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FACULTAD

FACULTADDE DECIÉNCIAS
CIÉNCIASMÉDICAS
MÉDICAS
Escuela Profesional de Estomatología
Escuela Profesional de Estomatología

MICROBIOLOGÍA MANUAL DE PRÁCTICAS

AUTOR:
Dr. Mblgo. MIGUEL ANGEL RUIZ BARRUETO PIURA – PERÚ, 2019
FACULTAD DE CIÉNCIAS MÉDICAS
Escuela Profesional de Estomatología

DATOS DEL ESTUDIANTE

 APELLIDOS Y NOMBRES:…………………………………………………………………………..

 DIRECCIÓN:…………………………………………………………………………………………

 CORREO:……………………………………………………CELULAR:……………………………

 SEMESTRE ACADÉMICO:……………………….CICLO:……………..SECCIÓN:…….………

 No DE MESA:………………..GRUPO:……………......TURNO:…………………………………

 APODERADO:…………………………………………………..CELULAR:………………………

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TERCERA EDICIÓN 2019

AUTORIDADES NACIONALES DE LA UNIVERSIDAD CÉSAR VALLEJO

 Fundador: CÉSAR ACUÑA PERALTA


 Presidenta Ejecutiva: BEATRIZ MERINO LUCERO
 Rector: HUMBERTO LLEMPÉN CORONEL
 Gerente General: KARINA CÁRDENAS RUIZ
 Vicerrector Académico: HERACLIO CAMPANA AÑASCO
 Vicerrector de Investigación: SANTIAGO M. BENITES CASTILLO
 Vicerrectora de Bienestar Universitario: SOPHÍA V. CALDERÓN ROJAS
 Secretario General: VÍCTOR RAFAEL SANTISTEBAN CHÁVEZ
 Defensor Universitario (e): NILTON YAIR GRAUS GUEVARA

AUTORIDADES UNIVERSIDAD CÉSAR VALLEJO – FILIAL PIURA

 Director General: ALCIBÍADES SIME MÁRQUEZ


 Director Académico: FREDDY HELI BARDALES URIARTE
 Director de Bienestar Universitario: ESMÉRITA CHERRES MADRID

AUTORIDADES ESCUELA DE ESTOMATOLOGÍA UCV – FILIAL PIURA

 Decana de La Facultad de Ciencias Médicas


DRA. AMALIA GUADALUPE VEGA FERNÁNDEZ
 Directora de Escuela de Estomatología
DRA. CD. ERIKA RAQUEL ENOKI MIÑANO
 Secretario Académico
MG. CD. WILFREDO TERRONES CAMPOS
 Director de Clínica Estomatológica
CD. GUILLERMO ENRÍQUEZ PÉREZ

AUTOR DEL PRESENTE MANUAL

 MIGUEL ANGEL RUIZ BARRUETO


Biólogo Microbiólogo
Maestro en Ciencias con mención en Microbiología Clínica
Doctor en Ciencias Biomédicas

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REGLAMENTO DE PRÁCTICAS

1. El alumno deberá portar su MANUAL DE PRÁCTICAS desde el primer día


de clases. En caso contrario no podrá ingresar al laboratorio.
2. Deberá leer previamente la práctica correspondiente antes de
ingresar al laboratorio.
3. El docente haciendo uso de un instrumento de evaluación evaluará a
los estudiantes en todo lo concerniente a la práctica que corresponde,
la evaluación se realizará de la información proporcionada en el
presente manual de prácticas.
4. Antes de iniciada la práctica el docente cuestionará a los estudiantes
de forma verbal sobre el tema que corresponda a fin de corroborar la
lectura realizada por ellos.
5. Al inicio de la práctica el docente explicará la metodología de trabajo
y el protocolo de la práctica en la pizarra o mediante una presentación
PowerPoint.
6. Posterior a la explicación los estudiantes que conformen cada grupo
colocarán sobre la mesa de trabajo los materiales solicitados para el
desarrollo de la práctica y que consta detalladamente en cada
práctica. No se permitirá el intercambio de materiales dentro del
laboratorio. La falta de algún material solicitado influirá en la nota final
de la sesión práctica.
7. El estudiante deberá anotar sus resultados, en su manual, en los
espacios designados para ello.
8. Al finalizar la práctica se analizarán y discutirán los resultados obtenidos.
El estudiante podrá realizar preguntas relacionadas al tema en
cualquier momento del desarrollo de la práctica.
9. Cada alumno es responsable de la información que coloca en su
Manual de Prácticas. Cada práctica desarrollada será revisada en la
semana siguiente a su realización. En el caso que se encontrara
duplicidad de prácticas, copias de respuestas de cuestionario,
fotocopia de resultados o cualquier otro indicador de plagio este será
calificado con nota cero, tanto para el que prestó el Manual como
para el que plagió. Intentamos formar estudiantes con valores y
respetuosos del esfuerzo de cada uno.

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PRESENTACIÓN

El manual de Microbiología para los estudiantes de la Escuela de Estomatología


se ha elaborado teniendo en cuenta las competencias académicas que el futuro
Cirujano Dentista debe adquirir durante el desarrollo del presente curso. La
Microbiología es la ciencia que estudia a los microorganismos, su biología, su
ecología y su relación con el hombre. El conocimiento de la biología y la ecología
microbiana son imprescindibles para poder comprender de qué forma los
microorganismos interaccionan con los seres humanos y qué tipos de relaciones
establecen con ellos.
Microorganismo es cualquier organismo vivo que no es visible a simple vista. Esta
definición operativa no incluye los hongos, tanto inferiores como superiores, ni las
algas, aunque ambos grupos son considerados microorganismos porque su
organización es esencialmente unicelular. Por otra parte, organismos pluricelulares
pueden ser de tamaño tan pequeño que entren dentro de la definición anterior
sin dejar por ello de ser estructuralmente tan complejos como cualquier animal
superior. En el curso nos centraremos en bacterias, virus, hongos y parásitos de
interés clínico estomatológico para el ser humano.
Como estudiantes que inician su experiencia en el manejo de microorganismos,
se les darán las indicaciones básicas de conducta que deben cumplir en un
laboratorio de microbiología a fin de que puedan realizar un trabajo seguro y
eficiente. Este manual inicia con la práctica de Bioseguridad, con los
antecedentes y reglas de seguridad más importantes que deberán conocer y
practicar siempre. Las prácticas propuestas tratan sobre el manejo de bacterias,
hongos y parásitos, porque son los grupos microbianos más abundantes y porque
muchos representantes de ellos tienen importancia clínica debido a su capacidad
de causar enfermedad en el hombre.
Cada práctica comienza con el título, la Introducción y luego las competencias
para facilitar la comprensión de los fundamentos de las prácticas. Seguidamente
se indican los materiales que se requieren y los procedimientos a realizar en forma
de instrucciones numeradas. Los invitamos a consultar este manual y sobre todo a
realizar los experimentos propuestos con interés y entusiasmo para adquirir los
conocimientos y habilidades de trabajo que se requiere en un futuro Cirujano
Dentista.
Es nuestro deseo que el presente manual pueda ayudar al estudiante en la
comprensión teórica y ejecución práctica de la asignatura y en la apertura de
investigaciones básicas en el campo de la Microbiología oral. Se espera que el
esfuerzo desplegado, cumpla su cometido en bien de una óptima formación
profesional y una mejor comprensión del papel importante que cumple el estudio
de la MICROBIOLOGÍA en las Ciencias Médicas. Así mismo se esperan las valiosas
sugerencias de colegas y estudiantes que permitan el perfeccionamiento de este
manual en ediciones futuras.

EL AUTOR

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NORMAS, RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES PARA


EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

El trabajo en el laboratorio requiere la observación de una serie de normas de bioseguridad,


a fin de evitar posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se está haciendo
o por una posible negligencia. Quien trabaja en el laboratorio está expuesto a muchos
riesgos, pues hay productos químicos que son tóxicos, inflamables, explosivos, corrosivos,
carcinogénicos, agentes microbianos patógenos y, a veces, existe el peligro derivado del
uso de altos voltajes, de luz ultravioleta y otras radiaciones.

I. NORMAS PERSONALES

1. Seguir las instrucciones y recomendaciones dadas por el docente para cada sesión
práctica. No manipule muestras, materiales, instrumentos o equipos por su cuenta.
2. Procure ingresar al laboratorio a la hora señalada, con el guardapolvo y las barreras
de bioseguridad colocados y con el material de trabajo previamente solicitado.
3. En el laboratorio es obligatoria la utilización de guardapolvo (mandil) para evitar que
posibles sustancias químicas lleguen a la piel o deterioren las prendes de vestir. El
guardapolvo debe ser de color blanco, bordado con nombre y apellido del estudiante
y el logo de la escuela de Estomatología UCV. Es de uso exclusivo dentro del
laboratorio, hay que sacárselo si se va abandonar el mismo.
4. Si se tiene el cabello largo, es conveniente llevarlo recogido.
5. Durante su permanencia en el laboratorio aproveche y use adecuadamente el
tiempo, materiales de trabajo, agua, corriente eléctrica, gas, mobiliario y espacio.
6. No arroje desechos a los lavaderos ni al piso. Procure colocarlos en los tachos
correspondientes para que sean descartados una vez finalizada la práctica. En el
tacho con bolsa ROJA, se desechan los residuos de materiales biológico (restos
vegetales y animales, material contaminado con sangre); en el tacho con bolsa
NEGRA se arrojan los desperdicios comunes no contaminados (papeles, etc.).
7. Está estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio.
8. Sobre la mesa de trabajo del laboratorio debe de tener solamente el material
solicitado y el Manual de Prácticas de Microbiología. Coloque las carteras, mochilas,
libros y otros en los casilleros o en los lugares destinados para ellos.
9. Durante el desarrollo de la práctica observe y grafique con detalle los diversos
experimentos, protocolos u observaciones microscópicas; intercambie conceptos,
ideas y puntos de vista con sus compañeros y profesor.
10. Al término de la práctica el estudiante debe limpiar su mesa de trabajo, lavar el
material de vidrio utilizado, lavarse cuidadosamente las manos, despojarse del
guardapolvo y retirarse ordenadamente.

II. NORMAS DE UTILIZACIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS

1. Antes de utilizar un compuesto químico, asegurarse de que es el que se necesita.


2. No devolver a los frascos de origen los sobrantes de los productos químicos o medios
de cultivo. Si existiese sobrante, desecharlo.

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3. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos, utilizar peras de
succión o propipetas.
4. Los ácidos requieren un cuidado especial, cuando haya que diluirlos, nunca echar
agua sobre ellos; por el contrario, se debe agregar el ácido sobre agua.
5. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) no deben estar cerca de fuentes
de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hará al baño maría, nunca
directamente a la llama.
6. Si se vierte sobre la piel cualquier ácido o producto corrosivo, lavarse inmediatamente
con abundante agua y avisar al encargado del laboratorio.
7. Si se preparan soluciones químicas, éstas deben colocarse en un frasco limpio y seco
y rotulado convenientemente.

III. NORMAS DE UTILIZACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO

1. Tener cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio.
2. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frio. Para evitar quemaduras,
dejarlo enfriar antes de tocarlo.
3. Las pipetas usadas deben colocarse en recipientes que contienen una solución
desinfectante (mezcla sulfocrómica o bicloruro de mercurio). De la misma manera se
procede para tubos de ensayo, láminas cubreobjetos y laminillas.
4. Si se tiene que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, debe
considerarse lo siguiente:
a) La boca del tubo de ensayo no debe apuntar a ningún compañero de trabajo ni
a sí mismo. Puede hervir el líquido y salir disparado, ocasionando un accidente.
b) El tubo de ensayo debe calentarse por la parte lateral, nunca por el fondo,
agitando suavemente.
5. Todos los que trabajan en el laboratorio, deben saber dónde está el botiquín, las
botellas de irrigación de los ojos, y los extintores de incendio.

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I. DATOS GENERALES

1.1. Unidad Académica: ESTOMATOLOGÍA


1.2. Semestre Académico: 2019 - II
1.3. Ciclo de estudios: TERCERO
1.4. Experiencia curricular: MICROBIOLOGÍA
1.5. Docente: Dr. Mblgo. MIGUEL ANGEL RUIZ BARRUETO

II. SUMILLA
Esta experiencia curricular de microbiología pertenece al área de
estudios específicos es de carácter teórico-práctico y obligatorio. Se
propone que el estudiante obtenga una base sólida sobre el inicio de la
vida humana desde la fecundación al nacimiento, describiendo
cronológicamente los cambios que ocurren durante el proceso de la
organogénesis, así como las malformaciones congénitas del desarrollo.
Finalmente, el alumno podrá comprender y aplicar los conocimientos
básicos de la microbiología y los aportes que esta ciencia da a la
Estomatología. Abarca los siguientes conocimientos: Proceso de
formación de la cara, embriología e histología dentaria y proceso de
formación de los maxilares, microbiología de las infecciones orales,
conceptos básicos de la microbiología, bacteriología y virología.

III. COMPETENCIA

Identifica a los microorganismos patógenos para el hombre con el fin de


comprender la fisiopatología de las infecciones orales y su tratamiento,
siguiendo estándares establecidos científicos y éticos.

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PRÁCTICA No 01

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26
BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y
TEMÁTICA
MICROSCOPÍA ÓPTICA: MANEJO Y CUIDADOS

SESIÓN 01 FECHA 04/09/2019 DURACIÓN 100 minutos

Identifica a los microorganismos de forma inequívoca


CAPACIDAD relacionándolos con su morfología y metabolismo trabajando
en equipo y respetando las opiniones de sus compañeros.

I. INTRODUCCIÓN
En el campo de la salud existen diversos lugares donde el profesional se
desempeña, como hospitales, clínicas, postas, centros asistenciales, etc. Sin
embargo, el laboratorio también constituye un lugar de trabajo, tanto en el
campo clínico, educativo y de investigación, siendo por ello necesario que se
conozcan las pautas mínimas necesarias para el normal desempeño dentro
de él. Los laboratorios microbiológicos constituyen ambientes de trabajo
especiales, generalmente únicos, que pueden presentar riesgos de
enfermedades infecciosas identificables para las personas que se encuentren
en o cerca de ellos. Durante el transcurso de la historia de la microbiología,
muchas infecciones se han contraído en el laboratorio.
Desde la década de 1940 hasta la actualidad existes reportes de casos de
infecciones adquiridas por personal de los laboratorios en todo el mundo.
Dichos reportes concluyeron que la “manipulación de cultivos o especímenes
o la inhalación de polvo con contenido de microorganismos constituye un
peligro inminente para quienes trabajan en los laboratorios”. Algunos casos se
atribuyeron al descuido o a malas técnicas en la manipulación de materiales
infecciosos. Según la Organización Mundial de la Salud (2005), la Bioseguridad
es un conjunto de normas y medidas para proteger la salud del personal,
frente a riesgos biológicos, químicos y físicos a los que está expuesto en el
desempeño de sus funciones, también a los pacientes y al medio ambiente.
Entonces definimos como bioseguridad al conjunto de combinaciones
específicas (normas) de trabajo, equipo de seguridad y facilidades diseñadas
para minimizar la exposición de los trabajadores y el ambiente a los agentes
infecciosos; es así que las normas de bioseguridad están destinadas a reducir
el riesgo de transmisión de microorganismos de fuentes reconocidas o no
reconocidas de infección en Servicios de Salud vinculadas a accidentes por

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exposición a sangre y fluidos corporales, así como también agentes físicos y


químicos. Los objetivos de estas normas son:
1. Proteger la salud del personal que pueda estar expuesto a riesgos
relacionados con la exposición a agentes biológicos, químicos y físicos.
2. Establecer la conducta a seguir frente a un accidente con exposición a
dichos elementos.
3. Participar de las normas de Bioseguridad a todo el personal que directa o
indirectamente toma contacto con el laboratorio.

DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

1. Agente biológico: Todo organismo viviente capaz de causar infección,


enfermedad o muerte en el ser humano con inclusión de los genéticamente
modificados y endoparásitos humanos susceptibles de originar cualquier
tipo de infección, alergia o toxicidad.
2. Antisépticos: Se definen como agentes germicidas para ser usados sobre la
piel y los tejidos vivos. Aunque algunos germicidas pueden ser utilizados
como desinfectantes y antisépticos (alcohol 70-90%), su efectividad no es
necesariamente la misma en cada caso, un buen antiséptico puede no ser
eficaz como desinfectante y viceversa.
3. Área contaminada: Área donde se manipulan microorganismos de riesgo.
Ejemplo: Laboratorios donde se manipulan virus, producción de antígenos,
etc.
4. Área de tránsito limitado: Área donde el tránsito está permitido sólo a
personas previamente autorizadas, debido a la presencia de agentes que
corresponden a los grupos I y II de la clasificación de agentes de riesgo o al
uso de sustancias químicas de bajo riesgo. El acceso del personal
administrativo está terminantemente prohibido.
5. Área de tránsito restringido: Área en la que el tránsito está permitido sólo al
personal adecuadamente protegido y autorizado, debido a la presencia
de agentes de los grupos III y IV. También incluye los laboratorios de
producción de biológicos y control de calidad d alimentos, medicamentos
y afines. El acceso del personal administrativo está terminantemente
prohibido.
6. Área limpia: Área del laboratorio donde no se manipulan microorganismos
de riesgo. Ejemplo: donde se mantienen los medios de cultivos celulares, se
preparan los medios de cultivo y a la vez se realiza la formulación de la
vacuna.
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7. Área libre: Área de tránsito libre para todo el personal. Ejemplo: pasadizos,
comedor y otras áreas de uso común.
8. Accidente de trabajo: Ocurrencia durante las horas de trabajo que causa
la inhabilitación temporal o permanente del trabajador.
9. Acción correctiva: Procedimiento realizado para eliminar la causa de una
disconformidad, defecto u otra situación no deseable y existente con el
propósito de evitar que vuelva a suceder.
10. Acción preventiva: Acción tomada para eliminar las causas de una
disconformidad, defecto u otra situación potencial no deseada a fin de
evitar que se produzca.
11. Bioseguridad: Conjunto de medidas preventivas reconocidas
internacionalmente orientadas a proteger la salud y la seguridad del
personal y su entorno. Complementariamente se incluye normas contra
riesgos producidos por agentes físicos, químicos y mecánicos.
Modernamente se incorporan también las acciones o medidas de
seguridad requeridas para minimizar los riesgos derivados del manejo de un
organismo modificado genéticamente (OMG), sus derivados o productos
que los contengan, y uso de la tecnología del ADN recombinante
(ingeniería genética) y otras técnicas moleculares más recientes.
12. Cabina de flujo laminar: Son recintos que emplean un ventilador para forzar
el paso del aire a través de un filtro HEPA (acrónimo del término en inglés
High Efficiency Particulate Air) es decir purificador de alta eficiencia de
partículas suspendidas en el aire, barriendo la superficie de trabajo. El flujo
de aire puede ser vertical u horizontal. Estas cabinas ofrecen protección
únicamente al material que se maneja en su interior, pero nunca al
operador.
13. Cabina de seguridad biológica: Son equipos que proporcionan una barrera
de contención para trabajar de forma segura con agentes infecciosos.
Permiten proteger según su diseño y clasificación al trabajador, medio
ambiente o al producto. Es una combinación de elementos
electromecánicos/electrónicos y procesos físicos que impulsan el aire a
través de unos filtros especiales de gran superficie estratégicamente
situados, que tienen una eficiencia mínima de retención de partículas del
99,99%, cuando el tamaño de éstas es de 0,3 µm.
14. Daño: Es la consecuencia producida por un peligro sobre la calidad de vida
individual o colectiva de las personas.
15. Desinfección: Proceso que mediante el empleo de agentes (sobre todo
químicos), es capaz de eliminar los microorganismos patógenos de un

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material. Generalmente se presentan efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por


lo que se emplea sólo sobre materiales inertes.
16. Equipo de Protección Personal (EPP): El equipo de protección personal (PPE-
Personal Protection Equipment) está diseñado para proteger a los
empleados en el lugar de trabajo, de lesiones o enfermedades serias que
puedan resultar del contacto con peligros químicos, radiológicos, físicos,
eléctricos, mecánicos u otros. Además de caretas, gafas de seguridad,
cascos y zapatos de seguridad, el PPE incluye una variedad de dispositivos
y ropa tales como gafas protectoras, overoles, guantes, chalecos, tapones
para oídos y equipo respiratorio.
17. Esterilización: Proceso que mediante el empleo de agentes físicos o
químicos produce la inactivación total de todas las formas de vida
microbiana en forma irreversible (estado esporulado y vegetativo).
18. Ensayo: Operación técnica que consiste en la determinación de una o
varias características o el rendimiento de un producto, material, equipo,
organismo, fenómeno físico, proceso o servicio dados de acuerdo con un
procedimiento especificado.
19. Incidente de trabajo: Situación de riesgo que podría generar la ocurrencia
de un accidente de trabajo.
20. Inmunización: Proceso destinado a brindar protección mediante la
aplicación de inmunobiológicos (gammaglobulinas, toxoides, vacunas) a
personas en riesgo de contraer enfermedades.
21. Laboratorio: Organismo que calibra o ensaya.
22. Laboratorio de ensayo: Es el lugar donde se realizan actividades para la
determinación de una o varias características o el rendimiento de un
producto, material, equipo, organismo, fenómeno físico, proceso o servicio
dados de acuerdo con un procedimiento especificado.
23. Laboratorio de biomedicina: Es en el que se realizan actividades de
investigación biomédica relacionadas con enfermedades transmisibles y no
transmisibles.
24. Laboratorio médico/laboratorio clínico: Laboratorio para los análisis
biológicos, microbiológicos, inmunológicos, químicos, inmunohemato-
lógicos, biofísicos, citológicos, patológicos u otros análisis de materiales
derivados del cuerpo humano con el propósito de brindar información para
el diagnóstico, prevención y tratamiento de las enfermedades o
contribuyendo en la salud de los seres humanos.

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25. Limpieza: Es el proceso físico por el cual se elimina de los objetos en uso, las
materias orgánicas y otros elementos sucios, mediante el lavado con agua
con o sin detergente. El propósito de la limpieza no es destruir o matar los
microorganismos que contaminan los objetos, sino eliminarlos por arrastre.
26. Microorganismo: Toda entidad microbiológica, celular o no, capaz de
reproducirse o de transferir material genético.
27. Muestra para diagnóstico: Es el material de origen humano o animal
consistente en excretas, secreciones, sangre y sus componentes, tejidos y
líquidos tisulares enviados para diagnóstico. Se excluyen los animales vivos
infectados.
28. Peligro: Todo aquello que puede producir un daño o un deterioro de la
calidad de vida individual o colectiva de las personas.
29. Peligro biológico: Todo agente biológico y materiales que son
potencialmente peligrosos para los seres humanos, animales o plantas.
30. Producto biológico: Es una vacuna producida con microorganismos vivos o
atenuados, componentes celulares, reactivos de diagnóstico o productos
terapéuticos de naturaleza biológica destinados para uso humano o animal
y fabricados según los requisitos estándares. Riesgo: Probabilidad de que
ante un determinado peligro se produzca un cierto daño, pudiendo por ello
cuantificarse.
31. Sustancia infecciosa: Es aquella que contiene microorganismos viables
(bacterias, virus, rickettsias, parásitos, hongos o recombinantes híbridos
mutantes) que pueden causar enfermedades tanto en el hombre como en
los animales. No incluye toxina que no contiene ninguna sustancia
infecciosa.

RIESGOS EN EL LABORATORIO

Como la Bioseguridad se define como el conjunto de acciones que se ejecutan


para proteger la vida y su entorno. El Laboratorio Clínico, es un espacio en
donde deben considerarse potenciales riesgos inherentes a la naturaleza de sus
actividades, dentro de los que se encuentran:
 RIESGOS BIOLÓGICOS: Exposición a: Virus; Bacterias; Hongos, Parásitos y
organismos genéticamente modificados.
 RIESGO QUÍMICO: Exposición a sustancias químicas potencialmente tóxicas
por diversas vías.

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 RIESGOS FÍSICOS: Ruidos intensos; Vibraciones; Exposición a radiaciones


ionizantes y no ionizantes; Ausencia de protección personal (mascarilla, gorra
de cirugía, guantes, gafas, ropa esterilizada, zapatos especiales, entre otros);
Ausencia de protección colectiva (limpieza del lugar de trabajo, de los
instrumentos, falta de ventilación, temperatura ambiental inadecuada.
 RIESGO DE ACCIDENTES DE TRABAJO: Accidentes con punzocortantes,
quemaduras.
 RIESGO DE ENFERMEDADES PROFESIONALES: Dolores asociados a posturas
inadecuadas; estrés, fatiga.
 RIESGOS ERGONÓMICOS: Manejo de materiales pesados; transportes de
aparatos.
 RIESGO DE SOBRECARGA PSÍQUICA: Malas relaciones interpersonales en el
lugar de trabajo; malas remuneraciones; alejamiento geográfico.

CLASIFICACIÓN DE RIESGO POR TIPO DE PATÓGENO


Las designaciones del nivel de bioseguridad se basan en una combinación de
las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo,
prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes
patógenos de los distintos grupos de riesgo.

CUADRO 1. Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo

Grupo de riesgo 1: (riesgo individual y poblacional escaso o nulo). Microorganismos


que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los
animales.

Grupo de riesgo 2: (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo). Agentes


patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que
tienen pocas probabilidades de ocasionar un riesgo grave para el personal de
laboratorio. La exposición puede provocar una infección, pero existen medidas
preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado.

Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo). Agentes


patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero
que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas
y terapéuticas eficaces.

Grupo de riesgo 4 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional elevado). Agentes


patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los
animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o
indirectamente. No existen medidas preventivas o terapéuticas eficaces.
Fuente: Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Organización Mundial de la Salud. 3ra. ed. 2005.

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TIPIFICACIÓN DE PATÓGENOS POR GRUPO DE RIESGO

GRUPO DE RIESGO 1: Agrupa microorganismos que tienen escaso o nulo riesgo de


provocar enfermedades.

Bacterias Virus Hongos Parásitos

Bacilos subtilis Virus de plantas. Saccharomyces sp. Entamoeba coli

GRUPO DE RIESGO 2: Agrupa a microorganismos que pueden provocar


enfermedades humanas de riesgo moderado. Si provoca una infección al personal
de laboratorio, ésta tiene tratamiento y cura.

Bacterias Virus Hongos Parásitos


Bacteroides fragilis Astroviridae Actinomyces spp.´ Acanthamoeba
Bartonella Coranaviridae Blastomyces castellani
baciliformes Parvoridae dermatitidis Ancylostoma
Bordetella pertussis Papviridae Candida albicans duodenale
Campylobacter Parayxoviridae Mucor sp. Ascaris lumbricoides
jejuni Picornaviridae Rhyzopus sp. Balantidium coli
Clostridium sp. Rubivirus Sporothrix schenkii Leishmania
Corynebacterium Cryptococcus peruviana
spp. neoformans Giardia lamblia
Enterococcus sp. Fasciola hepática
GRUPO DE RIESGO 3: Agrupa microorganismos que pueden provocar
enfermedades humanas graves. Tienen tratamiento, cura limitada.

Bacterias Virus Hongos Parásitos


Bacillus anthracis Adenoviridae Ajellomyces Echinococcus
Brucella abortus Astroviridae dermatitidis granulosus
Mycobacyterium Flebovirus Histoplasma Leishmania
leprae Calciviridae capsulatum brasiliensis
Salmonella tiphi Flaviviridae Paracoccidioides Plasmodium
Yersinia pestis brasiliensis falciparum
Taenia solium
Trypanosoma cruzi
GRUPO DE RIESGO 4: Agrupa microorganismos que provocan enfermedades graves
en el ser humano. No hay tratamiento para su cura.

Solo Virus: Lassa, Guanarito, Junín, Machupo, Sabia, de la fiebre hemorragica de


Crimea – Congo, Ébola, de Marburg, Variola (major&minor) virus, Whitepox virus y
Morbilli virus equino

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MEDIDAS DE PROTECCIÓN
Las medidas de protección en los laboratorios buscan disminuir la probabilidad
de contacto con agentes potencialmente patógenos y/o sustancias que
puedan afectar piel y/o mucosas. Las barreras de protección pueden ser
individuales y físicas.
A. MEDIDAS DE PROTECCIÓN INDIVIDUAL
El personal que trabaje en el laboratorio, dependiendo del lugar de trabajo
deberá usar como medidas de protección individual, respetando el
principio de universal de que “cualquier muestra en el laboratorio deberá
ser considerada como potencialmente infecciosa”, todos los estudiantes sin
ninguna distinción deberán portar al laboratorio los siguientes materiales de
protección:
a. Guardapolvo con manga larga, el cual deberá usarse siempre
cerrado, para que ejerza su efecto de barrera mecánica. Por
ningún motivo se deberá usar el mandil para acudir a áreas
diferentes al laboratorio, como áreas de alimentación, áreas
administrativas, más aún fuera del área física de laboratorio
(incluso a las propias casas) pues por concepto se trata de ropa
“SUCIA”, potencialmente infecciosa.
b. Gafas de seguridad, para disminuir el contacto con aerosoles,
debe ser de uso obligatorio en las áreas de recepción de
muestras, separación de muestras y áreas de análisis.
c. Guantes: De Látex, para la manipulación de muestras y
contenedores independientemente del área de trabajo. Debe
evitarse el uso de guantes en áreas de circulación de personal
administrativo o de público en general. De caucho, para las
áreas de Servicios Generales en la ejecución de las tareas de
limpieza.
d. Zapatos cerrados: para evitar el riesgo de accidentes con
muestras. No se usarán sandalias. Esta instrucción aplica a todas
las personas que ingresan al laboratorio.
e. Otras: Como gorras, mascarillas, guantes de caucho.

B. MEDIDAS FÍSICAS DE CONTENCIÓN


Son todas aquellas medidas tendientes a separar físicamente a la(s)
persona(s) del potencial agente patógeno o agente de riesgo. Las barreras
físicas de separación deben aplicarse para áreas particulares como las de
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microbiología, cultivos celulares y biología molecular. Se consideran como


medios físicos de contención también el uso de cabinas de seguridad y
cámaras de flujo laminar. La infraestructura de los laboratorios, debe
favorecer la disminución de potenciales riesgos, debiendo considerarse al
menos:
 Cada unidad debe tener un lavabo para el lavado de manos e incluir
un lavador de ojos.
 Las superficies de trabajo tienen que ser impermeables y resistentes a los
ácidos, álcalis, disolventes orgánicos y al calor moderado. Además hay
que calcular una longitud de 2 metros lineales por persona.
 Deben existir medios de protección contra incendios, para evitar su
inicio y propagación.
 Debe disponerse de una instalación eléctrica segura y de suficiente
capacidad.

MANEJO Y DISPOSICIÓN DE DESECHOS EN EL LABORATORIO

A. CLASIFICACIÓNDE LOS DESECHOS


Por lo general, los laboratorios deben reconocer la existencia de 3 tipos de
desechos:
1. Desechos generales o comunes: No representan riesgo adicional para la
salud humana y el ambiente; no requieren manejo especial. Mismo
grado de contaminación que los desechos domiciliarios. Ejemplo: Papel,
cartón, plástico, restos alimenticios.
2. Desechos infecciosos: Contienen gérmenes patógenos, se encuentran:
a. Desechos de laboratorio: cultivo de agentes infecciosos, placas Petri,
láminas de frotis, etc.
b. Desechos anátomo–patológicos: órganos, tejidos o partes corporales
extraídas mediante cirugía autopsia, biopsia u otro procedimiento.
c. Desechos de sangre: sangre de pacientes, suero, plasma u otros
componentes, insumos usados para toma de muestras de laboratorio.
d. Desechos cortopunzantes: agujas, pipetas de equipos, tubos primarios,
tubos secundarios, copas, bajalenguas, isopos, palillos, entre otros.
3. Desechos especiales: Desechos provenientes de reactivos o materiales
no infecciosos utilizados en el laboratorio (Ejemplo: reactivos vencidos).

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B. SEPARACIÓN DE PUNTO PRIMARIO


Los desechos deben separarse directamente en las áreas de trabajo,
asegurando la clasificación en desechos infecciosos, especiales y generales
o comunes. Cada una de las áreas de laboratorio deberá disponer al
menos de los siguientes tipos de recipientes perfectamente rotulados e
identificados:
a. Recipientes para basura común (tachos con bolsas negras).
b. Recipientes para basura infecciosa, que incluyen:
 Tachos con bolsas rojas para almacenar desechos potencialmente
infecciosos NO CORTOPUNZANTES.
 Recipientes de plástico resistente y de boca angosta para DESECHOS
CORTOPUNZANTES de plástico resistente de boca angosta; se llenarán
hasta no más de las ¾ partes de su capacidad; no deben contener por
ningún concepto ningún tipo de líquidos para evitar la generación de
aerosoles.
 Los desechos especiales: (Ejemplo: frascos de reactivos, toners de
impresoras), deben almacenarse en recipientes de cartón rotulados
DESECHOS ESPECIALES.

MICROSCOPÍA ÓPTICA: MANEJO Y CUIDADOS


El microscopio es un instrumento óptico que nos permite ver de cerca y
aumentados objetos pequeños o detalles estructurales imperceptibles a simple
vista. Es de mucha utilidad en el campo médico, con aplicaciones en el campo
del diagnóstico y en la valoración clínica de trastornos o enfermedades en el
hombre. Por ser los fotones (partículas elementales de la energía de todo el
espectro luminoso desde el infrarrojo al ultravioleta) los que se utilizan para
formar imágenes en los microscopios comunes, se le ha propuesto denominarlo
microscopio fotónico, aunque se acepta unánimemente la de microscopio
común u óptico.

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El desarrollo y perfeccionamiento del microscopio en los últimos años, ha


permitido ampliar el campo de las investigaciones biológicas y se ha convertido
en uno de los instrumentos básicos para abrir fronteras en la Biología. El
microscopio es un instrumento que permite observar una imagen amplificada
de un objeto pequeño. La imagen puede ser observada directamente,
fotografiada o proyectada, dependiendo de la naturaleza y del uso que haya
de hacerse de esta imagen.

RESOLUCIÓN DE UN MICROSCOPIO: Se denomina así a la capacidad del


microscopio de distinguir dos puntos vecinos individualmente. Dos puntos
luminosos pueden formar imágenes separadas siempre que exista entre ellos
una distancia mínima llamada “límite de resolución” (r), si la distancia que
separa dos puntos es menor que r, formarán una sola imagen, es decir se
confunden.
MICROSCOPIO ÓPTICO
PARTES DEL MICROSCOPIO: Se pueden agrupar en cuatro sistemas: El sistema de
soporte, el sistema de aumento, el sistema de iluminación, y el sistema de ajuste.
A. EL SISTEMA DE SOPORTE
1. EL PIE: Es la parte que sostiene al microscopio, asegurando perfecta
estabilidad del aparato en posición vertical, inclinada u horizontal.
Presenta diferentes formas siendo la más común la de herradura.
2. LA COLUMNA, BRAZO O BASTIDOR: Es la parte articulada al pie por medio
de una bisagra, sostiene la platina, el tubo óptico, lleva los tornillos
macrométrico y micrométrico. Generalmente tiene la forma de un arco,
es por donde se toma para su traslado de un lugar a otro.
3. LA PLATINA: Es una plancha metálica colocada en posición horizontal,
presenta un orificio en la parte central que permite el paso de luz
proveniente del sistema de iluminación. En algunos modelos la platina
lleva adherida un par de pinzas que sirven para sujetar la lámina porta-
objeto o un carro móvil (charriot) para el desplazamiento del preparado
hacia la derecha o izquierda durante la observación.
4. EL REVOLVER: Es un dispositivo metálico de forma circular, atornillado en la
parte inferior del tubo óptico, gira sobre su eje central; presenta 3 o 4
orificios a los que van atornillados los objetivos. Este dispositivo sirve para
cambiar la posición de los objetivos durante las observaciones.

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B. EL SISTEMA DE AUMENTO
1. EL OCULAR. Denominado así porque va cerca al ojo del observador,
dispuesto en un tubo cilíndrico de metal, con un diafragma intermedio,
ambos lentes presentan las caras planas hacia el ojo del observador y las
caras convexas hacia el objeto. La lente que va cerca al ojo del
observador se denomina ocular propiamente dicho y la lente inferior como
lente de campo; en la parte lateral y superior del tubo cilíndrico lleva una
numeración que indica el número de aumento propio del ocular. El más
común es el de 10X.
2. OBJETIVOS. Llamado así porque va cerca del objeto a observar, constituye
la parte más importante del microscopio de los cuales depende su
alcance. Está constituido por un tubo metálico cilíndrico cónico, que lleva
en su interior un sistema de lentes destinados a dar la imagen real e
invertida del objeto.
a. Objetivos Secos. Son aquellos en los que, entre el lente frontal y el
preparado a observar, no existe sustancia alguna, excepto el aire. Se
utiliza generalmente para observaciones de preparados en fresco. Los
más comunes son de 4X, 10X y 40X.
b. Objetivos de Inmersión. Son aquellos en los que, entre el lente frontal y el
preparado a observar, se interpone una sustancia líquida, comúnmente
el aceite de cedro, cuyo índice de refracción es de 1.5; se utilizan
generalmente para observaciones de preparados en seco. El más
común es el de 100X. De acuerdo a la procedencia lleva una franja o
una raya negra o blanca para facilitar su identificación.
C. SISTEMA DE ILUMINACION: Se encuentra ubicado en la parte inferior de la
platina y comprende:
1. Fuente de Luz: Antiguamente estaba constituido por un espejo de forma
circular, sujeto por medio de un eje giratorio. Se utilizaba para enviar los
rayos luminosos hacia el preparado. Actualmente la mayoría de
microscopios compuestos presentan una fuente de luz eléctrica
incorporada, constituida por una lámpara de 15 vatios.
2. El diafragma: Es un dispositivo constituido por un sistema de laminillas
metálicas dispuestas concéntricamente, de tal forma que permita cerrar y
abrir, regulando de esta manera la entrada de luz emitida por el espejo.
3. El condensador: Es un dispositivo constituido, por un sistema de dos o más
lentes montadas dentro de un cilindro cónico truncado de metal, está
situado por debajo de la platina. Este sistema óptico sirve para concentrar

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o condensar los rayos luminosos emitidos por el espejo; funciona


accionando un tornillo.
4. Porta filtro: Es un dispositivo que permite colocar filtros de diferentes colores,
los cuales facilitan la observación.
D. EL SISTEMA DE AJUSTE: El sistema comprende:
1. TORNILLO MACROMETRICO. Se utiliza primero para lograr la aproximación
del enfoque. Se encuentra situado en la parte superior o inferior de la
columna, permite desplazamiento del tubo óptico y de la platina.
2. TORNILLO MICROMETRICO. Hace que el objetivo se desplace más
lentamente. Se encuentra situado por debajo del macrométrico. En los
microscopios modernos, el micrométrico y el macrométrico se encuentran
accionados por un solo tornillo.
3. TORNILLO DE AJUSTE DEL CONDENSADOR. Se utiliza para elevar el
condensador y aumentar la iluminación o descenderlo y reducir la
iluminación.
4. TORNILLOS PARA CENTRAR EL CONDENSADOR. Se usan para centrar el
condensador exactamente en relación con el objetivo.
5. ELEVADOR DEL DIAFRAGMA IRIS. Es un pequeño elevador fijado al
condensador. Se mueve para cerrar o abrir el diafragma, reduciendo o
aumentando así el ángulo y la intensidad de la luz.
6. REGULADORES DE LA PLATINA METALICA. Se utilizan para desplazar el
portaobjeto sobre la platina (presente en los microscopios mejorados).

ILUMINACION Y ENFOQUE
La iluminación y enfoque son dos condiciones principales para realizar una
observación microscópica. La iluminación se consigue utilizando fuentes
luminosas adecuadas, que pueden ser: natural o artificial. Los rayos de luz son
reflejados por el espejo o por la lámpara de iluminación hacia el objeto o
preparado. Cuando se examina con grandes aumentos, la luz debe ser intensa,
en cambio cuando se hacen con menores aumentos, la luz debe ser menos
intensa, lo que se consigue desplazando en forma vertical (arriba o abajo) al
condensador, y graduando la abertura del diafragma. Obtenida la iluminación
conveniente, se efectuará el enfoque del preparado, utilizando primero el
macrométrico hasta encontrar la imagen (enfoque aproximado), y por último
accionando el tornillo micrométrico que permite el enfoque perfecto
(visualización de la imagen).

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CONDICIONES NECESARIAS PARA LA ILUMINACIÓN Y ENFOQUE:


Son las siguientes:
1. Objetivo a menor aumento (panorámico).
2. Diafragma abierto.
3. Lámpara encendida.
4. Descienda el objetivo hasta que se encuentre inmediatamente por arriba de
la preparación que se encuentra en el portaobjetos.
5. Utilizando el tornillo macrométrico eleve el objetivo hasta que observe una
imagen clara a través del ocular.
AMPLIFICACION
Cuando se trabaja en el laboratorio con el microscopio, es de gran importancia
conocer los grados de aumento o de magnificación de los objetos observados.
Así tenemos que, el grado de aumento es la amplificación que ha sufrido la
imagen del objeto que está siendo observado. Para obtener la amplificación
se multiplica el número de aumento del ocular por el número de aumento del
objetivo.
Ejemplo: La lente ocular presenta el número 10X y el número de la lente del
objetivo es 4X, el poder de amplificación del microscopio cuando se trabaja
simultáneamente con estas dos lentes será de: Amplificación: 10X x 4X = 40
diámetros.
AUMENTO DE LA OBSERVACIÓN
Pare determinar el aumento al cual se está observando una muestra en
particular, se debe multiplicar el valor del lente ocular por el valor del lente
objetivo.
Aumento = (Valor del lente ocular) (Valor del lente objetivo)

Así, por ejemplo: Lente ocular empleado = 10x, Lente objetivo utilizado = 4x
Aumento = (10x) (4x) = 40x; es decir, 40 veces de su imagen real.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES:
1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en
posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina
no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.
2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto
con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar
de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para
protegerlo del polvo.

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3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy
suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el
microscopio.
5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que
queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de
filtro (menos recomendable). En cualquier caso, se pasará el papel por la
lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y
pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-
acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si
se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su
sujeción.
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico,
micrométrico, platina, revólver y condensador).
7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la
mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No
cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo
mientras se está observando a través del ocular.
8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella
algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un
paño humedecido en xilol.
9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión
práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión
general de los mismos.
FACTORES QUE DAÑAN AL MICROSCOPIO:
a. Lavar las lentes con alcohol.
b. Mojar los objetivos con xilol o alcohol, o bien con alguna otra sustancia.
c. Usar papel ordinario para limpiar las lentes.
d. Poner los dedos sobre las lentes.
e. Limpiar el soporte o la platina con xilol o alcohol Isopropílico.
f. Limpiar el interior de las lentes con tela o papel, en caso de que sea
completamente necesario, utiliza un pincel de cerdas muy pequeñas y/o
utiliza papel seda.
g. Dejar el microscopio sin oculares.
h. Guardar el microscopio con aceite de inmersión en el objetivo.
i. Transportar el microscopio con una sola mano.

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II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO:
 Microscopios ópticos
 Estereomicroscopio
 Reactivos con pictogramas de seguridad (varios).
2.2. DEL ALUMNO: (POR MESA DE TRABAJO)
 01 caja de láminas portaobjeto
 01 caja de laminillas cubreobjeto
 01 caja de mondadientes
 01 botella pequeña de alcohol de 96º
 01 paquete de algodón pequeño
 01 caja de fósforos (o encendedor).
 01 paquete de papel absorbente (papel toalla).

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. EXPERIENCIA 01. MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar
la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente
en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas
metálicas.
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición).
Para realizar el enfoque:
a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación,
empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando
directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de
incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de
ellos o ambos.
b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente
el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se
observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener
un enfoque fino.
4. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada
y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el
enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la
imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir
la operación desde el paso 3.

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5. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y


por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la
preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo
con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se
enfocó con el objetivo de inmersión.
6. Empleo del objetivo de inmersión:
 Bajar totalmente la platina.
 Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de
luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que
echar el aceite.
 Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo entre éste
y el de x40.
 Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de
luz.
 Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del
objetivo de inmersión.
 Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta
que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como
si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
 Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de
trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima,
aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es
muy grande.
 Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación,
ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se
mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay
que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
 Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la
platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el
revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la
platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en
posición de observación.
 Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel
especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está
perfectamente limpio.

IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.

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V. EVALUACIÓN
1. Las Normas de Bioseguridad se definen como un:
a. Conjunto de medidas preventivas que protegen la salud y seguridad del
personal, paciente y comunidad.
b. Conjunto de normas para evitar la propagación de enfermedades e
interrumpir el proceso de transmisión de infecciones.
c. Conjunto de medidas para eliminar, inactivar o matar gérmenes
patógenos por medios eficaces, simples y económicos.
2. Los principios de Bioseguridad son:
a. Protección, Aislamiento y Universalidad.
b. Universalidad, Barreras protectoras y Control de residuos.
c. Barreras protectoras, Universalidad y Control de infecciones.
3. El proceso de tratamiento de los materiales contaminados sigue los
siguientes pasos:
a. Descontaminación, desinfección, cepillado, enjuague y esterilización.
b. Cepillado, descontaminación, secado, enjuague y esterilización.
c. Descontaminación, cepillado, enjuague, secado esterilización y/o
desinfección.
4. Las principales vías de transmisión de los agentes patógenos son:
a. Vía aérea, por contacto y vía digestivo.
b. Contado directo, por gotas y vía aérea.
c. Vía aérea, por gotas y vía digestivas.
5. El agente más apropiado para el lavado de manos en el trabajo es:
a. Jabón antiséptico.
b. Jabón líquido y/o espuma sin antiséptico.
c. Jabón de lavar ropa.
6. El material más apropiado para el secado de manos es:
a. Toalla de tela. b. Toalla de papel. c. Secador de aire caliente.
7. El tiempo de duración del lavado de manos clínico es:
a. Menos de 6 segundos.
b. 7 - 10 segundos.
c. más de 11 segundos
8. Señale Ud. el color de bolsa donde colocaría material biocontaminado:
a. bolsa roja. b. bolsa negra. c. bolsa amarilla.

9. Señale Ud. el componente que define la forma de propagación del agente


causal de las enfermedades infecto-contagiosas
a. Reservorio b. Huésped y agente c. Mecanismo de transmisión
10. Escriba usted los peligros a los que está expuesto en el laboratorio de
Microbiología.
……………………………………………………………………………………………….
……………………………………………………………………………………………….

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VI. BIBLIOGRAFÍA
1. Dirección General de Salud Ambiental (DIGESA). Agencia Internacional de
Cooperación del Japón. Manual de difusión técnica No 01: Gestión de los
residuos Peligrosos en el Perú. Lima; 2006.
2. Chiriboga M., Sáenz K., Sánchez M., Montalvo G. Guía Básica de
Bioseguridad para Laboratorios de Atención Primaria. Quito; 2010.
3. Organización Mundial de la Salud. Manual de Bioseguridad en el
Laboratorio. 3a Ed. Ginebra; 2005.
4. Ministerio de Salud. Subsecretaria de Programas de Prevención y Promoción
Programa de Vigilancia de la Salud y Control de Enfermedades (CDC).
Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud. Bioseguridad
en Laboratorios de Microbiología y Biomedicina. 4a ed. Atlanta, Georgia;
2010.
5. Ministerio de Salud. Dirección General de Salud Ambiental. Plan Nacional
de Gestión de Residuos Sólidos en Establecimientos de Salud y Servicios
Médicos de Apoyo 2010-2012. Lima; 2010.
6. Negroni M. MICROBIOLOGÍA ESTOMATOLÓGICA. Fundamentos y Guía
práctica. 2ª ed. Buenos Aires: Médica Panamericana; 2009.
VII. ANEXO
MICROSCOPIO OLYMPUS Y SUS PARTES

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PRÁCTICA No 02

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA COLORACIONES MICROBIOLÓGICAS: MORFOLOGÍA BACTERIANA

SESIÓN 02 FECHA 11/09/2019 DURACIÓN 100 minutos

Identifica a los microorganismos de forma inequívoca


CAPACIDAD relacionándolos con su morfología y metabolismo trabajando
en equipo y respetando las opiniones de sus compañeros.

I. INTRODUCCIÓN
La coloración y la observación microscópica de las bacterias revelan su
tamaño, morfología y tipos de agrupaciones, características que son de
ayuda para la identificación bacteriana. Las bacterias tienen alrededor de 1
µm de diámetro y 0.2 a 3-4 µm de largo y poseen tres formas básicas; las
cocáceas o cocos (bacterias de forma esférica); los bacilos (bacterias de
forma cilíndrica) y las espiroquetas (bacterias con forma de espiral). Muchas
especies bacterianas, especialmente las cocáceas, permanecen unidas
luego de su división, dando origen a distintas agrupaciones que facilitan su
identificación presuntiva. Las agrupaciones están determinadas por el plano
de división bacteriana y la mayor o menor tendencia de las bacterias a
permanecer unidas.
Todas las células son demasiado pequeñas para ser observadas por el ojo
humano, por lo que es esencial el uso del microscopio para evaluar la forma
y estructura de estas. Además, se debe tener en cuenta dos factores de gran
importancia:
 Para que el objeto sea percibido a través del microscopio, este debe de
poseer cierto grado de contraste con el medio circundante.
 El microscopio debe poseer un poder de resolución suficiente para permitir
la percepción, como objetos separados, de dos puntos adyacentes muy
próximos en la imagen.
Distinguimos dos tipos de microscopía: óptica y electrónica. Dentro de la
primera tenemos, a su vez, microscopía de campo claro, de campo oscuro,
de contraste de fase, ultravioleta y de fluorescencia mencionados en
la práctica anterior. En la microscopía óptica, muchas veces es necesaria
la utilización de colorantes. Un colorante es sustancia química orgánica de
naturaleza variable. Los colorantes aumentan el contraste, estos constan de

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dos partes en su molécula: grupo cromóforo (confiere el color) y grupo


autocromo (confiere su capacidad a comunicar el color a la estructura). Los
colorantes se clasifican en función al grado de ionización o a su origen. En
microbiología, el uso de colorantes es fundamental para la identificación de
la morfología bacteriana. Y como se sabe, inicialmente se clasificaron a las
bacterias según la técnica propuesta por Christian Gram, 1844, en
Gramnegativas (rojas) y Grampositivas (violetas).

II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO (POR MESA DE PRÁCTICA)
 03 Microscopios
 03 mecheros bunsen o de alcohol.
 Cultivo líquido de Staphylococcus aureus de 24 horas (2 mL).
 Cultivo líquido de Bacillus subtilis de 24 horas (2 mL).
 Cultivo líquido de Escherichia coli de 24 horas (2 mL).
 06 Tubos de ensayo estériles de 13 x 100 mm en gradilla.
 03 Asas bacteriológicas en anillo.
 100 mL de agua destilada estéril (ADE).
 Set de Gram: Cristal violeta, Lugol, Alcohol-acetona, Safranina.
 Set BK, tinción de Ziehl Neelsen, Alcohol-ácido, Fucsina fenicada.
 Set de Tinción para espirilos:
- Líquido de Rouge (ácido acético glacial 1mL, formol 2 mL y agua
destilada 100 mL).
- Alcohol de 96o
- Ácido tánico al 5%

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- Solución de fontana (Colocar solución de nitrato de plata al 5 % y


agregar, gota a gota, una solución de amoníaco al 5 % hasta
opalescencia. Seguir agregando amoníaco hasta clarificación de la
solución y finalmente agregar solución de nitrato de plata hasta
ligera opalescencia. La solución debe prepararse en el momento de
usarse).
 Colorante azul de metileno.
 Colorante verde de malaquita.
 Colorante nigrosina o tinta china negra.
2.2. DEL ALUMNO: (INDIVIDUAL Y POR MESA DE PRÁCTICA)
 Manual de prácticas impreso y anillado.
 Libreta de apuntes y lapicero.
 Barreras de bioseguridad personal: Guantes descartables de látex o de
nitrilo, mascarilla descartable y cofia o gorro
 01 Plumón marcador indeleble punta fina.
 01 fosforo o un encendedor.
 01 Paquete de hisopos de toma de muestra microbiológica
 01 Caja de láminas portaobjeto.
 01 Caja de laminillas cubreobjeto.
 01 Caja de mondadientes
 01 botella pequeña de alcohol de 96º
 01 paquete de algodón pequeño
 01 paquete de papel absorbente (papel toalla).
III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
3.1. EXPERIENCIA 01. PREPARADOS PARA MICROSCOPIA ÓPTICA
Los pasos fundamentales previos a una coloración son: extendido,
secado y fijado.
a. Extendido: se coloca una pequeña porción de la muestra en un
portaobjetos y se extiende con el asa en forma circular en el centro de
la lámina. Para muestras provenientes de medios sólidos, debe
colocarse previamente una gota de agua sobre el portaobjetos.
b. Secado: puede dejarse secar el extendido a temperatura ambiente, o
colocar a 30-40 cm sobre la llama del mechero.
c. Fijado: la fijación tiene como finalidades evitar el desprendimiento del
preparado durante la coloración, así como también preservar la forma
original de los microorganismos. El procedimiento más común es pasar
el preparado 3 veces por la llama del mechero. Sin embargo, esta
técnica no es conveniente para ciertas coloraciones para las cuales

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deben utilizarse procedimientos más suaves. Algunos agentes fijadores


utilizados son etanol, metanol, formol, sales de mercurio, tetróxido de
osmio, ácido pícrico, etc.
Debe tenerse en cuenta que, luego del procedimiento de coloración, los
preparados pueden contener microorganismos viables, en especial si hay
esporos. Por consiguiente, siempre deben considerarse como
potencialmente riesgosos y manejarse con precaución.
3.1.1. Tinción simple
1. Extender, secar y fijar por calor.
2. Aplicar solución de colorante durante alrededor de 2 minutos. En
general, el tiempo de la coloración depende de la concentración
y del colorante utilizado.
3. Lavar con agua corriente.
4. Secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.
3.1.2. Tinción negativa
1. Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un asa, una gota
de una solución acuosa de nigrosina al 10 %.
2. Tomar una porción del cultivo, suspender en la gota de nigrosina y
extender en forma circular en el centro de la lámina.
3. Dejar secar (no exponer al calor) y observar con objetivo de
inmersión.
3.1.3. Tinciones compuestas y específicas
3.1.3.1. Tinción de Gram.
1. Prepare un extendido con los cultivos bacterianos proporcionados
y con el sarro dentario de la manera ya conocida. Déjelo secar y
fíjelo por calentamiento sobre la llama del mechero. Cubra la
extensión con cristal violeta y colorear por un minuto. Elimine el
exceso de colorante y lave a chorro suave con agua corriente.
2. Agregar solución de Lugol y dejar actuar durante un minuto. Elimine
el exceso de Lugol y lave. Decolore con una mezcla de alcohol-
acetona hasta que no se desprenda más colorante de la
preparación (15 seg.). Lave con agua corriente.
3. Aplique safranina y colorear por 30 seg. Elimine el colorante y lave.
3.1.3.2. Coloración de Ziehl Neelsen.
1. Prepare un extendido con la muestra de esputo. Déjelo secar y fíjelo
por calentamiento sobre la llama del mechero.

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2. Coloque la lámina en el soporte apropiado y cubra el extendido


con fucsina fenicada concentrada y caliente suavemente hasta la
emisión de vapores. El colorante no debe hervir. Mantenga el
calentamiento por 3 minutos. Lave con agua corriente y decolore
con alcohol-ácido hasta que deje de eliminar colorante. Lave con
agua corriente y cubra el extendido con la solución de azul de
metileno y déjelo actuar por 1 minuto.
3. Lave nuevamente con agua corriente, escúrralo y deje secar al
ambiente. observar con objetivo de inmersión.
3.1.3.3. Coloración de Espirilos
1. Extender la muestra de saliva a examinar sobre un portaobjetos. Si
la muestra es sanguinolenta deshemoglobinizar con líquido de
Rouge (ácido acético glacial 1 ml, formol 2 ml y agua 100 ml). Lavar
con agua corriente. Fijar con alcohol, dejar escurrir y encender el
alcohol. Apagar inmediatamente.
2. Cubrir con la solución de ácido tánico (5 %) y calentar con hisopo
encendido hasta emisión de vapores.
3. Mantener la emisión de vapores durante 30 segundos cuidando
que no hierva la solución. Lavar con abundante agua destilada.
4. Cubrir con solución de Fontana en frío, mover el preparado hasta
que tome color castaño claro. Calentar y mantener emisión de
vapores durante 15 segundos.
5. Lavar con agua destilada, secar entre papeles de filtro y observar
con objetivo de inmersión.
3.1.3.4. Coloración de Esporas: Según método de Dorner.
1. Preparar una suspensión del cultivo a analizar en 1 mL de agua
destilada. Añadir 1 mL de fucsina fenicada (solución acuosa de
fucsina 1 % y fenol 5 %) y colocar la mezcla en un baño de agua
hirviendo durante 10 minutos.
2. Tomar una asada del material y colocar en un portaobjetos.
Añadir una asada de una solución acuosa, saturada, fresca y
filtrada de nigrosina (10 %). Mezclar bien y extender en forma de
circular en el centro de la lámina.
3. Dejar secar y observar con objetivo de inmersión.

IV. FUNDAMENTACIÓN
4.1. TINCIÓN SIMPLE
Esta coloración permite la observación de la morfología y agrupación de
los microorganismos. Se realiza con un solo colorante. Entre los colorantes

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más utilizados para realizar coloraciones simples podemos nombrar el


cristal violeta y el azul de metileno que se utilizan en soluciones acuosas
al 1 %.

4.2. TINCIÓN NEGATIVA


Para esta coloración, se utilizan sustancias que no penetran en la célula
y por lo tanto se tiñe el fondo quedando los microorganismos incoloros.
Normalmente el tamaño de las bacterias observadas por esta técnica es
mayor que el real y no debe utilizarse para la medición de
microorganismos. Los agentes más utilizados son la nigrosina y la tinta
china y los microorganismos quedan incluidos en el colorante que forma
una capa relativamente gruesa. Con este método pueden observarse
morfología y agrupación, así como también estructuras extracelulares
como la cápsula.

4.3. TINCIÓN GRAM


Fue ideada por el bacteriólogo danés Christian Gram en el año 1883 y ha
demostrado ser de suma utilidad. Permite agrupar a las bacterias en
Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonómica. En
esta técnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con
cristal violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con
alcohol-acetona y finalmente se contracolorea con safranina. Las
bacterias Gram (+) resultarán de color violeta mientras que las Gram (-)
se verán rojas. La explicación de las diferencias en el comportamiento
tintorial entre bacterias Gram (+) y Gram (-), se fundamenta en la
estructura y composición de la pared celular bacteriana.
La pared de las bacterias Gram (+) está conformada por una gruesa
capa de peptidoglucano (20-30 nm), que es un polímero de N-acetil
glucosamina y N-acetil murámico. Las cadenas de peptidoglucano, se
unen a través de puentes formados por aminoácidos, que varían de una
especie bacteriana a otra. En esta capa también se encuentran ácidos
teicoicos, formados por ésteres fosfato de glicerol o ribitol, y ácidos
lipoteicoicos cuya estructura es similar a los ácidos teicoicos, pero se
hallan anclados a la membrana citoplasmática. En las bacterias Gram (-
), la capa de peptidoglucano es mucho más delgada (3-5 nm) y poseen
una membrana externa de estructura compleja en cuya composición
intervienen fosfolípidos, proteínas y lipopolisacáridos. En la figura puede
observarse una representación de las paredes celulares de organismos G
(+) y G (-).

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GRAM + GRAM

Fuente: https://biotechmind.files.wordpress.com/2015/04/parede-celular.jpg

Al tratar los preparados con cristal violeta y Lugol, se forman agregados entre
el colorante y el mordiente que, durante el proceso de decoloración, no
pueden ser extraídos de las bacterias Gram (+) debido a la gruesa capa de
peptidoglucano. En las bacterias Gram (-), la mezcla decolorante puede
atravesar fácilmente la capa de lípidos de la membrana externa y la delgadez
de la capa de peptidoglucano presente, permite la extracción de los
agregados y, por consiguiente, del color violeta. Al ser tratadas con safranina,
las bacterias Gram (-) tomarán el color del colorante de contraste.
En esta coloración, el paso crítico es la decoloración, ya que si se prolonga
demasiado resultarán decoloradas aún las bacterias Gram (+). Debe tenerse
en cuenta, asimismo, que como la integridad de las envolturas celulares resulta
fundamental para lograr una buena diferenciación, debe trabajarse en lo
posible con cultivos jóvenes. Es importante mencionar, que la clasificación en
Gram (+) y Gram (-) no puede aplicarse a todas las bacterias ya que hay
algunas que no pueden colorearse con esta técnica o para las cuales no tiene
sentido esta clasificación.

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4.4. TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN


La pared celular de los bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) está
compuesta por una gran cantidad de lípidos tanto libres como
covalentemente unidos: los ácidos micólicos y los micósidos. La alta
proporción lipídica otorga a estas bacterias una gran hidrofobicidad, con
la consiguiente tendencia a formar agregados y la dificultad para captar
colorantes que hace necesaria la utilización de métodos drásticos. Se
utiliza fucsina fenicada en caliente, luego un paso de decoloración con
ácido-alcohol y una contracoloración con azul de metileno. La mezcla
decolorante no podrá extraer el colorante de los BAAR que
permanecerán rojas mientras que las demás bacterias se verán azules.
Entre las bacterias ácido-alcohol resistentes más representativas se
encuentran las pertenecientes al género Mycobacterium, al cual
pertenecen los agentes etiológicos de la tuberculosis (Mycobacterium
tuberculosis) y de la lepra (Mycobacterium leprae). Esta coloración es de
suma importancia diagnóstica. Otro género de bacterias que se
colorean mediante esta técnica es Actinomyces.

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4.5. TINCIÓN DE ESPIRILOS Y ESPIROQUETAS


Existen bacterias de forma espiralada que son llamadas en forma general
espirilos, aunque debe hacerse una aclaración: los espirilos son bacterias
con morfología helicoidal y un cuerpo bastante rígido, que se mueven
mediante flagelos, pero existe otro tipo de microorganismos con la misma
morfología que se llaman espiroquetas cuyo cuerpo es flexible y tienen
flagelos internos. Las espiroquetas están formadas por un cilindro
protoplasmático constituido por el citoplasma, la región nuclear, la
membrana citoplasmática y la pared celular. El cilindro protoplasmático
se halla rodeado a su vez por una membrana multilaminar llamada capa
externa en cuya composición intervienen proteínas, lipoproteínas,
polisacáridos y fosfolípidos. Alrededor del cilindro protoplasmático se
encuentran un número variable de flagelos periplásmicos que, según la
especie, puede variar entre 2 y más de 100. La composición química de
los flagelos es similar a la de otros flagelos bacterianos. A diferencia de
otras bacterias móviles, las espiroquetas pueden desplazarse en medios
de alta viscosidad a través de un movimiento de sacacorchos. Entre los
géneros de bacterias espiraladas del tipo de las espiroquetas, podemos
nombrar Treponema (el Treponema pallidum es el agente etiológico de
la sífilis), Borrelia y Leptospira. En general, estos microorganismos son
demasiado delgados para poder ser visualizados mediante microscopía
óptica y por lo tanto deben engrosarse. En la técnica de Fontana –
Tribondeau, se usa ácido tánico como mordiente y luego se realiza una
impregnación argéntica con nitrato de plata amoniacal (solución de
Fontana). Es importante que los lavados se realicen con agua destilada
libre de cloruros ya que de otra manera precipitaría cloruro de plata. En
los casos en que la muestra contenga sangre, debe deshemoglobinizarse
con líquido de Rouge (ácido acético – formaldehído – agua). Al aplicar
esta técnica de coloración, se verán los microorganismos marrones
oscuro sobre fondo amarillento.

4.6. TINCIÓN DE ESPORAS


Algunas bacterias, son capaces de producir formas de resistencia a
través de un proceso llamado esporulación. Este proceso de
diferenciación, está codificado genéticamente y permite a los
microorganismos sobrevivir hasta que las condiciones exteriores sean
favorables para el desarrollo. Los géneros de bacterias capaces de
esporular hasta ahora descriptos son Bacillus, Clostridium y Sporosarcina
por lo cual la presencia de esporas en una bacteria es de gran utilidad
taxonómica. Estructuralmente, las esporas bacterianas están rodeadas

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por gruesas envolturas y tienen muy bajo contenido de agua. El córtex o


corteza, está compuesto por un peptidoglucano que contiene menos
enlaces cruzados que el correspondiente a la pared celular. La cubierta
está formada por una proteína del tipo de la queratina con gran
cantidad de puentes disulfuro. Esta capa es fundamental para la
resistencia de la espora a los agentes físicos y químicos. El exosporium es
de naturaleza lipoproteica.
Asimismo, poseen en su composición química, una alta concentración de
dipicolinato de calcio, que es una sustancia que no se encuentra en las
células vegetativas, y que estaría involucrada en la eliminación de agua
durante el proceso de esporulación. Estas características, dan cuenta de
la resistencia de las esporas a los agentes físicos y químicos y de la
dificultad que presentan para ser coloreados. Cabe aclarar que una vez
coloreados son difíciles de decolorar. En todas las técnicas para colorear
esporas se utilizan procedimientos drásticos. Describiremos las técnicas de
Dorner y de Moeller. Para la coloración de esporos según Dorner, se
sensibiliza y colorea al esporo con fucsina fenicada en caliente y luego
se extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraerá el colorante de todas
las estructuras celulares excepto de las esporas y por consiguiente, se
verán las esporas rojas, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro.
La técnica de Moeller utiliza ácido crómico y fucsina fenicada en caliente
para sensibilizar y colorear la espora. La decoloración se realiza con
ácido-alcohol y se contracolorea con azul de metileno. Se observan las
esporas rojas y el resto de la bacteria azul. Si bien es cierto que con otras
coloraciones las esporas se verán incoloras, en algunos casos las
bacterias pueden presentar zonas sin colorear que no corresponden a
esporas y debe confirmarse su presencia mediante una coloración
específica. Otro aspecto que debe tenerse en cuenta al observar
esporas es su posición: terminal, subterminal o central, y si deforman o no
a la bacteria ya que serán características que ayudarán en la
clasificación.

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V. PRECAUCIONES Y BOSEGURIDAD
Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.

VI. EVALUACIÓN
1. Investigue ¿Qué es un colorante ácido y un colorante básico? Menciones 2
ejemplos de cada uno.
2. Explique el proceso de fijación de una muestra bacteriana sobre una lámina
portaobjetos.
3. Mencione los métodos más comunes por los cuales se fija una muestra.
4. ¿Cuál es la función del aceite de inversión en un preparado en seco?
5. ¿Por qué es necesario colorear o teñir las extensiones microbiológicas?
6. Explique en qué consiste una tinción simple.
7. Explique el fundamento de la Tinción diferencial de Gram.
8. Explique el fundamento de la Tinción diferencial de Ziehl Neelsen.
9. Escriba correctamente el nombre científico completo de 5 bacterias Gram
positivas y 5 bacterias Gram Negativas.
10. Explique ¿Por qué algunas bacterias gram positivas cuando envejecen se
vuelven gram negativas?

VII. RESULTADOS: OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página 37


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Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

VIII. BIBLIOGRAFÍA
1. Montoya HH. Microbiología básica para el área de salud y afines. 2a.
Editorial Universidad de Antioquia. Colombia; 2008.
2. Koneman EW., Allen SD., Jorda WM., Procop GW., Schreckenberger PC.,
Woods GL. Diagnóstico microbiológico. 6a. Editorial médica:
Panamericana. Argentina; 2008.
3. Davis B., Dulbecco R., Eisen H., Ginsberg H., Wood W. Tratado de
Microbiología. Editorial Salvat. Buenos Aires. Argentina; 1983.
4. Basualdo J., Coto C., De Torres R. Microbiología Biomédica. Editorial
Atlante Argentina S. R. L; 1996.
5. Velasco J., Araque M., Araujo E., Longa A., Nieves B., Ramírez A., Sánchez
K., Velazco E. Manual práctico de bacteriología clínica. Colección Textos
Universitarios. Universidad de los Andes. Colombia; 2008.

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PRÁCTICA No 03

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO


MICROBIANO

SESIÓN 03 FECHA 18/09/2019 DURACIÓN 100 minutos

Identifica a los microorganismos de forma inequívoca


CAPACIDAD relacionándolos con su morfología y metabolismo trabajando
en equipo y respetando las opiniones de sus compañeros.

I. INTRODUCCIÓN
Dos conceptos para analizar, el término medio es el nexo para conseguir algo,
en este caso, es que la vida continúe, y el proceso de cultivar es buscar que
los seres vivientes sigan con su existencia, el término cultivar lo usan otros
pensadores, como la acción de hacer o crear, en los seres vivientes es hacer
algo para multiplicar o crecer. Así las bacterias aparecen dentro de la
evolución de las especies y su estudio hubiese sido muy difícil si no se hubieran
diseñado medios de cultivo dónde poderlos estudiar.
Años han pasado desde que se comenzó a cultivar microorganismos fuera de
su hábitat, en ambientes diseñados en un laboratorio o cerca de su entorno
natural, así es como el hombre ha creado ambientes y productos químicos
para proporcionarle a los microorganismos los nutrientes necesarios para que
puedan vivir y reproducirse. Un medio de cultivo es el alimento para las
bacterias. Nutrientes y ecología artificial para preservar la vida de los
microorganismos fuera de su hábitat natural.
Hoy en día, las técnicas de cultivo, para aislar y de crecimiento de
los microorganismos, se han desarrollado notablemente con requisitos
nutricionales específicos. Por lo tanto un medio de cultivo es un
conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que
crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos.
Puesto que la diversidad metabólica de los microorganismos es enorme, la
variedad de medios de cultivo es también muy grande. La mayoría de los
medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso
rehidratar. Todo medio de cultivo debe contener: fuente de carbono, de
nitrógeno, presentar un equilibrio acido-base (pH) y estar libre de gérmenes
contaminantes.

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A. CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:


 Agar: Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se
obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de
degradarlo.
 Carbohidratos: Son una fuente de carbono para los
microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa y la
sacarosa.
 Extractos: Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales
o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de
levadura, de malta, etc.
 Peptonas: Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión
química o enzimática de proteínas animales o vegetales.
 Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma
o suero sanguíneo son añadidos a los medios empleados para
el cultivo de algunos microorganismos patógenos.
 Sistemas amortiguadores. Son sales que se añaden al medio para
mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano.
Ej.: fosfatos bisódicos o bipotásicos.
 Indicadores de pH. Se incorporan a los medios de cultivo para dar
prueba visual del pH y otros cambios producidos durante el crecimiento
de la bacteria. Los indicadores no deben ser tóxicos.
 Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las
condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos
o anaerobios. Ej.: cisteína y tioglicolato.
 Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares
etc. que a determinadas concentraciones en el medio actúan como
agentes selectivos frente a determinados microorganismos.
 Bilis. Contiene varios ácidos biliares como compuestos conjugados con
aminoácidos. También contiene pigmentos, como bilirrubina y
biliverdina.
 Sales biliares. Son extraídas de la bilis, inhiben el crecimiento
de microorganismos Gram positivos y bacilos que forma esporas, sin
afectar el desarrollo de los bacilos entéricos gramnegativos.

B. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:


 Por su naturaleza:
 Naturales: Ejemplo. Leche, Suero, papa.
 Artificiales: Son de composición química conocida y constante,
producidos en una fábrica o laboratorio: constituidos en su mayor parte
por sales inorgánicas, peptonas y carbohidratos. Ejemplo. Agar Nutritivo.

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 Por su estado físico


 Líquidos: Caldos.
 Semisólidos: Medio Cary – Blair.
 Sólidos: Agar nutritivo. (Todos los medios que llevan agar de 13 – 18 %).
 Por su Aplicación: a. Medios comunes: Permiten el desarrollo de una
gran variedad de Microorganismos. Ejemplo: agar común, caldo
nutritivo, caldo peptona y b. Medios Especiales: Presentan
constituyentes esenciales. Se dividen en:
 Medios mejorados o enriquecidos: Son medios comunes a los que se les
agrega aditivos orgánicos como sangre, albumina, suero, yema de
huevo, liquido ascítico, etc. Se emplean para el cultivo de gérmenes
exigentes. Ejemplo: Agar Sangre, Medio Lowenstein, Caldo Suero.
 Medios selectivos o de aislamiento: Tienen por objeto facilitar el
desarrollo de determinado grupo de Microorganismos, inhibiendo a la
vez otros acompañantes, proveniente de muestras que contengan flora
mixta. Ejemplo: Agar Acida de Sodio, Agar Chapman, Agar telurito de
Potasio.
 Medios selectivos diferenciales: Son semejantes a los medios de
aislamiento, pero contienen además un sustrato definido y un indicador
de pH. Tienen por objeto permitir el desarrollo de un determinado grupo
de estos y diferenciarlos según la utilización del sustrato, observándose
la variación del pH del medio por el cambio de color del indicador.
Ejemplo: Agar MacConkey, Agar salmonella-Shigella.
 Medios Diferenciales: Permiten poner de manifiesto algunas
propiedades bioquímicas de los gérmenes. Se caracteriza por tener uno
o más sustratos específicos como carbohidratos, sales, etc. y un
indicador de pH. Ejemplo: Caldo Lactosado, Caldo Urea, Agar TSI.

C. PREPARACIÓN, ESTERILIZACIÓN Y SERVIDO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

 PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN:
Pesar la cantidad de gramos indicados en el frasco para una cantidad
de agua destilada. Utilizar papel de aluminio y evitar que caigan
residuos fuera del área de pesado. Transferir el medio de cultivo al
recipiente de preparación este debe ser un matraz o un balón de fondo
plano. Adicionar la medida de agua destilada lentamente y disolver
bien con ayuda de una cocina o un baño maría hirviente. Enfriar y
ajustar el pH si fuere necesario. Colocar el tapón de algodón y cubrir
con un pedazo de papel kraft cuadrado, anotar el nombre del medio y

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amarrar a la boca del matraz con hilo pabilo, llevar los medios a la
autoclave y esterilizar a 121 oC por 15 minutos, terminada la
esterilización dejar el autoclave baje su presión a cero para luego abrir
la misma, retirar los frascos y se agitan por rotación para que la mezcla
sea homogénea.

 SERVIDO:
En la mesa limpia y desinfectada, a lado de un mechero encendido se
procede a servir los medios de cultivo en placas Petri, tubos de ensayo
y en viales.

MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO MICROBIANO


El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento
de técnicas de siembra o inoculación y de aislamiento para transferirlos de un
medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es indispensable para
realizar diversos estudios morfológicos, de identificación, bioquímicos, de
patogenicidad y ecológicos, entre otros. Existen diferentes técnicas de siembra:
por suspensión de la muestra en medios líquidos; extensión de diluciones de un
cultivo en superficie de medios en placa de Petri; por estría en placa de Petri y
en tubos con medios solidificados en forma inclinada; por piquete o picadura
en tubos con medios sólidos o semisólidos. Con la aplicación de cada técnica
se obtiene información de importancia para el estudio básico o aplicado de los
microorganismos de interés.
En la naturaleza, los microorganismos generalmente se encuentran en
poblaciones, formando parte de comunidades de gran complejidad, por lo
que uno de los objetivos de estudio más importantes en microbiología es
aislarlos. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en
la mayoría de los casos, mediante la técnica de estría cruzada para producir
colonias aisladas en cultivos sólidos y así, obtener un cultivo puro o axénico,
también conocido como cepa, que contiene un solo tipo de microorganismo
con la misma composición genética. Cuando la técnica por estría se aplica
para aislar un microorganismo de interés a partir de mezclas donde se
encuentra en pequeñas cantidades, generalmente se obtendrán las bacterias
dominantes. En este caso, se utilizan medios selectivos o de enriquecimiento, los
que contienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones de
sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura que incrementarán la población
del microorganismo de interés y se facilitará su aislamiento.
Si se agregan a los medios de cultivo otros componentes como: sangre,
colorantes, indicadores, es posible distinguir entre especies bacterianas por la

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forma en que metabolizan los sustratos y que se manifiesta por cambios en la


apariencia del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios
diferenciales y son de gran utilidad para la caracterización e identificación de
especies bacterianas.

II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO (POR MESA DE TRABAJO)
 09 placas petri, cada una con los siguientes medios de cultivo: Agar
Mueller-Hinton, agar nutritivo, agar Sangre, agar Chocolate, agar
MacConkey, agar Manitol Salado, agar SS, agar Cetrimide y agar
sabouraud.
 07 Tubos con cada uno de los siguientes medios de cultivo: TSI, LIA,
Citrato, caldo urea, caldo RM-VP, medio SIM, caldo nutritivo.
 Cultivo en caldo y en medio sólido (cualquier bacteria aerobia).
 09 tubos de ensayo estériles.
 04 asas bacteriológicas (03 en anillo y 01 en punta).
 01 Incubadora microbiológica
 03 mecheros bunsen o de alcohol
2.2. DEL ALUMNO
Individual
 Manual de prácticas impreso y anillado, libreta de apuntes y lapicero.
 Barreras de bioseguridad personal: Guantes, mascarilla y cofia.
 01 plumón marcador indeleble y 01 fósforo o encendedor.
Grupal:
 Paquete de hisopos estéril de toma de muestra microbiológica.
 Baja lengua estéril.

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. NORMAS GENERALES:
Para realizar la siembra de microorganismos es necesario cumplir las
siguientes reglas microbiológicas:
 Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes de empezar y al finalizar.
 Disponer de todo el material que se requiera para la siembra sobre la
mesa de trabajo.
 Colocarse los guantes de látex antes de manipular material contaminado
y evitar las corrientes de aire. No hablar durante la siembra y mantener
siempre puesto la mascarilla o tapa boca.

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 Esterilizar el asa bacteriológica (llevarla a rojo vivo) antes y después de la


siembra.
 Emplear medios de cultivo estériles.

3.2. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS EN MEDIOS LÍQUIDOS


La siembra se realiza llevando el inoculo o la muestra con el asa en anillo
o en punta al medio líquido y se deposita o mezcla. También pueden
emplearse pipetas estériles.

Flameado Flameado

Muestra Inoculación Incubación

3.3. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS EN MEDIOS SEMISÓLIDOS


Con un asa en punta colocar la muestra por puntura en el medio
semisólido. Sembrar también en Medio Tioglicolato; luego de la
inoculación, rotar suavemente los tubos entre las palmas de las manos
para dispersar la muestra.

Flameado Flameado

Muestra Medio semisólido Incubación

3.4. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS POR DISEMINACIÓN EN SUPERFICIE


Se emplean porque ofrecen mayor área de siembra y permiten diferenciar
a los microorganismos por sus características culturales. Con el asa
bacteriológica tomar la muestra y realizar un estriado muy junto en el
primer tercio de la placa (agotar) y luego realizar estrías en forma de zigzag

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más separadas hasta el lado opuesto. También se puede realizar el


estriado utilizando los cuadrantes de la placa; en dos cuadrantes o cuatro
cuadrantes.

A). 1 cuadrante b). 2 Cuadrantes c). 4 Cuadrantes

3.5. Siembra en tubos con agar inclinado


Se emplean tubos de prueba con agar inclinado o pico de flauta. La
siembra se realiza mediante estrías en la superficie inclinada y en algunos
casos se realiza una puntura hasta las dos terceras partes de profundidad;
o una puntura seguida de estrías en la superficie. En estos casos se emplea
el asa bacteriológica en punta.

Asa en punta.

Pico de flauta

Siembra en profundidad Siembra en estría en


(Picadura profunda) superficie inclinada.

3.6. Siembra por difusión en placa - por incorporación:


Utilizado para el recuento total de gérmenes a partir de una muestra
líquida. La siembra se realiza colocando una alícuota (1 mL.) de la muestra
sobre la superficie de una placa Petri estéril vacía. Luego agregar de 12 a
15 mL. de agar Nutritivo enfriado a 45 – 50ºC. Homogenizar mediante

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movimientos de rotación y traslación. Dejar solidificar. Las placas se llevan


luego a incubación.

SIEMBRA POR EXTENSIÓN EN Colonias de


SUPERFICIE: superficie

Incubación

La muestra se pipetea Resultado típico de la


La muestra se extiende siembra por extensión en
sobre la superficie del
uniformemente utilizando un superficie.
agar (0,1 mL o menos).
asa de Drigalsky estéril.
Colonia debajo del
SIEMBRA POR INCORPORACIÓN O VERTIDO EN PLACA medio de cultivo.

Incubación

Resultado típico de la
La muestra se pipetea Se añade medio de siembra por vertido en Colonia de
en una placa estéril. cultivo estéril y se placa o incorporación. superficie
mezcla bien con el
inóculo.

IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del presente
manual.
Manejo de residuos: Todo el material (vidrio, plástico, tela, etc) que tenga
contacto con microorganismos debe ser esterilizado en autoclave a 121°C/15
libras de presión/15 minutos para su descarte o reutilización.

V. EVALUACIÓN
1. ¿Por qué los medios de cultivo se diluyen con agua destilada
desmineralizada y no cualquier tipo de agua?
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
2. ¿Menciona por qué algunos medios de cultivo no se deben esterilizar en
autoclave?
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………

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3. ¿Por qué se recomienda enfriar a 45 °C o 50 °C el medio de cultivo sólido


antes de efectuar el vaciado en las placas Petri?
…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
4. ¿Qué características tiene el agar agar en cuanto a composición química,
valor alimenticio y propiedades físicas?
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5. Porqué es importante regular el valor de pH en los medios de cultivo
diferenciales.
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…………………………………………………………………………………………………
6. Explique en qué consisten los medios de cultivo cromógenos.
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7. Describir que técnica de aislamiento bacteriano utilizaría a partir de una
muestra que proviene de un ambiente natural.
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…………………………………………………………………………………………………
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8. ¿Explicar a qué se le denomina cultivo axénico o puro?
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…………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………
9. Fundamente la importancia de obtener un cultivo puro durante un
aislamiento microbiológico.
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10. Mencione 5 colecciones internaciones de cepas microbiológicas


certificadas.
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…………………………………………………………………………………………………

VI. FUNDAMENTACIÓN
Los medios de cultivo se utilizan para diferentes propósitos: la enumeración, el
aislamiento de ciertos tipos de bacterias, el mantenimiento de cultivos para su
uso posterior y para facilitar el reconocimiento de algún tipo de bacteria en
particular. Frecuentemente, en el laboratorio se requiere aislar un tipo de
bacteria a partir de una mezcla de diversos tipos. Para ello, se ha diseñado
diversos medios de cultivo que favorece el crecimiento de la bacteria de interés
e inhibe el resto. Entre estos tenemos:
a. Medios generales: Permiten el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos no exigentes, también son usados como medios de cultivo
base para la preparación de otros medios (enriquecidos y selectivos).
b. Medios de enriquecimiento: Favorece el crecimiento de un determinado tipo
de microorganismos, sin llegar a inhibir el crecimiento del resto. Son medio
generales a los que se les añade: suero, sangre o factores esenciales
específicos como vitaminas o cofactores. Permiten el crecimiento de
bacterias exigentes como estreptococos, neumococo, gonococo y otras.
Ejemplo: Agar sangre, Agar chocolate, Agar Mueller- Hinton.
c. Medios selectivos: Permite el crecimiento de un tipo microbiano
determinado, inhibiendo el desarrollo de los demás pues dentro de su
composición presentan sustancias inhibitorias.
d. Medios diferenciales: Son aquellos en los que se ponen en relieve
propiedades que posee un determinado tipo de microorganismo. Ejemplos
de Medios de cultivos selectivos diferenciales: Agar Mac Conkey, Agar
manitol salado, agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD), Medio de Lowenstein–
Jensen, Chromagar, Agar con inhibidor de hongos filamentosos, y otros.

VII. BIBLIOGRAFÍA
1. Gamazco C., López I., Díaz R. Manual Práctico de Microbiología. 3a.
Editorial Masson S.A. España; 2005.
2. Prast G. Microbiología clínica. Editorial medica Panamericana. Buenos
Aires.2007.
3. Murray R. Microbiología Médica. 7a. Editorial: Elsevier. Madrid. 2013.

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PRÁCTICA No 04

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA EFECTOS CITOPÁTICOS CAUSADOS POR VIRUS

SESIÓN 04 FECHA 25/09/2019 DURACIÓN 100 minutos

Identifica a los microorganismos de forma inequívoca


CAPACIDAD relacionándolos con su morfología y metabolismo trabajando
en equipo y respetando las opiniones de sus compañeros.

I. INTRODUCCIÓN
Para cultivar virus se utilizan tipos específicos de células de cultivo tisular. Los
cultivos de células primarias se obtienen por tratamiento de algún órgano
animal específico con tripsina o colagenasa. Las células obtenidas con este
método se cultivan en monocapa (fibroblasto o células epiteliales) o en
suspensión (linfocitos) en medios artificiales complementados con suero
bovino o alguna otra de factores de crecimiento.

Las células primarias se pueden separar con tripsina, se diluyen y crecen en


nuevas monocapas (subcultivos) para convertirse en cultivos celulares
secundarios. Las líneas de células diploides son cultivos de un único tipo de
células con los que se puede hacer un gran número de pases, aunque finito,
antes de presentar signos de senescencia o experimentar cambios
significativos en sus características.

Las líneas celulares tumorales y las líneas celulares inmortalizadas, iniciadas a


partir de tumores de pacientes o por efecto de virus o compuestos químicos
respectivamente, se componen de células de un solo tipo que pueden ser
sometidas a pases continuos sin envejecer. Las células primarias de riñón de
mono son muy adecuadas para llevar a cabo el aislamiento del virus de la
gripe, paramixovirus, muchos enterovirus y alguno adenovirus.

Las células diploides fetales humanas, que generalmente son fibroblastos,


permiten el crecimiento de un amplio abanico de virus (VHS, VVZ, CMV,
adenovirus, picornavirus). Las células HeLa, una línea continua de células
epiteliales derivadas de un cáncer humano son excelentes para aislar el VRS,
los adenovirus y los VHS. Muchos virus con importancia clínica se pueden aislar
con algunos de estos cultivos celulares.

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Se denomina efecto citopático (ECP) a los cambios bioquímicos y


moleculares, morfológicos y de viabilidad celular, visibles a microscopía
óptica, causados durante el ciclo de replicación viral. Estos efectos se usan
para reconocer las células infectadas por virus en un cultivo. Los efectos
citopáticos inducidos por los virus se pueden examinar con un microscopio de
luz invertida de baja potencia. Se determinan características como
redondeamiento y contracción de las células, aumento de la refractabilidad,
fusión o formación de sincitios, agregación, pérdida de adherencia y lisis o
muerte celular.

Los efectos citopáticos se producen como resultado de:

 Ingreso del virus en el huésped (paso a través de la membrana


plasmática).
 Inhibición de la transcripción celular o estimulación de la actividad de la
RNA polimerasa celular.
 Interacciones del virus con las vías de procesamiento del RNA.
 Interacciones del virus con el aparato de traducción.
 Respuesta del huésped a la infección viral.

Los efectos citopático pueden ser identificados en cultivos no fijados y no


teñidos con baja iluminación del microscopio, pero la fijación de la monocapa
ayuda a tener mayor detalle en el diagnóstico y de esta forma se pueden
observar cuerpos de inclusión o células gigantes. Los cuerpos de inclusión
formados durante la replicación viral tienen afinidad por los colorantes ácidos
y pueden encontrarse en el citoplasma de las células nerviosas, denominados
cuerpos de Negri, para el diagnóstico de la rabia; en el núcleo como el virus
de la laringotraqueitis, o en ambos como el virus del sarampión. El análisis más
ampliamente utilizado para el virus infectante es la demostración de
formación de placas al inocular monocapas con diluciones adecuadas del
virus. Los métodos para el diagnóstico de la rabia deben ofrecer condiciones
óptimas de precisión, rapidez y economía. Dentro de estas técnicas está la
investigación microscópica de los corpúsculos de Negri, que se realizan en un
frotis de tejido encefálico infectado con el virus rábico y es teñido por la
técnica de Sellers.

Los efectos citopáticos son los criterios más simples y utilizados con más
frecuencia para reconocer las infecciones virales, aunque no todos los virus
causan estos efectos. Por tal razón deben usarse otros métodos para detectar
las infecciones virales. La práctica consistirá en la visualización del efecto
citopático de los virus VHS, CMV y virus rabia.

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II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO
A. EXPERIENCIA 01: FORMACIÓN DE CALVAS EN CULTIVO CELULAR
PRIMARIO:
 03 Microplacas estériles de cuatro pozos.
 01 Cabina de Seguridad Biológica Nivel II
 03 Matraz de tripsinización, 03 Probetas de 100 mL, vasos de
precipitado de 50, 100 y 250 mL (03 de cada uno), 12 Tubos de vidrio
con tapón de rosca 15 x 125 mm estériles, pipetas de 1 a 10 mL y
micropipetas de 1000 µL.
 25 mL de suspensión de fibroblastos en medio MEM, 25 mL Medio
MEM y 25 mL de Suero de bovino, 100 mL de Caldo triptosa fosfato
(TPB) y 100 mL de Solución salina buferada (SSB pH 7.2)
 01 Incubadora a 37ºC y 01 Microscopio óptico binocular.
 Un vial de Gentamicina, 01 Vacuna comercial, Carboximetil
celulosa y 100 mL de metanol al 20% y de Hipoclorito de sodio al 2%
y 20 mL de Cristal violeta al 1%
 02 Bombillas de seguridad
B. CORPÚSCULOS DE NEGRI POR VIRUS RÁBICO: TINCIÓN DE SELLERS
 Estuche de disección
 01 pliego de papel filtro
 Colorante de Sellers
 Soporte para tinción
 200 mL de solución amortiguadora de fosfatos pH 7.5
 Cronómetro
C. OBSERVACIÓN DE CÉLULAS CITOMEGÁLICAS EN ORINA
 09 Beakers de 100 y 250 mL
 12 Tubos de vidrio con tapón de rosca 15 x125 mm estériles o de
plástico de primer uso
 12 Tubos de 16 x 150 mm.
 06 Pipetas de 5 mL.
 01 caja de láminas portaobjetos.
 200 mL de alcohol-éter al 50%.
 500 mL de Buffer fosfato pH 7.2.
 Set para coloración de hematoxilina Eosina.
 Centrífuga refrigerada.
 Mechero bunsen o de alcohol

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2.2. DEL ALUMNO


Individual:
 Manual de prácticas impreso y libreta de apuntes y lapicero.
 Guardapolvo limpio en bolsa de transporte (o en su defecto
guardapolvo descartable) y barreras de bioseguridad personal:
Guantes, mascarilla y cofia.
 01 Plumón, marcador indeleble y 01 fosforo o encendedor.
Grupal:
 02 Embriones de pollo de 9 -11 días de edad. (huevo fecundado ovado
10 días).
 02 Ratones BAL-C de 3 - 5 semanas de nacidos.
 Orina fresca de mujer gestante (de 1 a 8 meses de gestación).
 Orina fresca de estudiante (cualquier sexo).
 02 Tijeras rectas(o 02 Estuches de disección). 10 Baja lenguas.

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. FORMACIÓN DE PLACAS EN CULTIVO CELULAR PRIMARIO
1. Ya preparada una suspensión de fibroblastos de embrión de pollo con
la concentración celular indicada por cada ml en medio de cultivo
MEM, como se señaló anteriormente,
2. Distribuir 2.0 ml de suspensión celular en microplacas de cuatro posos
con tapa. Incubar las placas a 37ºC en presencia de atmósfera de
CO2 durante 72 horas y en alta humedad.
3. Reconstituir el virus y diluirlo por dilución decimal.
4. Retirar el medio de cultivo de los pozos e Inocular el virus diluido con
0.5 ml por pozo, utilizar dos pozos por dilución.
5. Esperar 60 minutos a 37 cultivo suplementando con 1% de suero y con
1.5% de carboximetil celulosa, incubar a 37°C, en presencia de CO2 y
humedad abundante nuevamente.
6. A las 48 o 72 horas post inoculación, observar el monoestrato celular
para detectar la formación de placas bajo el microscopio de luz
invertida. Lavar la monocapa con solución salina buferada PBS de
forma suave y eliminar el sobrenadante.
7. Fijar la monocapa con 1% de cristal violeta en 20% de metanol por
5minutos para observar al microscopio invertido o de luz normal el
número de placas formadas por dilución viral.

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3.2. CORPÚSCULOS DE NEGRI POR VIRUS RÁBICO: TINCIÓN DE SELLERS


1. Con ayuda del equipo de disección y de las tijeras de punta fina se
realizará un corte entre ambas fosas orbitales del ratón.
2. Se levanta la piel y músculos de la cara y cabeza para exponer el
cráneo.
3. Se dobla el cuello del ratón para exponer el agujero magno.
4. Se inserta la punta de una tijera para cortar el hueso y se corta la
bóveda hasta exponer el cerebro. Se saca integro el cerebro
desprendiéndolo de la base del cráneo (incluyendo cerebelo y parte
de la medula). Se saca integro el cerebro desprendiéndolo de la base
del cráneo (incluyendo cerebelo y parte de la medula).
5. Con el bisturí se hace una sección transversal tomando un fragmento
del cerebro que contenga el asta de Ammon o cuerpo de Ammon del
hipocampo donde los corpúsculos de Negri son especialmente visibles.
PREPARACIÓN DE LA IMPRONTA
1. En el extremo de un baja lenguas se coloca una banda de papel filtro
y sobre este se pone el corte del cerebro del ratón. Luego en un
portaobjetos se hacen de 3 a 4 impresiones del cerebro, tomando
ligeramente y haciendo presión hasta que quede marcado en el porta
objetos la silueta de la pieza de cerebro a estudiar.
2. Se realiza la tinción de Sellers de acuerdo al siguiente metodología:
a. Cubrir la impronta con el colorante de Sellers durante 15 segundos.
b. En seguida enjuagar con buffer pH = 7.5.
c. Dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo de
inmersión.
3. Observar y describir las células nerviosas, no se apreciarán los
corpúsculos de Negri pues el riego de manejar virus rábico es muy alto
(solo se simulará que el ratón está infectado).

3.3. OBSERVACIÓN DE CÉLULAS CITOMEGÁLICAS EN ORINA


3.3.1. PROCESAMIENTO DE LA ORINA
1. Colocar 5 mL de orina en un tubo plástico con tapa rosca y agregar
5 mL de alcohol-éter al 50%. Agitar mecánicamente hasta
conseguir una mezcla homogénea. Dejar a temperatura ambiente
durante 10 min y luego centrifugar a 1500 rpm durante 15 minutos.
Descartar el sobrenadante.

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2. Agregar al sedimento 5 mL de buffer fosfato pH 7.2, mezclar y


transvasar a otro tubo con tapa rosca. Centrifugar a 1500 rpm
durante 15 minutos y descartar el sobrenadante. Repetir este
lavado por dos veces.
3. Después del último lavado, descartar el sobrenadante y a partir del
sedimento realizar extensiones en láminas portaobjetos, si el
sedimento está muy denso agregar buffer fosfato pH 7.2. Dejar
secar a temperatura ambiente durante 24 horas. Colorear con
hematoxilina Eosina o Giemsa y observar a 400 aumentos las células
citomegálicas.
3.3.2. COLORACIÓN HEMATOXILINA EOSINA
1. Fijar la muestra en alcohol éter al 50% durante 20 minutos. Secar a
temperatura ambiente.
2. Colorear con hematoxilina durante 10 minutos, luego lavar con
agua de caño. Decolorar en ácido clorhídrico al 0,5%
introduciendo y sacando inmediatamente la lámina.
3. Lavar con agua de caño. Fijar en amoniaco al 1% durante 3
minutos y decolorar con alcohol de 95%. Decolorar con alcohol al
absoluto y aclarar con xilol por dos veces. Finalmente secar a
temperatura ambiente.

IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Todo el material (vidrio, plástico, tela, etc) que tenga
contacto con microorganismos o fluidos corporales humanos o animales debe
ser esterilizado en autoclave a 121°C/15 libras de presión/15 minutos para su
descarte o reutilización.

V. EVALUACIÓN
En todos los casos, señale la opción CORRECTA. Puede haber más de una
opción correcta o ninguna. Justifique cuando una opción es incorrecta.
1. Los virus se asocian a múltiples características inherentes a la relación
entre su estructura / función.
a. Son agentes que invaden seres vivos y se multiplican en ellos,
infectándolos
b. Todos poseen un menor tamaño al límite de resolución del microscopio
óptico.

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c. Sus genomas le confieren infectividad.


d. Exhiben un parasitismo genético obligatorio.
e. Se comportan como partículas inertes fuera de un organismo vivo.
f. Los agentes envueltos no son antigénicos dado que dicha envoltura es
de origen celular.
g. Los virus desnudos tienen habitualmente mayor resistencia a las
condiciones ambientales que los agentes envueltos.
2. Las siguientes partículas / estructuras son infecciosas.
a. Partículas de Dane del virus hepatitis B (HBV).
b. Los viriones generados en el curso de una infección productiva
c. Las partículas semejantes a virus (viral-like particles)
d. Las partículas compuestas por glicoproteínas virales secretadas desde
el interior celular a la circulación sanguínea.
e. Los antígenos solubles liberados desde el interior de las células
infectadas.
f. Las partículas de los virus atenuados.
g. Las partículas de los virus inactivados.
h. Las viriones con mínima patogenicidad.
i. Los viriones con mínima virulencia
j. El RNA (+) de un virus, que es introducido en una célula
experimentalmente.
3. Los siguientes son virus que promueven habitualmente infecciones
localizadas.
a. Influenza b. Parainfluenza c. Junín d. Rotavirus e. Norovirus f. Virus
sincicial respiratorio g. Coxsackie h. Parvovirus B19 i. Parotiditis j. Dengue
4. Los siguientes son virus que promueven habitualmente infecciones
sistémicas.
a. Fiebre amarilla b. Polio c. Zika d. Varicela-zóster e. Sarampión
f. Rubéola g. Metapneumovirus humano h. Citomegalovirus humano i.
Virus Epstein-Barr j. Virus papiloma humano
5. Los siguientes son eventos que se pueden observar durante la replicación
viral de diversos agentes.
a. La interacción entre receptores celulares y ligandos virales es
imprescindible para el ingreso de los virus envueltos, pero no de los
desnudos.
b. Cada virus utiliza un único receptor para ingresar a una determinada
estirpe celular.

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c. Algunos virus pertenecientes a diferentes especies pueden utilizar un


mismo receptor.
d. Variantes emergentes de una misma especie viral en un organismo
pueden cambiar su tropismo celular con el devenir de una infección
persistente.
e. La mayoría de los virus que poseen un genoma de ADN replican en el
núcleo.
f. La mayoría de los virus que poseen un genoma de ARN replican en el
citoplasma.
g. La producción de infecciones localizadas o sistémicas es dependiente
de la célula polarizada infectada e independiente de la población viral
que lo haga.
h. Los virus que egresan por el polo apical de una célula no pueden
hacerlo desde el polo basolateral.
i. Las variantes generadas como consecuencia de la replicación viral se
denominan mutantes.
6. Los siguientes son mecanismos / eventos que contribuyen habitualmente
a la variabilidad genética viral.
a. Inserciones
b. Delecciones
c. Recombinaciones entre regiones del genoma de diversos virus (a ADN o
de ARN) que infectan una misma célula.
d. Reasociaciones entre segmentos del genoma de virus a RNA que
infectan una misma célula, provenientes de distinto origen parental.
e. Actividad de una transcriptasa inversa viral.
f. Actividad de una ARN polimerasa ARN-dependiente viral.
g. Generación de viroides en infecciones persistentes latentes.
h. Actividad de una ARN polimerasa II celular para sintetizar ARN a partir
del moléculas de DNA de retrovirus o hepadnavirus.
i. Actividad de una integrasa viral como acontece con los retrovirus.
7. La patogenicidad y la virulencia viral pueden diferir entre sí, según la
especie considerada.
a. Polio: baja patogenicidad y elevada virulencia.
b. Sarampión: muy alta patogenicidad y elevada virulencia.
c. HIV: muy alta patogenicidad y virulencia.
d. Rinovirus: muy alta patogenicidad y elevada virulencia.
e. Virus rabia: máxima patogenicidad y virulencia.
f. Vacuna atenuada anti-poliomielítica (tipo Sabin): habitualmente, nula
patogenicidad y virulencia; muy excepcionalmente (1 c/3 millones de

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vacunados con la vacuna trivalente), se observó que puede ser


patogénica y virulenta.
g. Vacunas inactivadas virales (tipo Salk): moderada patogenicidad y
virulencia.
h. Virus parotiditis: máxima patogenicidad y virulencia
8. Los virus pueden producir daño celular, mediante uno o múltiples
mecanismos.
a. El efecto citopático viral puede ser reconocido sólo mediante
microscopia electrónica.
b. La apoptosis puede ser promovida o inhibida por un mismo virus, según
la estirpe celular y la etapa de la infección.
c. Los virus que poseen una proteína de fusión pueden promover la
formación de sincitios.
d. Diversos virus que producen infecciones sistémicas asociadas a
elevados niveles de viremia, pueden promover el depósito de
inmunocomplejos en glomérulos, pequeños vasos y articulaciones.
e. Los cuerpos de inclusión pueden observarse al microscopio óptico y
corresponden a sitios de acúmulo nuclear o citoplasmático de
componentes virales, que pueden estar asociados a componentes de
la célula y perturbar su funcionamiento.
f. La apoptosis puede ser promovida por la respuesta inmune celular del
huésped.
g. Una célula no necesita estar infectada para que determinados virus le
produzcan daño, como acontece con una virotoxina sintetizada por los
rotavirus
h. Los linfocitos T CD8+ y las NK pueden promover la eliminación viral sólo
mediante efectos citotóxicos que culminan con la destrucción celular.
VI. FUNDAMENTACIÓN
EFECTO CITOPÁTICO: Se conoce como efecto citopático al aspecto
macroscópico e histológico del daño producido por un virus en un cultivo
celular el cual es un importante criterio de diagnóstico ya que muchos virus
causan efectos citopáticos característicos. Entre los cambios citopáticos en
las células se encuentran los siguientes:
4.1. DEGENERACIÓN: Se refiere a todas las lesiones causadas por los virus en el
tejido afectado, este daño es causado por distintos factores como son la
síntesis de proteínas toxicas por parte del virus dentro de la célula o por la
acumulación de proteínas víricas que van a afectar la configuración
original de la célula; el virus al sintetizar sus proteínas impide que la célula

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sinteticé sus proteínas estructurales lo que provoca la degeneración de


esta hasta llegar a la muerte.
4.2. CORPÚSCULO: Un cambio característico de las células infectadas por virus
es la formación de cuerpos de inclusión identificables por microscopia
óptica con ayuda de tinciones. Dependiendo del virus estos cuerpos de
inclusión pueden ser simples o múltiples, grandes o pequeños, redondos o
irregulares, intranucleares o intracitoplasmáticos y acidófilos o basófilos;
estos cuerpos de inclusión son formados por acumulación de viriones o de
componentes virales como agregados cristalinos, es decir fábricas de virus
donde los componentes virales están siendo sintetizados; Estos cuerpos de
inclusión también pueden ser causados por agentes químicos y bacterias.
Ejemplo:(Corpúsculos de Negri-virus de la rabia).
4.3. FUSIÓN CELULAR: Es característica de la infección de monocapas celulares
por paramixovirus, herpes virus, coronavirus y poxvirus. Es la formación de
sincitios (policariocitos o células gigantes), esto se da por cambios en la
membrana celular que determinan la fusión de las células infectadas con
las células vecinas no infectadas.
4.4. INCORPORACIÓN DE ANTÍGENOS A LA MEMBRANA PLASMÁTICA: En
muchas infecciones víricas se insertan proteínas codificadas por el virus en
la membrana plasmática de las células infectadas por virus RNA por
ejemplo: influenza, paramixovirus y togavirus. Estas glicoproteínas víricas no
se insertan al azar en la membrana si no que indican el lugar en el que ha
de madurar el virus. Estos antígenos en la membrana constituyen la diana
para los mecanismos inmunitarios específicos del organismo los cuales
pueden destruir la célula antes de que se produzca un número significativo
de nuevos viriones.
4.5. MUERTE CELULAR: El evento terminal de muchas relaciones virus-célula es
la muerte celular causado por virus citocidas, la apariencia del daño
producido en los cultivos celulares es utilizado como criterio de
diagnóstico; la muerte celular puede ser causada por la suspensión de la
síntesis del ARN y de las proteínas del huésped lo que es incompatible con
la vida de este, otra causa puede ser el acumulo de proteínas virales
toxicas para la célula como las proteínas de la cápside, las proteínas de
viriones se congregan en grandes cristales agregados o en inclusiones que
distorsionan a la célula, otra causa es que las células infectadas se hinchan
bastante lo que provoca cambios en la permeabilidad de la membrana,
eventualmente las enzimas lisosomales de la célula se derraman en el
citoplasma dando lugar a la digestión autolítica de la célula.

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VII. RESULTADOS: OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

VIII. BIBLIOGRAFÍA
1. Carballal G, Oubiña J. Virología Médica. Ed. El ateneo. Argentina; 1998.
2. Díaz R., Gamazo C., López G. Manual práctico de virología. 2da Edición.
Editorial Masson. S.A. Barcelona; 1999.
3. Ruiz M., Santillán J., Morales E. Manual de Laboratorio de Virología. Facultad
de Química. Universidad Autónoma del estado de México. México D.F; 2012.

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PRÁCTICA No 05

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA OBSERVACIÓN DE ESTRUCTURAS FÚNGICAS: MICOSIS HUMANAS

SESIÓN 05 FECHA 02/10/2019 DURACIÓN 100 minutos

Identifica a los microorganismos de forma inequívoca


CAPACIDAD relacionándolos con su morfología y metabolismo trabajando
en equipo y respetando las opiniones de sus compañeros.

I. INTRODUCCIÓN
Las enfermedades micóticas han aumentado últimamente, sobre todo las de
tipo oportunista, ello ha significado la aparición de nuevas formas clínicas de
micosis, además de la presencia de nuevas especies fúngicas consideradas
antiguamente como no patógenas pero que excepcionalmente producían
enfermedad en individuos inmunodeprimidos. Diversos factores han permitido
la aparición de infecciones emergentes: cambios poblacionales, avances
tecnológicos y desarrollo económico de algunos países, permitiendo la
generalización de tratamientos médicos quirúrgicos invasivos, con
supervivencia de enfermos que difícilmente superaban procesos patológicos
y que favorecen el desarrollo de micosis sistémicas; nuevos mecanismos de
adaptación de algunos microorganismos que conlleva a la aparición de
resistencia a los antifúngicos e infección por VIH.
Actualmente se reconocen casi 400 especies de hongos causantes de micosis
sistémicas, las cuales constituyen un pequeño porcentaje del total de más de
100 000 especies catalogadas. Se prefiere mencionar un “comportamiento
oportunista” por parte del hongo, debido a que los patógenos primarios al
infectar a individuos inmunosuprimidos, se comportan con mayor agresividad,
originando infecciones sistémicas, diseminadas, de evolución aguda y mal
pronóstico. Las infecciones oportunistas se producen cuando los mecanismos
de defensa específicos e inespecíficos del huésped son ineficaces, mientras
que las sistémicas o diseminadas se producen cuando fallan los mecanismos
celulares de defensa. La mayoría de las micosis oportunistas siguen siendo
ocasionadas por las especies clásicas: Candida albicans, Aspergillus
fumigatus, Cryptococcus neoformans.
El aumento en la prevalencia de las infecciones fúngicas ha sido constante en
los últimos años, y se relaciona con el incremento de pacientes
inmunocomprometidos y con el uso generalizado de antimicrobianos, la
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utilización de inmunosupresores, maniobras diagnósticas invasoras y la


implantación de alimentación parenteral. Junto a estas micosis (oportunistas),
coexisten otras micosis primarias, causadas por hongos muy adaptados para
la supervivencia en los tejidos infectados. Algunas se comportan como micosis
profundas, y se caracterizan porque se distribuyen en determinadas zonas
geográficas, donde son endémicas. Otras, ubicuas, se caracterizan por
afectar a piel y mucosas: las dermatomicosis y candidosis de las mucosas. Con
menos frecuencia, se encuentran las micosis subcutáneas, caracterizadas por
la agresividad local y que suelen contar con antecedentes traumáticos que
justifican la inoculación del hongo.
El cultivo sigue siendo el "gold standard" del diagnóstico microbiológico, ya
que permite la identificación del agente etiológico y la realización del estudio
de sensibilidad. Sin embargo, no está exento de inconvenientes: la necesidad
de obtener muestras por métodos invasores, la posible contaminación de la
muestra, su dificultad para diferenciar fácilmente entre infección y
colonización, la baja sensibilidad que presenta y su lentitud para el
diagnóstico. Las pruebas de sensibilidad a los antifúngicos están basadas en
las técnicas de microdilución en caldo, que se desarrollaron para conocer la
actividad in vitro de los antibacterianos. Estas técnicas determinan la CMI
(concentración mínima inhibitoria), que se obtiene calculando porcentajes de
inhibición respecto a un control de crecimiento.
1. MICOSIS SUPERFICIALES
1.1. COSMÉTICAS: Son las que afectan la capa córnea de la piel y la
porción suprafolicular del cabello y vellos, generalmente
asintomáticas por la poca o nula respuesta inmune.
a. Pitiriasis versicolor: Producida por especies del hongo lipofíilico
Malassezia: M. furfur, M. globosa, M. obtusa, M. restricta, M.
slooffiae, M. sympodiales, hongo que puede ser colonizante de la
epidermis; se relaciona con la presencia de ciertos aminoácidos y
compuestos hidrófobos en la piel, así como la disminución del
recambio epitelial del estrato córneo.
b. Tiña negra palmar: Infección crónica del estrato córneo causada
por el hongo levaduriforme dematiáceo Phaeoannelomyces
wernekii, que consiste en lesiones maculares color oscuro
afectando principalmente las palmas de las manos y las plantas de
los pies, rara vez en la cara.
c. Piedra negra: Son nódulos duros, negros, adheridos a la porción
extrafolicular del cabello, producida por la forma sexual del hongo
Piedraia hortae.

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d. Piedra blanca. Son nódulos blandos de color blanquecino que se


pueden localizar en vellos de cejas, bigote o pelo escrotal y vulva,
al igual que en cabello de la cabeza. Es producida por
colonización de especies del hongo levaduriforme Trichosporum: T.
asteroides, T. beigelii, T. cutaneum, T. inkin, T. mucoides, T. ovoides,
T. pullulans. Este hongo también se ha asociado a fungemia en
pacientes inmunosuprimidos, especialmente VIH positivos.
1.2. CUTÁNEAS. Se refiere a una diversidad de cuadros clínicos en los que
están involucrados la piel y sus anexos. Las manifestaciones en piel son
prurito, eritema y descamación; en cuero cabelludo son alopecia e
invasión al cabello tipo endothrix, ectrothrix y tipo fávico; y en uñas,
onicomicosis.
a. Dermatofitosis: Producida por un grupo de hongos queratinolíticos
identificados como dermatofitos: Microsporum, Trichophyton,
Epidermophyton. Sus cuadros clínicos se denominan tiñas y se
encuentran entre las infecciones más prevalentes a nivel mundial y
son T. capitis y T. fávica (cuero cabelludo), T. barbae, T. córporis, T.
manum, T. ungium, T. cruris y T. pedis.
b. Dermatomicosis: Son infecciones crónicas que afectan la piel
altamente queratinizadas de palmas, plantas, uñas y espacios
interdigitales. Los cuadros clínicos son muy similares a las tiñas
producidas por dermatofitos, pero el tratamiento es diferente.
Dentro de los principales agentes etiológicos están los hongos
hialinos como el Scytalidium dimidiatum, S. hyalinum, Fusarium sp,
Aspergillus spp, especies de Cándida y especies del género
Phialophora, Curvularia, Alternaria, Bipolares, etc.
2. MICOSIS PROFUNDAS
2.1. SUBCUTANEAS: Son infecciones del tejido celular subcutáneo,
adquiridas por trauma con material contaminado por hongos
saprofitos ambientales. Afectan la dermis y epidermis y las
manifestaciones clínicas son crónicas; se pueden caracterizar por ser
inflamatorias y granulomatosas.
a. Esporotricosis: El hongo que la produce se denomina Sporothrix
schenkii. Después de un período de incubación de 15 a 30 días (se
ha reportado hasta 2 años) se produce una lesión nodular,
denominada chancro, en el tejido cutáneo y subcutáneo en el sitio
de inoculación.

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b. Cromoblastomicosis. Micosis producida por un grupo de hongos


dematiaceos, tales como Fonsecae pedrosoi, Fonsecae
compactum, Phialophora verrucosa, Cladosporum carrionii y
Rhinocladiella aquasperma.
c. Lobomicosis. Producida por el hongo Loboa loboi, con lesiones
crónicas tipo queloides en sitios anatómicos expuestos, como por
ejemplo la región sacra, miembros inferiores, superiores y región
auricular.
d. Rinosporidiasis. El agente etiológico no es un hongo, es un
microorganismo acuático perteneciente al reino Stromophila
denominado Rhinosporidium seeberii.
e. Eumicetomas. Infección de carácter crónico que se adquiere por
trauma con material contaminado por hongos como Madurella
mycetomatis y Exophiala sp.
f. Faeohifomicosis. Infección por inoculación traumática de hongos
dematiaceos, como por ejemplo Alternaria alternata, Bipolaris
spicifera, Curvularia geniculata, Exophiala jeanselmei, Exophiala
moniliae, Wangiella dermatitidis.
g. Hialohifomicosis. Infección por inoculación traumática de hongos
hialinos a nivel subcutáneo, pero también puede cursar con
compromiso sistémico. Los pacientes inmunocomprometidos los
pueden adquirir por vía aérea, por ejemplo infección por Fusarium
spp, y Aspergillus spp.

2.2. SISTÉMICAS
Este tipo de micosis se adquieren por inhalación de propágulos de los
hongos que están en el medio ambiente, muchas veces en nichos
ecológicos muy restringidos. Causan cuadros clínicos que dependen
del estado inmunológico del huésped y de la cantidad de propágulos
inhalados, y pueden ser desde cuadros asintomáticos inespecíficos,
hasta procesos pulmonares granulomatosos; en pacientes
inmunocomprometidos se manifiesta de forma generalizada.
a. Histoplasmosis. Es producida por el hongo Histoplasma capsulatum
variedad capsulatum, quien predomina en América, desde el sur
de Canadá hasta Argentina, y la variedad duboisii en el África; su
nicho son cuevas de murciélagos, gallineros y palomares.
b. Blastomicosis. Infección causada por Blastomyces dermatitidis,
cuyo nicho ecológico es el suelo de gallineros, corrales y establos,

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terrenos con alto contenido orgánico, abonados o con


deyecciones de animales, pH ácido y elevada humedad.
c. Coccidioidomicosis. Infección causada por Coccidioides inmitis en
zonas endémicas desde el sudoeste estadounidense, Centro
América, Venezuela, Paraguay hasta la Patagonia en Argentina.
La inhalación de artroconidios puede causar un cuadro pulmonar
con o sin diseminación sistémica principalmente en pacientes
inmunocomprometidos.
d. Paracoccidioidomicosis. Micosis granulomatosa producida por el
hongo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, restringido a zonas
boscosas de los grandes ríos y lagos del Brasil, Venezuela,
Colombia, Paraguay y norte de Argentina.
e. Criptococosis. Infección subaguda o crónica pulmonar o
meníngea causada por Cryptococcus neoformans, hongo ubicuo
en la naturaleza principalmente en excretas de palomas (variedad
neoformans y grubii) y detritus de árboles (variedad gatti). Las
levaduras desecadas y de menor tamaño son inhaladas, llegan a
espacios alveolares, pero el desarrollo de la enfermedad depende
de la respuesta del sistema inmune celular.
2.3. OPORTUNISTAS
Este tipo de micosis involucra especies de hongos que forman parte
de la microbiota ambiental o son comensales de la piel y mucosa, y
quienes habitualmente son eliminadas por el sistema inmune celular.
Cuando hay deficiencia de la respuesta inmune, alteraciones de la
flora bacteriana por suministro de antibióticos o la existencia de
enfermedades de base en el paciente, como por ejemplo la diabetes
o enfermedades mieloproliferativas con neutropenia, pueden causar
una infección diseminada fatal para el paciente.
a. Candidiasis sistémica: Es la micosis más frecuente. Es producida por
Candida albicans y otras especies del mismo género, capaces de
invadir sangre y otros órganos profundos. Las levaduras de Candida
son colonizadoras de la mucosa rectal, vaginal y bucal, por lo que
las infecciones pueden ser endógenas.
b. Aspergilosis sistémica: Es producida por especies del género
Aspergillus. Aspergillus fumigatus es el agente causal de más del
90% de los casos de aspergilosis invasora; se adquiere por
inhalación de conidios, que germinan e invaden los tejidos.

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c. Zigomicosis: Infecciones causadas por hongos pertenecientes a los


mucorales: Mucor spp, Rhizomucors spp, Rhizopus spp,
Cunninhanella spp, etc. Su hábitat es la materia orgánica en
descomposición. Causan cuadros principalmente subcutáneos..
d. Pneumocistosis: Neumonía causada por el hongo Pneumocystis
jiroveci y que afecta pacientes inmunocomprometidos,
principalmente VIH positivos.

II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO
 10 Microscopios ópticos
 02 Estereomicroscopios
 Láminas montadas con diferentes estructuras fúngicas.
 Placas de Petri con colonias de hongos (levadura y moho).
 Colorante azul de lactofenol.
 Hidróxido de potasio al 10%.

2.2. DEL ALUMNO


Individual
 Manual de prácticas, libreta de apuntes y lapicero.
 Guardapolvo limpio y barreras de bioseguridad: Guantes, mascarilla y
cofia.
 01 Marcador indeleble y 01 fosforo o encendedor.
Grupal
 Muestras biológicas con micosis humanas o de animales (uñas, pelo,
raspado de piel, exudados, etc).
 Estuche de disección.

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. PROCEDIMIENTO PARA LEVADURAS:
1. Cultivar Candida albicans en agar sabouraud por 96 horas a
temperatura ambiente.
2. Con la ayuda de un asa bacteriológica en anillo extraer una colonia y
realizar una extensión en un portaobjeto.
3. Asegurar la esterilidad del área de trabajo.
4. Realizar una coloración simple. También se puede observar en fresco
con azul de lactofenol.
5. Graficar las observaciones.

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3.2. PARA HONGOS QUERATINOLÍTICOS PRESENTE EN UÑAS:


1. Trabajar con el mechero encendido. Con la ayuda de un asa
bacteriológica en “L” colocar una pequeña cantidad de muestra
(uñas, pelos, raspado de piel, etc) sobre un portaobjeto limpio y
desengrasado.
2. Agregarle a la muestra una gota de hidróxido de potasio al 10%. Dejar
actuar de 3 a 5 minutos. Para aumentar contraste agregar una gota
de azul de lactofenol. Cubrir con una laminilla y observar al
microscopio con objetivos de 4x, 10x y 40x.
3. Buscar hifas de hongos como indicador de colonización fúngica.

IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Todo el material (vidrio, plástico, tela, etc) que tenga
contacto con microorganismos o muestras fúngicas provenientes de humanos
o animales debe ser esterilizado en autoclave a 121°C/15 libras de presión/15
minutos para su descarte o reutilización.

V. EVALUACIÓN
1. ¿Qué diferencia a un patógeno primario de un oportunista?
a. El patógeno primario sólo inicia la infección cuando ocurre interrupción
de las barreras de defensa;
b. El patógeno primario puede iniciar una infección en el huésped normal;
c. El patógeno primario no posee factores de virulencia;
d. El patógeno primario siempre forma parte de la flora de la piel.
2. En la patogénesis por hongos primarios, es correcto afirmar:
a. Los patógenos primarios sistémicos no son agentes de infecciones
respiratorias;
b. Poseen una fase saprofítica levaduriforme;
c. Poseen dimorfismo como una característica de virulencia;
d. Poseen una fase parasitaria filamentosa.
3. ¿Cuál es la línea de defensa más importante contra los hongos dimórficos
endémicos?
a. Linfocitos B pulmonares;
b. Neutrófilos pulmonares;
c. Macrófagos pulmonares;
b. Linfocitos T pulmonares.

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4. ¿Cuál es el factor de virulencia común para los patógenos fúngicos


primarios y los oportunistas?
a. Dimorfismo;
b. Puerta de entrada respiratoria;
c. Presencia de β-(1-3)-glucano en la pared celular;
b. Crecer a 37ºC.
5. Las concentraciones de progesterona y 17-β-estradiol estimulan el
crecimiento y la liberación de endosporas de:
a. Candida albicans;
b. Rhinosporidium seeberi;
c. Coccidioides immitis;
d. Prothoteca spp.
6. Señale la alternativa que presenta las tres líneas de defensa contra la
infección por Cryptococcus neoformans:
a. Macrófagos alveolares, células fagocíticas inflamatorias y respuestas de
linfocitos T;
b. Macrófagos alveolares, células fagocíticas inflamatorias y respuestas de
linfocitos B;
c. Macrófagos alveolares, células fagocíticas inflamatorias y respuestas de
linfocitos T y B;
d. Neutrófilos alveolares, células fagocíticas inflamatorias y respuestas de
linfocitos T y B.
7. La aspergilosis invasiva está altamente asociada a:
a. Neutropenia y déficit en la función neutrofílica;
b. Eosinopenia y déficit en la función neutrofílica;
c. Leucocitosis y déficit en la función fagocítica;
d. Linfopenia y déficit en la función neutrofílica.
8. El Histoplasma capsulatum parece poseer un importante mecanismo para
su supervivencia dentro del fagolisosoma. Señale la alternativa que
presenta ese mecanismo:
a. Capacidad de captar magnesio y calcio;
b. Capacidad de captar hierro y calcio;
c. Capacidad de captar hierro y zinc;
d. Capacidad de captar potasio y calcio.
9. ¿Cuáles son las ventajas del examen microscópico directo del material
clínico para el diagnóstico de la infección fúngica?
a. Bajo costo y diagnóstico en tiempo real;
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b. Toma de muestra fácil y transporte de las muestras en sobre lacrado;


c. Conservación del material en formol por largo tiempo y rapidez en el
diagnóstico;
d. No se necesita técnico para la toma de muestra e instrumental
adecuado.
10. ¿Por qué es importante saber cuál hongo está causando una infección
determinada?
a. Pronóstico y ciclo biológico;
b. Tratamiento y determinación de reservorios;
c. Identificar riesgo biológico;
d. Pronóstico y tratamiento.

VI. FUNDAMENTACIÓN
EXAMEN DIRECTO
El diagnóstico definitivo de la mayoría de las micosis requiere el aislamiento e
identificación del hongo a partir del cultivo, lo que supone con frecuencia,
varios días o semanas de dilación. Las muestras para estudio micológico
deben examinarse tanto macroscópica como microscópicamente.
El método más rápido para la detección de estructuras fúngicas en una
muestra clínica es el examen microscópico de la misma. Este examen puede
aportar, en ocasiones, un diagnóstico definitivo (pitiriasis versicolor) y en otras,
un diagnóstico de sospecha previo a la confirmación definitiva por cultivo.
Por lo tanto, es un procedimiento que debería realizarse en todos los
laboratorios ya que utiliza técnicas sencillas, permitiendo un cultivo mejor
dirigido, seleccionando los medios más apropiados. Sin embargo, si la muestra
es escasa, el cultivo debe ser prioritario. Las técnicas moleculares comienzan
a ser una realidad y permitirán un diagnóstico más rápido que el cultivo, si bien
están menos desarrolladas que para las bacterias o los virus.

6.1. OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA


Las muestras, antes de ser procesadas, tienen que observarse
macroscópicamente, en busca de material caseoso, purulento,
hemorrágico, necrótico o gránulos.

6.2. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA


El examen microscópico directo de una muestra clínica correctamente
tomada es el medio más simple y rápido de detectar una infección
fúngica. Cuando los elementos fúngicos están presentes en número
suficiente se puede establecer una orientación diagnóstica presuntiva,
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en ocasiones definitiva, y en pocos minutos informar al clínico, lo cual


permitirá la instauración temprana de una terapia antifúngica, siendo
éste uno de los factores esenciales en el pronóstico de las micosis en los
pacientes inmunocomprometidos.
La microscopía sigue siendo una de las herramientas más antiguas y útiles
del micólogo clínico. Con frecuencia los hongos tardan en desarrollar las
estructuras conidiógenas características para su identificación definitiva.
Por lo tanto, es de gran utilidad que a la vez que se inoculan los medios
de cultivo, se realicen las técnicas microscópicas que, en tiempo real
(menos de 10 min), puedan orientar de forma preliminar la etiología del
proceso.
El examen microscópico directo proporciona un diagnóstico definitivo si
se observan elementos fúngicos patognomónicos: cápsula de
Cryptococcus neoformans, células fumagoides en cromoblastomicosis,
levaduras pequeñas intracelulares de Histoplasma capsulatum,
quistes/ascas típicos de P. jiroveci, levaduras con brotes de base ancha
de Blastomyces dermatitidis, levaduras con gemación multipolar en
rueda de timón de Paracoccidiodes brasiliensis o las esférulas de
Coccidioides immitis.
En algunos casos, el diagnóstico microscópico puede ser la única
evidencia de infección fúngica y, en otros, su negatividad puede
sustentar la interpretación de aislamientos como contaminantes. La
escasez de la muestra es, en la práctica, la única razón para no efectuar
la observación microscópica en beneficio del cultivo.
El examen microscópico puede también orientar la técnica de cultivo
(medios, temperatura, tiempo de incubación, precauciones especiales
de bioseguridad) e, incluso, su inutilidad por tratarse de patógenos
enigmáticos no cultivables como Rhinosporidium seeberi, Lacazia loboi o
Pneumocystis jiroveci.
Los métodos usados para la visualización fúngica difieren en algunos
aspectos de los de las bacterias; el mayor tamaño de los hongos hace,
generalmente, innecesarios la tinción de frotis secos; en su lugar son más
utilizadas las preparaciones directas en fresco con o sin líquidos de
montaje y clarificación. La observación microscópica se realiza con bajo
aumento, seguida de alto aumento en seco y, si es necesario, con aceite
de inmersión.

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Tabla 1. Agentes etiológicos de micosis superficiales cutáneas y mucocutáneas

Tabla mostrando las características morfológicas de las diferentes especies de


hongos patógenos y su morfología.
In vivo: tal como se observa la morfología en una tinción en fresco y al directo de
la muestra;
In vitro: tal como se observa la morfología de un frotis en fresco del cultivo de la
misma muestra.

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Tabla 2. Agentes etiológicos de micosis profundas, subcutáneas y sistémicas

Leyenda:
In vivo: tal como se observa en una tinción al fresco y al directo de la muestra.
In vitro: tal como se observa la morfología de un frotis al fresco del cultivo de la
misma muestra.
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VII. RESULTADOS: OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

VIII. BIBLIOGRAFÍA
1. Cercenado E., Cantón R. Diagnóstico microbiológico y de la micosis y
estudios de sensibilidad a los antifúngicos. Sociedad Española de
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica; 2006.
2. Ministerio de Salud. Manual de procedimientos y técnicas de laboratorio
para la identificación de los principales hongos oportunistas causantes de
micosis humanas. Instituto Nacional de Salud serie de normas técnicas lima;
2007.
3. Koneman E. Diagnóstico Microbiológico. Panamericana 3ra. Ed. Buenos
Aires 2006: 426-9.
4. Arenas R. Dermatofitosis. Micología Médica. México: lnteramericana-
MacGraw-Hill. 2015: 57-76.

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PRÁCTICA No 06

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA OBSERVACIÓN PARÁSITOS DE IMPORTANCIA MÉDICA

SESIÓN 06 FECHA 09/10/2019 DURACIÓN 100 minutos

Identifica a los microorganismos de forma inequívoca


CAPACIDAD relacionándolos con su morfología y metabolismo trabajando
en equipo y respetando las opiniones de sus compañeros.

I. INTRODUCCIÓN
Los parásitos son organismos que requieren de otro organismo (un huésped u
hospedero) para vivir o por lo menos para completar una parte de su ciclo
vital. Son eucariotas y contienen estructuras y organelos similares a los de las
células humanas, presentan pared celular y se consideran animales. Por ello
es muy difícil crear antibióticos eficaces y seguros contra los parásitos, ya que
la mayor parte de los fármacos antiparasitarios ejercen algunos efectos
adversos en las células de los humanos.
Las enfermedades parasitarias constituyen un importante problema de salud
pública mundial. Su prevalencia es mayor en los países del tercer mundo,
donde afectan a millones de personas ya que están ligadas a la pobreza y a
las condiciones socio sanitarias precarias. En países desarrollados su incidencia
y gravedad se está incrementando debido al aumento de pacientes
inmunodeprimidos y la posible aparición de casos importados. Aunque los
microorganismos patógenos (virus, bacterias y hongos), también son parásitos,
éstos son estudiados por la microbiología. La parasitología es la ciencia que
estudia los protozoarios, los helmintos y los artrópodos parásitos.
Los protozoarios son organismos unicelulares, dentro de los cuales se
encuentran varios grupos parásitos:
 Apicomplexa (esporozoarios): se localizan en la sangre, los tejidos o en el
intestino, tienen reproducción sexual y asexual. Los más importantes son el
Plasmodium (paludismo), Pneumocystis (neumonía), Toxoplasma
(toxoplasmosis) y Cryptosporidium (cryptosporidiasis).
 Ciliophora (ciliados): Balantidium coli (causa disentería).
 Sarcomastigophora (flagelados y amebas): incluye los flagelados que se
encuentran en la sangre (Trypanosoma), tejido linfático (Leishmania) o
aparato digestivo (Giardia). Entre los sarcodina se tiene a Entamoeba

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histolytica (disentería amebiana), y a las amebas de vida libre


Acanhthamoeba y Naegleria. Cerca del 10 % de la población mundial está
infectada con E. histolytica, el paludismo es la causa principal de muerte
relacionada con enfermedades infecciosas en todo el mundo. La
neumonía por Pneumocystis carinii es la principal causa de muerte en
enfermos de SIDA.
Los Helmintos incluyen organismos metazoarios denominados gusanos
(redondos y planos) que miden desde unos mm hasta varios metros, aunque
sus huevos son microscópicos, así como algunas de sus larvas (etapas
juveniles). Los Helmintos son miembros de dos grupos:
 Nematelmintos (gusanos redondos), por ejemplo Ancylostoma, Ascaris,
Enterobius, Necator, Onchocerca, Strongyloides, Trichinella, Trichuris.
 Platelmintos (gusanos planos), como Taenia, Hymenolepis, Echinococcus,
Dipylidium, Fasciola. Todos las etapas de un parásito pueden ser
desarrolladas en un sólo huésped o en varios, o parte en un huésped y parte
en el medio ambiente. En el caso de los parásitos que desarrollan ciclo
sexual y asexual, se le denomina huésped intermediario a aquél donde
forma las etapas asexuales. Y huésped definitivo, donde desarrolla la etapa
sexual.
El parásito después de penetrar en el huésped se establece en un órgano
blanco o en tejidos. La mayoría de los parásitos que entran por ingestión de
alimentos o agua contaminados con heces (vía fecal-oral) pasan su ciclo de
vida en el aparato digestivo. Los que penetran de manera directa a través de
la piel o se introducen a través de un vector, infectan la sangre o los vasos
sanguíneos o establecen infecciones en los tejidos subcutáneos u órganos
principales, incluso en la médula ósea y en los tejidos linfáticos.

DIAGNÓSTICO DE PARÁSITOS EN EL LABORATORIO


Se basa sobre todo en el hallazgo del parásito en los tejidos infectados, en
heces y en líquidos corporales (sangre, L.C.R, orina, esputo y otros). Casi todos
los parásitos se pueden detectar en muestras de los tejidos infectados,
observadas al microscopio. Cuando el parásito es un protozoario, las muestras
se tiñen y se examinan al microscopio, donde se pueden detectar trofozoítos
(formas metabólicamente activas que se nutren del huésped) o quistes
(formas latentes). Cuando el agente infeccioso es un helminto, el diagnóstico
se basa en el hallazgo de huevos del gusano o de larvas en heces, microfilarias
en sangre, gusanos adultos en los tejidos subcutáneos o en el aparato
digestivo.

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II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO (POR MESA DE TRABAJO)
 03 Microscopios ópticos binoculares
 01 Estereomicroscopio
 Reactivo de Lugol parasitológico
 Solución salina fisiológica estéril (SSF).
2.2. DEL ALUMNO (Individual)
Individual
 Guardapolvo y barreras de bioseguridad: Guantes, mascarilla y cofia.
 01 Marcador indeleble y 01 fosforo o encendedor.
 01 Cámara fotográfica
Grupal
 Muestras de heces positivas para parásitos (solicitar en el área de
laboratorio de hospitales y centros de salud, o traer la algún familiar
que se encuentre parasitado y no esté medicado).
 01 caja de Láminas portaobjetos y 01 caja de laminillas cubreobjetos.
 Goteros descartables o pipetas Pasteur de plástico.
 250 mL de Solución Salina Fisiológica.

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. PREPARACIÓN EN FRESCO A PARTIR DE UNA MUESTRA DE HECES
1. Colocar en un portaobjetos limpio una gota de Lugol parasitológico y
una de solución salina fisiológica de forma equidistante en ambos
extremos de la lámina.
2. Suspender en cada gota una pequeñísima cantidad de heces y cubrir
con una laminilla evitando la formación de burbujas.
3. Observar al microscopio con objetivo de 40X.
4. Buscar quistes de protozoarios o huevos de helmintos.
5. Dibujar o fotografiar las observaciones.
3.2. Observación de Parásitos adultos.
1. Con la ayuda de una pinza retirar los especímenes de los frascos de
conservación con mucho cuidado, evitando romper o alterar alguna
de sus estructuras.
2. Colocarlas en una placa Petri y observar sus estructuras taxonómicas.
3. Si es necesario observarlas en el Estereomicroscopio.
4. Graficar o fotografiar las observaciones.

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IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Todo el material (vidrio, plástico, tela, etc) que tenga
contacto con microorganismos o muestras de heces con o sin parásitos
provenientes de humanos o animales debe ser esterilizado en autoclave a
121°C/15 libras de presión/15 minutos para su descarte o reutilización. Las
láminas portaobjeto y laminillas cubreobjeto utilizadas para las observaciones
de muestras de heces en fresco deben ser colocadas en un recipiente
conteniendo solución de hipoclorito de sodio al 2.5 % durante 30 min. Luego
lavar en agua corriente o eliminar como material punzocortante.
V. EVALUACIÓN
1. Parte de la morfología de los protozoarios afectada por el albendazol
a. Tubulina b. Endoplasma c. Ectoplasma d. Vacuolas e. Cuerpos
Cromatoidales
2. ¿Cuál no es característica de los Helmintos?
a. Ventosas b. Cutícula c. Secreción de sustancias líticas d. Aparato
respiratorio bien desarrollado e. Pseudocele
3. La formación de quistes de Entamoeba histolytica se da exclusivamente en:
a. Duodeno distal b. Apéndice cecal c. Yeyuno-Ileon d. Colon d. Pared
intestinal
4. En la Giardiasis esta disminuida la absorción de:
a. Vitamina C, B6, glucosa b. Vitamina A, B12, D-Xilosa b. Vitamina D y B1
c. Vitamina D, B12, D-Xilosa d. Glucosa, Sacarosa
5. El síndrome de Loeffler es causada por:
a. Ascaris lumbricoides b. Uncinarias c. Tricocéfalos d. Oxiuros b. a y b
6. ¿Qué estadio de Entamoeba histolytica es infectante por vía oral?
a. Trofozoíto b. Quistes c. Prequistes d. b y c e. Todos los señalados
7. ¿Cuál no es un protozoo intestinal?
a. Blastocistosis b. Uncinariasis c. Giardiasis d. Ciclosporiasis e. Sarcocistosis
8. El protozoo de mayor tamaño que afecta al hombre es:
a. Balantidium coli b. Blastocistis c. Giardiasis d. Criptosporidium e.
Ciclosporiasis
9. El diagnóstico clínico diferencial de Balantidiasis se hace con:
a. Amebiasis b. Tricocefalosis aguda c. Disentería bacilar d. Colitis
ulcerativa e. Todos los señalados
10. El principal mecanismo de acción patógena en Giardiasis es:
a. Alérgico b. Tóxico c. Mecánico d. Infeccioso e. Exfoliatriz
11. ¿Cuál no es un nematodo?
a. Oxiuros b. Tricocefalosis c. Balantidiasis d. Ascariasis e. Estrongiloidiasis

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12. La mitad de los casos de diarrea infecciosa son producidos por:


a. Rotavirus b. Escherichia coli enteropatógena c. Shigella d. Salmonella e.
ayb
13. Las diarreas de origen parasitario son producidas principalmente por,
excepto:
a. Entamoeba histolytica b. Giardia c. Trichuris d. Balantidium e. Yersenia
14. La patología de mayor gravedad se presenta por la migración de Ascaris
adultos a:
a. Apéndice b. Vías biliares c. Vías respiratorias d. Boca e. Fosas nasales
15. La infección de Trichomonas vaginalis en hombres y mujeres se limita a:
a. Sólo vagina b. Vulva y epidídimo c. Útero y vesículas seminales d. Sólo
próstata e. Vagina, cuello uterino, próstata y uretra
16. ¿Cuál no es características de los nematodos?
a. Cuerpo segmentado b. Sistema digestivo completo c. Sexos separados
d. Pseudocele e. Aparato reproductor muy desarrollado
17. El huésped definitivo de la mayoría de céstodos es:
a. Cerdo b. Hombre c. Perro d. Gato e. Vaca
18. La enfermedad del “sueño” está producido por:
a. Rizópodo b. Filaria c. Tripanosoma africano d. Nemantelmito e.
Esporozoario
19. La Fasciola hepática común en los animales herbívoros y frecuente en el
hombre pertenece a la clasificación de:
a. Filarias b. Trematodos c. Artrópodos d. Protozoarios e. Nematodos
20. Son características de los cestodos, excepto:
a. Son parásitos aplanados b. Escólex c. Rostelo d. Sistema nervioso bien
desarrollado e. Sin sistema circulatorio.
VI. FUNDAMENTACIÓN
6.1. EL LABORATORIO EN LA IDENTIFICACIÓN PARASITOLÓGICA
La confirmación de parásitos o sus productos de reproducción en
muestras de pacientes sospechosos clínicamente de tener una infección
o enfermedad de origen parasitario, se basa en la identificación
morfológica de los organismos causantes. Los criterios utilizados para este
reconocimiento e identificación deben ser del dominio de todo personal
de laboratorio, irrespectivamente de su formación profesional. Esto
debido a que el personal ocupa diferentes cargos en instituciones que
tienen sus exigencias particulares o cuando labora en hospitales públicos
o privados, rota por diferentes turnos de trabajo, sobre todo en aquellos
que mantienen una consulta durante 24 horas y debe estar preparado
para atender estas solicitudes.

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La aparición de nuevos métodos de diagnóstico laboratorial, tales como


pruebas moleculares e inmunoensayos, exigirá primero conocimientos
epidemiológicos sólidos de las parasitosis que prevalecen
geográficamente, para poder interpretar en países tropicales el
significado de estos resultados de manera correcta. Será indispensable,
a su vez, que el clínico sea capaz de interpretar la relevancia o no de
esos resultados, lo cual exigirá una formación sólida sobre la especialidad
de parasitología. Por los momentos, la identificación parasitológica
continuará dependiendo de la capacidad y confiabilidad del personal
de laboratorio en la identificación morfológica.
La recolección adecuada de muestras es crítica, ya sea para
confirmación o para realizar encuestas y estudios de investigación sobre
diferentes especies de parásitos del humano. Si esto no se cumple, los
parásitos o sus productos de identificación no serán detectados. A su vez,
para la observación microscópica será requisito la aplicación de técnicas
que permitan recobrar, concentrar, extraer, las formas diagnósticas
observables bajo el microscopio óptico con la menor alteración posible.
No es competencia de este Manual considerar cada uno de esos
aspectos, esto depende de las normas por las cuales se rigen los
laboratorios nacionales. Sin embargo, cada método incluye un párrafo
sobre la manera de recolectar la muestra para ejecutar esa técnica en
particular. Muchos de los métodos son los mismos que se utilizan en
encuestas epidemiológicas y en investigaciones puntuales.

6.2. PRINCIPIOS GENERALES PARA LA RECOLECCIÓN DE MUESTRAS DE HECES


PARA DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO
 Cuando las heces no se recogen de manera adecuada, los resultados
no son confiables. Heces viejas y no preservadas no tienen valor
diagnóstico. Heces refrigeradas no son recomendadas para buscar
larvas de helmintos como Strongyloides stercoralis. Para buscar
trofozoítos de protozoos se requiere que la muestra sea examinada
dentro de una hora o menos después de evacuada.
 Cuando hay moco y sangre debe incluirse esta porción, igual que
parásitos adultos, segmentos de estróbila de cestodos, otros.
 Debe evitarse dar antidiarreicos o antibióticos o antiparasitarios antes
del examen de heces; tampoco se acepta administración de laxantes
aceitosos, bario o bismuto antes de la recolección de la muestra.
 Se tratará de revisar las instrucciones de recolección de muestras según
parásito o método a aplicar en donde amerite.

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 Es práctica recomendada de informar al clínico por medio de


memoranda o avisos cada vez que se requiera recolección particular
de muestras al implementar nuevas metodologías.

6.3. REGLA DE ORO EN PARASITOLOGÍA


Recobrar, identificar y demostrar el parásito, o sus productos de
reproducción para determinar la etiología de la infección o enfermedad
parasitaria.

6.3.1. MÉTODOS DIRECTOS: Aquellos que identifican al parásito o sus


productos de reproducción. Ejemplo:
 Baermann: extrae larvas que se identifican a especie por
morfología.
 Flotación de Sheather: Concentra ooquistes de algunos
apicomplexa.
 Raspado de úlcera perineal: Demuestra trofozoítos de Entamoeba
histolytica en amebiasis cutis.
 Raspado de úlcera cutánea: Evidencia amastigotes de
Leishmania.
 Lavado bronquial: Demuestra estadios de Pneumocystis spp. en
algunas situaciones de inmunocompromiso.

6.3.2. MÉTODOS INDIRECTOS: Ofrecen resultados sugestivos de enfermedad


parasitaria pero no confirman el agente etiológico. Ejemplo:
 Inmunológicos: Hemaglutinación indirecta para tripanosomiasis
americana.
 Inmunohistoquímicos: Microsporidiosis.
 Radiografía de abdomen: Para visualizar intestinales en infección
aguda o crónica por Angiostrongylus costaricensis.
 Tomografía axial computarizada: Neurocisticercosis.
 Resonancia magnética: Absceso hepático amebiano.
 Péptidos sintéticos, otra tecnología biomolecular: Diferenciar
Trypanosoma cruzi de T. rangeli.
Ejemplos de muestra a enviar al laboratorio para demostrar parásitos
en general: Heces, sangre, LCR, biopsia de tejidos, aspirados, pus,
orina, secreciones, esputo, excreciones y otros líquidos.

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VII. RESULTADOS:
OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS

Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

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Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

Muestra:

Preparado:

Coloración:

Aumento:

Observación:

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OBSERVACIONES MICROSCÓPIAS

FORMA EVOLUTIVA: FORMA EVOLUTIVA:

ESPECIE: ESPECIE:

FORMA EVOLUTIVA: FORMA EVOLUTIVA:

ESPECIE: ESPECIE:

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FORMA EVOLUTIVA: FORMA EVOLUTIVA:

ESPECIE: ESPECIE:

VIII. BIBLIOGRAFÍA
1. Girard R. Manual de Parasitología: Técnicas para laboratorios de atención
primaria de salud y para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas
desatendidas. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional
Autónoma de Honduras. 3ra. Edición; 2014.
2. Haro I., Salazar P., Cabrera M. Diagnostico morfológico de las parasitosis.
Méndez editores; México D. F. 1995.
3. Atías A. Parasitología Médica. Edit. Mediterráneo. Santiago de Chile; 1999.
4. Biagi F. Enfermedades parasitarias. Edit. La Prensa Medica Mexicana. 17ª
reimpresión. México D.F; 2000.
5. Botero R. Parasitosis Humana. 4ta. Ed. Corporación Para Investigaciones
Biológicas. Medellín Colombia, 2.005.
6. Beaver. Parasitología Clínica. 3ra. Ed. Revisada. Masson Doyma Mexico, S.A.
2.003.

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PRÁCTICA No 07

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA ACCIÓN DE LOS AGENTES QUÍMICOS Y FÍSICOS SOBRE EL


CRECIMIENTO MICROBIANO

SESIÓN 07 FECHA 16/10/2019 DURACIÓN 100 minutos

Aplica sin error las medidas de bioseguridad durante las


CAPACIDAD prácticas de laboratorio con actitud positiva, respeto a la
opinión de sus compañeros y a su entorno.

I. INTRODUCCIÓN
A. AGENTES QUÍMICOS: Existen ciertas sustancias químicas que influyen
negativamente sobre las bacterias, pudiendo ejercer dos tipos de efectos
diferentes: Efecto Bacteriostático: cuando impiden el crecimiento
bacteriano; entiéndase como la inhibición de la reproducción bacteriana.
Y Efecto Bactericida: cuando destruyen (matan) a las bacterias.
Si nos referimos a cualquier tipo de microorganismos, hablamos
respectivamente de agentes microbiostáticos y microbicidas. Ahora bien,
para una misma sustancia química, la línea de demarcación entre un
efecto microbiostático y otro microbicida depende muchas veces de la
concentración de dicha sustancia y del tiempo durante el que actúa.
Pero ¿Cómo podemos saber que un microorganismo está “muerto”? El
único criterio válido es la pérdida irreversible de la capacidad de división
celular, es decir, de la pérdida de viabilidad, y se suele comprobar
empleando técnicas con placas de Petri (confirmando que no crecen en
medios sólidos adecuados). Antes de proceder al estudio de las diversas
moléculas que pueden afectar el crecimiento o la viabilidad de los
microorganismos, veamos unas cuantas definiciones básicas.
B. AGENTES ESTERILIZANTES: Son aquellos que producen la inactivación total de
todas las formas de vida microbiana (o sea, su “muerte” o pérdida
irreversible de su viabilidad).
C. AGENTES DESINFECTANTES (o germicidas): Son agentes (sobre todo
químicos) antimicrobianos capaces de matar los microorganismos
patógenos (infecciosos) de un material. Pueden (y en muchos casos suelen)
presentar efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por lo que se suelen emplear
sólo sobre materiales inertes.

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D. AGENTES ANTISÉPTICOS: Son sustancias químicas antimicrobianas que se


oponen a la sepsis o putrefacción de materiales vivos. Se trata de
desinfectantes con baja actividad tóxica hacia los tejidos vivos donde se
aplican.
E. AGENTES QUIMIOTERÁPICOS: Son compuestos químicos con actividad
microbicida o microbiostática, con una toxicidad suficientemente baja
como para permitir su administración a un organismo superior, en cuyos
fluidos corporales y tejidos permanece estable un cierto tiempo a
concentraciones tales que los hace eficaces como antimicrobianos dentro
del organismo.
Todos los días usamos agentes químicos para controlar el crecimiento
microbiano: detergentes y jabones para el cuerpo y la ropa, cloración de
las aguas potables, antisépticos para la piel y el tratamiento de heridas,
desinfectantes para tratar superficies en la industria y en los laboratorios,
quimioterápicos y antibióticos para tratar enfermedades bacterianas, etc.
F. AGENTES FÍSICOS: Las células procarióticas sufren los cambios ambientales
de un modo mucho más directo e inmediato que las células de los
organismos pluricelulares. A lo largo de miles de millones de años, los
procariotas han venido estando sometidas a diversas presiones
ambientales, y han respondido evolutivamente creando numerosos
mecanismos de adaptación. Actualmente, las únicas formas de vida
existentes en determinados ambientes extremos son exclusivamente
procarióticas. Desafiando a nuestras ideas preconcebidas de lo que es la
vida “normal”, encontramos extraordinarios seres vivos unicelulares viviendo
“cómodamente” a pHs muy ácidos o muy alcalinos, sumergidos en
salmueras y salinas, o reproduciéndose a temperaturas de más de 100ºC y
a grandes presiones. Este tipo de microorganismos que habitan medios que
los humanos consideramos como “extremos” reciben el calificativo de
extremófilos.
No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado
factor ambiental. Así, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas
para una especie bacteriana, y en cambio ser neutras o beneficiosas para
otra. Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales,
conviene distinguir entre los efectos que un determinado agente puede
tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden simplemente afectar al
crecimiento, a la capacidad de diferenciación (si la hubiera) o de
reproducción. Los principales tipos de factores físicos a considerar se
pueden desglosar de la siguiente manera: Temperatura desecación,
radiaciones, ondas sonoras, presión hidrostática, presión osmótica.

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II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO (POR MESA DE TRABAJO)
 12 Placas con agar Mueller-Hinton.
 Cultivo líquido de Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus y
Streptococcus mutans.
 Papel de filtro Whatman.
 Soluciones de fenol al 1%, alcohol al 70% y formol al 1%.
 06 Tubos estériles con 02 mL de caldo nutritivo.
 01 250 mL de agua destilada estéril.
 10 tubos de ensayo de 13 x 100 mL, estériles.
 06 beaker de 250 mL.
 03 Pinzas de metal.
 03 Mecheros de alcohol o Bunsen.
2.2. DEL ALUMNO
INDIVIDUAL
 Barreras de bioseguridad: Guantes, mascarilla y cofia.
 01 plumón marcador indeleble y 01 fosforo o encendedor.
GRUPAL
 100 mL de: Lejía, Jabón líquido bactericida, Poet, pineSol, Ayudín.
 01 paquete de hisopos de toma de muestra estériles.
 100 mL de: agua de caño, agua estancada y de agua oxigenada.

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. Efecto de la Temperatura: 70 oC.
Se proporcionarán cultivos de
dos microorganismos: S. mutans,
E. faecalis y S. aureus. Dividir la
placa con Mueller-Hinton como 0 5
indica la figura N° 1; tome una Minutos Minutos
muestra del tubo con el asa
10 15
bacteriológica para el tiempo 0,
Minutos Minutos
seguidamente colocar los
microorganismos en agua a 70
oC y tomar muestras a los 5, 10 y

15 minutos. Incubar a 37 °C por


24 horas.
Placa con Agar Mueller-Hinton

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3.2. ACCIÓN DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO BACTERIANO.


Según la cantidad de placas con medio Mueller-Hinton con las que se
cuenten por mesa sembrar en la tercera parte de ellas Staphylococcus
aureus, Enterococcus faecalis y Streptococcus mutans mediante la
técnica de dispersión en superficie con hisopo a partir de los cultivos
bacterianos que se encuentran en caldo.

Dividir la placa con un marcador indeleble en tres cuadrantes y rotular


cada cuadrante según el producto químico a colocar. Los compuestos
químicos se encuentran embebidos en discos de papel de filtro, los cuales
hay que colocar con la ayuda de una pinza de metal en el centro de
cada cuadrante correspondiente teniendo mucho cuidado de no
arrastrar el disco sobre el agar antes de colocarlo.

Realizar el mismo procedimiento con las soluciones desinfectantes traídas


de casa.
Observar las siguientes figuras:

DISCO DE PAPEL DE FILTRO

LEJÍA 5% FENOL 1%

JABÓN ALCOHOL 70%


BACTERICIDA

DESINFECTANTE FORMOL 10%

PLACAS CON AGAR MUELLER-HINTON

IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Todo el material (vidrio, plástico, tela, etc) que tenga
contacto con microorganismos o muestras de fluidos corporales provenientes
de humanos o animales debe ser esterilizado en autoclave a 121°C/15 libras
de presión/15 minutos para su descarte o reutilización.

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V. EVALUACIÓN
1. ¿Qué método es denominado la “esterilización definitiva”?
a. Radiación. b. Tindalización. c. Incineración. d. Uperización
2. ¿Qué desinfección puede ser esterilizante?
a. Aldehído fórmico. b. Clorhexidina. c. Hexaclorofeno. d. Permanganato
potásico.
3. ¿Qué desinfectante es activo incluso en presencia de materia orgánica?
a. Compuestos fenólicos. b. Compuestos yodados. c. Cloro y derivados.
4. Para un ciclo de esterilización de 20 minutos, Cuánto debe tardar el proceso
de inicio a fin.
a. Entre 20 y 30 min. b. Entre 50 y 70 min. c. Entre 90 y100 min. d. 120 y 130
min.
5. Respecto al alcohol etílico a 70º, señalar la respuesta incorrecta:
a. Se deshidrata favoreciendo la creación de esporas.
b. Es inflamable.
c. No es adecuado para desinfectar heridas abiertas.
d. Es antiséptico y desinfectante.
6. ¿Qué clasificación estableció Spaulding?
a. Clasificación de desinfectantes.
b. Clasificación del material por su peligrosidad infectiva.
c. Clasificación del material según su durabilidad.
d. Clasificación de la desinfección por su efectividad.
7. ¿Qué objetivo tiene el Test de Bowie-Dick?
a. Comprobar el buen funcionamiento del autoclave.
b. Comprobar que se ha realizado la esterilización.
c. Son correctas a) y b).
d. Todas son correctas.
8. ¿Cuál de los siguientes desinfectantes elimina el VIH?
a. Hipoclorito sódico. b. Permanganato potásico. c. Solución de lugol. d.
Alcohol etílico 70º.
9. Los compuestos yodados:
a. Actúan oxidando el citoplasma microbiano.
b. Tienen una acción muy rápida.
c. Su remanencia es alta.
d. Es idóneo para la desinfección del acero.

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10. Del cloro y sus derivados, ¿cuál es la forma más bactericida?


a. Hipoclorito sódico. b. Ácido hipocloroso. c. Lejía. d. Todas ellas tienen la
misma capacidad bactericida.
11. ¿Qué antiséptico lesiona la membrana bacteriana consiguiendo la
inhibición enzimática y coagulando las proteínas?
a. Iodofóros. b. Peróxido de hidrógeno. c. Formaldehído. d. Bisguanidas.
12. ¿Qué desinfectante tiene más potencia?
a. Solución acuosa al 8% de formaldehído.
b. Solución sólida al 2% de formaldehído.
c. Solución alcohólica al 8% de formaldehído.
d. Ninguna es correcta.
13. ¿Qué desinfectante realiza su actividad antimicrobiana rompiendo las
membranas y desnaturalizando las lipoproteínas?
a. Compuestos iodados. b. Compuestos catiónicos. c. Bisguanidas.
d. Peróxido de oxígeno.
14. Para que el autoclave esterilice correctamente, la relación vapor-agua ha
de ser:
a. 97% de agua. b. 97% de vapor. c. Menos de 97% de vapor. d. Más del
3% de agua.
15. ¿Qué antiséptico es el más adecuado para observar la evolución de una
herida?
a. Mercurocromo. b. Tiomersal. c. Povidona yodada. d. Clorhexidina.
16. ¿Cuál es un método físico de esterilización?
a. Flameado. b. Hervido. c. Radiación no ionizante. d. Ultrasonidos.
17. ¿Cuál no es una etapa del ciclo de esterilización del autoclave de vapor?
a. Igualación. b. Secado por vacío. c. Desinfección. d. Calentamiento.
18. ¿Qué es limpieza?
a. Proceso que elimina la suciedad orgánica
b. Proceso que elimina la suciedad orgánica e inorgánica
c. Proceso que elimina la suciedad con agua
d. Todas las anteriores
19. ¿Los métodos de limpieza para instrumental pueden ser?
a. Lavado manual b. Lavado mecánico c. Combinación manual-
mecánico d. Todas las anteriores
20. ¿La eliminación de microorganismos por los métodos de esterilización son?
a. Destrucción de las proteínas b. Destrucción del plasma c. Destrucción
de la pared celular d. Todas las anteriores

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VI. FUNDAMENTACIÓN
6.1. FACTORES QUE AFECTAN LA POTENCIA DE UN DESINFECTANTE
1. Concentración del agente y tiempo de actuación.
2. pH: El pH afecta tanto a la carga superficial neta de la bacteria como
al grado de ionización del agente. En general, las formas ionizadas de
los agentes disociables pasan mejor a través de las membranas
biológicas, y por lo tanto son más efectivos. Los agentes aniónicos
suelen ser más efectivos a pH ácidos, mientras que los agentes
catiónicos muestran más eficacia a pH alcalinos.
3. Temperatura. Normalmente, al aumentar la temperatura aumenta la
potencia de los desinfectantes. Para muchos agentes la subida de 10
grados supone duplicar la tasa de muerte.
4. Naturaleza del microorganismo y otros factores asociados a la
población microbiana:
 Según la especie empleada: p. ej., el bacilo tuberculoso resiste los
hipocloritos mejor que otras bacterias;
 Según la fase de cultivo;
 Dependiendo de la presencia de cápsulas o de esporas (suelen
conferir más resistencia);
 Dependiendo del número de microorganismos iniciales.
5. Presencia de materiales extraños: La existencia de materia orgánica en
el material a tratar (p. ej., sangre, suero, pus) afecta negativamente a
la potencia de los desinfectantes de tipo oxidante (como los
hipocloritos) y de tipo desnaturalizante de proteínas, hasta el punto
que pueden llegar a hacerlos inactivos en cuanto a su poder
desinfectante o esterilizante. Por lo tanto, para el empleo eficaz de
muchos desinfectantes hay que contar con este factor, determinando
previamente el gasto de materia orgánica inerte, o calculando la
potencia neta del desinfectante en presencia de la materia orgánica.
6.2. EFECTO LETAL DEL CALOR
Al subir la temperatura por encima de la temperatura máxima de
crecimiento, se dejan sentir los efectos sobre la viabilidad: la pérdida de
viabilidad significa que las bacterias dejan de ser capaces de crecer y
dividirse, aun cuando las transfiramos a un medio idóneo. ¿Cómo
podemos caracterizar o medir en la práctica la inactivación por calor de
una suspensión bacteriana? He aquí algunos parámetros utilizados:
 Tiempo térmico mortal: es el tiempo mínimo requerido para que
mueran todas las bacterias de una determinada suspensión a una
determinada temperatura;

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 Tiempo de reducción decimal: es el tiempo requerido para reducir al


10% la densidad de la suspensión, a una determinada temperatura
(también llamado valor D);
 Punto térmico mortal: es la temperatura mínima que mata a todas las
bacterias en un tiempo determinado (normalmente el tiempo de
referencia empleado es de 10 min).
Es importante tener claro que, dependiendo de la temperatura y el
tiempo a que sometamos un material a tratamiento térmico, lograremos
inactivación parcial de la población microbiana (es decir, queda una
fracción de células viables) o bien esterilización (=inactivación total).

VII. RESULTADOS
7.1. ACCIÓN DE LOS AGENTES FÍSICOS: TEMPERATURA
Para el efecto de la temperatura colocar los resultados (recuentos de
unidades formadoras de colonias UFC de cada cuadrante) en cuadros
de la siguiente manera:

BACTERIA (UFC) 0 min. 5 min. 10 min. 15 min.


Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Streptococcus mutans

7.2. ACCIÓN DE LOS AGENTES QUÍMICOS


Dibujar el halo de inhibición formado (expresar en mm) y colocar los
valores obtenidos en los cuadros siguientes:

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BACTERIA (UFC) Fenol 1% Formol 10% Alcohol 70% Lejía 5% Poet Jabón PineSol Ayudín

S. aureus

E. faecalis

S. mutans

VIII. BIBLIOGRAFÍA
1. Lañez E. Curso de Microbiología General. Departamento de Microbiología.
Facultad de Ciencias. Universidad de Granada. España; 2006.
2. Jawetz, E., Melnick J., Adelberg E. Microbiología Médica. 17ava edición.
Edit. El Manual Moderno, S.A., México D.F.; 2001.
3. Murray P., Rosenthal K. Microbiología Médica. 4ta. Edición. Edit. Elsevier
Science. Barcelona; 2002.
4. D'Aquino M, Rezk R. Desinfección, desinfectantes, desinfestantes, limpieza.
Editorial Eudeba. Bs. As. Rep. Argentina. 1995.
5. Industrias Hogner. Esterilizador automático por vapor de agua. Manual para
el usuario.
6. Manual de Patología quirúrgica. Pontificia universidad Católica de Chile -
Escuela de medicina. Capitulo Esterilización. 2008.
7. Cuoso A, Robilotti S. Esterilización hospitalaria. Vol. 2. Adecua. Bs.As. 2005.

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página 92


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PRÁCTICA No 08

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA PROTOCOLOS DE ASEPSIA EN ESTOMATOLOGÍA

SESIÓN 08 FECHA 23/10/2019 DURACIÓN 100 minutos

Aplica sin error las medidas de bioseguridad durante las


CAPACIDAD prácticas de laboratorio con actitud positiva, respeto a la
opinión de sus compañeros y a su entorno.

I. INTRODUCCIÓN
La infección cruzada se define como la transmisión de diversos agentes
infecciosos a distintos niveles: paciente-paciente, paciente-profesional
sanitario, o profesional sanitario-paciente. Las vías de contagio pueden ser por
contacto directo con sangre, fluidos orales u otras secreciones, por contacto
indirecto con superficies u objetos contaminados, o por inhalación de
aerosoles que contengan partículas infecciosas. Así pues, es fundamental
seguir un protocolo de control de la infección cruzada durante la práctica
odontológica, y aplicarlo a todos los pacientes por igual, considerándolos
como potencialmente infecciosos.
En EEUU los Center for Disease Control and Prevention (CDC) consideraron
conveniente adoptar ciertas medidas de seguridad al manejar sangre y
determinados fluidos orgánicos (como la saliva), ya que la identificación a
simple vista de individuos infectados por VIH o VHB, no es nada fiable. Estas
medidas pasaron a denominarse “Precauciones Universales”. Con esta
revisión se pretende proporcionar unos principios actualizados sobre asepsia y
recomendaciones generales. Protocolos sencillos de llevar a cabo de forma
continua en nuestra actividad diaria e indispensables para evitar que
aparezcan casos de infección cruzada en nuestra actividad clínica.
Hay que conocer y tener claro una serie de conceptos como son asepsia,
antisepsia, desinfección y esterilización. La asepsia es la ausencia total de
microorganismos infecciosos o estado libre de infección. La antisepsia es el
conjunto de métodos destinados a prevenir y combatir la misma, destruyendo
los microorganismos existentes en la superficie o interior de las cosas y/o los
seres vivos. Desinfección es la disminución o reducción de microorganismos en
un área, que incluye la destrucción de los gérmenes patógenos en estado
vegetativo o no esporulante, pero no incluye la destrucción de esporas, bacilo

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tuberculoso ni VHB o VIH. Por ello, solo se deben utilizar para controlar la
contaminación sobre superficies u objetos no esterilizables.
Por último, la esterilización supone la eliminación completa de todas las formas
microbianas, incluyendo las formas más resistentes como son las esporas
bacterianas. Representa el nivel más avanzado de control de infección y
contaminación. Los programas de control de infección cruzada, siguiendo los
parámetros de la asepsia, fueron desarrollados con el fin de evitar riesgos
profesionales y garantizar una protección total a nuestros pacientes. Se basan
en una serie de medidas preventivas eficaces como son las normas de higiene
personal, el uso de barreras de protección, la esterilización y desinfección
correcta de instrumentos y superficies, correcto manejo y tratamiento de los
instrumentos punzantes y desechos, así como la vacunación ante la hepatitis
B de los trabajadores sanitarios. Así mismo, es importante que el paciente esté
informado sobre los riesgos de infección y los métodos de los que disponemos
para combatirlos, consiguiendo así, que acuda a la consulta sin temor a
contagiarse de alguna enfermedad.
La finalidad de estas medidas es procurar que nuestros pacientes reciban
atención en un medio lo más aséptico posible para reducir al máximo la
posibilidad de contagio; así como de evitarlo durante la realización de los
tratamientos quirúrgicos. Todo ello se debe realizar y poner en práctica a todos
los niveles.

ASEPSIA DEL PACIENTE


Debido a la microflora oral propia de cada individuo, el área bucal no se
puede considerar un medio aséptico. Para reducir al máximo el número de
microorganismos presentes, se aconseja que antes de iniciar el tratamiento el
paciente realice un cepillado dental minucioso y enjuagues durante 30 - 60
segundos con una solución desinfectante, como por ejemplo clorhexidina a
una concentración de 0,12 – 0,2%.
En el caso que se vaya a realizar un procedimiento quirúrgico, se procederá
al aislamiento del campo operatorio colocando al paciente un gorro que le
recoja el pelo, una bata y una toalla sobre el pecho; preferiblemente estériles
y desechables. Además, se recomienda pincelar con povidona yodada el
área perilabial, para desinfectar y evitar contaminar los instrumentos que
entran en contacto con esa zona. Por último, es importante que siempre que
se prevea la formación de aerosoles se debe proporcionar al paciente unas
gafas protectoras, ya que la mucosa ocular puede ser puerta de entrada para
diversos agentes infecciosos.

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ASEPSIA DE LOS PROFESIONALES SANITARIOS


Las medidas preventivas las deben desarrollar tanto odontólogos como
higienistas o auxiliares. Según diversos estudios, el paciente percibe estas
barreras de modo satisfactorio, es decir, se siente más cómodo y seguro ante
la amenaza de cualquier tipo de contagio. De hecho, si un odontólogo no usa
estas protecciones puede ser interpretado como un signo de falta de
profesionalidad por subestimar la importancia del control de las infecciones.
Es aconsejable que todo el personal que pueda tener contacto directo o
indirecto con sangre o saliva esté vacunado contra el virus de la hepatitis B y
se revacune cada 5 años aproximadamente. Otro tipo de vacunas
recomendables son la del tétanos, que requiere dosis de recuerdo cada 10
años, y la de la gripe de forma anual.
La protección de las manos incluye tanto el uso de guantes como el lavado y
cuidado de las mismas. Hay que procurar mantener la piel hidratada y las uñas
cortas, no llevar anillos ni otras joyas, y si existe alguna herida cubrirla con
apósitos impermeables. Las manos se deben lavar al principio y final de la
jornada laboral y entre pacientes, una vez desechados los guantes usados y
antes de iniciar el siguiente tratamiento. Se usará jabón líquido desinfectante
y cepillo de uñas; a continuación, se aclararan con agua fría (ya que el agua
caliente abre los poros de la piel) y se secaran con toallas de papel
desechables esforzándose en las zonas interdigitales, ya que son más
propensas a permanecer húmedas y por tanto a irritarse y a permitir la
proliferación de microorganismos una vez colocados los guantes. Es
conveniente que el caño sea de pedal o disponga de un mango largo que
permita manejarlo sin tener que tocarlo con las manos contaminadas.
En la década de los 80, para actos de exploración era posible reutilizar los
guantes entre pacientes, siempre y cuando estuvieran intactos y fueran
desinfectados. Actualmente, está demostrado que constituyen el elemento
de barrera de protección más importante, a pesar de que no evitan
accidentes con objetos punzantes o afilados. De hecho, reducen al menos en
un 50% la carga de sangre transmitida tras un pinchazo o corte accidental;
esto se debe tener en cuenta, ya que la probabilidad de adquirir una
enfermedad infecciosa transmitida por vía sanguínea depende en gran
medida de la cantidad de microorganismos inoculada. Por tanto, es
obligatorio colocarse guantes en cualquier acto de operatoria, si se trata de
exploración clínica u otros tratamientos no invasivos es suficiente con utilizar
unos no estériles de látex o vinilo; sin embargo, ante un procedimiento
quirúrgico se deben usar siempre estériles, para reducir al máximo la
probabilidad de contaminación en el campo operatorio.

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En el caso de guantes no estériles se pueden desinfectar con una solución


alcohólica con el fin de evitar la posible contaminación que puedan haber
sufrido durante el proceso de fabricación. Por último, en el caso de los
pacientes de alto riesgo, como los infectados por VIH o hepatitis B o C, se
aconseja el uso de doble guante para asegurar una mayor protección.
Al finalizar cada tratamiento los guantes se deben desechar; bajo ningún
concepto pueden reutilizarse, porque al lavarlos o desinfectarlos pierden su
capacidad protectora. Igualmente han de cambiarse si se rasgan durante la
actividad clínica o si resultan defectuosos. También se ha establecido que a
partir de dos horas de uso continuado es más probable que aparezcan
anomalías y no hay garantía de que permanezcan totalmente íntegros. Las
características que buscaremos al elegir los guantes son: que queden
ajustados para evitar la fatiga manual, de superficie no deslizante, que no
dificulten la sensibilidad al tacto, y que no tengan ni olor ni sabores
desagradables para el paciente. Así mismo, es preferible que sean
hipoalérgicos, es decir, que contengan una baja cantidad de aceleradores
residuales como en proteínas del látex, estas últimas suelen ser las causantes
de reacciones alérgicas (como por ejemplo edemas, urticaria o picazón); y los
aceleradores residuales y el polvo que llevan en el interior pueden provocar
dermatitis de contacto.
Otra medida protectora que debe usar el odontólogo y sus ayudantes durante
su actividad profesional son las mascarillas, ya que evitan la inhalación de
aerosoles o salpicaduras contaminadas a través de la cavidad oral o nasal de
los sanitarios. Las de papel son ineficaces porque no poseen ningún tipo de
filtro, por eso se recomiendan las que incorporan filtros de polipropileno, que
permiten respirar sin dificultad a la vez que impiden el paso de partículas y
humedad. Se debe cambiar entre pacientes y desechar cada vez que se
humedezca, ya que esa zona es una puerta de entrada para los
microorganismos, así pues se colocara de forma que no contacte con labios
ni narinas. Además, deben quedar ajustadas a la nariz para producir menos
vaho en las gafas de protección. Siguiendo esta línea, algunos autores
recomiendan las rectangulares con barra nasal ajustable frente a las rígidas
preformadas, además de haber mostrado mejores resultados respecto a la
filtración bacteriana.
Para evitar cualquier traumatismo ocular o infección a través de la mucosa
conjuntiva se emplean las gafas protectoras o bien la máscara facial. Es
imprescindible usarlas cuando se prevea que se van a generar spray o
aerosoles. Deben ser de policarbonato, ofrecer protección total, tanto frontal
como lateral, y a ser posible con propiedades de antivaho y antirayado.

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La ventaja que presenta la máscara facial es que ofrece un mayor campo de


protección respecto al de las gafas, pero, no exime del empleo de mascarilla.
Debido a su composición no se pueden esterilizar en el autoclave, así que se
aconseja limpiar con agua y jabón primero y una vez secas frotarlas con
toallitas impregnadas en desinfectante. Esto se debe hacer al finalizar cada
tratamiento.
Respecto a la indumentaria, no hay que llevar la misma ropa ni calzado que
en la calle para evitar el trasiego de microorganismos desde el exterior y que
se puedan desencadenar infecciones. El uniforme, tanto si es guardapolvo o
uniforme, debe ser cómodo y holgado para permitir la libertad de
movimientos, los tejidos recomendados son el tergal y el algodón ya que son
capaces de resistir las altas temperaturas de lavado, la lejía y las condiciones
de la esterilización. Es recomendable cambiarlo diariamente o siempre que
esté visiblemente manchado. En el caso de la cirugía, para garantizar la
asepsia es obligatorio usar guardapolvo, gorros y polainas estériles
descartables, y desecharlos al finalizar el tratamiento.

ASEPSIA DE INSTRUMENTAL
El mejor medio para evitar desencadenar una posible infección cruzada a
nivel del material es usarlo desechable siempre que sea posible. En el caso del
resto de instrumental antes de reutilizarlo se debe eliminar toda la
contaminación que puedan presentar, y para conseguirlo sólo hay que seguir
el protocolo adecuado. En función de la necesidad de descontaminación
podemos clasificar los objetos en críticos, semicríticos y no críticos. Los críticos
son aquellos que penetran en los tejidos o contactan con sangre o mucosas
no intactas; por ello, tras su uso deben ser siempre esterilizados,
preferiblemente en autoclave. Los semicríticos son los que entran en contacto
con mucosas íntegras, pero al estar expuestos a saliva se aconseja esterilizarlos
igualmente. Sólo en el caso que puedan dañarse por el calor del autoclave,
se deben desinfectar con glutaraldehido. Por último, los objetos que no se
introducen en la cavidad oral pero que por cercanía están expuestos a
salpicaduras de sangre o saliva, aerosoles o al contacto con manos
contaminadas representan el material no crítico, con lo que será suficiente
con someterlos simplemente a la desinfección química.
El protocolo recomendado a cerca de la manipulación del instrumental crítico
y semicrítico contaminado se basa en una serie de fases y procesos que una
vez cumplidos garantizan la asepsia. En primer lugar, una vez finalizado el
tratamiento, inmediatamente el instrumental se sumerge en un baño con
solución desinfectante, para impedir que la sangre, saliva u otros restos se
sequen en el material y así facilitar su limpieza posterior.

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La presencia de restos de sangre y detritus protegen los microorganismos de


la penetración del vapor del autoclave, y por tanto no se logra una total
esterilización. El agente desinfectante ideal es el glutaraldehido porque
presenta un amplio espectro, eliminando los microorganismos por alquilación,
alterando la síntesis proteica de sus ácidos nucleicos. Se puede emplear a una
concentración del 2% durante aproximadamente 25 minutos o al 3% durante
una hora. Su único inconveniente es que es tóxico e irritante para piel y
mucosas. Además, hay que tener en cuenta que la solución de gluteraldehido
se activa alcalinizándola con polvo o líquido amortiguador, y se debe cambiar
al cabo de quince días aproximadamente o cuando se observe turbia.
También se puede controlar con indicadores químicos en forma de tiras que
señalan cuando la concentración desciende por debajo de su valor eficaz.
Otro desinfectante recomendado es el ácido peracético, combinación de
ácido acético al 35% con peróxido de hidrógeno, que actúa por oxidación
desnaturalizando las proteínas de los gérmenes. Su concentración idónea es
de 0,1-0,2% en 10-15 minutos. No necesita activación ni produce residuos
tóxicos, pero puede corroer metales y se debe diluir en el momento de usarlo.
Tanto el glutaraldehido como el ácido peracético son agentes químicos que
ofrecen una desinfección de alto nivel, es decir, que eliminan todos los
microorganismos y algunas esporas bacterianas. Por ello se aconsejan usar
estos desinfectantes en el material termosensible frente a los alcoholes, los
compuestos halogenados (clorados y yodados) o los compuestos de amonio
cuaternario, ya que únicamente logran una desinfección de nivel bajo o
intermedio. A continuación, se debe limpiar cualquier resto orgánico que
pueda haber quedado sobre la superficie de los instrumentos. Esto se puede
llevar a cabo mediante el lavado manual con cepillo, o bien utilizando la cuba
de ultrasonidos.
En el caso del primero es obligatorio usar guantes de goma domésticos
resistentes, para disminuir el riesgo de pinchazos y cortes con el material
contaminado. De todas formas es más aconsejable el uso de ultrasonidos por
ser más seguro ya que permite una limpieza que no requiere manipular el
material con las manos, reduciendo la posibilidad de pinchazos y cortes
accidentales. La cuba de ultrasonidos es un microvibrador que contiene una
solución enzimática detergente y desincrustante, que al generar ondas
permite una limpieza mucho más eficaz del instrumental que la manual. El
tiempo necesario variará de 5 a 15 minutos en función del grado de suciedad
que presenten los objetos, una vez finalizado se inspeccionarán los
instrumentos y si siguen sucios se repasarán a mano con el cepillo.

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La eficacia de los ultrasonidos puede potenciarse si la solución que


introducimos tiene como base el glutaraldehido, logrando una limpieza
adecuada en menos tiempo.
Tanto de una forma u otra, tras la limpieza se procederá al aclarado con agua
abundante para eliminar el desinfectante; y después, inmediatamente, se
deben secar los instrumentos con papel absorbente para evitar la corrosión.
Además, hay zonas como las junturas de fórceps, pinzas o tijeras, que se deben
engrasar para evitar que se oxiden. Una vez el material ya está limpio, y antes
de esterilizarlo, se debe empaquetar para protegerlo de la contaminación
posterior, ya que una vez sale del autoclave deja de ser estéril y simplemente
está desinfectado.
Además, el material embolsado es una evidencia para el paciente de que se
cumplen las normas asépticas. Los paquetes utilizados tienen una cara de
plástico transparente que permite mostrar el contenido y otra cara de papel
a través de cuyo poro penetra el vapor del autoclave, la cual debe ser
impermeable a las bacterias. El siguiente paso es introducir el material
empaquetado en el autoclave para lograr la eliminación total de los
microorganismos presentes. Este método de esterilización por calor húmedo
se basa en vapor saturado a presión que penetra en las formas
microorgánicas provocando la desnaturalización y coagulación de sus
enzimas y proteínas.
Es preferible a otros métodos como el horno de aire caliente, el quimiclave o
el óxido de etileno, por ser el más eficaz y rápido, además de no deteriorar la
mayoría de materiales (metales y textiles). Es fundamental monitorizar el
proceso para asegurarnos que se alcanza la esterilización. Para ello se pueden
emplear indicadores físicos, químicos o biológicos. Los de tipo físico consisten
en un control visual de los valores de temperatura, tiempo y presión mientras
dure el proceso; sin embargo, esto resulta poco práctico y no se puede
demostrar que se cumplan en el interior del aparato.
Los químicos son unas tiras de papel que viran de color bajo ciertas
condiciones de presión y temperatura; el problema es que sólo indican que
en algún momento se alcanzan esas condiciones, pero no garantiza que se
mantengan durante todo el ciclo. Los indicadores más eficaces son los
biológicos porque son tiras de papel impregnadas con esporas bacterianas
no patógenas que crecen en cultivo si fracasa la esterilización. Se presentan
en sobres y cápsulas, es preferible utilizar las últimas porque el cultivo se realiza
en una incubadora en 48 horas, mientras que con el sistema de sobres el
cultivo se realiza posteriormente con lo que aumenta la posibilidad de que
aparezcan falsos negativos.

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Así pues, se aconseja emplear los indicadores químicos de forma rutinaria en


cada ciclo de esterilización, debido a su sencillez; y los biológicos
semanalmente y siempre y cuando se use un nuevo sistema de bolsas, un
nuevo autoclave o tras la reparación del mismo. Para finalizar, el material
estéril y empaquetado se debe almacenar en un lugar adecuado donde
estén protegidos de la contaminación externa, y es aconsejable indicar sobre
el papel la fecha en la que se ha introducido en el autoclave.
Es muy difícil determinar el tiempo que permanece estéril el instrumental
empaquetado, los estudios que se han realizado sobre este tema establecen
que la esterilidad podría mantenerse indefinidamente siempre y cuando se
almacenara en unas condiciones en las que no se comprometa su integridad.
Causas externas como desgarros, pinchazos, humedades o algún contacto
con fluidos pueden provocar la contaminación del paquete,
independientemente del factor tiempo. Establecer una media de período de
tiempo de esterilidad es complicado, ya que en este punto no hay consenso,
algunos autores consideran que se mantiene durante 2 o 6 meses, y en otros
estudios se concluyó como válido el período de 1 año.
Durante muchos años ha habido grandes dudas sobre el correcto manejo del
instrumental rotatorio, clásicamente para evitar su deterioro solo se procedía
a la desinfección externa, pero con los avances tecnológicos actualmente no
hay riesgo de avería; por lo que se debe esterilizar siempre. La secuencia a
seguir sería hacer funcionar el circuito aire-agua del equipo durante 15-20
segundos, después se limpia la superficie externa con agua y jabón, sin
sumergirlo en el ultrasonidos. Una vez seco se procede a la esterilización, en el
autoclave sin ciclo de secado y con el cabezal más alto que el cuerpo, para
evitar que el agua de condensación penetre en el cabezal. Por último, el
material rotatorio se engrasa y embolsa, no se engrasa antes porque el calor
degrada el aceite y se empaqueta al final del proceso para evitar que la
humedad pueda corroer el interior de los cabezales.
Las jeringas de triple uso que se comercializan actualmente no son
esterilizables, habiendo riesgo de contaminación cruzada por contacto
directo con fluidos o por reflujo al interior del mismo al dejar de presionar el
botón. Por ello, se recomienda emplear cánulas desechables o que sean
desmontables y esterilizables. Una variante del protocolo se debe aplicar en el
caso de los materiales que no toleran la esterilización por calor, como los que
contienen caucho y plástico; y siempre que no sean punzantes o cortantes.
En este caso el objeto contaminado se sumerge inmediatamente en una
solución de gluteraldehido al 3% durante 10 horas o bien glutaraldehido
fenolato al 2% que tan sólo necesita 6 horas y 45 minutos.

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A continuación se aclara con agua estéril o alcohol, se seca y se almacena.


Estas soluciones son muy eficaces y no corrosivas, sin embargo, son irritantes y
despiden vapor tóxico, por eso debe mantenerse siempre cubierto con la
tapa. El mayor inconveniente que presenta es que este proceso no se puede
monitorizar, por tanto este método se debe aplicar únicamente a instrumental
crítico y semicrítico que se estropea con el autoclave.

ASEPSIA DEL EQUIPO Y SUPERFICIES


Las superficies del área operativa se contaminan por contacto directo o
aerosoles y pueden servir como vía indirecta de transmisión de la infección
cruzada. Por tanto, al finalizar cada tratamiento se procederá a la
desinfección de las probables superficies contaminadas. Los desinfectantes
recomendables son los que contienen una base de glutaraldehido a solas o
combinada con alcoholes, ya que son los más eficaces y no perjudican
metales ni plásticos o caucho, debido a su toxicidad, se deben utilizar guantes
y mascarillas. Cualquier desinfectante es más eficaz si se usa sobre superficies
previamente limpias, porque ya se han eliminado los restos orgánicos.
Por ello, la secuencia a seguir consiste en primer lugar en aplicar el
desinfectante, preferiblemente en forma de spray y frotar enérgicamente
hasta que queden limpias. Después se vuelve a pulverizar y se deja humedecer
durante unos 3 minutos, con lo que se logra la desinfección. De todas formas,
siempre es preferible limitar las superficies contaminadas a tener que
desinfectarlas después. Para ello, previamente hay que dispensar todo el
material que pueda ser necesario durante el tratamiento, y el odontólogo
procurará evitar tocar objetos innecesarios. Así mismo, se recomienda usar
fundas o sobreguantes de plástico para proteger las superficies que se vayan
a tocar durante el tratamiento, como por ejemplo, la bancada de los muebles
del gabinete, el cono de rayos X, el asa de la lámpara o los mandos del sillón.
Un tema controvertido es la posibilidad de contaminación del agua del
equipo dental. Esto es debido al pequeño diámetro de los conductos del
mismo, que representan un medio ideal para que se forme una biopelícula
compuesta por los microorganismos procedentes de la boca de los pacientes
y del sistema de aguas públicas. Generalmente se trata de bacterias
ambientales no patógenas, aunque se han aislado formas patógenas y
oportunistas como Legionella, Pseudomonas y Mycobacterias. Así pues, el
biofilm actúa como reservorio de gérmenes aumentando la cantidad
presente en el circuito del agua del equipo.

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En el momento en que se produzca una disminución repentina de la presión


del agua los fluidos corporales pueden ser aspirados desde la boca del
paciente, en este caso habría un posible riesgo de transmisión de gérmenes
entre personas que usen el mismo sistema de agua. Pero realmente, este
intercambio a través del agua no se reconoce como un problema de salud
pública, ya que la evidencia científica demuestra que la ruta de contagio de
virus sanguíneos, como el VIH o el VHB, es a través del contacto íntimo con
sangre o fluidos potencialmente infecciosos. Por tanto, la infección a través de
cualquier fuente de agua es improbable; además, estos microorganismos son
incapaces de reproducirse fuera del huésped. De todos modos, el hecho de
introducir microorganismos en la boca del paciente es indefendible según los
parámetros de asepsia.
Organismos como la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Asociación
Dental Americana (ADA) y el CDC pretenden que en el agua del equipo no
se superen las 200 UFC/ml en el caso de los tratamientos no quirúrgicos, para
garantizar la calidad de la misma. Esto se basa en los valores estándar
empleados en la hemodiálisis. Para lograrlo se proponen unas estrategias de
prevención como son las de cambiar periódicamente las válvulas antireflujo
tanto del material rotatorio como del de la jeringa de aire-agua, emplear
reservorios de agua destilada independientes a las del sistema público, la
desinfección química de los filtros y conductos del equipo, y además purgar y
drenar el aire del compresor diariamente. Sin embargo, no hay datos
suficientes para establecer la eficacia de cada uno de los métodos, la
información pre-eliminar sugiere que ninguno puede erradicar
completamente el biofilm, por ello se recomienda combinarlas.
II. MATERIALES
No se requerirán materiales para esta práctica.
III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
El estudiante analizará la información teórica proporcionada para elaborar un
protocolo de limpieza, desinfección y esterilización de instrumental
odontológico, unidades dentales y equipo radiográfico.
IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD
Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Todo el material (vidrio, plástico, tela, etc) que tenga
contacto con microorganismos o muestras de fluidos corporales provenientes
de humanos o animales debe ser esterilizado en autoclave a 121°C/15 libras
de presión/15 minutos para su descarte o reutilización.

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V. RESULTADOS
Elabora un protocolo de asepsia (en una hoja aparte) para el instrumental,
la unidad dental y el equipo radiográfico en la práctica clínica
estomatológica utilizando el método científico y bibliografía actualizada.

VI. BIBLIOGRAFÍA
1. Araujo M, Andreana S. Riesgo y prevención de la transmisión de
enfermedades infecciosas en odontología. Quintessence (ed. Esp.) 2003;
16:603-10.
2. Lozano V. Control de las infecciones cruzadas en odontología. Madrid:
Ediciones Avances; 2000. p. 93-153.
3. Ministerio de Sanidad y Consumo. Plan Nacional sobre el SIDA. Prevención
de la infección por virus de transmisión sanguínea (VIH, VHB, VHC)en
odontoestomatología. Madrid; 2001.
4. Molinari J. Practical infection control for the 1990s. J Am Dent Assoc 1994;
125: 1189-97.
5. Molinari J. Infection control: its evolution to the current standard precautions.
J Am Dent Assoc 2003; 134: 569-74.
6. Porta J.Asepsia en odontología. Barcelona: Collegi Oficial d’Odontòlegs i
Estomatòlegs de Catalunya; 1994. p. 7-29, 37-38
7. Organización Mundial de la Salud. Manual de bioseguridad en el laboratorio
[internet]. 3ra edición. Ginebra; 2005
8. Ministerio de Salud del Perú. Bioseguridad en centros y puestos de Salud.
Programa Salud Básica Para Todos. Lima; 2003.
9. Ministerio de Salud del Perú. Manual de bioseguridad. Sistema de Gestión
de la Calidad del PROMAHEBAS [internet]. Lima; 2004.
10. Albornoz E, Mata M, Tovar V, Guerra M. Barreras protectoras utilizadas por
los estudiantes de post-grado de la Facultad de Odontología de la
Universidad Central de Venezuela. Julio- agosto 2004. Acta Odontol Venez.
2008;46(2):1-7.
11. Antunes D, Vergara C, Caballero A, Murta Z. Accidentes con material
biológico entre estudiantes universitarios de odontología. Rev Clín Med Fam.
2011;4(1):19-24.

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PRÁCTICA No 09

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS INMUNOLÓGICAS Y REACCIÓN


ANTÍGENO - ANTICUERPO

SESIÓN 09 FECHA 30/10/2019 DURACIÓN 100 minutos

Aplica sin error las medidas de bioseguridad durante las


CAPACIDAD prácticas de laboratorio con actitud positiva, respeto a la
opinión de sus compañeros y a su entorno.

I. INTRODUCCIÓN

CÉLULAS INMUNOLÓGICAS

Paul Ehrlich fue el primero en utilizar colorantes simples de anilina, aunque sus
preparados ya no se utilizan en la actualidad. Lanner en 1889, encontró que
el precipitado obtenido por la mezcla de eosina y azul de metileno podía
disolverse en alcohol metílico para formar un colorante útil, que combinaba
algunas propiedades de los dos colorantes iniciales. Romanowsky, 1890,
encontró que al mezclar una solución de azul de metileno madura, con eosina
(policromía), y disolviendo el precipitado en alcohol metílico, se obtenía un
colorante de uso más amplio que el de Lanner, que podía teñir los núcleos
celulares y los gránulos de las plaquetas (a los que la mezcla de Lanner no
coloreaba).
Colorantes modernos a los de Romanowsky; por ejemplo, los colorantes de
Wright, Leishman, etc., son semejantes, en principio, al método original de
Romanowsky, la diferencia principal estriba en el método de obtención de la
policromía del azul de metileno. El estudio citomorfológico de extendidos
coloreados de la sangre pone de manifiesto el producto final de un
maravilloso y complicado proceso de maduración que tiene lugar en el
sistema hematopoyético, y que se encuentra representado por los eritrocitos,
los leucocitos y las plaquetas. Cada profesional debe entrenarse y aprender a
reconocer todos los elementos del frotis sanguíneo, mientras lleva a cabo el
recuento diferencial. Debe formar el hábito de verificar en cuanto al tamaño,
forma y concentración de hemoglobina en eritrocitos, además si existe un
grado importante de anisocitosis o poiquilocitosis, hipocromía, microcítocis,
macrocitocis e hipercromía aparente, etc.

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En cuanto a plaquetas se debe tener en cuenta si se encuentran en


cantidades aproximadamente normales (de 3 a 8 por 100 x glóbulos rojos), si
son normales o si hay formas gigantes o extrañas. Asimismo, en cuanto a
leucocitos se debe considerar si son maduros o atípicos; si su número es normal,
aumentado o disminuido. En los frotis muy gruesos, los leucocitos son
pequeños, difíciles de teñir siendo imposible su reconocimiento. Aun en los
mejores frotis, a causa de la diferencia de tamaño, densidad, etc., los
leucocitos muestran una distribución particular. Los monocitos grandes y los
polimorfonucleares (PMN) predominan en los bordes y al final de la extensión,
mientras que los linfocitos, más pequeños, se distribuyen en forma más
uniforme en la parte media.

REACCIÓN ATÍNGENO - ANTICUERPO


El grupo sanguíneo al que pertenece un individuo está determinado por los
antígenos de membrana de sus eritrocitos y los anticuerpos del suero. Algunos
antígenos y sus anticuerpos se encuentran además en las secreciones. Los
anticuerpos del suero suelen producir aglutinación de los eritrocitos portadores
de antígenos de grupo distinto. Por ello, algunos grupos sanguíneos, como los
del sistema ABO o el factor Rh, han de tenerse en cuenta a la hora de realizar
transfusiones sanguíneas o trasplante de órganos. Por ejemplo, las reacciones
de aglutinación que revisten peligro, son aquellas en los que los anticuerpos
del receptor aglutinan los eritrocitos del donante. Es por eso que las personas
AB pueden recibir transfusiones de todos los grupos sanguíneos (receptor
universal), mientras que no pueden donar sangre más que a personas de su
grupo. Sin embargo, a los del grupo O (donante universal), le ocurre lo
contrario. A principios del siglo XIX, K. Landsteiner observó que al mezclar
eritrocitos de una persona con el suero de otra, a veces, se producían
aglutinaciones. Es así que estudiando este comportamiento de los eritrocitos,
se percató de que en la población existen individuos de tres fenotipos
diferentes correspondientes a los grupos A, B y O.
En 1940, Landsteiner y Wiener descubrieron otra diferenciación hereditaria en
la sangre. El llamado factor Rh. Inyectaron sangre de Macacus rhesus en
conejos, obteniendo de estos un suero, capaz de aglutinar los eritrocitos de los
monos y que, al ser inyectados en humanos, se observó que podían aglutinar
los eritrocitos de un 85% de los neoyorquinos, llamados Rh positivos, a
diferencia del 15% que no reaccionaron, a los que se denominaron Rh
negativos. Poco tiempo después se dieron cuenta de que el carácter Rh
negativo es recesivo frente al Rh positivo. En el mismo año se comprobó que
las transfusiones de sangre Rh positivos a individuos Rh negativos provocaban
crisis hemolíticas, a pesar de que fueron del mismo grupo sanguíneo del

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sistema ABO, lo que llevó a reconocer que este factor está involucrado en la
producción de la enfermedad hemolítica del recién nacido (eritroblastosis
fetal).
GRUPO
A B AB O
SANGUÍNEO

ERITROCITOS

EN MEMBRANA Antígeno Antígeno Antígenos Sin antígenos


A B AyB

Anticuerpos-
EN EL PLASMA Anticuerpo-B Anticuerpo-A Sin anticuerpos
AyB

II. MATERIALES
2.3. DEL LABORATORIO (POR MESA DE TRABAJO)
 03 Microscopios ópticos
 Aceite de inmersión
 Colorante Wright o Giemsa
 Agua destilada o buffer fosfato
 Kit de grupo sanguíneo AB-D
 02 Beakers
 02 láminas excavadas
2.4. DEL ALUMNO
INDIVIDUAL
 Barreras de bioseguridad: Guantes, mascarilla y cofia.
 01 plumón marcador indeleble y 01 fosforo o encendedor.
GRUPAL
 01 caja de láminas portaobjetos biseladas
 01 paquete de algodón pequeño
 01 botella pequeña de alcohol
 10 lancetas de punción capilar
 01 caja de mondadientes

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


106
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III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. COLORACIÓN DE EXTENDIDOS SANGUÍNEOS: (Método de Wright)
a. El frotis bien seco y rotulado se coloca sobre la gradilla de coloración.
b. Cubrir la lámina con un volumen de colorante y dejar por un minuto (4-
5 gotas)
c. Diluir el colorante con dos volúmenes de agua tamponada pH. 6.4,
mezclar bien, observándose la formación de una escarcha metálica y
dejar por 6 minutos.
d. Lavar con agua corriente y dejar secar colocando la lámina
verticalmente.
NOTA: Los tiempos indicados pueden variar de acuerdo a la antigüedad
del colorante.
3.2. RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS:
a. Colocar las láminas coloreadas al microscopio, colocar una gota de
aceite de cedro y observar con objetivo de inmersión.
b. Reconocer los diversos tipos de células sanguíneas y dibujar.

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


107
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3.3. REACCIÓN ANTÍGENO - ANTICUERPO


La técnica que permite la identificación de los grupos sanguíneos se basa
en la aglutinación o no de los eritrocitos, empleando para ello sueros.

1. Desinfecte la pulpa del


dedo medio con un
algodón con alcohol.
2. Seguido de la
desinfección, una vez
seco el dedo realice
una punción con la
lanceta o aguja.
3. Coloque, tres gotas de sangre en una lámina
portaobjetos.

1 2 3

4. Agregue una gota de suero anti A en la primera gota de sangre, de


suero anti B en la segunda gota y suero anti D en la tercera gota.

Anti A Anti B Anti D

1 2 3

5. Mezcle de manera circular


cada gota (con ayuda de un
mondadientes) y deje reposar 1 2 3
entre 1 a 2 minutos.

6. Interpretar el resultado.

1 2 3

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


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IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Todo el material (vidrio, plástico, tela, etc) que tenga
contacto con microorganismos o muestras de fluidos corporales (salía, orina,
suero, plasma, sangre) provenientes de humanos o animales debe ser
esterilizado en autoclave a 121°C/15 libras de presión/15 minutos para su
descarte o reutilización.

V. EVALUACIÓN
1. Señale cuál de las siguientes afirmaciones sobre los procesos de inmunidad
es CORRECTA:
a. La inmunidad específica depende de los leucocitos polinucleares
b. Los monocitos producen anticuerpos
c. La inmunidad de base humoral depende de los leucocitos polinucleares
d. Los macrófagos producen anticuerpos
e. La inmunidad específica celular depende de los linfocitos T
2. Acerca de la diferencia entre suero y plasma es CIERTO que:
a. El fibrinógeno es un componente del suero
b. El suero contiene todos los enzimas de la cascada de coagulación
c. El plasma no contiene fibrinógeno
d. Ni el suero ni el plasma contienen plaquetas
e. El plasma se obtiene a través del suero.
3. Señale cuál de las siguientes afirmaciones sobre la hemostasia es FALSA:
a. La coagulación de la sangre constituye el primer paso de la hemostasia
b. La estabilización del trombo de fibrina es el último paso hemostático
c. La trombina activa la formación y estabilización de la fibrina
d. Una lesión vascular se acompaña de la formación de un trombo
plaquetario
e. La coagulación se puede activar a través de una vía extrínseca o una
intrínseca.
4. Los leucocitos más abundantes en el torrente sanguíneo en condiciones
fisiológicas normales son los:
a. Linfocitos b. Basófilos c. Monocitos d. Neutrófilos e. Eosinófilos
5. Los fragmentos de megacariocitos que circulan en la sangre son:
a. Neutrófilos b. Linfocitos c. Eritrocitos d. Plaquetas e. Proteínas del plasma

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


109
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6. La proteína del plasma más abundante es:


a. Albúmina b. Hemoglobina c. Gamma globulina d. Proteína de
coagulación e. Alfa globulina
7. Los anticuerpos son:
a. Células plasmáticas b. Linfocitos B c. Linfocitos T d. Gamma globulinas
e. Citoquinas
8. En la inmunidad celular el agente extraño es destruido por:
a. Linfocitos T asesinas b. Basófilos c. Anticuerpos d. Complemento
e. Células plasmáticas
9. Señale el enunciado CORRECTO:
a. Los leucocitos son los elementos más abundantes de la sangre.
b. La hematopoyesis en el adulto se realiza en el bazo e hígado.
c. Las plaquetas y los eritrocitos se caracterizan por tener el núcleo
segmentado.
d. Todas las células y elementos formes de la sangre deriva de una célula
madre pluripotencial común.
e. El plasma está formado principalmente por células y en menor proporción
por agua solutos y proteínas.
10. Respecto a la sangre, es FALSO, que:
a. El plasma se compone principalmente de 90% de agua y en menor
proporción de proteína y solutos.
b. Un aumento del valor del hematocrito 50/55% indicaría anemia.
c. La sangre transporta gases, nutrientes y sustancia de desecho.
d. Los eritrocitos son los elementos más abundantes de la sangre.
e. La albumina es la principal determinante de la presión oncótica del
plasma.
11. Con respecto a la respuesta inmunitaria es FALSO que:
a. La inmunidad inespecífica se posee desde el nacimiento.
b. Los linfocitos son las células responsables de la inmunidad específica.
c. Los linfocitos B se transforman en células plasmáticas productoras de
anticuerpos.
d. Los linfocitos NK, la fiebre y el interferón forman parte de la inmunidad
inespecífica.
e. La respuesta humoral primaria es más rápida que la secundaria.
12. ¿Qué significa un aumento de reticulocitos en el recuento celular?
a. Que la medula ósea ha aumentado la velocidad de producción de
glóbulos rojos
b. Que el hematocrito ha aumentado
c. Una infección
MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página
110
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d. Una alteración de la función renal


e. Que los leucocitos no son normales
13. Los neutrófilos sanguíneos:
a. Disminuyen en respuesta a una infección
b. Son menos numerosos en sangre que los eosinófilos y basófilos
c. Son más numerosos que los monocitos
d. Se producen a través de normoblastos
e. Todo es falso
14. ¿En qué se basa la técnica de aglutinación directa?
.……………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………..
15. ¿Qué es un antígeno y qué es un anticuerpo?
………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………..
16. ¿En qué consiste una reacción antígeno – anticuerpo?
………………………………………………………………………………………………..
……………………………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………………………..
17. ¿Explique el fenómeno de eritroblastosis fetal y cómo podría evitarse?
………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………….....
………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………..
18. Explique la diferencia entre aglutinación y coagulación.
………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………..

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


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VI. RESULTADOS

6.1. OBSERVACIÓN DE CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO

Célula Tipo:

Aumento:

Características:

Célula Tipo:

Aumento:

Características:

Célula Tipo:

Aumento:

Características:

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Célula Tipo:

Aumento:

Características:

Célula Tipo:

Aumento:

Características:

Célula Tipo:

Aumento:

Características:

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6.2. REACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO: GRUPO SANGUÍNEO SISTEMA ABO

VII. BIBLIOGRAFÍA
1. David J. Cell Delivery Mechanisms for Tissue Repair. Current Stem Journal.
2008; 205 -212.
2. David T, Harris R. Umbilical Cord Blood: A unique source of Pluripotent Stem
Cell for Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research and Therapy
Journal. 2007; 4 (2), 301-309.
3. Genovese J, Cortes M, Chachques. Cell Based Approaches for Myocardial
Regeneration and Artificial Myocardium. Current Stem Cell Research and
Therapy Journal. 2007; 2(2), 121-127.
4. Rodak F. Hematología: fundamentos y aplicaciones clínicas. 2ª ed. Médica
Panamericana. Buenos Aires. 2004.
5. Giangrande P. L. F. The history of blood transfusion. British Journal of
Haematology. 2000; 110(4), 758–767.
6. Góngora-Biachi R. A. La sangre en la historia de la humanidad. Rev Biomed.
2005; 16(4), 281–288.

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PRÁCTICA No 10

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA RESPUESTA INMUNE CELULAR: FAGOCITOSIS IN VIVO

SESIÓN 10 FECHA 06/11/2019 DURACIÓN 100 minutos

Aplica sin error las medidas de bioseguridad durante las


CAPACIDAD prácticas de laboratorio con actitud positiva, respeto a la
opinión de sus compañeros y a su entorno.

I. INTRODUCCIÓN
La fagocitosis es un mecanismo crucial en la inmunidad innata. Las células
fagocíticas son atraídas quimiotácticamente hacia los focos inflamatorios
inducidos por la presencia de agentes patógenos en los tejidos.
Alternativamente, el sistema fagocítico mononuclear consiste en un número
de fagocitos fijos en ciertos órganos, como bazo e hígado, que retiran las
partículas extrañas presentes en la sangre. Esta actividad de depuración de la
sangre es un parámetro importante de la capacidad de defensa del
organismo frente a microorganismos, inmunocomplejos y células muertas por
apoptosis. Por tanto, una deficiencia en la capacidad de depuración tiene
como consecuencia un mayor riesgo de infecciones y de trastornos
inmunopatológicos. El fenómeno de la fagocitosis es parte de la respuesta
inmune inespecífica y representa el contacto inicial del huésped con las
sustancias extrañas.
Existe un término más general, el de endocitosis, que incluye a la vez la
fagocitosis (ingestión de partículas) y la pinocitosis (ingestión de sustancias que
no se presentan como partículas, o sea gotas de líquido). En ambos casos la
célula engulle y substrae al medio partículas o gotas de líquido; los grupos de
células especializadas que llevan a cabo estas funciones suelen llamarse
células fagocitarias. En algunos casos, la digestión ulterior de dichas sustancias
hasta producir fragmentos menores, facilita su eliminación. En el hombre, la
fagocitosis es realiza fundamentalmente por los fagocitos mononucleares, los
neutrófilos y en menor grado los Eosinófilos. El fenómeno de fagocitosis
involucra tres procesos. En primer lugar, las células deben llegar al lugar donde
se encuentra la sustancia extraña (quimotactismo). Luego deben ingerir dicha
sustancia (fagocitosis). Finalmente, después de una serie de acontecimientos
metabólicos, deben destruir la sustancia en mención o inhibir la multiplicación
del microorganismo (muerte microbiana).

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


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Escuela Profesional de Estomatología

II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO (POR MESA DE TRABAJO)
 01 Cultivo líquido de Staphylococcus aureus de 24 horas.
 Colorante Giemsa o Wright.
 03 microscopios
 100 mL de Solución salina fisiológica estéril a 37oC.
 10 mL de cloroformo

2.2. DEL ALUMNO


Individual
 Manual de prácticas, Libreta de apuntes y lapicero.
 Barreras de bioseguridad: Guantes, mascarilla y cofia.
 01 Marcador indeleble y 01 fosforo o encendedor.
Grupal
 02 Ratones blancos (por turno de práctica).
 01 Paquete de hisopos de toma de muestra microbiológica.
 01 Caja de Láminas portaobjeto
 01 Caja de laminillas cubreobjeto
 04 Jeringa de 5 mL.
 04 Agujas Hipodérmicas No 211/2”
 02 Estuches de disección completo
 10 hojas de bisturí No 21
 01 Paquete de algodón pequeño.
 01 Botella de alcohol pequeña.

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. PREPARACIÓN DE LA SUSPENSIÓN BACTERIANA
Suspender un cultivo de Staphylococcus aureus en 2 mL de solución salina
fisiológica estéril a pH 7.0 hasta obtener una turbidez equivalente a 900
000 gérmenes por mL (tubo No 3 del NMF).
3.2. FAGOCITOSIS IN VIVO
1. 24 horas antes de la prueba, inocular un ratón con 0,5 mL de una
suspensión de S. aureus muerto por calor. Vía Intraperitoneal.
2. Dos horas antes de la prueba, al ratón anteriormente inoculado, se le
debe inocular con 0,5 mL de suspensión de cultivo vivo de S. aureus
(suspensión ajustada al tubo No 3 del NMF). Vía intraperitoneal.
3. Hacer una inoculación igual en un ratón no inoculado previamente.
MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página
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4. Cumplida las dos horas, sacrificar los dos ratones inoculados


colocándolos en una cámara con éter o cloroformo.
5. Abra la cavidad abdominal y realice frotis de cada una de ellas
utilizando torundas.
6. Rote cuidadosamente la torunda sobre una lámina portaobjeto.
7. Secar a temperatura ambiente y colorear con Giemsa, Leishman o con
azul de metileno.
8. Observar la presencia de bacterias libres y la existencia de células
mostrando bacterias dentro de su citoplasma (englobadas).
9. Realizar el recuento de bacterias libres y de bacterias fagocitadas en
ambos ratones.
10. Al abrir la cavidad abdominal si puede inocular con una jeringa 2 mL
de SSF estéril a 37 oC a fin de lavar el exudado y hacer un preparado
en fresco en el cual se puede observar el momento de la fagocitosis.

IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Todo el material (vidrio, plástico, tela, etc) que tenga
contacto con microorganismos o muestras de fluidos corporales (salía, orina,
suero, plasma, sangre) provenientes de humanos o animales debe ser
esterilizado en autoclave a 121°C/15 libras de presión/15 minutos para su
descarte o reutilización.

V. EVALUACIÓN
En todos los casos señale la opción CORRECTA (puede haber más de una o
ninguna). Justifique cuando una opción es INCORRECTA:
1. Respecto de las bacterias extracelulares y los mecanismos de evasión a la
respuesta inmune:
a. El sistema complemento es esencial en la erradicación de las bacterias
extracelulares.
b. Los principales mecanismos de erradicación de las bacterias
extracelulares son la lisis por acción del complemento y la fagocitosis.
c. La opsonización de la bacteria inhibe la fagocitosis.
d. Algunas bacterias evaden la fagocitosis inhibiendo la opsonización.
e. Las bacterias extracelulares no poseen mecanismos de evasión a la
opsonización por anticuerpos.

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


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f. La cápsula bacteriana es una envoltura que puede inhibir la


opsonización.
g. Todas las bacterias capsuladas inhiben la fagocitosis.
h. El enmascaramiento de una bacteria con IgA favorece la activación del
sistema del complemento, la opsonización y por ende su fagocitosis.
i. El LPS puede, tanto activar el sistema complemento como inhibir la lisis
bacteriana por el complejo C5-C9. Recuerden que el antígeno O activa
el sistema C y a la vez impide que el complejo C5-C9 se inserte en la
membrana (resistencia al suero de las gramnegativas).
j. Los mecanismos de evasión a la respuesta inmune innata no afectan a la
respuesta inmune adquirida.
2. Acerca de los mecanismos bacterianos de inactivación de los anticuerpos:
a. Le permiten a la bacteria evadir la respuesta inmune adquirida y también
la innata.
b. Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes tienen un mecanismo
similar para impedir la opsonización por anticuerpos.
c. Los mecanismos de inactivación de los anticuerpos implican
indefectiblemente la degradación de la inmunoglobulina.
d. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista y por lo tanto no
posee mecanismos de evasión que inactiven anticuerpos.
e. Algunas bacterias utilizan proteínas de su pared para inactivar la acción
de las inmunoglobulinas.
f. Los mecanismos de degradación de inmunoglobulinas son privativos de
las bacterias grampositivas.
g. Algunas bacterias que colonizan la mucosa respiratoria presentan
mecanismos de inactivación de la IgA.
h. Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes comparten el
mecanismo de inactivación de los anticuerpos.
i. Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis y Haemophilus
influenzae degradan exclusivamente IgM.
j. Las cápsulas de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis y
Haemophilus influenzae son las responsables de degradar las
inmunoglobulinas.
k. Algunas bacterias favorecen su unión a las inmunoglobulinas pero aun así
inhiben su opsonización por anticuerpos.
3. Con respecto a los mecanismos de evasión a la inflamación y a la
fagocitosis:
a. Las células eucariotas pueden reconocer antígenos bacterianos e iniciar
una respuesta inflamatoria.

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


118
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b. El antígeno O del LPS es reconocido por el receptor TLR4.


c. El LOS no puede ser reconocido por el TLR4.
d. Algunas bacterias pueden interferir con respuesta inmune mediada por
receptores TLR e inhibir la inflamación.
e. Salmonella Typhi y Brucella abortus son capaces de evadir el
reconocimiento por el TLR4.
f. Algunas bacterias estimulan los receptores TLRs que resulta en la
inducción de una respuesta anti-inflamatoria.
g. Mycobacterium tuberculosis genera una fuerte respuesta inflamatoria
pero su cápsula inhibe la fagocitosis por los PMN.
h. Algunas bacterias inhiben la fagocitosis porque liberan sustancias que
destruyen a los fagocitos (ej.: leucocidinas).
i. Algunas bacterias inhiben la fagocitosis porque interfieren con los
filamentos de actina de los fagocitos.
j. Una vez fagocitadas, las bacterias son destruidas indefectiblemente.
4. Respecto de la sobrevida de las bacterias dentro de la célula eucariota:
a. Algunas bacterias pueden vivir dentro de células del huésped.
b. Ciertas bacterias están obligadas a vivir dentro de células eucariotas.
c. El efecto de “caballo de Troya” favorece la rápida eliminación de un
gran número de bacterias fagocitadas por los PMNs.
d. Luego de ser fagocitadas las bacterias se encuentran en el endosoma
temprano que tiene un pH cercano al neutro.
e. Las bacterias que sobreviven dentro del endosoma tardío deben resistir
al pH ácido cercano a 5.
f. Mycobacterium tuberculosis no resiste el pH ácido, pero puede sobrevivir
dentro del endosoma porque lo alcaliniza.
g. Luego de ser fagocitadas algunas bacterias evitan ser eliminadas
destruyendo el lisosoma.
h. Algunas bacterias sobreviven escapando al citoplasma de la célula
eucariota.
i. Algunas bacterias mueren dentro del fagocito porque no pueden formar
el fagolisosoma.
j. Listeria monocytogenes y Chlamydia trachomatis son bacterias
intracelulares obligadas
VI. FUNDAMENTACIÓN
6.1. EL PROCESO DE LA FAGOCITOSIS
No obstante que hay disparidades específicas entre la función fagocítica
de los macrófagos y neutrófilos, el proceso fagocítico incluye varias
etapas secuenciales que son comunes en ambas células y que

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


119
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comprenden la quimiotaxis, la adhesión, la endocitosis (la cual se


optimiza por la opsonización de las partículas), y los cambios físicos y
bioquímicos intracelulares que capacitan a los fagocitos para endocitar,
matar y digerir a los microorganismos: el incremento en el metabolismo
general de las células, la formación del fagosoma, la interacción del
fagosoma con endosomas y lisosomas para formar el fagosoma maduro
(fagolisosoma), la acidificación del fagolisosoma, la formación de
metabolitos reactivos del oxígeno y del nitrógeno, la activación de las
hidrolasas lisosomales, y finalmente la expulsión del material de desecho
mediante el proceso de la exocitosis.
Estos cambios son generales y ocurren aun cuando se trate del
enfrentamiento entre los fagocitos y partículas o parásitos de tamaño
muchas veces mayor que el de ellos. En estos casos, los fagocitos, al
hacer contacto con las macropartículas, estimulan sus mecanismos
citocidas y vierten al exterior el contenido de sus gránulos. La “fagocitosis
frustrada”, como se le llama a este fenómeno, ocasiona no sólo la
destrucción de la partícula sino también daño del tejido circundante.

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VII. RESULTADOS

Preparado:

Aumento:

Observación:

VIII. BIBLIOGRAFÍA
1. Brown GD, Gordon S. Phagocytes and anti-infective immunity. In: Kaufmann
SHE, Sher A, Ahmed R, eds. Immunology of infectious diseases. Washington
DC: ASM Press. 2002; 79-91.

2. Labro MT. Interference of antibacterial agents with phagocyte functions:


immunomodulation or «immuno-fairy tales»? Clin Microbiol Rev 2000; 13: 615-
650.

3. Bonnet M, Van de Auwera P. In vitro and in vivo intraleukocytic


accumulation of azithromycin (CP-62, 993) and its influence on ex vivo
leukocyte chemiluminiscence. Antimicrob Agents Chemother. 1992; 36:
1302-1309.

4. Ortega E, Escobar MA, Gaforio JJ, Algarra I, Alvarez de Cienfuegos G.


Modification of phagocytosis and cytokine production in peritoneal and
splenic murine cells by erythromycin A, azithromycin and josamycin. J
Antimicrob Chemother 2004; 53: 367-370.

5. Vicente-Manzanares M, Sancho D, Yañez-Mó, M, Sánchez-Madrid M. The


leukocyte cytoskeleton in cell migration and immune interactions. Internat
Rev Cytol 2002; 216:233-289.

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


121
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PRÁCTICA No 11

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA SHOCK ANAFILÁCTICO RETARDADO IN VIVO

SESIÓN 11 FECHA 13/11/2019 DURACIÓN 100 minutos

Aplica sin error las medidas de bioseguridad durante las


CAPACIDAD prácticas de laboratorio con actitud positiva, respeto a la
opinión de sus compañeros y a su entorno.
I. INTRODUCCIÓN
Los modelos experimentales desempeñan un papel relevante dentro de las
Ciencias Biomédicas en el esclarecimiento de la etiopatogenia de diferentes
enfermedades, en el desarrollo de marcadores de diagnóstico y en la
evaluación de la eficacia y seguridad de diferentes alternativas de
tratamiento, incluso en nuevas terapias farmacológicas. Gran parte del
conocimiento actual sobre anafilaxia, una de las formas de alteración de la
inmunidad de mayor riesgo potencial para la vida humana que se asocia a
reacciones de hipersensibilidad inmediata o alérgica Tipo 1 (Clasificación de
Gell y Coombs), ha sido obtenida a partir de modelos experimentales.
La anafilaxia es un síndrome de aparición brusca y afectación plurisistémica
cuya incidencia global no se conoce con toda precisión, si bien se sabe que
el número de casos de anafilaxia va en aumento y que puede llegar a afectar
hasta el 20 % de la población caucásica en algún momento de su vida. La
anafilaxia constituye una reacción inflamatoria de instauración generalmente
inmediata, a veces lenta, causada por la liberación masiva de mediadores
inflamatorios (histamina, prostaglandinas, serotonina, factor activador de
plaquetas, leucotrienos) de leucocitos basófilos y mastocitos, como
consecuencia de la unión de anticuerpos tipo inmunoglobulina E (IgE) frente
a determinados antígenos.
Tales mediadores son causantes de manifestaciones clínicas que según la vía
de acceso y el grado de difusión intracorporal del alérgeno, pueden adoptar
una forma localizada como el asma, o generalizada como el eritema,
diaforesis, palidez o cianosis, vasodilatación sistémica, hipotensión, shock, etc.
La unión Ag-Ac es uno de los mecanismos fisiopatológicos más importantes
que se involucran en el desarrollo de la anafilaxia, por lo cual los modelos que
desarrollan las reacciones de hipersensibilidad tipo1 asociadas a esta

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


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interacción han cobrado vital importancia en la evaluación preclínica de


sustancias con efectos antianafilácticos.
II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO
 01 Balanza analítica o gramera digital
 01 Campana nebulizadora con accesorios.
2.2. DEL ESTUDIANTE
Individual:
 Manual de prácticas, Libreta de apuntes y lapicero.
 Barreras de bioseguridad: Guantes, mascarilla y cofia.
 01 Marcador indeleble y 01 fosforo o encendedor.
Grupal:
 05 Jeringas hipodérmicas de 5 mL.
 05 jeringas hipodérmicas de tuberculina (1 mL).
 01 paquete de algodón pequeño.
 01 botella de alcohol pequeña.
 01 Rollo de papel toalla.
 01 botella de solución salina fisiológica estéril (500 mL).
 02 cobayos (cuyes) machos adultos en jaulas separadas.
 02 ampollas de adrenalina 1:1000.
 02 ampollas de clorfenamina de 10mg/mL.
 02 ampollas de dexametasona de 4mg/mL.

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. MÉTODO 1: Shock anafiláctico retardado in vivo inducido por albúmina
de huevo en cobayos.
1. Para la evaluación del shock anafiláctico retardado, se sensibilizan
cobayos albinos machos (300 a 400 g) mediante tres inyecciones
intraperitoneales de disolución de albúmina de huevo al 5 % que se
efectúan en el primer, tercer y quinto días del experimento,
respectivamente.
2. Pasados 21 días se administra la sustancia a evaluar. Dos horas más
tarde, los animales se preparan para la inducción de la anafilaxia.
3. Para ello, se anestesia localmente la zona ventral del cuello con
procaína 2 % (2 mL/kg) y se aísla la vena yugular, a través de la cual se
inyecta una disolución de mepiramina (100 µg/kg) y a los 5 min la
albúmina de huevo (10 mg/kg).
4. Finalmente, se registra el tiempo de supervivencia.

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123
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3.2. MÉTODO 2: Shock anafiláctico (Nebulización de Histamina)


1. Pesar y marcar a cada uno de los cobayos
2. Calcular la dosis de antihistamínico para administrar a cada cobayo.
3. A uno de los cobayos, administrar el antihistamínico por vía
intramuscular
4. Esperar 20 minutos y observar los efectos producidos por el
antihistamínico
5. Colocar a ambos cobayos en la campana e iniciar nebulización de
histamina
6. Observar los efectos en ambos cobayos
7. Administrar adrenalina, dexametasona y clorfenamina según se
requiera. Anotar y discutir los resultados.
IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD
Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Todo el material (vidrio, plástico, tela, etc) que tenga
contacto con microorganismos o muestras de fluidos corporales (salía, orina,
suero, plasma, sangre) y punzocortante, provenientes de humanos o animales
debe ser esterilizado en autoclave a 121°C/15 libras de presión/15 minutos
para su descarte o reutilización.

V. EVALUACIÓN
1. De las siguientes ¿cuál considera la fisiopatología fundamental del shock
anafiláctico?
a. Hipotensión arterial b. Deterioro del nivel neurológico c. Hipoperfusión
tisular d. Liberación de sustancias vasoactivas e. Aumento del óxido nítrico.
2. La definición de anafilaxia incluye:
a. Reacción adversa de causa inmunológica.
b. Se desencadena por el contacto con el alergeno.
c. Paciente previamente sensibilizado.
d. Todo lo anterior.
e. Nada de lo anterior.
3. Las reacciones IgE mediadas son producidas por:
a. Alimentos: chocolate, leche, etc.
b. Fármacos
c. Veneno de himenópteros
d. Solo a y b son ciertas.
e. Todo lo anterior.

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4. Dentro de la clínica de la anafilaxia:


a. El comienzo de la reacción es insidioso.
b. A mayor tiempo de latencia mayor gravedad.
c. A los pocos minutos del contacto aparecen los síntomas.
d. A veces, tras cesar la primera reacción, se producen reactivaciones
clínicas en las horas siguientes.
e. Son ciertas c y d.
5. En la anafilaxia:
a. Las reacciones potencialmente letales son más frecuentes en niños.
b. En los niños, la muerte se produce por arritmias e hipoxia.
c. En los niños se produce la muerte por edema de laringe.
d. Son ciertas b) y c).
e. Ninguna es cierta.
6. Los aspectos clínicos de la anafilaxia están relacionados con mediadores.
Cuál de las siguientes afirmaciones es cierta:
a. La clínica de las mucosas está mediada por la histamina.
b. Vías respiratorias bajas por bradicinina.
c. Piel mediada por SRS-A.
d. Sistema gastrointestinal por histamina.
e. Vías respiratorias altas, el mediador es desconocido.
7. ¿Qué síntomas son típicos de la anafilaxia y lo diferencian del IAM?:
a. Urticaria y sudoración b. Disnea y taquicardia c. Urticaria y ronquera
d. Taquicardia y alteraciones en el ECG e. Hipoglucemia y palidez.
8. En el tratamiento de la anafilaxia, el fármaco de elección es:
a. Antihistamínicos b. Adrenalina c. Corticoides d. Benzodiacepinas e.
Nitroglicerina
9. El oxígeno se usa en la anafilaxia:
a. Nunca b. Siempre c. A petición del paciente d. Si hay disnea o sibilancias
e. Al final del proceso
10. Ante una hipotensión mantenida en la anafilaxia, que no remonta con
aporte de líquidos, debemos utilizar:
a. Corticoides b. Broncodilatadores c. Antihistamínicos d. Calcioantagonistas
e. Vasopresores
11. Paciente de 75 años con antecedentes de IAM que acude a Urgencias por
cuadro de anafilaxia; se instaura tratamiento con adrenalina y no responde,

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por lo que se usa glucagon con buena respuesta, ¿cuál puede ser la causa
de la falta de respuesta a la adrenalina?:
a. El uso de beta-bloqueantes b. La edad del paciente c. El estado de las
coronarias d. Tratamiento con nitroglicerina e. El uso de aspirina
12. Ante un paciente con antecedentes de reacción anafiláctica, la principal
vía de administración de medicamentos va a ser:
a. Intravenosa b. Intramuscular c. Oral d. Subcutánea e. Sublingual
13. La principal causa fisiopatológica del shock anafiláctico es:
a. La contracción del músculo liso b. La vasodilatación c. El prurito d. El
aumento de la presión arterial e. Ninguno de ellos.
14. La lesión elemental de la urticaria/angioedema es:
a. Placa b. Mácula c. Vesícula d. Pústula e. Habón
15. Las lesiones de la urticaria se localizan en:
a. Dermis profunda b. Músculo liso c. Tejido celular subcutáneo d. Dermis
superficial e. Tejido mucoso
16. Las lesiones del angioedema se localizan en:
a. Dermis profunda b. Tejido celular subcutáneo c. Tejido submucoso
d. Todos ellos e. Ninguno de ellos
17. El angioedema puede ser producido por:
a. Alimentos b. Fármacos c. Infecciones d. Sólo a y c e. Todas ellas
18. En la clínica de urticaria/angioedema predominan los síntomas cutáneos,
pero la afectación extracutánea más común es:
a. Vías respiratorias altas b. Gastrointestinal c. Genitourinaria d. Endocrina
e. Sistema nervioso central
19. La Ig que está implicada en los procesos anafilácticos es la:
a. IgA b. IgM c. IgG d. IgE e. IgF
20. El mediador causante de convulsiones en la anafilaxia es:
a. Desconocido b. Histamina c. Quininas d. SRS-A e. Todos ellos

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VI. FUNDAMENTACIÓN

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VII. BIBLIOGRAFÍA
1. Pavón-Romero L. Inmunología molecular traslacional. España: Edit.
Lippincott Willians and Wilkins. 2016.
2. Bruton A, Chadner B, Knollmann B. Goodman and Gilman. las bases
farmacológicas de la terapéutica. México: Edit. McGraw Hill. 12a Ed. 2011.
3. Romero-Valdez. Reacciones de hipersensibilidad. México: Editorial McGraw
Hill. 2016.
4. VanArsdel P. Trastornos por hipersensibilidad. España: Editorial Doyma
Libros.1994.
5. Goodman G. Las Bases Farmacológicas de la terapéutica. Undécima
edición. México. McGraw Hill Interamericana. 2006.
6. Katzung B. Farmacología Básica y Clínica. Editorial Manual Moderno,
novena edición. México DF. México, 2006.
7. Benito-Fernández J. Urticaria, angioedema y anafilaxia. Diagnóstico y
tratamiento en urgencias pediátricas. 2ª Ed. Laboratorios Lesvi, 1999: 229-
233.
8. Coto López A, Anafilaxia. En: Medina Asensio J, edito. Manual de Urgencias
médicas Hospital Doce de Octubre. Madrid: Ed J Santos, S.A., 1997; 83-85.
9. Murrant T, Bihari D. Anaphylaxis and anaphylactoid reactions. Int Jclin Pract
2000;54(5):322-8.
10. Ostabal Artigas MJ. El shock anafiláctico. Rev Med Int 1996; 28: 145-150.
11. Perales R, Tejedor MA: Reacciones alérgicas en Urgencias. Pág: 245-
250.Urgencias en Medicina: Cabrera R, Peñalver C. 3ª ed. 1999 Ed.: Aula
médica.
12. Ring J, Bebrendt H. Anaphylaxis and anaphylactoid reactions. Classification
and pathophysiology. Clin Rev. Allergy Immunol. 1999;17(4): 387-399.
13. Guías de actuación en Urgencias: Moya M. 1ª 1999 Ed.: Mc Graw-Hill-
Interamericana de España, S.A.U.

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PRÁCTICA No 12

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA ANTIBIOGRAMA DE BACTERIAS DE INTERÉS ESTOMATOLÓGICO

SESIÓN 12 FECHA 20/11/2019 DURACIÓN 100 minutos

Clasifica con precisión a las enfermedades bucodentales según


CAPACIDAD su ubicación y tipo de agente causal con actitud participativa
y respetando la opinión de sus compañeros.

I. INTRODUCCIÓN
La resistencia a los antimicrobianos es un fenómeno biológico que ocurre de
manera natural, pero que se ha incrementado enormemente debido al uso
inapropiado y negligente de estos fármacos. Los ensayos de susceptibilidad
están indicados para apoyar la quimioterapia antimicrobiana de tratamiento
en procesos infecciosos por bacterias en las que la identidad del
microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiable su
susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que
el organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia
a los agentes antimicrobianos más comúnmente usados. Los mecanismos de
resistencia incluyen la producción de enzimas inactivantes del antibiótico, que
alteran el objetivo, o alteran la acción.
Las colonias aisladas de cada tipo de microorganismo que pueda
desempeñar un rol patógeno deberían ser seleccionadas de un agar primario
y probar su susceptibilidad. Los procedimientos de identificación a menudo
son realizados al mismo tiempo. Mezclas de diferentes microorganismos no
deberían probarse en una misma placa de ensayo de susceptibilidad.
Diferentes métodos de laboratorio pueden ser usados para determinar in vitro
la susceptibilidad de bacterias ante agentes microbianos. En muchos
laboratorios de microbiología clínica, el test de difusión en agar es usado en
forma rutinaria para bacterias de rápido crecimiento y algunas bacterias
fastidiosas patógenas. Este documento incluye un método estandarizado de
difusión en disco descrito por el Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI).
Los ensayos de susceptibilidad basados solamente en la presencia o ausencia
de una zona de inhibición sin importar su tamaño, no son aceptables.
Resultados confiables sólo se pueden obtener con un disco de ensayo de
difusión que use el principio de metodología estandarizada y con medidas de
diámetro de zonas correlacionadas con la determinación de Concentración

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Inhibitoria Mínima (CIM) con cepas conocidas susceptibles y resistentes a


varios antibióticos. El método que actualmente recomienda el CLSI está
basado en el método originalmente descrito por Bauer et al., (método de
Kirby-Bauer). Este es el método de difusión en disco en que se han desarrollado
estándares para su interpretación y está apoyado por datos clínicos y de
laboratorio.
El incremento de la resistencia bacteriana, la aparición y adquisición de
nuevos mecanismos de resistencia a los diferentes antibióticos utilizados
actualmente, se han convertido en un problema a nivel mundial; no
solamente para el diagnóstico de las infecciones sino por la dificultad en la
detección por el laboratorio de los diferentes perfiles de resistencia. Las
pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos se han convertido en
procedimientos de rutina en la práctica clínica y la información generada a
partir de ellas es fundamental para la vigilancia de los perfiles de sensibilidad
y la detección de nuevos patrones de resistencia por el laboratorio. Existen
vanos métodos para probar la susceptibilidad de los microorganismos a los
antibióticos siendo la difusión en disco el más utilizado. Se realiza en un medio
transparente y simple como el agar de Müeller Hinton. Se fundamenta en la
liberación del antibiótico al medio e inhibición del crecimiento bacteriano en
áreas concéntricas a la del disco.

II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO (POR MESA DE TRABAJO)
 Cultivo líquido (2 mL) de Staphylococcus aureus, Streptococcus
mutans, Enterococcus faecalis; en fase logarítmica (18-24 horas).
 06 placas Petri con agar Mueller-Hinton preparadas previamente.
 02 tubos de ensayo de 13x100 mm con 2 mL de agua destilada estéril.
 03 microscopios ópticos y 03 mecheros bunsen o de alcohol.
 10 set de discos de discos de antibiótico de rutina.
 03 pinzas de metal punta fina.

2.2. DEL ALUMNO


Individual:
 Manual de prácticas, Libreta de apuntes y lapicero.
 Barreras de bioseguridad: Guantes, mascarilla y cofia.
 01Plumón marcador indeleble y 01 fosforo o encendedor.
Grupal:
 01 Paquete de hisopos de toma de muestra microbiológica.
 01 Caja de Láminas portaobjeto
 01 paquete de algodón y 01 botella de alcohol pequeños.

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III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA DE DIFUSIÓN EN AGAR.
A. PREPARACIÓN DEL INÓCULO BACTERIANO
1. A partir del cultivo bacteriano en caldo tomar de éste 0.1 mL de
cultivo y colocarlo en un tubo con 2 mL agua destilada estéril.
2. Mezclar por rotación o en vórtex y llevar la turbidez al tubo 0.5 del
nefelómetro de MacFarland.
B. PREPARACIÓN DE LA PLACA
3. Rotular la placa de agar Mueller–Hinton con el nombre del
microorganismo a inocular, la fecha y hora de realización y el
nombre del estudiante que realizará la prueba.
C. COLOCACIÓN DE LOS DISCOS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA
4. En una placa Petri sembradas con el microorganismo a evaluar,
colocar 5 discos de antibióticos con la ayuda de una pinza estéril.
5. Los espacios entre los discos en la placa deben ser
proporcionalmente semejantes.
6. Incubar a 37oC por 24 horas, observar y explicar los resultados.
7. Con la ayuda de la tabla adjunta, determinar si la bacteria es
sensible o resistente a cada antibiótico.

3.2. DIAGRAMA DE LECTURA

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3.3. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LOS HALOS DE SUSCEPTIBILIDAD


RESISTENTE INTERMEDIO
ANTIBIÓTICOS ABREVIATURA SUSCEPTIBLE
(mm o menos) (mm rango)
Ampicilina AM 20 21 - 28 29
Amikacina AN 14 15 -16 17
Aureomicina A 14 15-18 19
Bacitracina B 8 9-12 13
Bactrim SxT 14 15-18 19
Cafalotina CR 14 15-17 18
Cloromicetín CR 12 13-17 18
Eritromicina E 13 14-17 18
Gentamicina GM 12 13-16 17
Kanamicina KM 13 14-17 18
Lincomicina L 13 14-17 18
Ácido
NA 13 14-18 19
Nalidíxico
Novobiocina NB 17 18-21 22
Oxacilina OX 9 10-13 14
Penicilina P 20 21-18 29
Polimixina B PB 8 9-11 12
Tetraciclina T 14 15-18 19

IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Después de observado el crecimiento microbiano,
autoclavar las placas de petri con los cultivos bacterianos a 121°C /15 libras
de presión / 20 minutos. Posteriormente, el material de vidrio deberá ser lavado
con agua y detergente y enjuagado varias veces para que no queden
residuos de detergente. Se envolverá en papel y luego esterilizará en horno a
180°C por 2 horas para su reutilización.

V. EVALUACIÓN
En todas las preguntas señale la opción CORRECTA. Puede haber más de
una opción correcta o ninguna.
1. En un antibiograma se observan los siguientes resultados:
SENSIDISCO HALO (mm)
Gentamicina 12
Eritromicina 0
Cefalexina 0
Amoxicilina 14

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De acuerdo a estos resultados se puede concluir que la bacteria es:


a. Resistente a la Gentamicina y Amoxicilina y Sensible a la Cefalexina y
Eritromicina.
b. Sensible a la Eritromicina y Cefalexina y Resistente a la Gentamicina y
Amoxicilina.
c. Resistente a la Gentamicina y Eritromicina y Sensible a la Cefalexina y
Amoxicilina.
d. Sensible a la Gentamicina y Amoxicilina y resistente a la Cefalexina y
Eritromicina
2. En relación a generalidades acerca de los antibióticos de uso en clínica
médica:
a. Todos los antibióticos usados en la actualidad son semisintéticos.
b. Louis Pasteur fue el primero en aislar y purificar estreptomicina para su uso
terapéutico.
c. Ciertos hongos y bacterias producen antibióticos naturales capaces de
inhibir el crecimiento de otras especies.
d. Hasta el momento se desarrollaron cuatro familias de antibióticos.
e. La penicilina se utilizó ampliamente para el tratamiento efectivo de la
sífilis.
f. Sólo algunos antibióticos producen la muerte bacteriana.
g. La penicilina es producida por el hongo Penicillium notatum.
h. Durante la II guerra mundial se implementó el uso de la penicilina
purificada para el tratamiento de infecciones.
i. En la actualidad, el término antibiótico excluye a los antimicrobianos
sintéticos.
j. La sulfonamida Pronotsyl era utilizada exitosamente en la práctica
médica años antes que la penicilina.
3. En cuanto a los antibióticos:
a. Un antibiótico es bacteriostático cuando impide la multiplicación
bacteriana, destruyendo las bacterias y matándolas usualmente por lisis
celular.
b. Algunos antibióticos pueden generar tanto bacteriólisis como efecto
bacteriostático sobre una cepa bacteriana, según las dosis
administradas.
c. El efecto antibacteriano de un antibiótico se puede determinar in vitro
mediante las pruebas de sensibilidad antibiótica.
d. La CIM es la más baja concentración de un antibiótico que elimina o
ejerce un efecto letal sobre el 99.9% de las bacterias presentes en un
inóculo inicial estandarizado.

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e. Los efectos adversos de un antibiótico altamente tóxico pueden ser


controlados mediante el dosaje de los niveles del fármaco en suero tal
como es en el caso de los Aminoglucósido y la vancomicina porque
presentan marcada nefro y ototoxicidad.
f. El antibiograma identifica la más baja concentración de antibiótico
capaz de inhibir el desarrollo de un determinado inóculo bacteriano.
g. El antibiograma se realiza de rutina en los laboratorios de Bacteriología
de los hospitales de nuestro país.
h. En el antibiograma se puede evaluar la susceptibilidad o resistencia a
varias familias de antibióticos en una misma placa de Petri.
i. Los antibióticos bacteriostáticos son utilizados preferentemente para el
tratamiento de infecciones en sitios anatómicos donde los efectores del
sistema inmune son escasos.
j. Algunas combinaciones de antibióticos potencian el efecto de los
mismos por el fenómeno llamado sinergia.
4. Acerca de la multirresistencia antibiótica:
a. Una cepa es multirresistente (MDR) cuando presenta resistencia al menos
a 3 antibióticos pertenecientes a diferentes familias de antibióticos.
b. Una cepa posee resistencia extrema (XDR) cuando presenta resistencia
al menos a un antibiótico en todas las familias menos dos familias de
antibióticos.
c. Una cepa es pandroga resistente (PDR) cuando presenta resistencia a
todos los antibióticos en todas las familias de antibióticos.
d. Es frecuente que las cepas XDR evolucionen a cepas MDR.
e. Tanto las cepas PDR como XDR fueron identificadas desde los inicios de
la era antibiótica.
f. Las cepas XDR se aíslan en regiones geográficas aisladas.
g. Las cepas MDR pueden emerger en cualquier sitio asistencial de salud.
h. Hay especies bacterianas que poseen MDR intrínseca.
i. Las cepas PDR están asociadas a infecciones intrahospitalarias.
j. Las cepas XDR pueden emerger por el efecto combinado de mutaciones
cromosómicas y plasmídicas, además de la adquisición de genes por
transferencia horizontal genética.
5. En relación a la diseminación de la resistencia a antibióticos:
a. Es considerado un problema de salud pública por la Organización
Mundial de la Salud.
b. El intercambio de material genético está limitado a especies del
ambiente hospitalario.

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c. Las bacterias ambientales pueden utilizar mecanismos de resistencia


intrínseca para su supervivencia en su hábitat natural.
d. Las Transferencia Horizontal Genética en bacterias se da únicamente por
conjugación y transducción.
e. El uso de antibióticos en veterinaria y agricultura son mínimos en
comparación con su uso en humanos.
f. El uso irracional de antibióticos favorece la emergencia de la resistencia
a antibióticos.
g. Ya en los inicios de la era antibiótica, se supo que la Transferencia
Horizontal Genética sería un factor preponderante en la diseminación de
la resistencia antibiótica.
h. La utilización desregulada de antibióticos en la industria agropecuaria
contribuye a selección de cepas con mecanismos de resistencia.
i. Los antibióticos utilizados como promotores de crecimiento en la cría de
animales de consumo, minimizan la emergencia de mecanismos de
resistencia transferibles.
j. La producción de alimentos emplea la mayor proporción de antibióticos
disponibles en el mercado.
6. En referencia a los mecanismos de resistencia a antibióticos:
a. La formación de biopelículas es un mecanismo de resistencia.
b. Ningún mecanismo puede ser adquirido por Transferencia Horizontal
Genética.
c. Las mutaciones en porinas pueden llevar a un aumento de la resistencia
antibiótica.
d. La modificación del blanco implica un cambio en la conformación del
blanco de acción.
e. La resistencia por eflujo se da por la síntesis de una matriz
exopolisacarídica.
f. Las bacterias solo pueden poseer un único mecanismo de resistencia.
g. Las beta-lactamasas metilan los antibióticos beta-lactámicos.
h. La metilación de proteínas diana puede dar lugar a resistencia a
antibióticos.
i. La resistencia poblacional es la capacidad de una bacteria en resistir a
una concentración específica de antibiótico en un medio de cultivo.
j. Las enzimas modificadoras de antibióticos pueden transmitirse entre
células bacterianas por plásmidos y transposones conjugativos.
7. Con respecto a las beta-lactamasas:
a. Son enzimas que están codificadas en plásmidos o cromosoma.
b. Hidrolizan el anillo beta-lactámico.

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c. En las últimas décadas, se observó una reducción en el número de las


distintas beta-lactamasas.
d. Se pueden utilizar en combinación beta-lactámicos e inhibidores
enzimáticos para atacar la resistencia quinolonas.
e. La combinación de beta-lactamasas e inhibidores enzimáticos tiene un
efecto sinérgico.
f. Constituyen un serio problema para la Salud Pública en infecciones
causadas por bacterias de la familia Enterobacteriaceae.
a. La resistencia a beta-lactámicos que otorgan las beta-lactamasas se
disemina exclusivamente por un transposón conjugativo.
b. Los elementos genéticos móviles colaboran con la diseminación de los
genes que codifican las betalactamasas.
c. Los integrones de clase 1 son plataformas genéticas que evolucionan
incorporando genes que codifican beta-lactamasas, entre otros.
d. Algunos genes de beta-lactamasas se adquirieron de bacterias
ambientales.
8. En referencia a la resistencia a beta-lactámicos en bacterias Gram-
positivas:
a. La resistencia a penicilinas en Streptococcus pneumoniae tiene una
significativa incidencia en Perú.
b. En los últimos años se observó un incremento en cepas de Streptococcus
pneumoniae resistentes a cefalosporinas de tercera generación.
c. Staphylococcus aureus es sensible natural a los antibióticos beta-
lactámicos.
d. Las cepas de Staphylococcus aureus meticilino-resistentes se encuentran
frecuentemente en el ámbito clínico.
e. La presencia del gen mecA en Staphylococcus aureus es indicativo de
resistencia a algunos betalactámicos.
f. Las cepas Staphylococcus aureus meticilino-resistentes pueden ser
resistentes a otras familias, como ser aminoglucósidos, cloranfenicol y
quinolonas.
g. Enterococcus spp. es naturalmente resistente a beta-lactámicos, TMS y
aminoglucósidos.
h. Enterococcus faecalis es naturalmente resistente a imipenem y
vancomicina.
i. El operón van está localizado en el transposón Tn1546 y se disemina por
conjugación a bacterias Gram-negativas.
j. Se detectó recientemente la resistencia vancomicina en Staphylococcus
aureus.

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VI. FUNDAMENTACIÓN
6.1. Método de Difusión en Disco
En muchos laboratorios de Microbiología se utiliza el método de difusión
en disco como de rutina para microorganismos de rápido crecimiento y
microorganismos de crecimiento exigente. El método de difusión en disco
está basado en la presencia o ausencia de una zona de inhibición de
crecimiento, que se mide en milímetros. La interpretación de la prueba
está basada en la correlación entre el diámetro de la zona de inhibición
(mm) con la CMI (μg/mL) para cada antimicrobiano y microorganismo.
Los resultados obtenidos con el método de difusión en disco pueden estar
afectados por varios factores que deben ser controlados para asegurar
la confiabilidad y reproducibilidad de los resultados:
 Medio de cultivo: Se utiliza Agar Mueller Hinton que está formulado y
avalado de acuerdo a los criterios de CLSI. El medio debe tener una
profundidad de 4mm.
 Cationes divalentes: Variaciones en los cationes de Ca++ y Mg++
pueden afectar los resultados de aminoglucósidos y tetraciclinas para
P. aeruginosa, exceso de cationes pueden dar una falsa resistencia y
baja cantidad de cationes una falsa sensibilidad. Variaciones en los
niveles de calcio pueden afectar los resultados para daptomicina.
Excesiva cantidad de iones de zinc puede dar una falsa resistencia a
carbapenemes
 Cantidad de timina y timidina: Una cantidad excesiva de timina y
timidina puede revertir el efecto inhibitorio de sulfonamidas y
trimetoprim causando una falsa resistencia.
 pH: Debe estar entre 7.2 y 7.4. Un pH bajo puede bajar la potencia de
aminoglucosidos y macrólidos mientras que otros agentes
antimicrobianos pueden parecer tener mayor actividad como las
tetraciclinas. Si el pH es alto se observa el efecto contrario.
 Turbidez del Inóculo: Preparar el inóculo del microorganismo con
suspensión directa de la colonia; se ajusta la suspensión del
microorganismo a la turbidez equivalente al estándar 0.5 McFarland.
También se puede preparar el inoculo por el método de crecimiento,
cuando la colonia es difícil de suspender directamente, ajustando la
turbidez al estándar 0.5 McFarland.
 Sensidiscos: Los Sensidiscos del antimicrobiano deben ser
almacenados en refrigeración a 8ºC o en refrigeración a -14ºC, con
desecante. Antibióticos lábiles como son β lactámicos,

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carbapenemes, ácido clavulánico y tetraciclinas pueden ser


almacenados en congelación y dejar en refrigeración los antibióticos
que usan de rutina.
 Incubación: Incubar las placas en ambiente aerobio a 35±2ºC de 16 a
18 horas para microorganismo no exigentes.
 Lectura: Se mide el diámetro de la zona completa de inhibición,
incluyendo el diámetro del disco, utilizando una regla o vernier
milimétrico y luz reflejada o transmitida.

VII. RESULTADOS
7.1. REPRESENTACIÓN GRÁFICA:

Staphylococcus aureus Streptococcus mutans

Enterococcus faecalis

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7.2. Mediciones y conclusiones:

MICROORGANISMO ANTIBIÓTICOS Halo (mm) CONCLUSIÓN (R-I-S)

Staphylococcus aureus

Streptococcus mutans

Enterococcus faecalis

VIII. BIBLIOGRAFÍA
1. Picazo J. Procedimientos en Microbiología clínica en líneo [consultado el 21
de Febrero del 2017]. Disponible en: coesant
seimc.org/documents/MétodosBásicos_SensibilidadAntibióticos.pdf
2. Sacsaquispe R., Velásquez J. Manual de Procedimientos para la Prueba de
Sensibilidad Antimicrobiana por el Método de Disco Difusión. Instituto
Nacional de Salud. Lima; 2002.
3. Gilbert A., Angel M. Interpretación clínica del Laboratorio. 7ª. Editorial
Médica Panamericana. Bogotá. 2007.
4. Sham D. The role of clinical microbiology in the control and surveillance of
antimicrobial resistance. ASM News. 1996;62:25-9.
5. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for
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CLSI document M100-S19. Wayne, PA: CLSI; 2009.
6. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST): Expert
rules in antimicrobial susceptibility testing, 2008. Disponible en:
http://www.srga.org/eucastwt/MICTAB/index.html
7. Mesa Española de Normalización de la Sensibilidad y Resistencia a los
Antimicrobianos (MENSURA). Recomendaciones del grupo MENSURA par la
selección de antimicrobianos en el estudio de la sensibilidad y criterios para
la interpretación del antibiograma. Rev Esp Quimioterap. 2000;13:73-86.

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PRÁCTICA No 13

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE COCOS GRAM POSITIVOS

SESIÓN 13 FECHA 27/11/2019 DURACIÓN 100 minutos

Clasifica con precisión a las enfermedades bucodentales según


CAPACIDAD su ubicación y tipo de agente causal con actitud participativa
y respetando la opinión de sus compañeros.

I. INTRODUCCIÓN
Los cocos Gram positivos son un grupo heterogéneo de bacterias. Las
características que tienen en común son su forma esférica, su reacción a la
tinción de Gram y la ausencia de endosporas. La presencia o ausencia de
actividad catalasa es una prueba sencilla que se utiliza para subdividirlas en
varios géneros. Las catalasas son enzimas que catabolizan peróxido de
hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso. Cuando se pone en contacto una
gota de solución de peróxido de hidrógeno con una colonia productora de
catalasa, aparecen burbujas a medida que se forma oxígeno gaseoso.
El nombre del género STAPHYLOCOCCUS se refiere a que las células de estos
cocos se desarrollan en un patrón que recuerda a un racimo de uvas; sin
embargo, los microorganismos presentes en muestras clínicas aparecen como
células aisladas, en pares o en cadenas cortas. La mayor parte de los
estafilococos tiene un diámetro de entre 0,5 y 1 m y son anaerobios
facultativos (es decir, crecen aerobia y anaerobiamente), inmóviles capaces
de crecer en un medio con una elevada concentración de sal (p. ej., cloruro
sódico al 10%) y a temperaturas de 18-40 °C.
Estas bacterias están presentes en la piel y las mucosas del ser humano. En la
actualidad, el género comprende 40 especies y 24 subespecies, muchas de
las cuales se encuentran en el ser humano. Algunas especies se desarrollan en
nichos muy específicos en los que se encuentran habitualmente. Por ejemplo,
Staphylococcus aureus coloniza las narinas anteriores, Staphylococcus capitis
crece en regiones con glándulas sebáceas (como la frente) y Staphylococcus
haemolyticus y Staphylococcus hominis se hallan en zonas dotadas de
glándulas apocrinas (como la axila).
Los estafilococos conforman un importante grupo de patógenos en el ser
humano y originan un amplio espectro de enfermedades sistémicas que
pueden poner en peligro la vida, infecciones de la piel, los tejidos blandos, los
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huesos y el aparato genitourinario e infecciones oportunistas. Las especies que


se asocian con mayor frecuencia a enfermedad en el ser humano son S.
aureus (el miembro más virulento y mejor conocido del género),
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus
lugdunensis y Staphylococcus saprophyticus.
Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) es importante porque
produce graves infecciones en pacientes hospitalizados y más recientemente
también de forma extrahospitalaria en niños y adultos previamente sanos. Las
colonias de S. aureus son doradas como consecuencia de los pigmentos
carotenoides que se forman durante su crecimiento y que dan el nombre a la
especie. Es la única presente en las personas que produce la enzima
coagulasa.
Cuando se suspende una colonia de S. aureus en un tubo con plasma, la
coagulasa se une a un factor sérico y el complejo convierte el fibrinógeno en
fibrina, lo que da lugar a un coágulo. Dado que las restantes especies
estafilocócicas carecen de la capacidad de producir coagulasa, son
conocidas colectivamente como estafilococos coagulasa-negativos.
Por otra parte, el género ESTREPTOCOCCUS ha sido objeto de numerosas
revisiones en la literatura científica, y su nomenclatura ha sido modificada con
frecuencia; son varias las especies que se han transferido de un subgrupo a
otro, se han añadido o se han redefinido. En estos últimos años, con la
aplicación de técnicas moleculares, la taxonomía y la clasificación del género
han sufrido algunas modificaciones. Muchas especies son difíciles de
diferenciar por sus características fenotípicas, algunas sólo se pueden
identificar empleando técnicas moleculares, e incluso hay casos en que ni
siquiera así se puede llegar a una identificación completa y segura.
El género Streptococcus es un grupo muy heterogéneo, formado por
bacterias de forma redondeada, Gram positivas, con tendencia a formar
cadenas o parejas, que se hallan ampliamente distribuidas en la naturaleza.
Hay especies que son importantes patógenos para el ser humano, pero la
mayoría son comensales, miembros de la microbiota normal humana de piel
y mucosas. Los estreptococos son descritos en el Bergey’s Manual of
Systematic Bacteriology como bacterias que forman células ovoides o
esféricas, de menos de 2 µm de diámetro, Gram positivas, catalasa negativas,
anaerobias facultativas, con tendencia a formar cadenas o parejas.
Fermentan la glucosa produciendo ácido láctico.
El contenido de guanina y citosina (G + C) del ADN está entre 34 y 46 mol%.
Las distintas especies del género Streptococcus, excepto S. thermophilus,
crecen bien en medios enriquecidos con sangre, suero o carbohidratos, a 35-

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37 oC, especialmente si son incubados en una atmósfera con dióxido de


carbono al 5-7%. Algunas especies necesitan el CO2 para crecer, como algún
S. pneumoniae y ciertos estreptococos del grupo viridans. Muchos
estreptococos, el neumococo entre ellos, crecen mejor en condiciones
anaerobias. En general, las colonias de los estreptococos en agar sangre no
son pigmentadas. La característica de algunas especies es formar colonias
grandes, mientras que otras forman colonias pequeñas (colonias puntiformes
o minute, menores de 0,5 mm de diámetro). La clasificación más actual
basada en la secuencia del gen 16SrRNA, los estreptococos se clasifican en 5
grandes grupos.
1. Grupo piogénico: formado principalmente por especies betahemolíticas,
de colonias grandes, y que incluye especies que son patógenos importantes
para el ser humano.
2. Grupo mitis: incluye al patógeno neumococo (S. pneumoniae) y a otros
estreptococos habituales de la cavidad oral, que producen alfahemólisis en
agar sangre.
3. Grupo anginosus o milleri: formado por especies que se encuentran en la
cavidad oral humana, en el tracto genital y gastrointestinal, con colonias
de tamaño pequeño y característico olor a caramelo.
4. Grupo salivarius: incluye 3 especies de estreptococos genotípicamente
relacionados, que normalmente se encuentran en la cavidad oral humana:
S. vestibularis, S. salivarius y S. thermophilus. El último de ellos se relaciona con
productos lácteos.
5. Grupo bovis: formado por especies que principalmente habitan en el canal
intestinal de los animales y que, en ocasiones, infectan a humanos.
Pertenecen al grupo D de Lancefield.
Además de estos 5 grupos, existe otro denominado “grupo mutans” que
engloba 8 especies que no están incluidas en los grupos mencionados
anteriormente, y que son genéticamente diversas, aunque fenotípicamente
similares. En este grupo hay especies relacionadas con la producción de la
caries dental.

II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO (POR MESA DE TRABAJO)
 Cultivo de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y
Enterococcus faecalis en medio sólido.
 12 placas petri con agar sangre.
 12 placas petri con agar chocolate.
 12 placas petri con agar manitol salado.
 100 mL de caldo Mueller-Hinton estéril.

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 100 mL de cada uno de los siguientes medios de cultivo diferencias: TSI,


LIA, CITRATO, RM-VP, MIO (SIM), CALDO UREA.
 50 tubos de ensayo de 13 x 100 mm estériles en dos gradillas.
 03 Asa bacteriológica en anillo y 03 en punta.
 Set de Tinción Gram (Cristal violeta, lugol, alcohol-acetona y safranina).
 Aceite de inmersión y 100 mL de agua destilada estéril y 100 mL de SSFE.
 01 Incubadora microbiológica y 03 Microscopios ópticos.
2.2. DEL ALUMNO
Individual:
 Barreras de bioseguridad: Guantes, mascarilla y cofia.
 01 Marcador indeleble y 01 fosforo o encendedor.
Grupal:
 Secreción faríngea (muestra reciente tomada en frasco estéril).
 Plasma sanguíneo (extraído recientemente).
 01 Caja de láminas portaobjeto.
 05 Jeringas hipodérmicas de 5 mL.
 50 g. de Almidón.
 100 mL de agua oxigenada.

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. GÉNERO STAPHYLOCOCCUS
A. PRUEBA DE CATALASA
1. En una lámina portaobjeto limpia y desengrasada, colocar una
gota de peróxido de hidrógeno.
2. Con ayuda de un asa bacteriológica y cerca al fuego del mechero
tomar una colonia bacteriana y sumergirla en la gota de peróxido
de hidrógeno.
3. La prueba es positiva si se observa una efervescencia por
desprendimiento de oxígeno.

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B. ESTUDIO DEL CRECIMIENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN AGAR


MANITOL SALADO.
Comparar una placa Petri que
contenga agar manitol salado sin
sembrar con una que contenga un
cultivo de Staphylococcus aureus
de 24 horas. Analizar:
1. Color del medio de cultivo antes y
después.
2. Color de las colonias de
Staphylococcus aureus.
C. HEMÓLISIS DE Staphylococcus aureus EN AGAR SANGRE.
Comparar una placa Petri que
contenga agar sangre sin sembrar
con una que contenga un cultivo de
S. aureus de 24 horas. Analizar:
1. Tipo de Hemólisis.
2. Color de la colonia de S. aureus.

BETA HEMÓLISIS
D. PRUEBA DE COAGULASA.
Con el asa estéril obtenga una ufc beta hemolítica aislada y mézclela
con 0.5 ml de plasma sanguíneo. Incube a 37 oC por 30 min. Observar
la formación de coágulo. Si no hay, leer cada 30 min durante 2 h. Si
hay coagulación del plasma, la bacteria es coagulasa positivo.

3.2. GÉNERO STREPTOCOCCUS


A. DETERRMINACIÓN DE CAPACIDAD HEMOLÍTICA
En cuanto a los requerimientos nutricionales el género Streptococcus
es exigente y por lo tanto debe ser cultivado en medios ricos que le

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aporten los nutrientes necesarios, por ejemplo, agar sangre ovina al


5%. Dentro de las pruebas bioquímicas para la identificación, la
primera, luego de determinar que se trata de cocos Gram positivos,
es la prueba de la catalasa. Luego de determinar que se trata de
cocos Gram positivos, catalasa negativos, debemos observar el
efecto que producen las colonias de la cepa en estudio sobre placas
de agar sangre ovina al 5% (tipo de hemólisis). Así podemos clasificar
este grupo de gérmenes en:
1. BETA-HEMOLÍTICOS: son aquellos que producen una hemólisis total
de los glóbulos rojos, observándose como un halo transparente
alrededor de las colonias.
2. ALFA-HEMOLÍTICOS: son aquellos que producen hemólisis parcial, la
cual se observa como un halo con tonalidad verdosa alrededor de
las colonias.
3. GAMMA-HEMOLÍTICOS: son aquellos que no producen hemólisis
sobre el agar sangre.

BETA HEMÓLISIS ALFA HEMÓLISIS GAMMA HEMÓLISIS

B. SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA
Separa el Streptococcus pyogenes de los demás estreptococos beta
hemolíticos. El 99% de las cepas de Streptococcus pyogenes son
sensible a bajas concentraciones de bacitracina (discos con 0,04 U).
Un 5% de las cepas de Streptococcus agalactiae son sensibles a la
bacitracina.
 Se realiza sembrando 3-4 colonias, tomadas con asa
bacteriológica de un cultivo puro, que se estrían sobre una placa
de agar sangre en varias direcciones intentando obtener un cultivo
confluente.
 Luego se coloca el disco de bacitracina y se incuba 18-24 horas a
35-37ºC.

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 La aparición de cualquier halo de inhibición del crecimiento


alrededor del disco se considera una prueba positiva (no importa
el diámetro del halo).

C. HIDROLISIS DEL PYR


Separa Streptococcus pyogenes y Enterococcus de los demás
estreptococos. S. pyogenes y Enterococcus poseen la capacidad de
hidrolizar el substrato PYR (pirridonil ß-naftilamida) debido a que
poseen la enzima l-piroglutamil aminopeptidasa. Existen varias
configuraciones comerciales de este test por eso no detallaremos
ninguna en particular. En general siempre se revelan por un cambio
de color. Este test es más específico y menos laborioso que realizar el
test de sensibilidad a la bacitracina, la bilis esculina y caldo salado (se
verán más adelante).

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D. BILIS ESCULINA
Esta prueba permite diferenciar los estreptococos
del grupo D y Enterococcus de los demás grupos
de estreptococos. Se basa en la capacidad de los
estreptococos del grupo D y Enterococcus para
crecer en un medio de cultivo con 40% de bilis y de
hidrolizar la esculina a esculetina; ésta se combina
con el citrato ferroso que posee el medio, dando
un complejo de color negro. La concentración de
bilis es fundamental, ya que existen estreptococos
del grupo viridans que son capaces de crecer a
concentraciones menores de bilis.
 Se realiza sembrando en superficie tubos de agar bilis esculina
inclinado.
 Una reacción positiva se evidencia como ennegrecimiento del
medio.
E. PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL (CALDO SALADO)
Separar los Enterococcus, capaces de crecer en caldo salado, de los
demás estreptococos del grupo D. Esta prueba se fundamente en la
capacidad de los enterococos de crecer en una concentración de
6,5% de NaCl. Se trata de un medio de cultivo líquido que contiene
además de NaCl, glucosa y un indicador de pH: púrpura de
bromocresol.
 Se inocula el caldo salado con la cepa a estudiar y se incuba 18-
24 horas a 35ºC.
 Se considera la prueba positiva cuando aparece turbidez con o sin
acidificación del medio, que se observa como un viraje de color
del púrpura al amarillo. La no aparición de turbidez indica una
prueba negativa.

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F. SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA
Sirve para diferenciar S. pneumoniae de otros estreptococos β-
hemolíticos se fundamenta en la sensibilidad de S. pneumoniae a una
concentración menor o igual a 5 µg/mL de hidroxicuprina
(optoquina).
 Estriar un cuadrante de una placa de
agar sangre en varias direcciones.
 Con una suspensión Mc Farland 0,5.
 Colocar luego un disco de optoquina
en el centro del área estriada.
Incubar 18-24 horas a 37ºC en 5-10%
de CO2.
 Los halos de inhibición iguales o
mayores a 14 mm (Disco de 6 mm); o
iguales o mayores a 16 mm (Disco de
10 mm), indican sensibilidad.

3.3. GÉNERO ENTEROCOCCUS


La mayoría de los laboratorios sólo necesitan diferenciar entre
Enterococcus faecalis y E. faecium, cobrando especial relevancia su
distinción de las otras especies del género, frente a una cepa resistente a
vancomicina. Las pruebas bioquímicas que permiten el diagnóstico de
género son: catalasa (negativa), hemólisis (γ), NaCl 6,5% (+), bilis esculina
(+) y PYR (+). Para el diagnóstico de especie se aconseja determinar, en
primer lugar, acidificación de arabinosa (ya sea el azúcar disuelto en
caldo o por medio de tabletas comerciales) y tolerancia al telurito (agar
telurito al 0,04% o tableta comercial). La determinación de movilidad en
medio MIO (movilidad-indol-ornitina) y la presencia de pigmento amarillo,
observado tomando cultivo con tórula de una placa de agar sangre, son
pruebas complementarias para la diferenciación de especies sin
relevancia desde el punto de vista de diseminación de resistencia.

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IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Después de observado el crecimiento microbiano,
autoclavar las placas de petri y los tubos con los cultivos bacterianos a 121°C
/15 libras de presión / 20 minutos. Posteriormente, el material de vidrio deberá
ser lavado con agua y detergente y enjuagado varias veces. Se envolverá en
papel y luego esterilizará en horno a 180°C por 2 horas para su reutilización.

V. EVALUACIÓN
En todos los casos señale la opción CORRECTA. Puede haber más de una
opción correcta o ninguna. Justifique cuando una opción es incorrecta.
1. En referencia a las características generales de Staphylococcus aureus:
a. Es un coco gram-positivo que se agrupa formando racimos.
b. Respecto a su requerimiento de oxígeno, es un anaerobio estricto.
c. Puede formar parte de la microbiota del humano.
d. Sólo causa infecciones a individuos hospitalizados.
e. Son de crecimiento rápido. Forman colonias sobre agares en 24 horas.
f. Respecto de su metabolismo, fermentan y oxidan los azúcares.
g. Da reacción positiva a la prueba de la coagulasa.
h. Su desarrollo se inhibe en medios hipersalados.
i. Sus colonias generan hemólisis completa en agar sangre.
j. En cultivo sobre agar forma colonias muy pequeñas, transparentes,
apenas visibles.
2. En referencia a las envolturas de Staphylococcus aureus:
a. Posee una gruesa pared bacteriana.
b. Su pared celular es rica en peptidoglucano.
c. El peptidoglucano carece de funcionalidad alguna y es sólo un
componente estructural.
d. Su membrana externa es rica en ácidos teicoicos.
e. Funcionalmente, la proteína A de su pared es un factor de evasión de la
respuesta inmune.
f. Dada la constitución de sus envolturas, ofrece muy poca resistencia a los
agentes ambientales.
g. Sus envolturas poseen diversas proteínas de adherencia a distintos
ligandos del hospedero.
h. Algunas adhesinas de S. aureus están localizadas en fimbrias.
i. Su cápsula está compuesta de ácido hialurónico.
j. El ácido lipoteicoico actúa sobre los “toll-like receptor “tipo 2 (TLR2).

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3. En referencia a factores de virulencia solubles de Staphylococcus aureus:


a. S. aureus produce enterotoxinas, que son responsables de la intoxicación
alimentaria.
b. Secreta un polisacárido que forma una fina cápsula que determina el
serotipo (5 u 8).
c. S. aureus produce leucocidinas, que se asocian a daño leucocitario.
d. La toxina del síndrome del shock tóxico (TSST-1) actúa formando poros en
la membrana celular.
e. S. aureus produce hemolisinas, que actúan causando daño a las
membranas celulares.
f. S. aureus afecta al miocardio por medio de una toxina, cuyo toxoide se
usa como vacuna.
g. Las exfoliatinas A y B se asocian a la formación de abscesos.
h. S. aureus carece de la capacidad de regular la producción de factores
de virulencia solubles.
i. La falta de producción de catalasa por S. aureus los diferencia de los
Streptococcus.
j. La producción de coagulasa permite una clasificación útil de los
Staphylococcus.
4. En referencia a las enfermedades que Staphylococcus aureus causa:
a. En el síndrome de la piel escaldada, las exfoliatinas A y B son un
determinante de patogenicidad.
b. En el síndrome de shock tóxico, la alfa-hemolisina es un determinante de
patogenicidad.
c. S. aureus es considerado en general un patógeno multifactorial.
d. S. aureus sólo causa infecciones en la puerta de entrada, sin
diseminación.
e. En las infecciones de piel y partes blandas por S. aureus no se genera pus.
f. S. aureus causa fascitis necrotizante, con rápida diseminación a músculo.
g. Una infección de piel por S. aureus puede conducir a un síndrome del
shock tóxico.
h. S. aureus causa frecuentemente osteomielitis asociadas a implante de
prótesis óseas.
i. S. aureus puede causar neumonías por aspiración en, por ejemplo,
alcohólicos crónicos.
j. S. aureus causa frecuentemente infecciones en pacientes con
quemaduras extensas.
5. En referencia a los Staphylococcus coagulasa-negativos (SCN):
a. S. epidermidis y S. saprophyticus son las especies de SCN con mayor
importancia médica.

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b. Carecen de la capacidad de causar infección endógena.


c. Pueden causar intoxicación alimentaria, produciendo vómitos y diarrea.
d. Es un típico oportunista que causa infección intrahospitalaria.
e. Es muy destacable su capacidad de formar biopelícula.
f. Las biopelículas que forman los SCN permiten su adherencia a sondas,
catéteres y prótesis.
g. Los SCN permanecen en la puerta de entrada y carecen de la
capacidad de diseminación sanguínea.
h. Pueden causar endocarditis en adictos intravenosos.
i. Pueden causar infección urinaria en mujeres jóvenes de la comunidad.
j. Causa faringitis con la posibilidad de desarrollar complicaciones
cardíacas tardías.
6. En referencia a las características generales de los Streptococcus:
a. Son cocos gram-positivos agrupados en cadena.
b. De crecimiento rápido. Forman UFC al cabo de 24-36 horas de cultivo.
c. Sólo pueden oxidar los azúcares, no pueden fermentarlos.
d. Son bacterias con mínimos requerimientos nutricionales y pueden crecer
en medios pobres.
e. Dan reacción positiva a la prueba de la catalasa.
f. Algunas especies difieren en su capacidad de producir hemólisis en
cultivo en agar sangre.
g. La mayoría de las especies, tras 24-36 horas de cultivo, forman colonias
grandes, pigmentadas.
h. Se las denomina fastidiosas porque las cepas con importancia médica
desarrollan más lentamente.
i. La clasificación de Lancefield y el tipo de hemólisis tienen utilidad para
orientar la identificación de especies.
j. Una de las especies beta hemolíticas con mayor importancia médica es
S. pneumoniae.
7. En referencia a Streptococcus pyogenes (estreptococos beta-hemolíticos
grupo A – EGA):
a. La proteína M y las exotoxinas SpeA, SpeB y SpeC caracterizan a las cepas
más patógenas.
b. Es la causa más frecuente de faringitis en niños y adolescentes de la
comunidad.
c. La escarlatina es una manifestación cutánea causada por una exotoxina
pirogénica.
d. La Glomerulonefritis aguda es una complicación no supurativa asociada
a fenómenos de mimetismo molecular.
e. Las cepas invasivas que producen SpeA pueden causar shock tóxico.

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f. Causan infecciones de piel localizadas, sin diseminación a tejidos


contiguos.
g. Es sensible a la bacitracina, lo que permite un reconocimiento temprano
en cultivo.
h. Causa infecciones piógenas, tanto superficiales como invasivas.
i. El depósito de inmunocomplejos caracteriza a una de las complicaciones
no supurativas postestreptocóccicas.
j. El aislamiento EGA en una faringitis exige la eliminación de la bacteria por
tratamiento.
8. En referencia a Streptococcus pneumoniae:
a. Puede integrar la microbiota normal nasofaríngea e infecta a individuos
de la comunidad.
b. Su reservorio exclusivo es el humano.
c. Desarrolla en agar sangre con producción de hemólisis completa.
d. La ausencia de cápsula permite su diseminación sanguínea.
e. Las cepas patógenas producen neumolisina.
f. Produce IgA proteasa, factor que actúa en la etapa de evasión.
g. Frecuentemente causa meningitis en niños menores de 3 años.
h. Es un frecuente causal de neumonía en individuos de la comunidad de
ambos extremos etarios (niños y ancianos).
i. Existen solo 2 serotipos capsulares, A y B.
j. La conjugación covalente entre el polisacárido capsular y una proteína
se ha ensayado con éxito en la construcción de una vacuna.
9. En referencia a Streptococcus agalactiae:
a. Sus envolturas contienen ácido lipoteicoico, que tiene acción tóxica.
b. En sus envolturas, el peptidoglicano está reemplazado por proteínas de
la membrana externa (Omp)
c. Es una bacteria capsulada.
d. Es alfa hemolítica cuando se la cultiva sobre agar sangre.
e. Es un patógeno multifactorial del grupo B de Lancefield.
f. Causa infección severa en la paciente sólo al inicio del embarazo.
g. Puede causar infección ascendente en la mujer grávida y ocasionar
corioamnionitis.
h. La corioamnionitis en la mujer grávida promueve la infección neonatal.
i. Puede causar neumonía, sepsis y meningitis en recién nacidos.
j. Causa infección severa necrotizante de piel y partes blandas en adultos
inmunocompetentes.

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VI. FUNDAMENTACIÓN
6.1. HEMÓLISIS EN AGAR SANGRE
El agar sangre se prepara utilizando un medio base puede ser agar base
sangre, agar Mueller-Hinton, o una combinación de nutritivo con agar soya
tripticasa al cual después de su preparación y esterilización hay que
incorporarle en condiciones de esterilidad 5% de sangre ovina, bajo ciertas
circunstancias puede usarse sangre humana. Es un medio de aislamiento
especialmente diseñado para facilitar el crecimiento de microorganismos
exigentes, bacterias Gram positivas y todas las especies encontradas en
muestras de origen clínico. Se usa también para observar la capacidad
hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de
virulencia). Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se
determina el tipo de hemólisis que genera, y estos pueden ser:
 Alfa: Halos verdosos (reducción de la hemoglobina de los glóbulos rojos
a metahemoglobina en el medio, formación de biliverdina).
 Beta: Halos incoloros (hemólisis total).
 Gamma: Inexistencia de halos (sin hemólisis).
Staphylococcus aureus, presentan beta hemólisis en agar sangre, aunque
algunas cepas pueden carecer de hemolisinas, Staphylococcus
saprophyticus, Staphylococcus epidermidis no producen hemólisis en agar
sangre.
6.2. CRECIMIENTO EN AGAR MANITOL SALADO
El agar Manitol Salado es un medio de cultivo selectivo y diferencial,
utilizado para el aislamiento y diferenciación de estafilococos. Es
recomendable para el aislamiento de estafilococos patógenos a partir de
muestras clínicas, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria. Es
un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los
estafilococos coagulasa positivos hidrolizan el manitol acidificando el
medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los
estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una
zona roja o púrpura. En el medio de cultivo, el extracto de carne y la
pluripeptona constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y
minerales, el manitol es el carbohidrato fermentable, el cloruro de sodio
(que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que
inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo de fenol es el
indicador. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración
de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el
pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo a amarillo.

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Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no


fermentar el manitol.
6.3. Streptococcus pyogenes
Es la especie más importante de los estreptococos del grupo A. Origina
diversas enfermedades supurativas, aunque este microorganismo
constituye la causa más frecuente de faringitis bacteriana. Las cepas de
Streptococcus pyogenes, son cocos esféricos de diámetro comprendido
entre 1 y 2 µm que forman cadenas cortas en las muestras clínicas y
cadenas de mayor longitud cuando crecen en medios de cultivo líquido.
Su crecimiento es óptimo en el medio de agar sangre enriquecido, pero se
inhibe cuando contiene una concentración elevada de glucosa.
6.3.1. ENFERMEDADES PROVOCADAS POR ESPECIES DE ESTREPTOCOCOS.

Streptococcus pyogenes
ENFERMEDAD DESCRIPCION
INFECCIONES SUPURATIVAS
Faringitis Faringe enrojecida con presencia frecuente de exudados.
Escarlatina Exantema eritematoso difuso que comienza en el tórax y se
extiende posteriormente a las extremidades; complicación
de faringitis estreptocócica.
Pioderma Infección cutánea localizada con vesículas que avanzan a
pústula; sin indicios de enfermedad sistémica.
Erisipela Infección cutánea localizada con dolor, inflamación,
adenopatía y síntomas sistémicos.
Celulitis Infección cutánea que afecta a los tejidos sub cutáneos.
Fascitis necrosante Infección profunda de la piel que provoca la destrucción de
capas musculares y de tejido adiposo.
Síndrome del shock Infección multiorgánica que remeda el síndrome del shock
toxico toxico estafilocócico; no obstante la mayor parte de los
estreptocócico pacientes presentan bacteriemia e indicios de Fascitis.
INFECCIONES NO SUPURATIVAS
Fiebre reumática Caracterizado por alteraciones inflamatorias del corazón,
articulaciones, vasos sanguíneos y tejidos subcutáneos.
Glomerulonefritis Inflamación aguda de los glomérulos renales con edema,
aguda. hipertensión, hematuria y proteinuria.
Streptococcus agalactiae (grupo B).
Enfermedad En el transcurso de los 7 días siguientes al nacimiento, los
neonatal de neonatos infectados desarrollan signos y síntomas de
comienzo precoz neumonía, meningitis y septicemia.
Enfermedad neonatal Más de una semana después del nacimiento, los neonatos
de comienzo tardío presentan signos y síntomas de bacteriemia con meningitis.
Infecciones en Más a menudo, se manifiestan con infecciones del aparato
mujeres gestantes urinario; pueden provocar bacteriemia y complicaciones
diseminadas.

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Infecciones en otros Las enfermedades más frecuentes son la bacteriemia, la


pacientes adultos neumonía, infecciones óseas y articulares, infecciones
cutáneas y de partes blandas.
Streptococcus pneumoniae
Inicio agudo con escalofríos intensos y fiebre mantenida; tos
Neumonía productiva con esputo tenido de sangre; consolidación
lobular.
Infección grave que afecta a las meninges y cursa con
Meningitis cefalea, fiebre y septicemia; elevada mortalidad y graves
deficiencias neurológicas en los supervivientes.
Más frecuente en pacientes aquejados de meningitis que en
Bacteriemia aquellos con neumonía, otitis media o sinusitis; septicemia
fulminante en pacientes esplénicos

VII. RESULTADOS
7.1. GÉNERO STAPHYLOCOCCUS: TINCIÓN GRAM

Especie:

Aumento:

Coloración:

Disposición:

7.2. GÉNERO STREPTOCOCCUS: TINCIÓN GRAM

Especie:

Aumento:

Coloración:

Disposición:

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


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7.3. GÉNERO ENTEROCOCCUS: TINCIÓN GRAM

Especie:

Aumento:

Coloración:

Disposición:

7.4. PRUEBAS FENOTÍPICAS: COLOCAR LA LECTURA CORRESPONDIENTE.

Bacteria (ufc) Gram Catalasa Coagulasa Manitol Hemólisis Bacitracina Optoquina PYR Bilis-esculina

S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
Streptococcus α-
hemolítico
Streptococcus β-
hemolítico
Streptococcus ɣ-
hemolítico
Enterococcus faecalis

VIII. BIBLIOGRAFÍA
1. Murray P, Baron E, Pfaller M, Tenover F, Yolken R. Manual of Clinical
Microbiology. 7th edition. Edited by ASM Press. Washington; 1999.
2. Brogden K, et al. Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogens. 3rd ed.
Edited by ASM Press. Washington; 2000.
3. Roitt W. Microbiología Médica, 2ª edición. Mosby, Harcourt Brace. España;
1999.
4. Palavecino E. Puesta al día en Enterococcusaño 2001: identificación de
especies y estudio de susceptibilidad antimicrobiana. Rev Chil Infect 2001;
18: 95-100.
5. Juliet C. Estudio de susceptibilidad in vitro de Enterococcus spp. Rev Chil
Infect 2002; 19: S111-S5.
6. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Sixteenth
Informational Supplement, CLSI. 2006.

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PRÁCTICA No 14

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE Candida albicans

SESIÓN 14 FECHA 04/12/2019 DURACIÓN 100 minutos

Clasifica con precisión a las enfermedades bucodentales según


CAPACIDAD su ubicación y tipo de agente causal con actitud participativa
y respetando la opinión de sus compañeros.

I. INTRODUCCIÓN
Los hongos corresponden a un reino independiente, son heterotróficos y
eucariotas, porque el genoma está organizado en un núcleo envuelto por una
membrana contigua al retículo endoplásmico, presentan organelos celulares
como mitocondrias, ribosomas, vacuolas, cuerpos lipídicos y otros. De las más
de 100.000 especies de hongos descritas, solo 100 son conocidas por participar
regularmente en micosis humanas y animales. En la actualidad el reino Fungi,
se divide en dos subreinos, Dykaria el cual agrupa las divisiones Ascomycota y
Basidiomycota, y el llamado «Hongos Basales», que agrupa al resto de los
hongos. Refiriéndose únicamente a los patógenos, dentro del segundo
subreino se ubican aquellas especies que antes pertenecían a la división
Zygomycota.
Ciertos grupos de hongos se caracterizan por la presencia de su fase
levaduriforme en las etapas de su ciclo de vida, mientras que otros se
caracterizan por su ausencia. Algunos zigomicetos, ascomicetos y
basidiomicetos puede ser dimórficos y pasar de un crecimiento micelial a un
crecimiento tipo levadura en ciertas condiciones ambientales. Se reconocen
dos tipos de reproducción: sexual y asexual; en la reproducción asexual no
participa la cariogamia, la fusión de núcleo y meiosis, tampoco lo hacen los
órganos sexuales, en cambio la reproducción sexual se caracteriza por la
unión de dos núcleos seguida por meiosis resultando en recombinación y
formación de nuevos genotipos.
Dentro de la División Ascomycota, orden Saccharomycetales se encuentra el
género Candida, caracterizado como levadura. Se presenta como células
redondas u ovoides que miden entre 2,0 a 4,0 µm de diámetro,
considerablemente mayor que las cocáceas bacterianas. Las levaduras del
género Candida se reproducen por brotamiento o gemación y en
determinadas condiciones producen un pseudomicelio filamentoso, la

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identificación de este género se hace por características morfológicas y


fisiológicas, como lo es el test de auxonograma y zimograma. Tienen una
distribución amplia en la naturaleza, pudiendo ser encontrados en agua,
vegetales, alimentos y otros; en el ser humano forman parte de nuestra
microbiota residente.
Dentro del género Candida está la especie Candida albicans que es un
comensal común en las membranas de las mucosas de la boca, el intestino y
la vagina de individuos sanos, pero puede invadir localmente, causando, por
ejemplo, candidiasis en niños, vaginitis en mujeres embarazadas y estomatitis
subprotésica hasta en un 50% en personas con dentadura postiza. En casos
extremos, puede crecer sistemáticamente y causar la muerte después de
colonizar la sangre a través de un catéter intravenoso, en el cual las células de
levadura se adhieren. El equilibrio entre la infección, la colonización y la
eliminación depende de la capacidad de las cepas de Candida para
modular la expresión de factores de virulencia en la respuesta a los cambios
del medio ambiente, combinado con la competencia del sistema inmune del
huésped. Para permitir la invasión a los tejidos del huésped, las cepas de
Candida poseen constitutivamente enzimas hidrolíticas que destruyen o
alteran los constituyentes de las membranas. Las enzimas secretadas por C.
albicans, que se cree reflejan su grado de patogenicidad, se clasifican en dos
tipos principales de enzimas llamadas proteasas y fosfolipasas.
Las micosis invasoras son cada vez más frecuentes en la práctica clínica,
afectando especialmente a sujetos con grados variables de
inmunocompromiso, por causas como infección por el Virus de
Inmunodeficiencia Humana (VIH) y enfermedades hematológicas malignas.
Además, se presentan en forma secundaria a tratamientos agresivos como
cirugía mayor, terapia anti retroviral, quimioterapia, trasplante de precursores
hematopoyéticos y tratamientos antimicrobianos de amplio espectro. La
frecuencia de aislamiento de las diferentes especies presenta variaciones
significativas dependiendo de la ubicación geográfica.
En todo el mundo C. albicans sigue siendo la especie más aislada, pero de las
especies distintas de C. albicans se observan variaciones considerables, pues
en Norteamérica hay un claro predominio de C. glabrata, en cambio en
América del Sur se encuentra principalmente C. parapsilosis y C. tropicalis. En
inmunodeprimidos, cada vez se describen con más frecuencia otras especies
de Candida, que incluyen C. parapsilosis, C. krusei, C. glabrata o C tropicalis.
Otras especies menos comunes son C. guilliermondi o C. lusitaniae. Es
necesario reconocerlas porque algunas especies son intrínsecamente
resistentes a los azoles, como C. krusei y C. glabrata. C. lusitania pueden ser
resistente a la anfotericina.
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II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO (POR MESA DE TRABAJO)
 06 Beaker de 250 mL limpios y 03 Asas bacteriológicas en anillo.
 01 Set de Tinción de Gram y aceite de inmersión.
 03 Microscopios ópticos y 03 Estereomicroscopios.
 01 Incubadora microbiológica y 03 mecheros de alcohol o bunsen.
 Cultivo de Candida albicans en medio sólido.
 10 placas con agar sangre y 10 pacas con agar sabouraud.
 100 mL de Caldo Mueller-Hinton esterilizado.
2.2. DEL ALUMNO
Individual:
 Barreras de bioseguridad: Guantes, mascarilla y cofia.
 01 plumón marcador indeleble y 01 fosforo o encendedor.
Grupal:
 01 Paquete de hisopos estériles y 01 Caja de láminas portaobjeto.
 5 mL de Suero sanguíneo (obtenido recientemente).
 01 muestra de exudado proveniente de un tipo de candidiasis.

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
1. Se preparará una extensión en lámina a partir de las muestras traídas
por los estudiantes.
2. Posteriormente se realizará una tinción Gram para identificar la
presencia de levaduras.
3. Es necesario trabajar con todas las medidas de bioseguridad a fin de
evitar contagios.
3.2. VERIFICACIÓN DE LA VIABILIDAD Y PUREZA DE LAS LEVADURAS
1. Para verificar la pureza de las cepas de Candida, éstas deberán ser
sembradas por agotamiento en placas de Petri que contienen
CHROMagar Candida® (CHROMagar Company, París, Francia) o agar
sabouraud e incubadas a 32°C por 72 horas de tal forma que se
obtengan colonias aisladas de un color común verde.
2. Como control de comparación se puede utilizar una cepa de C.
dubliniensis CBS 7987 para la clasificación de los colores, siendo la
observación de colores realizada por dos observadores.
3. Si las crecen especies de levaduras que presentan color blanco
cremoso, necesitarán una identificación bioquímica posterior.
4. A partir de una colonia representativa se depositará una colonia en
agua destilada y se resembrará en Agar sabouraud (MERK) sin

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antibióticos para realizar las pruebas de caldo hipertónico y de


crecimiento a 42°C.
5. En todas estas etapas se pueden utilizar cepas de referencia de C.
albicans ATCC 28367 y C. dubliniensis CBS 7987 sembradas en
CHROMagar Candida®. Se diferencian en la tonalidad verde.
3.3. ANÁLISIS MICROMORFOLÓGICO (MICROCULTIVO)
1. Cada cepa será sembrada con ayuda de un asa bacteriológica en
punta en tres estrías paralelas sobre una placa Petri (60 x15mm), con
agar Arroz Tween-80 (polisorbato), el que se preparará con 20 gramos
de arroz, 20 gramos de peptona, y 10 ml de Tween-80 para 1 litro.
2. Las estrías realizadas sobre el agar se cubren con un cubreobjeto estéril
y la placa se incuba a 36°C durante 48 a 96 horas.
3. Las lecturas serán realizadas diariamente en un microscopio de luz con
objetivos de 10X y 40X. La presencia de clamidoconidios terminales y
únicos es confirmatorio de C. albicans y clamidoconidios múltiples de
C. dubliniensis.
4. Este método debe utilizarse como criterio de inclusión de las levaduras
compatibles con ambas especies.
3.4. ASIMILACIÓN DE FUENTES DE CARBONO (AUXONOGRAMA)
1. A partir de colonias se prepara una suspensión en ADE con una turbidez
equivalente al patrón N°5 de la escala de McFarland.
2. A partir de ella se inoculará 4 mL al medio con fuentes de carbono o
comúnmente llamado medio C, el cual previamente será estabilizado
en baño María de manera que su estado fuera líquido. Luego se
depositará la mezcla en una placa de Petri de 120 x 18 mm.
3. Una vez sólido se agregan diferentes hidratos de carbono. Se incubará
a 32°C y la lectura verificada a las 24 y 48 horas.
4. La presencia de un halo de crecimiento alrededor del hidrato de
carbono se considera como positivo para la asimilación del azúcar.
Esta prueba es fundamental para la identificación de levaduras.
3.5. FERMENTACIÓN DE HIDRATOS DE CARBONO (ZIMOGRAMA)
1. A partir de colonias aisladas del medio CHROMagar Candida®, se
utilizará una suspensión en agua destilada estéril con una turbidez
equivalente al patrón N°5 de la escala de McFarland.
2. A partir de ella se inocularán 200-250 µL a cada uno de los tubos de
fermentación con los diferentes hidratos de carbono.
3. La incubación se realizará a 32°C por un mínimo de 48 horas y un
máximo de 15 días.
4. La presencia de burbujas en la campana de Durham se considerará
como positivo. Esta prueba es utilizada como base para la

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identificación de levaduras en clínica, otorgando la capacidad de


diferenciar otras especies distintas a C. albicans o C. dubliniensis.
3.6. DESARROLLO A 42°C
1. Se realizará la siembra en el medio de cultivo agar Sabouraud sin
antibióticos de cepas provenientes de la siembra en CHROMagar
Candida® o de muestras clínicas y se incubará 42°C durante 48 horas
en una estufa.
2. Las cepas que no presenten crecimiento o su crecimiento sea débil a
esta temperatura serán clasificadas como sospechosas de C.
dubliniensis ya que solo un 9% de esta especie es capaz de
desarrollarse a esta temperatura dentro de las 48 horas.
3.7. PRUEBA DE CALDO HIPERTÓNICO
1. A partir de colonias con coloración verde en el medio CHROMagar
Candida® crecidas durante 48 horas, se preparará una suspensión en
agua destilada estéril con turbidez equivalente al patrón N° 5 de la
escala de McFarland del cual se transfirieron 20 µL a 1 mL de caldo
hipertónico (6,5 gramos de cloruro de sodio en 100 ml de caldo
Sabouraud).
2. La incubación de los 261 aislamientos fue realizada a 32°C por 96 horas.
Esta prueba tiene la capacidad de diferenciar C. albicans de C.
dubliniensis ya que la presencia de turbidez es indicativo de
crecimiento y esto sólo lo realiza C. albicans.
TABLA 1. PRUEBAS FENOTÍPICAS PARA LA CARACTERIZACIÓN DE Candida albicans
PRUEBA Candida albicans Candida dubliniensis
Crecimiento en agar AGS 99% de las cepas En general ninguna cepa logra
a 45ºC por 48 horas presentan crecimiento crecer
Crecimiento en agar AGS Todas las cepas 9% de las cepas logran crecer en
a 42ºC por 48 horas presentan buen estas condiciones
crecimiento
Producción de En general produce Produce clamidosporas
clamidosporas en Agar clamidosporas terminales agrupadas de a pares, tripletas o
arroz cadenas largas, pero no todas
las cepas las producen
Utilización de medio Produce colonias verdes- Produce colonias verdes a las 48
CHROMagar azuladas a las 48 horas a horas a 37ºC, pero solo en
37ºC cultivos primarios
Caldo Hipertónico al 6,5% Presencia de turbidez en No evidencia turbidez en el
el medio medio
Actividad beta- Presencia de actividad Ausencia de actividad
glucosidasa

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IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Después de observado el crecimiento fúngico,
autoclavar las placas de petri y los tubos con los cultivos a 121°C /15 libras de
presión / 20 minutos. Posteriormente, el material de vidrio deberá ser lavado
con agua y detergente y enjuagado varias veces. Se envolverá en papel y
luego esterilizará en horno a 180°C por 2 horas para su reutilización.

V. EVALUACIÓN
En todos los casos señale la opción CORRECTA. Puede haber más de una
opción correcta o ninguna. Justifique cuando una opción es incorrecta.
1. Respecto a las características del género Candida:
a. Son levaduras monogemantes que pueden producir seudomicelio o
micelio verdadero.
b. En los cultivos crecen con un micelio aéreo corto y de aspecto
pulverulento.
c. Su temperatura óptima de crecimiento es de 20 grados.
d. La formación de seudomicelios es exclusiva de la especie C. albicans.
e. La formación de clamidoconidios terminales se observa en la especie
Candida albicans en medios especiales.
f. La identificación definitiva de las especies de Candida se realiza por
pruebas bioquímicas.
g. La formación de tubo germinativo más allá de las tres horas se observa
en levaduras del complejo Candida parapsilosis.
h. Candida albicans, Candida dubliniensis y Candida africana pertenecen
al complejo Candida albicans.
i. El desarrollo de micelio verdadero se observa en levaduras del complejo
Candida albicans.
2. Respecto a la ecología de las levaduras del género Candida:
a. El índice de colonización-portación en el ser humano varía del 20 al 80%.
b. Los sitios de colonización varían de acuerdo a las distintas especies.
c. El complejo parapsilosis coloniza la mucosa oral y vaginal.
d. C. glabrata coloniza las vías urinarias.
e. El complejo C. albicans coloniza el tubo digestivo y la piel.
f. El origen de las candidiasis es primariamente endógeno.
g. La transmisión de especies de Candida, en el ambiente hospitalario, se
favorece por el contacto entre pacientes, con el personal de salud y a
través de los fómites.
h. Durante esta década se ha producido un descenso de la incidencia de
candidiasis invasoras.
i. En nuestro país, C albicans es la especie más frecuentemente aislada,
seguida por C. parapsilosis y C. tropicalis.
j. La frecuencia de especies varía de acuerdo al grupo etario, salas de
cuidados críticos y factores de riesgo.

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3. De acuerdo a los grupos de riesgo para candidiasis:


a. Las infecciones de mucosas están relacionadas a un fenómeno de
hipersensibilidad tipo III.
b. El uso prolongado de antibióticos de amplio espectro contribuye a la
aparición de enfermedad diseminada.
c. El uso de catéteres venosos centrales no representa un riesgo aumentado
de infección candidiasica sistémica.
d. En unidades cerradas, como UCI (unidades de cuidados intensivos), la
incidencia de candidiasis aumenta después de la primera semana de
estadía.
e. Las cirugías abdominales sin perforación del intestino no es un factor de
riesgo para candidiasis sistémica.
f. Las personas mayores de 65 años presentan una incidencia similar de
candidiasis sistémica que los adultos jóvenes.
g. La pancreatitis aguda es un factor de riesgo independiente.
h. En los pacientes HIV positivos con recuentos de linfocitos TCD4+ menores
a 200 es factor predisponente para candidemias.
i. Los adultos jóvenes presentan la misma incidencia de candidiasis
invasora que los neonatos.
j. La colonización de tres áreas anatómicas distintas por Candida albicans,
en pacientes en UCC (unidades de cuidados coronarios), es un factor de
riesgo para desarrollar candidiasis sistémica.
4. De acuerdo a los factores microbianos involucrados en las candidiasis
sistémicas:
a. Las levaduras son patógenos primarios que se trasforman en comensales
cuando invaden los tejidos.
b. La morfogénesis consiste en la habilidad de las levaduras en adoptar
distintas formas fenotípicas.
c. Candida glabrata no es patógena pues es una levadura incapaz de
adoptar distintas formas fenotípicas.
d. El desarrollo de pseudomicelios le permite colonizar prótesis produciendo
biopelículas
e. Adhesinas contribuyen en generar hidrofobicidad a las levaduras y les
permitirían su invasión.
f. Los mananos de la pared facilitan la adhesión a las superficies celulares.
g. Las SAP son enzimas que se liberan en el espacio periplásmico o pueden
estar ancladas en las membranas celulares.
h. La fosfolipasa B se relaciona tanto a la adhesión como a la invasión de
las levaduras en los tejidos.
i. En las biopelículas los antifúngicos son menos activos por el espesor de la
misma y a la sobreexpresión de bombas de eflujo por parte del
microrganismo.
5. Respecto de la patogénesis y la respuesta inmune en candidiasis sistémicas:
a. La inmunidad celular adaptativa cumple un rol fundamental en el control
de las candidemias.
b. La inmunidad celular innata cumple un rol fundamental en el control de
las candidiasis de las mucosas.
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c. La traslocación intestinal por especies de Candida se ve favorecido por


la presencia de mucositis.
d. Los TLR2 reconoce fosfolípidos de las levaduras.
e. TLR4 reconoce mananos e induce respuesta pro inflamatoria.
f. TLR9 puede reconocer ADN fúngico.
g. La dectina-1 es el principal receptor de reconocimiento de los
galactomananos de las levaduras.
h. Los polimorfonucleares neutrófilos solo reconocen blastoconidias,
mientras que los macrófagos solo seudohifas.
i. La respuesta TH17 es un factor importante para la protección de
candidiasis de las mucosas.
j. Las levaduras activan el complemento por las tres vías y el CAM
(complejo de ataque a membrana) puede producir la lisis de las
levaduras.

VI. FUNDAMENTACIÓN
CANDIDIASIS OROFARÍNGEA
A los pacientes con prótesis dentales se les debe sugerir remover y limpiar las
prótesis todas las noches antes de acostarse, mediante cepillado y
sumergiéndolas en una solución de desinfectante. Ante el paciente con
sospecha clínica de candidiasis oral, se requiere investigar los factores
predisponentes y de riesgo: xerostomía, tabaquismo, desnutrición, pérdida de
la integridad de la mucosa oral mediante traumatismo, maceración y oclusión
(prótesis dental), antecedente de quimioterapia, radioterapia, neoplasia,
infecciones crónicas, así como enfermedades endocrinas y estados de
inmunosupresión. El diagnóstico de la candidiasis orofaríngea es
generalmente clínico. El médico de primer contacto debe reconocer e
investigar las lesiones clínicas características, los factores predisponentes
(locales y sistémicos), así como el tipo, la gravedad y la cronicidad de las
lesiones. Para la identificación y el diagnóstico de las lesiones de la mucosa
oral, se requiere de una historia clínica y exploración física completa de la
cavidad oral. El conocimiento de las características clínicas, como el tamaño,
la ubicación, la morfología de la superficie, el color, la presencia o no de dolor
y la duración de las lesiones, son útiles para establecer el diagnóstico.
Para el diagnóstico de la candidiasis orofaríngea, es importante identificar la
localización y el tiempo de evolución de las lesiones, así como investigar la
presencia de comorbilidad y el uso de fármacos, particularmente
antimicrobianos y antineoplásicos. El patrón clínico reconocido con mayor
facilidad es la candidiasis pseudomembranosa (aftas), el cual se presenta
como placas blancas amarillentas que comprometen toda la mucosa bucal,
principalmente en la cara interna de las mejillas, la superficie de la lengua
paladar, encías y piso de la boca y que generalmente pueden desprenderse
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mediante raspado con una gasa o baja lenguas, dejando expuesta una base
eritematosa, habitualmente no dolorosa.
En el diagnóstico diferencial de la forma pseudomembranosa, Hay que
considerar lesiones blancas como quemaduras, leucoplasia, liquen, desechos
alimentarios, infecciones bacterianas o alteraciones congénitas tipo nevo
blanco esponjoso. Frente a una quemadura, la historia clínica será definitiva,
y en el liquen plano (leucoplasia) no se desprenderán las lesiones ni
responderán al tratamiento. Se sugiere considerar una posible candidiasis
eritematosa ante la presencia de manchas rojas localizadas frecuentemente
en el paladar duro y el dorso de la lengua, en pacientes con antecedente de
uso de corticoesteroides o antimicrobianos de amplio espectro.
Ante el paciente con lesiones características de candidiasis eritematosa se
sugiere investigar la presencia de depapilación de la mucosa lingual,
acompañada de la imposibilidad de ingerir alimentos ácidos, picantes y
calientes; disfagia y pérdida del espesor de la lengua. Se sugiere considerar la
sospecha clínica de candidiasis hiperplásica crónica ante la identificación de
placas blancas que no pueden removerse con una gasa o baja lenguas y que
habitualmente se localizan en la mucosa bucal, el paladar y la lengua.
El paciente puede estar asintomático o bien referir ardor, escozor y/o
alteración del gusto. Ante el paciente con candidiasis hiperplásica crónica,
hacer vigilancia y biopsia para confirmar el diagnóstico y excluir displasia.
En el diagnóstico diferencial de las formas hiperplásicas, se sugiere considerar:
queratosis congénitas y leucoplasias, en estos casos los hallazgos de anatomía
patológica y la respuesta al tratamiento, son elementos de apoyo para el
diagnóstico. Durante la exploración física del paciente con queilitis angular se
observa fisuras, eritema y/o lesiones costrosas, en las comisuras labiales.
Habitualmente asintomática o bien asociado con ardor, escozor o irritación.
Se sugiere considerar la sospecha diagnóstica de glositis romboidal media,
ante la presencia de una zona central eritematosa de atrofia papilar de la
lengua, que generalmente se observa en los fumadores o personas que usan
corticoesteroides inhalados.
En la mayoría de los casos, el diagnóstico de la candidiasis orofaríngea se basa
en la identificación de signos y síntomas clínicos. Cuando el diagnóstico clínico
no es claro o el paciente no responde al tratamiento antifúngico empírico, se
pueden considerar pruebas adicionales, tales como: citología exfoliativa,
biopsia de tejido o cultivo y pruebas de sensibilidad.
Se puede sospechar el diagnóstico de candiadiasis esofágica cuando el
paciente con candidiasis bucal refiere disfagia. La confirmación de la

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sospecha clínica de candidiasis se puede obtener por citología exfoliativa. El


material obtenido se debe extender sobre un portaobjetos de vidrio. La
aplicación de unas gotas de hidróxido de potasio al 10% (KOH) al frotis
citológico fresco puede permitir el examen microscópico inmediato de la
preparación.
El médico o el estomatólogo generalmente pueden diagnosticar la
candidiasis bucal observando la boca y la lengua, si el diagnóstico no es claro,
se pueden llevar a cabo los siguientes exámenes: cultivo de lesiones bucales
y examen microscópico de raspados bucales. Para mejorar la sensibilidad, del
frotis citológico puede dejarse secar, fijar con etanol y teñir con ácido
periódico de Schiff.
Se sugiere utilizar la inmunofluorescencia para detectar anticuerpos
anticandida, la cual tiene especial importancia en las candidiasis crónicas y
en estudios clínicos, ya que en estas formas el frotis y el cultivo son menos
concluyentes. En ocasiones es necesario realizar un raspado de la lesión o
zona afectada, para obtener una muestra y enviarla a laboratorio para la
identificación de hifas e incluso realizar cultivo, para confirmar la especie y
sensibilidad.

VII. RESULTADOS
7.1. CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE Candida albicans.

Figura 2. Microcultivo en Agar Tween 80:


Figura 1. Cepas de referencia
Se muestran las estructuras básicas de los
utilizadas en las pruebas fenotípicas
Clamidoconidios. A. forma única. B.
y moleculares sembradas en
agrupados en pares. C. Múltiples en la
CHROMagar Candida®.
muestra de hemocultivo.

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Figura 3. Auxonograma: Prueba Figura 4. Zimograma. En esta prueba se


considerada base. Permite observa la fermentación la glucosa (Glu)
diferenciar C albicans de otras y maltosa (Mal), siendo negativa la
especies de Candida. Azúcares fermentación para sacarosa (Sac),
evaluados en sensidiscos: glucosa, trehalosa (Tre), galactosa (Gal) y lactosa
galactosa, maltosa, sacarosa, (Lac). Característico de C. albicans.
melobiosa y lactosa.

A B
Figura 5.
A. Grupo de cepas con crecimiento a 42°C comparadas con las cepas de
referencia C. albicans ATCC 28367 y C. dubliniensis CBS 7987.
B. C. albicans ATCC 28367 y C. dubliniensis CBS 7987 en caldo hipertónico
fueron utilizadas como control de comparación.

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VIII. BIBLIOGRAFÍA
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units at a university hospital. Rev. Chilena. Infectol, 28, 118-122; 2011.
4. Pineda G., Scollo K., Santiso G., Lehmann E., Arechevala A. Aislamiento de
Candida dubliniensis en distintos materiales clínicos. Análisis de métodos
fenotípicos de diferenciación con Candida albicans. Rev. Argentina
Microbiol., 40, 211-217; 2008.

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PRÁCTICA No 15

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA CARACTERIZACIÓN DE LA MICROBIOTA BUCODENTAL

SESIÓN 15 FECHA 11/12/2019 DURACIÓN 100 minutos

Clasifica con precisión a las enfermedades bucodentales según


CAPACIDAD su ubicación y tipo de agente causal con actitud participativa
y respetando la opinión de sus compañeros.

I. INTRODUCCIÓN
La cavidad bucal se considera un ambiente y sus propiedades influyen en la
composición y la actividad de los microorganismos que en él se encuentran.
El sitio donde los microorganismos crecen es el hábitat. Los microorganismos
que permanecen y se desarrollan en un hábitat particular constituyen una
comunidad microbiana formada por especies individuales. La comunidad en
su hábitat específico junto con los elementos abióticos con los cuales los
microorganismos están asociados, constituyen un ecosistema. El término nicho
ecológico describe la función de los microorganismos en un hábitat particular
y marca su papel en la comunidad. Este papel está dado por las propiedades
biológicas de cada población microbiana. Las distintas interacciones
ecológicas que se producen en la cavidad bucal son las determinan las
características cualitativas y cuantitativas de la totalidad de su microbiota, en
los distintos nichos ecológicos y en las distintas situaciones de salud (eubiosis) y
enfermedad (disbiosis).
La cavidad bucal del feto en el útero se encuentra libre de gérmenes. A partir
del nacimiento dicha cavidad queda expuesta a la microbiota del tracto
vaginal materno donde aparecen microorganismos tales como especies de
corinebacterias, lactobacilos, coliformes y cocos anaerobios facultativos,
anaerobios estrictos y algunas veces protozoos. A partir del nacimiento
también se produce la sucesión de la microbiota oral que viene a ser la
sustitución de unos microorganismos por otros en respuesta a modificaciones
que afectan a las características intrínsecas del lugar en que habitan. Se trata
de un proceso continuo en el que la microbiota que inicialmente se instaura
en una zona recibe el nombre de comunidad pionera; diversas circunstancias
van modificándola hasta conseguir cierto grado de estabilidad en su
composición; la microbiota presente al completarse la dentición primaria y
más tarde la dentición permanente es lo que se denomina comunidad clímax.

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


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Los microorganismos que se encuentran en la cavidad oral humana se han


referido como la microflora oral, microbiota oral, o más recientemente, como
el microbioma oral. Se define el microbioma oral humano como todos los
microorganismos que se encuentran sobre o en la cavidad bucal humana y
sus extensiones contiguas. Las comunidades microbianas orales son algunas
de las floras microbianas más complejas del cuerpo humano formado por más
de 700 especies bacterianas diferentes. Se utilizan las comunidades
microbianas bucales como punto focal para describir una nueva tendencia y
discutir su posible impacto en futuros estudios en microbiología. La comunidad
microbiana oral es uno de los mejores modelos de biofilms para el estudio de
interacciones entre especies. Interacciones bacterianas pueden afectar la
composición de la comunidad microbiana, así como la incidencia de
enfermedades. Múltiples nichos ecológicos mantienen por lo menos cinco
principales ecosistemas bacterianos. Estos son: las bacterias en la lengua;
bacterias en la mucosa bucal, bacterias del margen gingival de los dientes
(placa supragingival); bacterias que son apicales al margen gingival (placa
subgingival), y bacterias en la saliva.
La cavidad bucal es también la puerta de entrada para una amplia gama de
desafíos antigénicos, éstos son representados por la colonización bacteriana
sustancial que existe en la cavidad oral. Muchas especies del complejo de la
microbiota bucal mantienen una relación simbiótica con el hospedero. Para
mantener la homeostasis dentro de la cavidad oral, el anfitrión tiene dos
sistemas inmunológicos distintos pero relacionados entre sí: el sistema de
respuesta inmune salival y el sistema inmune proveniente del suero. El equilibrio
cambiante de las condiciones en la boca influye en la estabilidad y la
integridad de los tejidos mucosos orales. El equilibrio puede ser perturbado por
tanto en un aumento del estrés local o una disminución de la inmunidad
innata. Las bacterias han desarrollado mecanismos para asegurar su
supervivencia y la reproducción mediante el control de su medio ambiente y
eludir o modificar al hospedero, según sea necesario. Las bacterias han
adaptado un equilibrio para el nicho ecológico que es proporcionado por las
superficies totales de la boca, así como a las condiciones del entorno
ambiental de la cavidad oral, por lo que un equilibrio dinámico suele existir
entre la comunidad microbiana oral (microorganismos libres) y el anfitrión. En
condiciones normales, "sanas”, el anfitrión recibe el estímulo inflamatorio
adecuado de estas bacterias comensales para mantener una barrera eficaz
inflamatoria pero no destructiva contra los patógenos potenciales.
El contacto físico del huésped con la comunidad microbiana oral se lleva a
cabo a través de la mucosa oral, especialmente las células epiteliales. A
medida que pasa de una forma comensal a una forma patógena, una

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


170
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comunidad microbiana puede inducir cambios significativos en la estructura


de los tejidos, con un desglose de la homeostasis oral. La microbiota comensal
es un componente integral de un mecanismo de homeostasis complejo que
impide la actividad de los microorganismos patógenos. En la composición
óptima, los comensales pueden prevenir tanto la unión y la multiplicación de
patógenos, invasión y circulación de las células epiteliales. Los comensales
suministrar nutrientes esenciales, regulan el desarrollo epitelial, y contribuyen a
la maduración y mantenimiento del sistema inmune. Los habitantes
comensales se han convertido en anfitrión adaptado durante una relación
evolutiva larga. Bajo ciertas condiciones, un subconjunto de especies puede
escapar de mecanismos de retención e iniciar la enfermedad, estas especies
han sido llamados comensales oportunistas. Hay evidencia de que el sistema
inmune innato puede discriminar entre comensales, y patógenos oportunistas,
esta discriminación controla el equilibrio entre la intrusión microbiana y de
integridad del hospedero.
El crecimiento de los microorganismos orales está influenciado por una
variedad de factores tales como la temperatura, pH, potencial de oxidación-
reducción, la disponibilidad de nutrientes y el agua, la anatomía de las
estructuras orales, flujo salival, y sustancias antimicrobianas. Cada factor en un
hábitat oral determinado influye en la selección de los microorganismos orales
y ayuda a mantener el equilibrio entre las poblaciones bacterianas. Existen
diferencias en la microbiota oral entre los diferentes sitios de la cavidad oral y
factores externos tales como la dieta o la higiene oral. Cuando las bacterias
comensales cambian a un estado patógeno, una implicación significativa
adicional dicha conversión puede ser causal para la aparición de la
enfermedad bucal.
Patógenos oportunistas son agentes infecciosos que normalmente no inducen
la enfermedad en un hospedero sano, pero puede afectar a personas con un
sistema de defensa que funcionan mal o inmunitario débil. El microbioma
humano comensal se estima que superan en número a la cantidad de células
del cuerpo humano por un factor de 10, éstas comunidades microbianas
complejas son residentes normales de la piel, la cavidad oral, la mucosa
vaginal e intestinal y llevan una amplia gama de funciones indispensables
para el bienestar del anfitrión, sólo se hacen conscientes de su presencia
cuando el equilibrio entre la microbiota y el huésped se pierde, y la
enfermedad se manifiesta.
La cavidad oral difiere de todos los hábitats microbianos humanos por la
presencia simultánea de dos tipos de superficies para la colonización
microbiana: mucosa y superficies sólidas (dientes). Esta propiedad intrínseca
de la cavidad oral proporciona inmensas posibilidades para una amplia
MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página
171
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variedad de microbiota. Cuando el equilibrio se ve comprometido, y cuando


aparece un desequilibrio entre las bacterias indígenas, infecciones bucales
podrían ocurrir. Las bacterias orales comensales y patógenas pueden
programar controladores de dominio. Los mecanismos de defensa locales que
protegen contra la invasión de agentes patógenos, el sistema inmune de la
mucosa ha desarrollado mecanismos especializados de regulación anti-
inflamatoria para eliminar o tolerar alimentos inofensivos y antígenos
transportados por el aire, así como microorganismos comensales.

II. MATERIALES
2.1. DEL LABORATORIO
 03 Asas bacteriológicas en anillo.
 Set de Tinción de Gram y Set de tinción de Ziehl Neelsen.
 03 Microscopios ópticos y 01 Incubadora microbiológica.
 03 Mecheros de alcohol o bunsen.
 10 placas con agar sangre y 10 placas con agar mitis salivarius.
2.2. DEL ALUMNO
Individual:
 Barreras de bioseguridad: Guantes, mascarilla y cofia.
 01 plumón marcador indeleble y 01 fosforo o encendedor.
Grupal:
 01 Paquete de hisopos de toma de muestra estériles.
 01 Caja de láminas portaobjeto.
 01 Muestra de saliva, sarro dentario y 01 diente cariado extraído
recientemente.

III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS DE LA CAVIDAD ORAL
1. Realizar un frotis directo de la cavidad oral con un hisopo estéril y teñir
con set de Gram.
2. También se pueden realizar las otras tinciones especiales ya conocidas.
3. Una muestra puede ser sembrada en medios de cultivo selectivos para
microorganismos orales como son: Agar sangre, agar sabouraud, agar
manitol salado, medio CRT bacteriaMR, agar mitis salivarius, medio
Alban y otros.
4. Sembrar por duplicado e incubar una placa en aerobiosis y la otra en
anaerobiosis. 48 horas después de la incubación realizar tinciones
Gram a partir de las colonias que desarrollaron y observar al
microscopio.

MANUAL DE PRÁCTICAS - MICROBIOLOGÍA Página


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5. A las colonias aisladas se les puede realizar pruebas bioquímicas para


la identificación de las especies bactrianas aisladas.

IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Después de observado el crecimiento bacteriano,
autoclavar a 121°C /15 libras de presión / 20 minutos las placas de petri, los
tubos con los cultivos y cualquier material que haya entrado en contacto con
microorganismos o con muestras biológicas. Posteriormente, el material de
vidrio deberá ser lavado con agua y detergente y enjuagado varias veces. Se
envolverá en papel y luego esterilizará en horno a 180°C por 2 horas para su
reutilización.

V. EVALUACIÓN
1. Según la teoría específica de la influencia de la placa dental en el desarrollo
de la caries dental:
a. Todos los microorganismos de la placa producen caries
b. Sólo algunos microorganismos de la placa producen caries
c. En la placa pueden encontrarse microorganismo cariogénicos
d. Ninguna es correcta
2. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones es falsa?
a. Las bacterias del género Lactobacillus son bacilos gram positivos y
algunas especies contribuyen en el proceso de caries.
b. Las bacterias del género Aggregatibacter son bacilos gram negativos,
algunos producen leucotoxinas para evadir la respuesta inmune
c. Las bacterias del género Campylobacter son cocos gram negativos que
pueden liberar endotoxinas que producen lesiones periodontales e
inflamaciones gingivales.
d. Las bacterias del género Haemophilus son bacilos gram negativos,
algunas especies producen meningitis, otitis y neumonías
3. ¿Cuál de los siguientes microorganismos no forma parte de la microbiota
habitual de la cavidad oral?
a. Streptococcus del grupo viridans b. Candida albicans c. Entamoeba
gingivalis d. Streptococcus pyogenes
4. Los hongos dimorfos causantes de micosis endémicas con repercusiones en
la cavidad oral son:
a. Blastomyces dermatitidis y Paracoccidioides brasilensis.
b. Coccidioides immitis y Histoplasma capsulatum.

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c. Histoplasma capsulatum y Paracoccidioides brasilensis.


d. Coccidioides immitis y Paracoccidioides brasilensis.
5. La película adquirida:
a. Es una sustancia dura
b. Facilita la adhesión de bacterias y les sirve de nutriente
c. Su principal función es la secreción de compuestos
d. Tiene una estructura bien definida
6. La placa dental:
a. Es un depósito mineralizado que se forma sobre los dientes
b. Contiene restos de comida
c. Contiene bacterias y al calcificarse forma sarro
d. Tiene un 20% de agua
7. De los siguientes Streptococcus, cuales son considerados los primeros
colonizadores de la mucosa de la cavidad oral:
a. Grupo Streptococcus oralis b. Grupo Streptococcus salivarius c. Grupo
Streptococcus mutans d. Grupo Streptococcus milleri
8. ¿Cuándo se forma la película adquirida de los dientes?
a. Minutos después de comer
b. Horas después de hacer una limpieza de la boca
c. Segundos después de hacer una limpieza de la boca
d. A los días de haber ido al dentista
9. ¿Qué es un depósito no mineralizado que se forma sobre los dientes o las
prótesis que no se limpian de forma adecuada?
a. Película adquirida b. Placa dura c. Placa blanda d. Sarro
10. ¿Cuál de estas afirmaciones a cerca de la placa dental no es correcta?
a. Es un depósito mineralizado que se forma sobre los dientes o las prótesis
dentales que no se limpian apropiadamente
b. La placa dental es un tipo de biopelícula
c. Hay placa supragingival y subgingival
d. La placa supragingival se forma sobre la película adquirida
11. La adquisición de la microbiota oral es alogénica cuando:
a. Es independiente de los microorganismos
b. Es dependiente de los microorganismos
c. No depende de la higiene oral
d. Ninguna de ellas es correcta
12. Las bacterias del género Aggregatibacter son:
a. Cocos gram + b. Cocos gram – c. Bacilos gram + d. Bacilos gram –

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13. ¿Qué género de espiroquetas provoca la infección de Vincent?


a. Treponema b. Leptospira c. Borrelia d. Ninguno de ellos
14. La caries dental:
a. Es una enfermedad infecciosa que afecta a tejidos de soporte del diente.
b. Es una enfermedad infecciosa que afecta a tejidos calcificados del
diente.
c. Es una enfermedad con baja prevalencia.
d. Es una enfermedad no transmisible.
15. Cuáles de los siguientes factores microbianos participan en la acción
indirecta de la periodontitis:
a. Endotoxina b. Proteasas c. Sulfuro de hidrógeno d. Ácidos orgánicos
16. Respecto a la caries:
a. Los microorganismos más implicados son los lactobacilos
b. Los microorganismos más implicados son los estreptococos
c. Cuando ocurre el pH sube
d. No produce ninguna infección secundaria
17. Frecuentemente están implicados en el absceso periapical:
a. Prevotella b. Porphyromonas c. Peptostreptococcus d. Todas las
anteriores son correctas
18. Los diferentes tipos de placa son:
a. Infragingival, supragingival y proximal.
b. Radicular, proximal, Supragingival e infragingival.
c. Subgingival, supragingival, proximal, radicular y en fosas y fisuras.
d. Fosas y fisuras, radicular, proximal, infragingival, y supragingival.
19. Es cierto que:
a. Los microorganismos de la cavidad oral pueden producir infecciones en
b. otras localizaciones
a. El tiempo no influye en la formación de caries
b. Las caries más comunes son las de las zonas proximales y superficies lisas
c. Entre los microorganismos implicados en la caries destaca Candida
20. Streptococcus mutans:
a. Es el principal causante de la gingivitis
b. No se puede diseminar a otras localizaciones
c. Es el principal causante de caries
d. No influye en ninguna enfermedad de la cavidad oral

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VI. RESULTADOS:
MICROBIOTA ORAL RESIDENTE
6.1. BACTERIAS
1. Cocos Gram Positivos: Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Micrococcus sp., Peptococcus sp., Enterococcus faecalis,
Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Streptococcus
salivarius, Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus
sanguis, Streptococcus oralis, peptostreptococcus sp.
2. Cocos Gram Negativos: Neisseria sicca, Neisseria flavescens, Neisseria
flava, Neisseria perflava, Veilonella sp.
3. Cocobacilos: (Gram Negativos) Haemophilus sp.
4. Bacilos Gram Positivos: Lactobacillus acidophillus, Actinomyces
naeslundii, Actinomyces israelli, Actinomyces bovis, Biphidobacterium
sp., Rothia dentocariosa, Corynebacterium matruchtii, Diphteroides.
5. Bacilos Gram Negativos: Prevotella sp., Fusobacterium sp.,
Porphyromonas sp., Capnocytophaga sp., Actinobacillus sp., etc.
6. Espiroquetas: Spirochaeta plicatilis, Spirochaeta sp.
7. Espirilos: Campylobacter sp.
8. Micoplasmas: Mycoplasma hominis, Mycoplasma sp.
6.2. LEVADURAS: Candida albicans, Candida stellatoidea, Candida
guillermondii.
6.3. PROTOZOARIOS: Trichomonas tenax, Entamoeba gingivalis.

OBSERVACIONES:

Especie:

Aumento:

Coloración:

Disposición:

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Especie:

Aumento:

Coloración:

Disposición:

Especie:

Aumento:

Coloración:

Disposición:

VII. BIBLIOGRAFÍA
1. Hormigot L., Enrique D., González A., Meriño Y. Estudio descriptivo transversal
sobre promoción de salud bucal y nivel de conocimientos de caries dental
en niños de 11-12 años. Medwave [en línea]. 2013 [acceso 24 de febrero de
2017]; 13 (5).
2. Rodríguez A., Martínez I. Influencia de la lactancia materna en el
micrognatismo transversal y los hábitos bucales deformantes. Rev Med
Electrón. 2011; 33 (1): 45-51.
3. Quirynen M., Teughels W., Kinder HS., Newman MF. Microbiología de las
enfermedades periodontales. Periodontología clínica. 10a edición. México:
Mac Graw-Hill Interamericana; 2010.
4. Riveron D., Pérez J., Fuentes I. Caries dental y ecología bucal, aspectos
importantes a considerar. Rev Cubana Estomatol. 2006; 43 (1): 1-12
5. Sánchez M., Ustrell I., Torrent M. Fisiología bucal infantil: función y crecimiento
de la cavidad oral del lactante. Matronas Profesión. 2003; 4 (14): 19-21.

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PRÁCTICA No 16 - OPCIONAL

CÓDIGO
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
F01L01LA26

TEMÁTICA AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS - FAGOTERAPIA

SESIÓN 15 FECHA 18/12/2019 DURACIÓN 100 minutos

Clasifica con precisión a las enfermedades bucodentales según


CAPACIDAD su ubicación y tipo de agente causal con actitud participativa
y respetando la opinión de sus compañeros.

I. INTRODUCCIÓN
Los bacteriófagos son virus que fueron descubiertos de forma independiente
por los microbiólogos Frederick W. Twort en 1915 y Félix d’Hérelle en 1917.
Siendo esta la última clase principal de virus en ser descubierta; este tipo de
virus constituye un sistema simple y de gran abundancia en la naturaleza. En
esencia, los bacteriófagos se encuentran de manera ubicua en el ambiente y
en el lugar en que se encuentre su célula huésped. Un bacteriófago es un virus
que se multiplica en bacterias y probablemente cada tipo de bacteria es
portadora de un fago. Los bacteriófagos se encuentran dónde están sus
hospedadores, para muchas bacterias del grupo entérico, las aguas
residuales son una fuente de fagos, así como la leche es la fuente de fagos
para Streptococcus lactis.
Los índices de crecimiento son muy rápidos una vez que se añade el virus sobre
la bacteria huésped, ya que la partícula vírica ingresa a la célula y se
multiplica hasta que la bacteria estalla y libera nuevas partículas formadas. El
tiempo que tardan los virus en lisar a una bacteria varía entre 13 y 40 minutos
y el número de partículas virales producidas en cada microorganismo varía
entre 120 y 400. La acción de los fagos sobre las bacterias sensibles es la lisis
bacteriana, la cual puede evidenciarse en medio líquido (los cultivos en caldo
turbios pueden aclararse en cuestión de horas, como resultado de la acción
lítica) o en medio sólido, generalmente en medio sólido se evidencia por la
aparición de calvas o placas líticas.
El tamaño de la placa lítica depende de: La concentración de nutrientes
(metabolismo bacteriano), la acumulación de inhibidores, la concentración
de agar (a mayor concentración, la difusión es más lenta y el tamaño de la
placa lítica es menor). Las dimensiones de las partículas fágicas (las pequeñas
difunden más rápidamente) y la velocidad de replicación fágica. Una placa

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lítica contiene entre 106 a 109 partículas fágicas, a veces más. De una placa
lítica aislada se puede obtener una línea pura de fago.
La fagoterapia es un tratamiento basado en la actividad bactericida de los
bacteriófagos (fagos), virus específicos de las bacterias. Los fagos reconocen
la superficie de la célula bacteriana con alta especificidad, inyectan su ADN
o ARN, y se multiplican y ensamblan dentro de la bacteria, para finalmente
romper la célula y liberar su progenie, que infectará nuevas células
bacterianas. El número de fagos crece de forma exponencial, por lo cual su
mayor efecto es en el sitio de infección. Además, la selección de nuevos fagos
es un proceso relativamente rápido.
La terapia con fagos se propuso desde el descubrimiento de los mismos y se
ha desarrollado en países como República de Georgia, Polonia, Rusia, y la
antigua Alemania del este; sin embargo, después del boom del
descubrimiento de la penicilina y otros antibióticos, la investigación en
fagoterapia en Europa occidental y América fue abandonada. En los últimos
años, con el incremento en la frecuencia de aparición de cepas
multirresistentes y panresistentes a antibióticos, los investigadores han
retomado el interés en el desarrollo de fagoterapia y su implementación para
el control de la contaminación e infecciones bacterianas en diversos campos.

II. MATERIALES
2.3. DEL LABORATORIO (POR MESA DE TRABAJO)
 06 Beaker de 250 mL limpios y 03 Asas bacteriológicas en anillo.
 Set de Tinción de Gram y Aceite de inmersión.
 100 mL de Lejía.
 03 Microscopios ópticos y 03 mecheros de alcohol o bunsen.
 Cultivo de Streptococcus pyogenes del grupo A β-hemolítico
 01 Litro de solución salina fisiológica estéril o PBS.
 100 mL de caldo tioglicolato estéril y frío.
 10 placas con agar sangre.
2.4. DEL ALUMNO
Individual:
 Barreras de bioseguridad: Guantes, mascarilla y cofia.
 01 plumón marcador indeleble y 01 fosforo o encendedor.
Grupal:
 01 Paquete de hisopos de toma de muestra estériles.
 01 Caja de láminas portaobjeto.
 01 paquete de bajalengua.

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III. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA


3.1. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Streptococcus pyogenes
1. Se tomarán muestras de hisopado faríngeo-amigdalar de 10
estudiantes con la ayuda de un depresor lingual, tocando con la
torunda todas las partes con exudados, membranas o inflamación,
frotando las criptas tonsilares y la faringe posterior. No se requieren
medidas especiales para su transporte y conservación.
2. Las torundas serán colocadas en caldo tioglicolato para el
enriquecimiento y se inocularon a 37°C durante 24 horas, luego se
sembrará en placas con agar sangre y se incubará en condiciones ya
indicadas anteriormente para el enriquecimiento.
3. Posteriormente se seleccionarán las colonias con β-hemólisis y se
colorearán con tinción Gram. La observación de cocos Gram positivos
en cadena se utilizará como indicador de Streptococcus. Estas
colonias serán sometidas a la prueba presuntiva basada en la
susceptibilidad a la inhibición del crecimiento por Bacitracina (0,04U)
para confirmar la presencia de Streptococcus pyogenes del grupo A
βhemolítico.
4. Los resultados son cualitativos y es positiva si se encuentra cualquier
halo de inhibición alrededor del disco.
3.2. AISLAMIENTO PARA BACTERIÓFAGO
1. Se tomarán 10 muestras de gargarismo faríngeo en frascos de boca
ancha con tapa rosca, estériles, conteniendo 15 mL de solución buffer
fosfato (PBS).
2. Se le instruirá al paciente de modo que mantenga la solución en la
garganta el mayor tiempo posible mientras hace gárgaras y deposite
nuevamente el líquido en el frasco.
3. Se hará pasar cada una de las muestras por filtro bacteriológico al
vacío, y se realizará un paso de enriquecimiento previo para fagos
mezclando 4 mL del filtrado anterior con 5 mL de caldo BHI + Triptosa
fosfato 2X y 1 mL de cultivo joven del estreptococo aislado
previamente llevándose a incubar a 37°C durante 24 horas.
4. El paso siguiente fue realizar un filtrado bacteriológico del medio de
enriquecimiento del paso anterior y el filtrado se guardará y conservará
a 4°C.
5. Con cada filtrado se analizará la existencia del fago, para lo cual, se
sembrará al Streptococcus pyogenes, en camada, sobre una placa
de agar sangre y se colocará una gota del filtrado (fagos). Luego se

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llevará a incubar a 37 oC durante 24 horas. Finalmente se observará la


presencia o ausencia de placas líticas.

IV. PRECAUCIONES Y BIOSEGURIDAD


Todas las normas de bioseguridad especificadas en la parte inicial del
presente manual.
Manejo de residuos: Después de observado el crecimiento bacteriano y viral,
autoclavar a 121°C /15 libras de presión / 20 minutos las placas de petri, los
tubos con los cultivos y cualquier material que haya entrado en contacto con
microorganismos o con muestras biológicas. Posteriormente, el material de
vidrio deberá ser lavado con agua y detergente y enjuagado varias veces. Se
envolverá en papel y luego esterilizará en horno a 180°C por 2 horas para su
reutilización.

V. FUNDAMENTACIÓN
Existe una relación entre la tasa de crecimiento de la bacteria hospedera y el
tiempo de aparición del halo lítico. Por lo que en las cepas bacterianas de
crecimiento lento los halos líticos aparecerán más tarde, en tanto que en
cepas de crecimiento rápido aparecen a las 24 horas. El habitad del
hospedero juega un rol importante y decisivo en el aislamiento de
bacteriófagos, porque de las condiciones que se brinde a la célula hospedera
a nivel de laboratorio dependerá en gran medida del éxito del aislamiento de
dichos bacteriófagos.
La etapa del enriquecimiento previo para el aislamiento del bacteriófago, de
los gargarismos faríngeos con cepas de los estreptococos empleados en el
presente estudio, se realiza para aumentar el número de las posibles partículas
virales (fagos) presentes en los gargarismos empleados ya que estas partículas
necesitan células jóvenes para su replicación. En el filtrado final del proceso
de enriquecimiento, utilizado para el aislamiento de los fagos, se debe
encontrar una concentración de fagos anti Streptococcus pyogenes del
grupo A β-hemolíticos capaz de lisar a las bacterias presentes en el cultivo.
Para esto, se utilizará bacterias del mismo cultivo empleado para el
enriquecimiento previo.
La alta especificidad del bacteriófago frente a Streptococcus pyogenes
explica esta baja incidencia, pues la lisis de una bacteria por su fago depende
tanto de las propiedades de éste, como de los receptores específicos situados
en la superficie bacteriana debido a que la multiplicación de los
bacteriófagos ocurre sólo cuando el organismo tipo y el fago coinciden. La
infección es el proceso en el cual el fago reconoce y se adhiere a la célula

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huésped e inyecta su ácido nucleico atravesando la membrana celular hasta


llegar al citoplasma.
En el medio ambiente, la infección que es siempre un evento al azar, está
altamente influenciada por la densidad bacteriana. Esto quiere decir que a
mayor densidad de huésped, mayor oportunidad de infección. El
reconocimiento y la interacción altamente específica entre la célula huésped
y el fago hacen parte del proceso inicial de la infección conocido como
adsorción. Este evento es afectado por factores como el ambiente iónico y la
temperatura. En trabajos donde se añadieron los cationes divalentes Ca+2 y
Mg+2 a los ensayos de placa, se observó un incremento en el número y
tamaño de las placas virales. De la misma manera, las bajas temperaturas
hacen inestable el proceso de la adsorción fago-huésped.
Aunque la infección parezca un evento sencillo, hay varios factores o barreras
intracelulares como lo son las restricciones específicas del huésped. La carga
de la membrana externa, un periplasma con nucleasas y el carácter de la
membrana citoplasmática; constituyen un sistema de defensa para la
bacteria hacia las moléculas de ADN exógeno, lo que tiene una marcada
influencia sobre la aparición de placas líticas sobre un cultivo bacteriano.

VI. RESULTADOS:
1. AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS

CALVAS

OBSERVACIÓN
MACROSCÓPICA

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FACULTAD DE CIÉNCIAS MÉDICAS
Escuela Profesional de Estomatología

VII. BIBLIOGRAFÍA
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