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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS.

LABORATORIO SISTEMAS DE CONTROL DE CALIDAD

REPORTE DE PRÁCTICA 10 y 11
TINCIÓN DE WRIGHT Y VALIDACION DE SUEROS HEMOCLASIFICADORES
DE GRUPO SANGUINEO “ABO”

PROFESORES:

HILDA PÉREZ CERVANTES


AURA P. HERNÁNDEZ OLICÓN
MERCEDES COLÍN
LUIS CARREÑO DURAN

ALUMNA:

GAXIOLA SALAMANCA ALEJANDRA MICHELLE.

SECCIÓN: 3 5QM1

29/05/2019
Introducción: La tinción de Wright ha sido utilizada ampliamente en los laboratorios
de parasitología y hematología con fines de investigación y diagnostico
principalmente debido a la característica de diferenciación morfológica que es capaz
de proporcionar la técnica, es por ello es por lo que es necesario que tanto la
extensión sanguínea como la tinción misma tengan un control de calidad adecuado
pues de ellos depende el correcto diagnóstico.
La determinación de grupos sanguíneos es de gran importancia por las
repercusiones que puede haber al realizar una transfusión sanguínea. El sistema
ABO es el más relevante, seguido del Rh por su potencia inmunogénica.1 La
tipificación por norma debe hacerse con la prueba directa e inversa. Sin embargo,
en muchos laboratorios al ser una prueba rápida, con material y equipo mínimos se
no se realiza el control de calidad interno y menos frecuente el externo
Objetivos:
1. Determinar el efecto que tiene sobre las células un colorante mal preparado.
2. Determinar el efecto del pH sobre la tinción.
3. Determinar el grupo sanguíneo de una muestra de sangre problema, de
forma directa e indirecta.
4. Realizar pruebas de control a los sueros hemo clasificadores
Fundamento: El colorante azul de metileno, debido a su naturaleza básica tiene
apetencia por las estructuras celulares de naturaleza ácida tal como los ácidos
nucleicos, gránulos de neutrófilos y proteínas ácidas. La eosina por su parte, dado
su naturaleza ácida, tiene apetencia por las estructuras de naturaleza básica dentro
de la célula tales como los gránulos de los eosinófilos, citoplasma y hemoglobina.
Visualmente, la técnica permite ver a los eritrocitos de color rosa, plaquetas de
color violeta o purpura, neutrófilos con núcleo violeta oscuro y citoplasma rosado
con gránulos de color violeta, eosinófilos de núcleo violeta, citoplasma azul con
gránulos rojos, los basófilos muestran núcleo azul oscuro o purpura con gránulos
negros, linfocitos con núcleo de color purpura y citoplasma de color azul celeste
mientras que los monocitos muestran núcleo laxo de color violeta y un citoplasma
de color azul celeste.
El análisis que utilizan los reactivos para determinar grupo sanguíneo se basa en el
principio de hemaglutinación directa. La incubación de los eritrocitos que se analizan
con Anti-A, Anti-B o Anti-A, B dará lugar a una reacción antígeno-anticuerpo
específica si el antígeno A o B correspondiente está presente en los glóbulos rojos.
La detección visible de esta reacción se pone de manifiesto por hemaglutinación.
La ausencia de aglutinación indica un resultado negativo e indica la ausencia del
antígeno correspondiente, dentro de las limitaciones aceptadas del procedimiento
de análisis. Los reactivos ocasionan una aglutinación directa (agrupamiento)de los
glóbulos rojos examinados portadores del antígeno ABO correspondiente.
La no aglutinación es indicadora de la ausencia del antígeno ABO
correspondiente / Anti-A, Anti-B o Anti-A,B
Metodología.
Resultados:
1) Tinción de Wright.
Metodología utilizada: Tinción de Wright
pH de los reguladores utilizados: 6.4, 6.8 y 7.2
Célula de referencia: Monocito
Característica que debe tener la célula de referencia: el monocito es de la célula
mas grande de la serie blanca, con esta tinción el núcleo se observa lila claro y el
citoplasma gris con gránulos rosas.
Se realizaron 5 extensiones sanguíneas de las cuales 3 fueron realizadas con la
técnica clásica de Wright utilizando búferes con diferentes pH, el primer extendido
fue realizado a pH 6.4, el segundo a pH 6.8 y el tercero a pH 7.4.

Figura 1: Tinción de Wright tratada con un pH 6.4. Se observan eritrocitos de color


rosado. Señalado en la imagen se muestra la presencia de monocito con núcleo
laxo color morado y citoplasma azul celeste
Figura 2: Tinción de Wright tratada con un pH 6.8. se observan los eritrocitos de
color rosado, se señala la presencia de un monocito con núcleo laxo de color
morado intenso y citoplasma color azul.

Figura 3: Tinción de Wright tratada con un pH 7.4. Se observan los eritrocitos de


color morado, con precipitados del colorante al interior de las células y al exterior,
así como un monocito de núcleo laxo morado con citoplasma irregular azul.
Características de una buena tinción:
Esta coloración es policromática, lo que quiere decir que genera varios colores
dependiendo de la estructura que absorbe el colorante, las extensiones de las
muestras de sangre deben secar al aire espontáneamente. Los extendidos deben
ser lo más delgados posibles para obtener una mejor fijación del colorante y evitar
las sobre coloraciones. Para teñidos de alta calidad, se aconseja realizar la tinción
durante las dos horas siguientes a la preparación del extendido. Por otra parte, la
muestra ideal es sangre capilar, sin anticoagulante. Sin embargo, si se usa sangre
venosa se debe usar como anticoagulante EDTA y no heparina, ya que este último
puede deformar las estructuras celulares. Para evitar el deterioro del colorante
preparado se debe guardar en lugares secos. Durante el proceso del lavado se
recomienda el uso de agua ajustada a pH neutro. Finalmente, es recomendable
realizar pruebas a los métodos tutoriales que se usan en el laboratorio cada cierto
tiempo. Esto se realiza tiñendo muestras o extendidos patrones, a manera de control
de calidad. Este paso es importante, ya que así se asegura que la tinción está
adecuadamente preparada y los tiempos de coloración están bien estandarizados.
Si la lámina patrón queda mal coloreada, entonces existen problemas que deben
ser resueltos.
IDENTIFICACION DE ACCIONES ACCIONES
PUNTOS CRITICOS EN CORRECTIVAS PREVENTIVAS
EL PROCESO
 Que los  No teñir los  En lo que se
extendidos se extendidos seca un
tiñan sin que hasta que extendido ir
estén estén secos haciendo los
completamente  Utilizar agua demás para que
secos. ajustada a un vayan secando y
 pH de la pH neutro por último teñir
tinción  El extendido todos.
 Grosor del debe ser lo  Revisar el pH de
extendido mas delgado los buffers
posible constantemente.
midiendo una  Utilizar
cantidad aplicadores lo
adecuada de cuales ya tienen
sangre en la fija la cantidad
gota de sangre que
depositada se usara en
cada extendido.
2) Validación de sueros hemo clasificadores de grupo sanguíneo “ABO”
Tabla 1. Código de color del sistema ABO y Rh.
Anti suero Color del suero Color del bulbo.
Anti-A Azul Negro
Anti-B Amarillo Negro
Anti-AB Incoloro Negro
Anti-D incoloro Gris

Tabla 2. Prueba de especificidad para el sistema ABO y Rh.


Eritrocitos Antisuero Aglutinados
conocidos de 1mm de
Anti-A Anti-B Anti-AB Anti-D diámetro

A1 + - + + Si
A2 + - + + Si
B- - + + + Si
O - - - + Si

Tabla 3. Prueba de avidez para el sistema ABO y Rh.


ANTISUERO Eritrocitos Avidez Tamaño de Valor
conocidos (seg) cúmulos esperado
después de 2
min
Anti-A A1 45 2 mm 1 mm

A2 53 2 mm 1 mm
Anti-B B 21 1 mm 1 mm

Anti-AB A1 46 ----- 1 mm
B 42 ----- 1 mm
Anti-D O 120 1 mm 1 mm
Tabla 4. Potencia para el sistema ABO y Rh
Dilución Lectura Dilución Lectura
Cruces Puntos Cruces Puntos
s/dilución ++++ 12 1:32 ++ 8
1:2 ++++ 12 1:64 ++ 8
1:4 ++++ 12 1:128 + 5
1:8 ++++ 12 1:256 +- 2
1:16 +++ 10 1:512 - 0
Ultima dilución en la que se observa el aglutinado: 1:256
Título: 256
Antisuero evaluado: anti A
Suspensión de eritrocitos utilizados: A1.

Tabla 5. Potencia y avidez para el sistema ABO y Rh.


ANTISUERO Eritrocitos Potencia
conocidos
(Título Título
obtenido) mínimo
aceptable
Anti-A A2 256 256

Anti-B B- 64 256

Anti-AB A1, B- 16 256

Anti-D O 512 256


Tabla 6. Prueba directa.
Suero utilizado: Anti-A, Anti-B, Anti AB y Anti-D
Eritrocitos: O+
suero anti A anti-B Anti AB Anti-D
eritrocitos O+ O+ O+ O+
Resultado negativo negativo negativo positivo
observaciones sin sin sin aglutino
aglutinación aglutinación aglutinación rápidamente.
Tabla 7. Prueba indirecta
Eritrocitos O+ O+ O+ O+
Suero anti A anti-B Anti AB Anti-D
Resultado positivo positivo positivo negativo
observaciones Presencia de aglutinación Sin aglutinación.
aproximadamente a los 20 segundos
Tabla 8. Sueros y eritrocitos utilizados
Antisueros hemo clasificadores Eritrocitos de tipo
Tipo Marca conocido
Anti-D Lafon O
Anti-A Lafon A2
Anti-AB Dialab A1,B-
Anti-B Lafon B-
Tabla 9. Especificaciones del sistema ABO Rh
DATOS Anti-A Anti-B Anti-AB Anti-D
Fecha de 18/oct/2013 15/dic/2013 01/feb/2013 08/ago/2015
caducidad
Lote 9687 9791 5283 9094
Código de
color:
Blanca con
Etiqueta Blanca con azul amarillo Blanca Blanca con gris
Suero Azul Amarillo Transparente Transparente
Bulbo Negro Amarillo Negro Gris

Aspecto
físico:

Ausencia de Si cumple Si cumple Si cumple Si cumple


turbidez

Precipitados No presenta No presenta No presenta No presenta


Partículas No presenta No presenta No presenta No presenta

Formación de No presenta No presenta No presenta No presenta


geles en el
sobrenadante

Discusiones:
1) Tinción de Wright
Las tinciones hematológicas se pueden definir como el conjunto de técnicas
necesarias para teñir y diferenciar los distintos componentes celulares de la sangre.
Estos componentes conforman la fracción forme de la sangre, y gracias a las
tinciones se pueden diferenciar en un microscopio óptico. Las técnicas en que se
basan las tinciones hematológicas hacen uso de colorantes. Éstos interactúan con
los componentes celulares dispuestos a modo de frotis sanguíneo sobre un
portaobjetos. Los colorantes son sustancias capaces de fijarse selectivamente
según su afinidad química. Este tipo de tincion se puede ver afectada por diversos
factores, uno de ellos es el pH el cual nosotros evaluamos en la realización de esta
práctica. En la figura 1, los eritrocitos están correctamente teñidos, aparentemente
de acuerdo con la bibliografía, presentando una coloración rosada, el monocito de
igual manera parece presentar las características descritas bibliográficamente de
una buena función, que es el núcleo lila y el citoplasma gris, sin embargo, no se
observan las granulaciones, esto no indica que estamos en un pH adecuado para
la realización de la tinción y que aparentemente no hay interferencias. En la figura
2 se puede apreciar que los eritrocitos de igual manera presentan una coloración
rosada, sin embargo, el exceso de luz provoca que dentro del eritrocito de vea un
“hueco” aparentemente vacío, esto por la morfología del mismo eritrocito que tiende
a estrecharse al centro de sí, el monocito enfocado presenta también los colores
referidos a demás de tonalidades que permiten distinguir el núcleo y el citoplasma.
En la figura 3 se evidencia el efecto de un pH demasiado básico, provocando la
precipitación del colorante, afectando la identificación de plaquetas en caso de estar
presentes, se descarta la posibilidad que los puntos negros sean plaquetas debido
a que se sitúan en su mayoría al interior de la célula. El monocito enfocado presenta
una tonalidad demasiado intensa del núcleo y del citoplasma, por lo que no
correspondería con la bibliografía.
Además de esto hay diversos errores a considerar que de igual manera afectan la
tinción, extendidos muy pálidos, por lo general se deben a un tiempo muy corto de
tinción o a un lavado muy exagerado. Se corrige alargando el tiempo de contacto
con el colorante o disminuyendo el tiempo de lavado. La presencia de precipitados
de colorante en el frotis puede tener varias causas, sin embargo, las causas más
frecuentes son: uso del colorante no filtrado, teñir sobre puentes de coloración
desnivelados, usar láminas sucias con polvo o grasa, no hacer un buen lavado al
culminar la tinción. El amortiguador es el responsable del pH del colorante.
Colorantes con pH por debajo del indicado (ácido) tendrán como consecuencia la
obtención de frotis muy rojizos. Si el pH del colorante está por encima (alcalino) se
obtendrá un frotis extremadamente azulado.
2) Validación de sueros hemo clasificadores
Al llevar a cabo el control de calidad interno, específicamente de los reactivos como
parte del proceso de tipificación, se corrobora que cumplan con las especificaciones
de la norma (marcado, código de color, aspecto, especificidad y avidez en cada
rutina y potencia en cada cambio de lote) para su aceptación y uso. La interpretación
de los resultados de da de acuerdo con la presencia de aglutinación para cualquiera
de las técnicas ensayadas, indica reacción POSITIVA.

La avidez de los reactivos hemo clasificadores para determinar grupos sanguíneos


del Sistema ABO, en la prueba en placa y a temperatura ambiente, debe ser tal, que
la aglutinación de los eritrocitos del tipo correspondiente se inicie en el tiempo
máximo que se especifica para cada subgrupo, contados a partir del momento en
que se ponen en contacto suero y eritrocitos y el tamaño de los cúmulos aglutinados
no debe ser menor de 1 mm de diámetro.

En la tabla 3 se observan los resultados obtenidos para esta prueba, al compararlo


con los establecidos con la norma obteneos que ninguno de los sueros cumple con
el máximo tiempo en segundos para que inicie la aglutinación, sin embargo, el
tamaño de la mayoría si fue de 1mm de diámetro.
En el caso de especificidad el producto debe estar libre de aglutininas diferentes a
las especificadas en la etiqueta y libre de efectos o substancias indeseables tales
como la presencia de hemolisinas o la tendencia a producir el fenómeno de
rouleaux. El fenómeno de rouleaux indica el agrupamiento de los eritrocitos en forma
de pilas de monedas; a veces es un artefacto que se produce en la preparación de
los extendido pero otras veces indica la presencia de hiperproteinemia e
hiperviscosidad como sucede en pacientes con mieloma múltiple,
macroglobulinemia y en estados inflamatorios crónicos. En la tabla 2 se muestran
los resultados obtenidos para esta prueba en este caso todos los sueros
presentaron especificidad.
El título mínimo de los reactivos hemo clasificadores o del reactivo de origen
monoclonal aceptable para cada grupo o subgrupo de eritrocitos de prueba se indica
en la siguiente tabla:

En la tabla 5 se muestran los resultados obtenidos para esta prueba por parte de la
sección para los diferentes sueros evaluados, tenemos que para todos los sueros
evaluados se cumplió satisfactoria mente con la prueba de potencia.
Idealmente las pruebas de rutina para determinar el grupo sanguíneo ABO deben
hacerse en dos partes, primero buscando en los eritrocitos la presencia de
antígenos A o B en la membrana, esta es la prueba directa, y segundo buscando en
el suero o plasma los anticuerpos anti A y/o anti-B que correspondería tener esa
persona (prueba inversa). Por lo tanto, las pruebas globulares y las inversas se
complementan ya que una confirma a la otra. Justo como observamos en las tablas
6 y 7 donde en este caso la sangre que utilizamos era O+ la cual solo tiene
anticuerpos contra los antígenos A y B, razón por la cual un paciente que tenga el
tipo sanguíneo O+ solo puede recibir sangre de otro O+, aunque son donadores
universales.
Conclusiones:
1. La mala preparación de un colorante puede alterar los resultados o generar
controversias a la hora de realizar una diferenciación.
2. El pH juega un papel importante en la tinción, siendo capaz de alterar la
afinidad de los colorantes por las estructuras celulares
3. La determinación del grupo sanguíneo esta basada en reacciones antígeno
anticuerpo.
4. Los sueros cumplieron con las especificaciones de la norma por lo que pasan
la validación.
5. El grupo sanguíneo de nuestro paciente es O+
Pregunta extra:

1. Norma Mexicana que especifica los valores de avidez y potencia requeridos


del antisuero D.
PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-222-SSA1-2002, Que
establece las especificaciones sanitarias de los reactivos: hemoclasificadores para
determinar grupos de sistema ABO, Anti-Rh para identificar el antígeno D y
antiglobulina humana para la prueba de Coombs
2. ¿Cuál es el pH óptimo para realizar la tinción de Wright?
En general el pH de la solución de fosfatos puede encontrarse en el intervalo de
6.4-7.2 dependiendo de la concentración de colorante por lo que se considera que
el pH optimo para esta tinción es el de 6.8.

Bibliografía:
1) Gutiérrez V. Estudio comparativo entre el método de coloración de Wright y
prueba de Elisa para el diagnóstico de Ehrlichiosis canina en la ciudad de
San Pedro Sula, Honduras. 2008. Tesis de Grado para optar al Título de
Médico Veterinario. Universidad de San Carlos de Guatemala. Consultado:
28-05-19

2) Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnóstico Microbiológico de Bailey


& Scott. 12 ed. Argentina. Editorial Panamericana S.A. consultado 28-05-19
3) NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-017-SSA1-1993, QUE ESTABLECE
LAS ESPECIFICACIONES SANITARIAS DE LOS REACTIVOS
HEMOCLASIFICADORES PARA DETERMINAR GRUPOS DEL SISTEMA
ABO, consultado: http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/017ssa13.html
28-05-19