Identificación bacteriana universal por PCR y secuenciación de ADN de genes de 16rRNA

28.1 Resumen del método

El ensayo es una PCR de amplificación única que incorpora tres reacciones separadas. Los
cebadores usados son cebadores de amplio rango que reconocen secuencias conservadas
dentro del gen 16S rRNA y amplifican las regiones variables intermedias. Las porciones
variables del gen 16S rRNA proporcionan firmas únicas que pueden analizarse para
proporcionar una identificación de las especies de bacterias en la muestra.
28.2 Introducción
La identificación de los aislados del cultivo de bacterias mediante el análisis de la secuencia
génica es rutinaria en muchos laboratorios. Genes tales como; Las secuencias transcritas rRNA
ribosómicas 16S, ARNr 23S y ARNr 16S-23S, rpoB (que codifica (3 subunidades de ARN
polimerasa), groEL (codificación de la proteína de choque térmico), gyrB (codificación 13
subunidad de DNA girasa) y recombinación que codifica recA Que se encuentran en
prácticamente toda la bacte- ria y que han sido utilizados para la identificación utilizando
secuencias conservadas como cebadores universales en la PCR [2] .La identificación de
secuencias de ADN es particularmente útil para organismos que son difíciles de cultivar o son
de crecimiento lento en medios de laboratorio y los que Son relativamente inertes
bioquímicamente o producen reacciones variables en esquemas de identificación fenotípica.
La detección e identificación de bacterias directamente de especímenes usando dianas
genéticas universales está comprometida debido a la presencia de otras bacterias
contaminantes en la muestra introducida durante; Recolección, procesamiento de muestras y
PCR. Estas bacterias contaminantes también producirán ADN amplificado en la PCR y
contribuirán a una secuencia mixta de ADN que no puede ser interpretada. Para esta reacción,
los ensayos de PCR utilizando cebadores universales sólo deben realizarse en muestras de
sitios normalmente estériles y sólo cuando las bacterias son visibles por microscopía. Si los
organismos no son visibles, la detección e identificación de la bacteria causante pueden ser
cuestionables. Las directrices para el uso de la secuenciación del ADN para la identificación de
microorganismos ha sido propuesta por el Instituto de Estándares Clínicos y Laboratorio [1].
Esta publicación debe ser revisada antes del desarrollo de un sistema de identificación
universal usando PCR y secuenciación de ADN. El gen 16SrRNA es la diana más común
utilizada para identificar los isoatos bacterianos y el número de deposiciones de secuencias en
bancos de datos como GenBank y MOM [http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank]
Www.ridom_rdna.de) está aumentando a un ritmo rápido.
28.3 Especímenes aceptables
El ensayo sólo debe realizarse en aislamientos de cultivo. La detección e identificación de
bacterias de muestras de sitio normalmente estériles tales como sangre, CSE, aspirados de las
articulaciones y el tejido se puede intentar cuando los organismos son visibles por
microscopía o cuando hay evidencia histológica de una infección bacteriana. Cuando se utiliza
el ensayo en especímenes, el resultado debe indicar claramente que el resultado del ensayo
debe interpretarse junto con otras pruebas clínicas y de laboratorio.
28.4 Especímenes inaceptables
Especímenes que no proceden de sitios normalmente estériles, tejidos fijados con formalina e
inclusiones de parafina o muestras de tejido fresco en las que no se ha observado evidencia
de infección por microscopía.
28.5 Extracción de muestras
Varía con el tipo de muestra. Los aislamientos de cultivo pueden prepararse para PCR
suspendiendo una colonia en 1 ml de agua y hirviendo durante 10 min. Después de una
centrifugación por impulsos durante 10 s, el sobrenadante se puede usar en la PCR. Los
especímenes requieren un tratamiento dependiente en el sitio de recolección. El ADN se
purifica a partir de especímenes utilizando sistemas automatizados y manuales de
procesamiento de muestras como BioMerieux EasyMag y Roche High Pure según las
instrucciones del fabricante.
28.6 Secuencias de cebadores Los cebadores fueron derivados de Reiman [3]; 1 (U1) 5CACG
CGT CGA CAG AGT TTG ATC CTG GCT-3 'Corto Universal 1 (U1R) 5'-GGA CFA CCA GGG TAT CTA
AT-3'
Universal 2 (U2) 5 '- CGC GGA TCC GCT ACC T10 TTA CGA CTT - 3' Universal 3 (U3) 5CAGT
GCC AGC AGC CGC GGT AA - 3 'Universal 4 (U4) 5' - AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC -3 '
Universal 5 (U5) 5'-TCA AAK GAA TTG ACG GGG GC-3' (K = 0 + 1) Se utilizan cebadores en
las siguientes combinaciones para amplificar el gen 16S rRNA; Aislamientos de cultivo; Ul +
U2, U3 + U4 y U5 + U4. especímenes; U I R + Ul, U3 + U4 y U5 + U4

28.6 Primer Sequences

 The primers were derived from Reiman [3]; Universal 1 (U1) 5CACG CGT CGA CAG AGT TTG ATC
CTG GCT-3' Short Universal 1 (U1R) 5'-GGA CFA CCA GGG TAT CTA AT-3'

Universal 2 (U2) 5'-CGC GGA TCC GCT ACC T10 TTA CGA CTT-3' Universal 3 (U3) 5CAGT GCC AGC
AGC CGC GGT AA-3' Universal 4 (U4) 5'-AGG CCC GGG AAC GTA TTC AC-3' Universal 5 (U5) 5'-TCA
AAK GAA TTG ACG GGG GC-3' (K = 0+1)

Primers are used in the following combinations to amplify the 16S rRNA gene;
Culture isolates; Ul+U2, U3+U4 and U5+U4. Specimens; U I R+Ul, U3+U4 and U5+U4.

28.7 Amplificación de la PCR

Cada tubo de mezcla maestra (MM) contiene los componentes para 10 reacciones de PCR de
25 U. Cada tubo de PCR requiere 15 pi de MM para una PCR de 25 pi. Añadir 10 p, 1 de ADN
de muestra a cada tubo de PCR respectivo. Nota: Es aconsejable irradiar todos los tubos y
componentes MM bajo luz ultravioleta durante 10 min en un armario biológico de seguridad.
Dado que este ensayo utiliza cebadores universales, la presencia de cualquier ADN bacteriano
extraño introducirá contaminación en el ensayo.
La amplificación se realizó en un thennocycler convencional (Eppendorf Mastercycler).
Desnaturalización inicial a. 94 ° C durante 3 min, seguido de 30 ciclos de 96 ° C durante 15 s,
60 ° C durante 1,5 min y 72 ° C durante 2 min. Un paso de extensión final a 72 ° C durante 5
minutos permite que todos los amplicones a estar totalmente extendidos.
28.8 Detección de productos
PCR segmentos de ADN amplificados se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al
2% y se visualizaron mediante tinción de ADN de seguridad SYBR (Invitrogen Life
Technologies). El tamaño del producto se determina por comparación con el Control Positivo
y una escala de tamaño de ADN.
28.9 Tratamiento previo a la secuenciación
Antes de la secuenciación de ADN, PCR producto se limpia de de no utilizados dNTP y el
cebador usando dos enzimas hidrolíticas, la fosfatasa alcalina de gamba y exonucleasa 1 según
las instrucciones del fabricante (ExoSAP-IT, USB Affymetrix).

Antes de la secuenciación de ADN, PCR producto se limpia de de no utilizados dNTP y el

cebador usando dos enzimas hidrolíticas, la fosfatasa alcalina de gamba y exonucleasa 1 según
las instrucciones del fabricante (ExoSAP-IT, USB Affymetrix).
28.10 Secuenciación de ADN
Se realiza por un proveedor de servicios comerciales y requiere aproximadamente 10 ng / 111
de ADN por muestra y 3 pM / 111 de cebador de secuenciación (U1, U3 o U5). Las variables de
los reactivos de secuenciación tales como la cantidad de ADN y las concentraciones de
cebadores deben optimizarse con cada proveedor.
28.11 Análisis de Secuencia de ADN
Las secuencias de ADN deben ser editadas usando un software apropiado (como Chromas),
para producir una secuencia limpia y de fácil lectura de longitud máxima. Siempre que sea
posible, las secuencias de los tres PCR (U1, U3 y U5) deben ser editadas y combinadas para
producir una única lectura continua. Si no es posible, como mínimo, Ul o U3 + U5 deben ser
legibles para obtener un resultado. Las secuencias deben ser copiadas en el software de
análisis de secuencias (como BioManager) y analizadas mediante una búsqueda BLAST contra
bases de datos apropiadas.
28.12 Informes
Consulte CLSI (1). El porcentaje de concordancia con las secuencias de ADN depositadas en las
bases de datos requeridas para la identificación varía con el género y la especie.
Generalmente se requiere un ajuste de> 98% y la identificación de la secuencia de ADN debe
correlacionarse con otros resultados tales como; Cromatografía de gases análisis de ácidos
grasos, morfología del organismo y características de crecimiento, bioquímicos
convencionales y resistencia antimicrobiana pro-archivos. La identificación también debe ser
discutida con el médico referente para determinar si la identificación coincide con el
diagnóstico clínico.
28.13 Control de calidad
Control positivo: Una especie de bacteria, rara vez si se encuentra en especímenes de
laboratorio, de secuencia conocida debe incluirse como un control positivo en cada ensayo de
PCR para asegurar que el ensayo está funcionando según las especificaciones y como control
para la posterior secuenciación del ADN. Si no se obtiene la secuencia de ADN completa y
correcta para el organismo de control positivo, entonces el ensayo no es válido y debe
repetirse. Controles negativos: A medida que se utilizan cebadores universales en este
ensayo, es importante no incluir controles de ADN (NDC, por sus siglas en inglés) para cada
muestra en cada etapa del proceso (Procesamiento de muestras y establecimiento de PCR)
para determinar la posibilidad de contaminación. Agregue primero cada tubo de NDC de
Procesamiento de muestras representativo en la misma secuencia en la que se añadirán las
muestras seguidas de la primera muestra. La muestra se añade diluida 1: 100 en agua (para
diluir posibles sustancias inhibidoras) y sin diluir. Después de la adición a los primeros tubos
de muestra, a continuación se añade el respectivo NDC de configuración de PCR. Este tubo
mostrará si alguna bacteria contaminante puede haber entrado en los tubos durante la
adición de la primera muestra. El proceso de adición se repite entonces para la siguiente
muestra y así sucesivamente. Después de que se añadió la última muestra y el NDC de
configuración RCR respectivo, se a~nade el ADN de control positivo a los tubos 'Spike' que
contienen volúmenes iguales de muestra diluida 1: 100 y Control Positivo diluido a un nivel
que es dos diluciones Por encima del límite de detección del ensayo. Finalmente, los tubos de
la serie de dilución de control positivo tienen control positivo añadido del más diluido al
menos diluido para demostrar el límite de detección del ensayo y proporcionar un monitor de
la reproducibilidad del ensayo. Cualquier producto de PCR formado en NDC debe ser
secuenciado por ADN y comparado con la secuencia de la muestra. Si la secuencia NDC está
presente en la secuencia de la muestra, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cualquier
tubo de Spike que no forme un producto de PCR muestra que la muestra respectiva era
inhibidora. La muestra debe volver a extraerse y volver a probarse.
28.14 Limitaciones del ensayo
La naturaleza omnipresente de las bacterias y el potencial de bacterias exógenas para
contaminar las muestras y producir un resultado incorrecto o espuria o una secuencia mixta
de ADN limitan la aplicación de este ensayo a personal altamente experimentado y para fines
prácticos, la identificación de aislamientos de cultivo.