Actividad enzimática en procesos de transformación

Gabriel Pataquiva. Paula Bravo.

Introducción.
Dentro de los procesos que se llevan a cabo en el cuerpo humano, la mayoría de las
reacciones se producen por la catalización de enzimas, donde la primera características que
contribuyen estas, son la aceleración de las reacciones, la primera sustancia involucrada se le
llama sustrato, en la que la enzima actúa sobre este uniéndose en un lugar específico, llamado
sitio activo. Después de que se termina de catalizar esta reacción, se libera la enzima y se
vuelve a unir con otro sustrato y así sucesivamente en un sin fin de reacciones. La razón de
que la enzima involucrada sea la que aumente la velocidad de una reacción, está ligada a la
expresión de la inversa de la energía de activación y la velocidad de la reacción, a medida que
que la energía de activación aumenta, la velocidad de esta es menor. (Garrido, A. Teijón J.
2006).
La cinética enzimática es la encargada de explicar la velocidad de reacción de enzimas, los
principales interventores en este proceso son las concentraciones de sustrato y enzima, esto
obedece a la ley de ​Michaelis y Menten, ​donde proponen dos etapas, en la primera se forma un
complejo enzima-sustrato y en la segunda, se analiza el producto resultante del complejo
enzima-sustrato liberando la enzima. (Daniel, L. R, Donald. 2000).
Otro de los factores que intervienen en la cinética enzimática es el pH del medio en el que se
encuentran dichas reacciones. Existen condiciones óptimas para que la reacción se lleve a
cabo de manera que el producto sea máximo, la ionización del sitio activo de la enzima,
incrementa gradualmente conforme aumenta el pH, esto sucede porque se encuentra más
grupos de ácidos carboxílicos ya ionizados y hace que para la enzima, sea mucho más fácil
enlazarse con los sustratos, existen puntos máximos para cada enzima respectiva donde se
encuentra la mayor cantidad de hidronios para protonar la sustancia. (​Roosdiana A.
Prasetyawan, S. Mahdi, C. Sutrisno. (2013).
Otro factor que influye en la reacción de una enzima es la temperatura, a medida que
incrementa esta variable, aumenta consigo la energía cinética de las moléculas reaccionantes,
y por consecuencia, es mayor la probabilidad de que se den colisiones efectivas para que
dichas reacciones se lleven a cabo. Conforme aumenta la temperatura, aumenta la velocidad
de reacción también, pero cuando alcanza un valor determinado, dependiendo de la enzima,
esta empieza a desnaturalizarse y la velocidad de reacción comienza a verse perjudicada, por
lo tanto, la temperatura óptima de reacción es aquella en donde la velocidad de reacción es
máxima. (Peña, A. Arroyo, A. Gómez, A. Tapia, R. 2004).
Por último, el factor que tampoco se puede dejar de lado dentro de los que interfieren en las
reacciones enzimáticas, son los productos de estas, se supone que en una reacción, la
sustancia que se necesita son generalmente los productos de dichas reacciones, sin embargo,
en un proceso metabólico existe lo que se llama una retroalimentación negativa, esto quiere
decir que el exceso de productos no será favorable, sino que la reacción será bloqueada por
estos, impidiendo a la enzima a volver a unirse con sustratos, actuando como un inhibidor, este
es uno de los mecanismos más importantes de regulación metabólica. (N. Campbell. 2001).
Metodología.

Antes de que se procediera a llevar a cabo los distintos procedimientos, era necesario extraer
la fosfatasa ácida, la cual consistía en pesar 10 gramos de germen de trigo y agregarlos a 50
ml de agua fría, después de esto, se agitó la mezcla hasta que se obtuvo una suspensión
uniforme. Se dejó en reposo por 30 minutos y luego se decantó por otros 15 minutos. La
solución requerida es sin residuos, ni precipitado, este fue entonces el extracto crudo de
fosfatasa ácida.

- Curva calibración fosfato inorgánico

Se prepararon las siguientes soluciones.

Figura 1. Volumen de reactivos para la preparación de la curva de calibración de fosfato

inorgánico.
Tubo Patrón de fosfato Agua (ml) Ácido molíbdico
mg/ml (ml) (ml)

B – 4.0 0.5

1 0.1 3.9 0.5

2 0.2 3.8 0.5

3 0.3 3.7 0.5

4 0.4 3.6 0.5

5 0.5 3.5 0.5

Se agitaron bien los tubos y se dejaron reposar durante 3 minutos, después de esto se
adicionaron 0,5ml de la solución de ácido ascórbico a cada tubo expuesto en la figura 1. Con
ayuda del vortex, se mezclaron muy bien y se dejaron reposar otros 10 minutos, para permitirle
a la reacción que desarrollara el calor. Se determinó la absorbancia a 660nm.

- A.1. Determinación de cantidad de fosfato por acción de fosfatasa ácida.

Se agregaron los siguientes reactivos en todos los casos, en el orden indicado.

Figura 2: Volúmenes de sustancias para determinación de fosfato.

Sobrenadante de la reacción enzimática 0.5 ml

Agua destilada 3.5 ml

 Ácido molíbdico 0.5 ml

Se agitó bien y se dejó reposar por 3 minutos; después se adicionaron 0,5 ml de ácido
ascórbico. Se agitó bien con ayuda del vortex y se dejó reposar por 10 minutos. Se hizo la
lectura de absorbancia a 660nm en todos los casos que se emplearon este procedimiento,
esto, con el fin de hallar la cantidad en forma de concentración de fosfato.

- Determinación de tiempo óptimo de incubación.

Se prepararon las siguientes mezclas de reacción

Figura 3: Volúmenes de reactivos para tiempo óptimo

Tubo Buffer citráto 0.1 β-​glicero fosfato Agua (ml) Mezcle Extracto
M de pH 5.3 (ml) de sodio (ml) bien los enzimático (ml)
tubos y
agregue
Blanco buffer 5.6 – 2.4 –
a
(BB)
continuaci
ón
Blanco sustrato 5.6 1.6 0.8 –
(BS)

Blanco enzima 5.6 – 1.6 0.8

(BE)

Tiempo 5.6 1.6 – 0.8

reacción (TR)

Se mezclaron muy bien y se dejó incubar a temperatura ambiente; el blanco de buffer (BB) y el
blanco de sustrato (BS) se dejaron reaccionar por 30 minutos, pasado el tiempo se tomaron
pequeños volúmenes de 1ml y se virtieron sobre ácido tricloroacético al 10%.

Además de esto, durante los 30 minutos que se mantuvieron en incubación BB y BS, se

tomaron muestras de 1ml de BE y TR a los 2, 5, 10, 15, 20 y 30 minutos, todas estas se
virtieron en tubos que contenían 1ml de tricloroacético al 10%, después de esto se agitaron y
centrifugaron a 4000 rpm durante 3 minutos.

Se determinó la cantidad de fosfato producido en el sobrenadante, ajustando el 100% de

temperatura (cero en ABS) con el tubo BB y siguiendo el procedimiento A1.
Desde este punto, se pararon las reacciones en cada tubo, al momento que se cumplen los 10
minutos de adicionarles la enzima.

- Determinación del pH óptimo

Se realizaron las siguientes soluciones, según la figura a continuación.

Figura 4: volúmenes utilizados para pH óptimo
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6

Sustrato – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

(ml)

Buffer 2.0 1.6 1.8 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
(ml)

pH del 5.3 5.3 5.3 3.0 4.0 5.0 5.3 5.6 6.2
buffer

Con respecto a lo anterior, el sustrato corresponde a la solución de *-glicerofosfato de sodio

0,1M. La solución buffer de citrato 0,1 M a diferentes pH. La enzima utilizada fue el extracto
crudo que se preparó al principio de la práctica. Y el tiempo de reacción correspondió a 10
minutos.

Se mezcló todo muy bien e inmediatamente se agregó la enzima, esta vez con intervalos de 30
segundos. Se le agregaron 0,2 ml de enzima a los tubos desde el BE hasta el tubo 6 y con
ayuda del vortex, otra vez se aseguró que se homogeneizara bien y se dejó incubando durante
10 minutos a temperatura ambiente, después de este tiempo se le agregaron 2 ml de ATA al
10% de concentración. Se mezcló, se centrifugó a 4000 rpm durante 3 minutos.
Se descartó el precipitado y sobre el sobrenadante de todos los tubos, se determina la
concentración por medio del procedimiento A1.

- Determinación de la temperatura óptima

Se prepararon las siguientes soluciones de acuerda la figura a continuación.

Figura 5. Volúmenes de reactivos para prueba de temperatura óptima.
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5

Buffer (ml) 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4

Sustrato (ml) – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

Agua (ml) 0.6 0.2 0.4 – – – – –

Temperatura° 18 18 18 0 18 37 60 92
C

De acuerdo a la figura 5, la solución buffer fue de citrato 0,1M, ph 5,3. El sustrato fue una
solución de ​b-​glicerofosfato de sodio 0,1M, la enzima fue el extracto preparado al inicio del
procedimiento, el tiempo de reacción fue de 10 minutos y la temperatura de incubación fueron
diferentes, dependiendo a la que corresponda, tal como se muestra en la figura 6 a
continuación.

Figura 6. Temperaturas utilizadas para la determinación de la temperatura óptima.

Temperatura, °C Medio

0 Agua – Hielo

18 Temperatura ambiente

37 Termostato

60 Termostato

98 Agua en ebullición

Las soluciones se mezclaron bien y se les agregó 0,2ml de la enzima en intervalos de 30

segundos, exceptuando a los tubos BB y BS.

Con ayuda del vortex, se agitaron nuevamente y se dejaron todos los tubos en incubación por
10 minutos. Pasado este tiempo, se adicionó 2 ml de ATA a todos los tubos al 10% y se
centrifuga a 4000 rpm durante 3 minutos. Después de esto, se descartó el precipitado y se
determinó la concentración de fosfato inorgánico, por medio del procedimiento A1.

- Concentración de la enzima en la velocidad de reacción.

Se realizaron las siguientes soluciones, tal como se muestra en la figura 7.

Figura 7. Volúmenes empleados para la determinación del efecto de concentración de la

enzima.
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5

Buffer 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2

(ml)

Sustrato – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

(ml)

Agua 0.8 0.4 0.75 0.35 0.30 0.25 0.10 –

(ml)

De acuerdo a la figura anterior, la solución buffer se indicó que era de citrato, 0,1M pH 5,3, el
sustrato era una solución de b-glicerofosfato de sodio 0,1M, la enzima fue el extracto preparado
al inicio del procedimiento, el tiempo de reacción es de 10 minutos y la temperatura de reacción
fue ambiente. Se mezcló bien y se adicionó la enzima de acuerdo a la siguiente figura,

Figura 8. Adición de enzima para determinación de efecto de concentración.

Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5

Enzima – – 50 50 100 150 300 400

(µl)

Con ayuda del vortex, se agitaron bien y se dejaron en incubación por el tiempo mencionado
anteriormente, pasado este tiempo, se adicionaron a todos los tubos 2 ml de ATA al 10% y se
centrifugaron a 4000 rpm durante 3 minutos. En el sobrenadante de todos los tubos se
determina la concentración de fosfato inorgánico, mediante el procedimiento A1.

- Efecto de la concentración de sustrato en la constante de Michaelis.

Se prepararon las siguientes soluciones con el fin de determinar el efecto que tiene el sustrato
en la velocidad de reacción de acuerdo a la constante Km.

Figura 9. Volúmenes de reactivos para la determinación de concentración de sustrato.

Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8

Buffer (ml) 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4

Sustrato (ml) – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8

concen* [S] – 5 – 5 10 20 40 60 80 100 100

Agua (ml) 1.0 0.6 0.8 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 –

La solución buffer fue de citrato 0,1M y pH 5,3, el sustrato fue una solución de b-glicerofosfato
de sodio de diversas concentraciones, en el rango de 5 - 100mM, esto se ve en la figura
número 9 en la casilla de “concentración*” donde indica la concentración a adicionar en cada
tubo distinto, esta fila se debe mirar en conjunto con la casilla que dice “sustrato”, pues ambas,
complementariamente, indican la cantidad y concentración a adicionar. La enzima utilizada fue
la misma que en los otros procedimientos, el extracto crudo del procedimiento primero, el
tiempo de duración de la reacción es de 10 minutos y la temperatura fue la ambiente.

Se mezcla todo bien y se agrega la enzima 0,2 ml a los tubos desde el BE hasta el 8, en
intervalos de 30 segundos. Después de esto, con ayuda del vortex se agita muy bien y se deja
incubar, pasado este tiempo se adicionaron 2 ml de ATA al 10% a todos los tubos y se
centrifugaron a 4000 rpm durante 3 minutos. En el sobrenadante de todos los tubos se
determinó la concentración de fosfato inorgánico, siguiendo los pasos del procedimiento A1.

- Efecto de la presencia de inhibidor en la velocidad de reacción.

Se utilizaron los siguientes volúmenes para las soluciones requeridas.

Figura 10. Volúmenes utilizados para la determinación del efecto de la concentración del
sustrato con inhibidor en la velocidad de reacción.
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8

Buffer (ml) 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2

Sustrato (ml) – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8

Concen* [ S ] – 5 – 5 10 20 40 60 80 100 100

mM

Agua (ml) 1.2 0.6 0.8 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 –

Inhibidor (ml) – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

De acuerdo a la figura 11, la solución de buffer fue de citrato 0,2 M con pH de 5,3, en cuanto al
sustrato es una solución de b-glicerofosfato de sodio de diversas concentraciones, en la casilla
de sustrato se indica los mililitros a adicionar y en la de concentración* [S] se indica la
respectiva concentración a la que debe estar el sustrato de acuerdo al tubo que corresponda, la
enzima fue la del extracto preparada en el primer procedimiento, el tiempo de reacción fue de
10 minutos, la temperatura fue la de ambiente y el inhibidor correspondiente fueron 5mg/ml de
HgCl2.
Se mezcló todo muy bien e inmediatamente se agregó 0,2ml de la enzima con intervalos de 30
segundos a todos los tubos excepto a los de BB y BS, con ayuda del vortex se
homogeneizaron mejor las soluciones y se dejaron en incubación. Después de este tiempo, se
adicionaron 2ml de ATA a todos los tubos al 10% y se centrifugaron a 4000 rpm durante 3
minutos, en el sobrenadante resultante de todos los tubos, se determina la concentración de
fosfato inorgánico, de acuerdo al procedimiento A1.

Análisis y resultados.

- Curva calibración fosfato inorgánico.

Para la realización de la curva de calibración se llevaron 5 tubos a estos volúmenes a

concentraciones distintas de cada reactivo. Asi,

Figura 11. Resultados de absorbancia medida en la curva patrón.

 Tubo Patrón fosfato Abs Concentración
(ml)

1 0,1 0,604 0,0008

2 0,2 1,073 0,0016

3 0,3 1,519 0,0024

4 0,4 1,853 0,0032

5 0,5 2,066 0,0040

De acuerdo con la tabla anterior, se logra determinar cada concentración de fósforo inorgánico
diluido en cada uno de los tubos de ensayos, utilizando la fórmula mostrada a continuación.

V1C1 = V2C2
Ecuación 1. Concentración de fósforo en diferentes volúmenes.
Se realiza una gráfica para analizar el comportamiento de la absorbancia vs la concentración hallado en
expresado en la tabla (11) anterior.

Figura 12. Curva de calibración de fosfato patrón

De esta gráfica, se puede usar la ecuación de la recta (​𝐴𝑏𝑠​=463 [​s​] + 0,3118) para conocer las
contracciones iniciales de la enzima y del sustrato, respectivamente.

Con estos resultados es posible hallar la concentración y obtener la ecuación de la curva de

calibración, está con el fin de utilizarla para interpolar los valores en la cantidad de fósforo
producido por acción de la fosfatasa ácida y de esta manera encontrar la concentración de
fósforo en dichas soluciones, de una manera gráfica y no con la ecuación.
- Determinación de tiempo óptimo de incubación.
En primer lugar, para determinar la velocidad de reacción a distintos tiempos de incubación, se
mide la absorbancia en los tubos con soluciones a diferentes tiempos, esta se reemplaza en la
ecuación obtenida en la curva de calibración, para determinar la concentración contenida en
cada tubo.
Las enzimas pueden llegar a deteriorar su actividad dependiendo que tanto tiempo reaccione
con el medio, por lo tanto se pretende determinar cuál es el tiempo óptimo de incubación con
esta prueba.

Figura 13. Valores de absorbancia para tiempo real de blanco de la enzima.

Tiempo (min) TR BE

2 0,218 0,165

5 0,391 0,262

10 0,48 0,348

15 0,441 0,321

20 0,42 0,31

30 0,382 0,321

Luego se procede a hallar la diferencia entre TR y BE para determinar la verdadera

absorbancia que permite realizar el cálculo de la concentración de fosfato en cada tiempo y así
concluir en que tiempo se genera un mayor rendimiento.

Figura 14. Valores de absorbancia y concentración de fósforo liberado.

Abs a 660 nm.

Tiempo (min) Abs [S] Vo

2 0,053 0,00042374 4,23736E-05

5 0,129 0,00109187 0,000109187

10 0,132 0,00111824 0,000111824

15 0,12 0,00101275 0,000101275

20 0,11 0,00092484 9,24835E-05

30 0,061 0,00049407 4,94066E-05

Figura 15. Gráfica de tiempo óptimo de incubación.

Como se puede ver en la tabla anterior, el tiempo óptimo de reacción es de 10 minutos ya que
se para este tiempo se obtuvo una concentración de fósforo inorgánico mayor a todas las
demás. Esto al parecer es un tiempo bajo, pero es adecuado ya que al tener presencia de un
inhibidor, este no tendrá el tiempo suficiente para actuar sobre la enzima, por lo tanto la
reacción será más óptima. Además, se tuvo en cuenta el tiempo de reacción a 10 min y no a 5
debido a que se considera que 5 minutos es posible que la enzima no esté en su actividad
cinética aun.

- Determinación del pH óptimo

Para la determinación de la concentración de cada tubo, se mide la absorbancia de cada tubo

con un medio de pH distinto y se reemplaza en la ecuación resultante utilizando la curva de
calibración, arrojando los siguientes resultados,

Figura 16. Resultados de absorbancia y concentración para pH distintos

Tubo Absorbancia Absorbancia Concentracion
corregida

BS 0,006 - 0

BE 0,736 - 0

1 1,418 0,676 0,005900659

2 1,108 0,366 0,003175385

 3 1,216 0,474 0,004124835

4 1,361 0,619 0,00539956

5 1,379 0,637 0,005557802

6 1,329 0,587 0,005118242

La gráfica resultante de la tabla anterior, se establece como,

Figura 17. Curva de Concentración vs Absorbancia.

En cuanto al cálculo de la velocidad inicial se realizó de la siguiente manera:

V0=[Concentración] / tiempo
Se toma un tiempo de 10min para cada uno de los tubos y las concentraciones especificadas
en la gráfica 16.

Figura 18. Resultados Velocidad inicial calculada para cada pH

Tubo pH Vo

BS 5,3 -

BE 5,3 -

1 3 0,000590066

2 4 0,000317538

3 5 0,000412484
 4 5,3 0,000539956

5 5,6 0,00055578

6 6,2 0,000511824

Se realiza una curva de pH vs velocidad inicial para establecer el pH óptimo de la reacción, ya

que este parámetro es muy importante debido a que especifica la cargas de los residuos de los
aminoácidos que pueden influenciar la estructura de una enzima, y como consecuencia su
actividad catalítica. Teóricamente la reacción tiene una mayor actividad a medida que el pH
aumenta, en este punto la ionización del sitio activo de la enzima aumenta gradualmente
también, ya que existen más grupos de ácidos carboxílicos ya ionizados y hace que para la
enzima, sea mucho más fácil enlazarse con los sustratos. El punto máximo se establece entre
4 y 6 porque es donde se encuentra la mayor cantidad de hidronios para protonar la sustancia.
(F. B. Armstrong. 1982).

Figura 19. Curva de pH vs Vo.

De acuerdo a la figura 18, tenemos que el punto máximo de pH es de 3, esto es un error, ya

que como se dijo anteriormente, comparándolo con la literatura, debería estar entre 4 y 6. Si
hacemos una pequeña corrección y omitimos este dato, el punto máximo estaría entre 5 y 6,
esto hace que este mucho más correcto el dato, sin embargo, sigue siendo ácido el medio en el
que la reacción tenga su mayor actividad, ya que esta almacenada por lisosomas, quienes
reaccionan con endosomas, los cuales poseen un pH ácido.
Los errores se establecen al momento de tomar muestras y manejas los utencilios del
laboratorio.

- Determinación de la temperatura óptima.

Al igual que en el procedimiento de pH, se calcula la absorbancia corregida, desde ahí las
concentraciones correspondientes y las velocidades de reacción, en medios con temperaturas
distintas, los datos arrojados fueron los de la siguiente tabla.

Figura 20. Datos de absorbancia corregida, concentración y velocidad de reacción a distintas

temperaturas.
Tubo Absorbancia Absorbancia Concentracion Temperatura Vo
Corregida

BS 0,003 - - - 0

BE 0,305 - - - 0

1 0,581 0,273 0,002357802 0 0,00023578

2 0,258 -0,05 -0,000481758 18 -4,81758E-05

3 0,646 0,338 0,002929231 37 0,000292923

4 0,661 0,353 0,003061099 60 0,00030611

5 0,558 0,25 0,002155604 92 0,00021556

Figura 21. Gráfica de absorbancia vs concentración.

A cada concentración obtenida, fue necesario dividirla sobre el tiempo (el cual es 10min para
todos los tubos), para así, conseguir los datos de velocidad a cada concentración a distintas
temperaturas.
Figura 22. Velocidad inicial de reacción vs temperaturas distintas.

Para la determinación óptima de la temperatura en esta reacción, en cuanto a la gráfica, a

temperaturas mayores de 50ºC la enzima comienza a desnaturalizarse, lo que indica que habrá
una pérdida de actividad enzimática. Esta variable es una de las más importantes en términos
de medio óptimo para que la reacción se lleve a cabo. Hipotéticamente, el punto máximo de
temperatura debe estar entre los 35 y 45ºC, en este punto, se encuentra el mayor número de
colisiones de enzima - sustrato, incrementando el producto deseado. (F. B. Armstrong. 1982)
En la figura 21 se puede ver que el punto máximo de temperatura esta entre los 40 y 45ºC lo
cual no se aleja mucho de la literatura de las velocidades de reacción encontradas.

- Efecto de la concentración de sustrato en la constante de Michaelis.

Para esta parte de la práctica, se preparan varias soluciones con distintas concentraciones de
sustratos, la idea de esto, es determinar de una manera experimental la ecuación de Michaelis.
Se les mide la absorbancia a los respectivos tubos y se calcula la concentración de cada uno
usando la ecuación de la recta que se obtiene en la correspondiente curva de calibración.

Figura 23. Datos de Absorbancia para concentraciones de sustratos.

Tubo concentración de Absorbancia Absorbancia Concentración
sustrato (mM) Corregida

BS - 0,025 0 0

BE 100 0,767 0 0

1 5 0,82 0,028 0,000203956

 2 10 0,847 0,055 0,000441319

3 20 1,017 0,225 0,001935824

4 40 1,102 0,31 0,002683077

5 60 1,414 0,622 0,005425934

6 80 1,138 0,346 0,00299956

7 100 1,228 0,436 0,003790769

8 100 1,353 0,561 0,00488967

Figura 24. Velocidad de reacción vs distintas concentraciones de sustratos.

De acuerdo a la gráfica anterior, debido a la imprecisión de la toma de muestras, no es mucho

el análisis que se puede hacer, ya que los datos no coinciden con lo que se supone se debe
analizar, pero en la literatura se encuentra que esta gráfica, debería tener una forma tal que, a
medida que la velocidad aumenta, la concentración de sustrato también incrementa, hasta que
se aproxima de forma asintótica a una velocidad máxima. (F. B. Armstrong. 1982).
La concentración, es necesario dividirla por el tiempo de reacción y así calcular los datos de
velocidad de reacción correspondiente a cada concentración.
Teniendo estos datos, se realiza la gráfica de concentración vs velocidad inicial de reacción,
con el fin de calcular el Km, usando el intercepto con el eje y la pendiente de la gráfica, cabe
aclarar que esto se hace con los datos de la gráfica ya linealizada.
Antes de realizar los cálculos y todo lo anterior establecido, es necesario hacer una corrección
en las unidades de sustratos, conociendo su peso molecular:
B-glicerofosfato de sodio = 216,04 mol/g
 ) * ( 216,04 mol/g ) * ( ) [1]
1g 1000mg
xmM = ( 1000mM
1M
) * ( 1000mL
1L
1g

Ahora, aplicando la ecuación anterior, las nuevas concentraciones de sustratos serán,

Figura 25. Nuevas concentraciones de sustrato y velocidades de reacción.

Concentració Concentración de Vo (mg/ml-1 1/ 1/Vo
n de sustrato sustrato (mg/mL) P/min) Concentració
(mM) n de sustrato

5 2,31E-05 2,03956E-05 4,32E+04 49030,17241

10 4,63E-05 4,41319E-05 2,16E+04 22659,36255

20 9,26E-05 0,000193582 1,08E+04 5165,758401

40 1,85E-04 0,000268308 5,40E+03 3727,06422

60 2,78E-04 0,000542593 3,60E+03 1843,000648

80 3,70E-04 0,000299956 2,70E+03 3333,821805

100 4,63E-04 0,000379077 2,16E+03 2637,987013

100 4,63E-04 0,000488967 2,16E+03 2045,127652

Ahora graficamos los inversos de la velocidad y concentración de sustrato, con el fin de lograr
linealizar la gráfica para determinar el Km ya con las unidades corregidas.

Figura 26. Concentraciones de sustrato vs Velocidades linealizadas.

Al linealizar la gráfica anterior, se sabe que el intercepto con el eje es 1 dividido la velocidad
máxima, como se ve en la gráfica es de 1831,2, despejando, la velocidad máxima sería igual a
0,00054609 mg/ml-1 P/min. La pendiente Km/Vmáx es igual a la pendiente de la recta de
1,1468, por lo tanto, despejando la ecuación, tenemos que Km es igual a 0,00062626 mg/ml.

- Efecto de la presencia de inhibidor en la velocidad de reacción.

En esta experiencia se utiliza el inhibidor de MgCl​2​. Para esta parte, tal como se hizo en la
parte de concentración de sustrato, es necesario restar los blancos a las absorbancias de cada
muestra con inhibidor. Con esta absorbancia resultante, se logra calcular la concentración del
fósforo inorgánico, utilizando la ecuación que siempre hemos venido usando para darle valor a
esta variable, la de la recta de la gráfica y posteriormente, las concentraciones obtenidas se
dividen en el tiempo óptimo para obtener las velocidades de reacción.
Se logra hacer una gráfica con los datos obtenidos de la parte anterior, entre
contracción de sustrato con inhibidor y velocidades de reacción, con el fin de calcular el Km y el
Vmax y determinar qué clase de inhibición es, ya sea de carácter competitivo, no competitivo o
mixto.

Figura 27. Resultados de absorbancia y concentración de la reacción en presencia de inhibidor.

Tubo Absorbancia Absorbancia Concentración
Corregida

BB 0 0 0

BS 0,001 0 0

BE 0,372 0 0
 1 0,376 0,003 -1,5824E-05

2 0,415 0,042 0,000327033

3 0,486 0,113 0,000951209

4 0,464 0,091 0,000757802

5 0,471 0,098 0,000819341

6 0,441 0,068 0,000555604

7 0,445 0,072 0,000590769

8 0,448 0,075 0,000617143

Figura 28. Absorbancia vs concentración de reacción en presencia de un inhibidor.

Para analizar el efecto que causa el MgCl​2 con concentración de 5mg/mL como inhibidor de la
actividad enzimática se halla la absorbancia en cada tubo con misma cantidad de inhibidor,
pero distinta concentración de sustrato, posterior a esto, a partir de la ecuación de la recta
obtenida de la curva patrón, se determina la concentración contenida en cada tubo.
Por otro lado para hallar el valor de la velocidad para cada tubo se divide la concentración del
sustrato sobre el tiempo (siendo 10 min para cada uno) y se grafican los inversos de la
concentración vs velocidad.

Figura 29. Datos de velocidad a distintas concentraciones en presencia de un inhibidor.

Tubo Vo [S] (mM) 1/[S] 1/[V]

1 -1,58E-06 5 0,2 -6,32E+05

 2 3,27E-05 10 0,1 3,06E+04

3 9,51E-05 20 0,05 1,05E+04

4 7,58E-05 40 0,025 1,32E+04

5 8,19E-05 60 0,016666667 1,22E+04

6 5,56E-05 80 0,0125 1,80E+04

7 5,91E-05 100 0,01 1,69E+04

8 6,17E-05 100 0,01 1,62E+04

Los datos de la tabla anterior, se hallan con el fin de generar una gráfica linealizada, que nos
permita analizarla desde un punto de vista un poco más teórico y tenemos más herramientas
para obtener el análisis correspondiente,

Figura 30. Velocidad de reacción inicial vs Concentración de sustrato con inhibidor.

Esta gráfica, se adapta a un modelo que estudia este comportamiento en cuanto a las
velocidades y concentraciones de sustrato, este se llama Michaelis-Menten. (Daniel L, R.
Donald. 2000). Donde por medio de una ecuación, se linealiza la figura anterior y queda de la
siguiente manera,

Figura 31. Gráfica linealizada de concentración de sustrato vs velocidad de reacción.

De acuerdo a la gráfica anterior, la presencia de un inhibidor en una reacción enzimática, se ve
afectada en la unión de la enzima con el sustrato, ya que este agente inhibidor, como su
nombre lo indica, va a impedir que esta unión se de, ya sea cambiando el sitio activo de la
enzima o simplemente ocupando el espacio que le corresponde al sustrato.

Conclusiones.

● Se logran identificar algunos de los factores que interfieren con la velocidad y actividad
enzimática que existen en la vida, en cuanto a la concentración de la enzima, la
desnaturalización o el deterioro de la misma.
● Se establecen algunos de los factores óptimos para que se den las distintas reacciones
en las que la enzima está involucrada, a nivel de pH, temperatura, tiempo de reacción e
incubación, presencia de inhibidores y concentraciones de las especies involucradas.
● De manera más específica, el pH óptimo para este tipo de reacción es de carácter
ácido, al momento en que aumenta el pH y se convierte en un medio alcalino, la
reacción tiende a inhibirse y el producto no es el deseado.
● Por otra parte, la elevación de la temperatura del medio en el que se encuentra, tiene
como consecuencia la desnaturalización de la enzima, esto es muy importante ya que
pierde sus funciones biológicas y no cumplen con los parámetros para que el sustrato
se una al sitio activo de esta.
● Por último, el tiempo de reacción para que esta sea óptima, no puede ser muy elevado,
ya que la sobresaturación de productos, hace que ellos mismos se conviertan en
inhibidores, ya sea modificando el sitio activo de la enzima o impidiendo que los
sustratos se unan a la misma.

BIBLIOGRAFÍA.
- Garrido, A. Teijón, J. Blanco, D. Villaverde, C. Mendoza, C. Ramirez, J. (2006).
“Fundamentos de bioquimica estructural”. Editorial Tébar, S. L. Madrid, España.

- Daniel, L. R, Donald. (2000). “Handbook of biochemical Kinetics”. Academics Press.

Gainessville, Florida, EE UU.

- Roosdiana A. Prasetyawan, S. Mahdi, C. Sutrisno. (2013). “Production and

characterization of ​Bacillus firmus Pectinase”. ​Laboratory of Biochemistry, Faculty of
mathematics and Natural Science. University of Brawijaya. Malang, East Java,
Indonesia.

- F. B. Armstrong. (1982). “Bioquímica”. Ed. REVERTÉ S.A. Barcelona, España.

- Capbell, Neil A. (2001) “Biología: Conceptos y Relaciones” 3a ed. Pearson Education,

Mexico.