCICIOS

1. Una disolución de concentración C tiene una transmitancia del 80%. Determinar el


porcentaje de transmitancia de una disolución de la misma sustancia de concentración
3C.

A1=ƐbC1 = -Log T1 A2=ƐbC2 =Ɛb3C1 =3ƐbC1 = -3Log T1=-3*Log (80/100)=0.2907

T2 = 10-A2 = 10-0.2907 = 0.512

Aunque la concentración aumenta tres veces, la transmitancia no disminuye al triple, ya que la


relación es logarítmica.

2. Una disolución tiene una transmitancia de 0.10 a una cierta λ,

a) determinar su absorbancia

b) si su concentración es de 0.020 g / l, su masa molecular de 100 y su transmitancia fue medida


en celdas de 1.0 cm, determinar su absortividad y su absortividad molar.

c) Calcular la transmitancia para una disolución que tenga la mitad de concentración pero se
mida en cubetas de 5.0 cm.

a) A = -log(T) = -log0.1 = 1

b) A=1 = Ɛbc(M)=abc(gL-1)

a= A/bc(gL-1)= 1/(1*0.020) = 50 L/(g cm)

Ɛ = A/bc(M) = 1/(1*0.02/100)=5x103 L/(mol cm)

O bien

Ɛ = a Pm = 50 *100 = 5x103

c) T = 10-A; A’ =ab’c’= a5bc/2 =5/2A = 5/2*1 = 2.5

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3.- La cafeína (C8H10O2N4•H2O) posee una absorbancia de 0.510 a 272 nm y 1 cm de
paso óptico en disoluciones de concentración de 1 mg/ 100 mL. Una muestra de 2.5 g
de café soluble se diluye con agua a 500 mL. Se toman 250 mL se añaden 25.0 mL de
H2SO4 0.1 N y se diluye a 500 mL. Se mide la absorbancia a 272 nm resultando ser
0.415. Calcular los gramos de cafeína por Kg de café soluble que tiene muestra. Dato:
Peso molecular (cafeína)=212 g/mol Solución: a) A=3.25 g/Kg

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