FACULTAD DE INGENIERÍA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

“EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DE JUGO DE NARANJA”

TRABAJO EXPERIMENTAL DEL PRODUCTO FINAL DEL CURSO

AUTOR (ES):

Culque Lezama Jeancarlos

Moreno Medina Gabriela

Vega Luna Andrea

Docente:

Blg. Eterio Alva Muñoz

Blg. Ana García Pinto

LÍNEA DE INVESTIGACIÓN:

INVESTIGACIÓN EXPERIMENTAL

Nuevo Chimbote, Perú

2019
 ÍNDICE

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 3

OBJETIVOS ............................................................................................................................ 5

2.1.1 Objetivo general .......................................................................................................... 5

2.1.2 Objetivos específicos ................................................................................................... 5

HIPÓTESIS.............................................................................................................................. 5

JUSTIFICACIÓN.................................................................................................................... 5

FUNDAMENTO TEÓRICO .................................................................................................. 6

Zumo de Naranja ................................................................................................................. 6

Microbiología de los Zumos Cítricos ................................................................................. 7

MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 10

6.1. Descripción del Sitio .................................................................................................. 10

Descripción del Ensayo ...................................................................................................... 11

PROCEDIMIENTO .............................................................................................................. 13

RESULTADOS ...................................................................................................................... 27

DISCUSIONES ...................................................................................................................... 30

CONCLUSIONES ................................................................................................................. 32

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 33

ANEXOS ...............................................................................................................................35I
I. INTRODUCCIÓN

En la elaboración de productos alimentarios es importante observar la inocuidad de estos ya

que esto confirman que sean aptos para el consumo y no brinden ningún problema de salud
posterior a su consumo en el presente informe abordaremos el tema de un jugo de naranja
casero que se vende por ambulantes se decidió trabajar con un jugo de la calle dicho de una
manera coloquial puesto que se quiere observar si dicho jugo cuenta con la garantía de estar
dentro de los números permisibles de agentes microbianos permitidos.
Consumir alimentos inocuos conlleva a una gran polémica, debido al desconocimiento de
la procedencia de los ingredientes, los métodos utilizados para la fabricación de estos
productos y las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM), las cuales aseguran una calidad
alimentaria segura para el consumo humano

Pelayo (2010) nos dice los microorganismos son seres vivos microscópicos capaces de
desarrollarse y multiplicarse en un medio que reúna las condiciones adecuadas. Se hallan en
el suelo, en las plantas, en el aire, en los organismos vivos o en el agua. Los alimentos
constituyen un medio idóneo porque les proveen de los nutrientes y la humedad que
necesitan para crecer.

La palabra "microorganismo" hace referencia a su tamaño, que es microscópico y exige el

uso de instrumentos adecuados (microscopios) para observarlo.

Willen (2009) afirma el crecimiento microbiano que se da en los alimentos es debido al

valor nutricional que tienen muchos de los alimentos, sin embargo no todos los alimentos
resultan ser un buen medio para el desarrollo de microorganismos, en los alimentos que se
produce el crecimiento microbiano se debe a que el alimento es un buen medio de cultivo
para el desarrollo de microorganismos.

En los alimentos el crecimiento de microorganismos está determinado por factores

intrínsecos, vinculados con el alimento, y con factores extrínsecos, relacionados donde se
guarda el alimento.

Las ventas de productos en la calle están presentes en casi todas las grandes ciudades del
mundo y desempeñan un papel integral en la vida cotidiana de millones de personas. Sin
embargo, el papel dominante que desempeñan los alimentos de venta callejera en la
nutrición de muchos habitantes de las ciudades plantea numerosos desafíos (FAO, 2011).
La proliferación de las ventas informales de jugos de naranja es probablemente debido a su
sabor y valor nutricional. Esta bebida es conocida por su alto contenido en vitamina C,
carotenoides, compuestos fenólicos y otras sustancias antioxidantes

Y es que la producción y comercialización de alimentos en la vía pública (jugos de naranja)

es un fenómeno de gran impacto social, en la cual se puede observar problemas sanitarios,
sociales y culturales, las cuales afectan a toda la ciudadanía. (Bayona, 2009).

Sin embargo, las enfermedades generadas por la comida de la calle, como por ejemplo los
jugos de naranja comercializados informalmente, son el resultado de una amplia variedad
de productos comestibles contaminados por microorganismos patógenos.

Para realizar un análisis microbiológico de alimentos en este caso del jugo de un fruto como
la naranja es necesario ejecutar la recolección de la muestra de manera que no haya
contaminación en este proceso, para que el análisis tenga validez en nuestro caso
compramos el jugo de naranja en la mañana horas antes del análisis y lo sometemos a un
proceso de refrigeración por unas pocas horas para que no sufra ningún tipo de deterioro
posteriormente luego de unas horas sacamos dicha muestra para realizar las evaluaciones
microbiológicas pertinentes

Varios alimentos presentan sustancias antimicrobianas naturales como por ejemplo

inhibidores químicos y enzimas complejas. Las verduras, las frutas, la leche de vaca y los
huevos contienen acciones microbianas. Las frutas y verduras contienen pieles externas
que cumplen una función de protección

Dentro de los problemas más significativos son los sanitarios, que conllevan al riesgo de
enfermedades gastrointestinales producidas por ciertos microorganismos patógenos los
cuales pueden afectar severamente a la población, provocando enfermedades
gastrointestinales (diarrea) e intoxicaciones, tendiendo síntomas como dolor abdominal

Entre las causas por las que puede existir esta contaminación microbiológica puede ser: la
falta de capacitación por las personas que expenden estos alimentos, por la manipulación de
los ingredientes y además de las BPM (lavado, almacenamiento y preparación) lo que
provoca un riesgo para la salubridad del producto que se oferta.
II. OBJETIVOS

2.1.1 Objetivo general

 Evaluar la calidad sanitaria de jugos elaborados a base de naranja (Citrus sinensis L)

en vía pública.

2.1.2 Objetivos específicos

Para cumplir con el objetivo general se establecieron los siguientes objetivos

específicos:
 Relacionar si el factor pH es una limitante para el crecimiento de microrganismos
presentes.
 Identificar presuntivamente los microorganismos presentes por medio del medio de
cultivo y pruebas bioquímicas.
 Determinar la calidad sanitaria del jugo de naranja basándose en Normas Sanitarias.

III. HIPÓTESIS

Los jugos elaborados a base de naranja (Citrus sinensis L.) de las juguerías de la Av.
Universitaria, son de buena calidad sanitaria.

IV. JUSTIFICACIÓN
La naranja nos proporciona vitaminas necesarias para la salud, fortalece las defensas
generales de nuestro organismo, mejora la cicatrización de heridas, alivia las encías
sangrantes, es excelente para combatir problemas circulatorios, y su consumo resulta
realmente positivo para los diabéticos tipo 1, ya que el consumo de una naranja previene
una hipoglucemia (Neto, 1999).
Además, se atribuye al consumo de zumos de naranja la reducción de cánceres de
estómago en los últimos años en este país. Su aporte calórico apenas se aprecia, una
pieza de naranja contiene tan sólo 70 calorías, y su consumo facilita la metabolización
de las grasas y reduce los niveles de colesterol (Arena y Sánchez, 1999).
En Perú, es uno de los principales productores de naranja, este fruto es consumido en
fresco y en forma de zumo. Es indispensable que esté libre de cualquier contaminante
físico, químico y biológico que pueda afectar la salud del consumidor, por tal motivo
la importancia de esta investigación radicó en determinar la calidad sanitaria con base
 En la cuantificación de microorganismos indicadores de higiene (mesófilos aerobios,
coliformes totales, coliformes fecales y la determinación presuntiva de bacterias
enteropatógenas) de los jugos comercializados en los principales juguerías de la Av.
Universitaria.

V. FUNDAMENTO TEÓRICO

 Zumo de Naranja

El zumo (o jugo) de naranja es un zumo de frutas en forma de líquido obtenido de

exprimir el interior de las naranjas (Citrus sinensis), generalmente con un instrumento
denominado exprimidor.
El mayor exportador de zumo de naranja es Brasil, seguido de Estados Unidos
(principalmente Florida). Los usos culinarios del zumo de naranja son diversos y
participan principalmente como refresco.

El zumo de naranja es un producto alimenticio complejo compuesto de diversos

ingredientes, hoy en día puede adquirirse exprimido en envases de tetra brick en casi
cualquier supermercado.
Generalmente en la extracción de zumo de naranja los rendimientos son del 40 %; es
decir, de 100 Kg de fruta se obtienen 40 Kg de zumo, y un contenido en sólidos solubles,
del orden de 10.5 a 12.0° Brix.
El zumo extraído es filtrado con la ayuda de un tamiz de acero inoxidable de 125μm,
cuyo fin es el de evitar la presencia de sólidos en suspensión como semillas, y partículas
groseras que pueda contener el zumo informa FIAI (2013)

Según la Norma del Códex, se entiende por zumo (jugo) concentrado de naranja, el
zumo sin fermentar, pero fermentable después de su reconstitución, conservado por
medios físicos exclusivamente obtenido mediante el procedimiento de concentración
que consiste en la separación física del agua hasta que el contenido de sólidos solubles
de la naranja no sea menor del 20% m/m, determinado con refractómetro a 20°C, sin
corregir la acidez, y expresado en °Brix en las Escalas Internacionales de Sacarosa (con
exclusión de los azúcares añadidos) y puede comprender la adición de (1) zumo o
concentrado o agua adecuados para conservar los factores esenciales de composición
 y calidad del concentrado, y (2) componentes volátiles naturales del zumo de naranja,
cuando éstos hayan sido extraídos anteriormente.
La materia prima de que se obtenga el producto será mediante un procedimiento
mecánico de naranjas (Citrus sinensis L. Osbeck) maduras y en buen estado.
El ácido ascórbico o vitamina C desempeña un importante papel en muchas reacciones
en las que interviene la incorporación de oxígeno molecular al sustrato. Interviene en la
síntesis de colágeno, también es importante para la síntesis de las hormonas esteroideas
y en el metabolismo de los lípidos.
La vitamina C no evita la aparición de resfriados de naturaleza vírica pero la ingesta
continuada de vitamina C, puede reducir los síntomas del resfriado agrega FIAI (2013)
Finalmente, la vitamina C es un antioxidante biológico que protege al organismo del
estrés oxidativo provocado por las especies oxigeno reactivas.

 Microbiología de los Zumos Cítricos

En zumos cítricos, la actividad microbiológica generalmente es perjudicial, ya que además

de afectar a la composición del producto, puede tener consecuencias patológicas, como los
casos recientes de enfermedades y muertes debidas a la contaminación microbiana en
zumos de frutas, que han hecho que se preste especial atención a este aspecto del procesado
de cítricos describe FIAI (2013).
La contaminación microbiana es una de las principales alteraciones que pueden sufrir los
productos cítricos, algunos microorganismos son patógenos humanos (que producen
enfermedades que afectan a las personas) y representan una de las principales
precauciones de las industrias de elaboración de alimentos.

Otros, aunque no son patógenos, estropean la calidad de los alimentos y los hacen
desagradables o incluso inaceptables para el consumidor.
En zumos no concentrados, el crecimiento microbiano puede generar diacetilo, un
compuesto que puede producir un sabor y aroma lácteo indeseable.
En los concentrados en los que se ha producido crecimiento microbiano son comunes los
1aromas alcohólicos propios de la fermentación por levaduras, como el del alcohol
isoamílico, cuyo umbral de detección sensorial en zumos de naranja concentrado
congelado es alrededor de 1 ppm.
Otros productos que pueden aparecer en concentrados de cítricos como consecuencia del
deterioro microbiológico son el acetaldehído, etanol, n-butanol, isobutanol y alcohol
amílico. Algunos patógenos comúnmente transmitidos por alimentos
son Salmonella, Listeria, E. coli O157:H7, Clostridium y Campylobacter.

Sin embargo, los microorganismos que se desarrollan en los productos de cítricos

generalmente no son patógenos, aunque pueden proliferar determinadas bacterias,
levaduras y mohos que toleran las condiciones ácidas.
Los microorganismos patógenos crecen generalmente en medios con pH mayor que 4.6,
mientras que el pH de los zumos de cítricos es de 2.0 (limones/limas) a alrededor de 4.4
(naranjas). Sin embargo, se han producido entre 1944 y 1995 siete brotes patológicos
documentados como consecuencia del consumo de zumo de naranja menciona Camacho
(2009)

La preocupación por la seguridad de todo tipo de zumos recién exprimidos ha impulsado

a la Agencia de alimentos y medicamentos de los EE UU (Food and Drug Administration,
FDA) a imponer normas que obligan a implantar un programa documentado de Análisis
de peligros y puntos de control críticos (APPCC) o programa HACCP, si se utiliza el
acrónimo inglés, que incluye la comprobación de la ausencia de Salmonella y E. Coli
O157: H7 nos dice Camacho (2009)

Aunque en los zumos de cítricos se han aislado bacterias productoras de ácidos de los
géneros Aerobacter y Xantomonas, únicamente las bacterias lácticas de los
géneros Lactobacillus y Leuconostoc afectan de forma significativa a los productos de
cítricos.
El diacetilo (2,3-bitanodiona), generado como producto del metabolismo del ácido cítrico
por Lactobacillus, imparte a los zumos de cítrico un sabor y olor a mantequilla no deseable
y es la principal causa de rechazo de zumo no concentrados contaminados en la industria.
Estos microorganismos no patógenos pueden crecer a temperaturas de 5 a 53ºC, y su
intervalo de temperatura de crecimiento óptimo es generalmente de 30 a 40ºC

Las bacterias del género Lactobacillus, son muy sensibles a la presión osmótica, siendo su
crecimiento lento cuando la concentración de zumo es de 35 a 38ºBrix y nulo a
concentraciones mayores que 45ºBrix sostiene (Torres ,2006)
Mientras el Leuconostoc es una bacteria cocoide gram-positiva, produce ácido láctico,
etanol, dióxido de carbono y diacetilo, por lo que genera el mismo sabor y olor a
mantequilla que las bacterias del género Lactobacillus. Su intervalo de temperatura de
crecimiento óptimo es de 20 a 30ºC y su intervalo de temperaturas de crecimiento de 10 a
37ºC da a conocer (Torres ,2006)

E. coli O157:H7 es un coliforme fecal, proviene de la superficie de la fruta que procede

de huertos en los que se han utilizado fertilizantes orgánicos o que están situados en
regiones en las que hay presencia de animales silvestres postula (Torres ,2006)
Por otro lado el género Salmonella que incluye las especies S. Typhi, S. hartford, S.
gaminara y S. rubislaw han sido relacionadas con brotes patógenos debidos al consumo de
zumos de cítricos contaminados.

Su temperatura ideal es de alrededor de 40ºC, pueden crecer en condiciones de

almacenamiento frigorífico y a temperaturas de hasta 60ºC.
Bacillus subtilis y Bacillus pumilus, se encuentran a veces en la superficie de los cítricos
y se incorporan al zumo durante la extracción. Pueden ser termófilos, es decir a altas
temperaturas, y pueden sobrevivir el tratamiento térmico de la pasteurización o
evaporación de los zumos de cítricos. Estos microorganismos no son patógenos, pero su
importancia radica en que pueden dificultarse mucho, o incluso imposibilitar, el recuento
de colonias en placa menciona (Torres ,2006)

Las levaduras pueden sobrevivir fácilmente en concentraciones de cítricos de 58 a 65ºBrix.

Son el principal problema microbiológico de los concentrados de cítricos, producen CO2
y alcohol. Según estudios recientes, la levadura que más frecuentemente contamina los
zumos de cítricos pasteurizados es probablemente Saccharomyces cerevisiae afirma
(Torres ,2006)
Los mohos generalmente no afectan a los productos de cítricos, crecen a veces en la
superficie de los envases de cartón y cajas con bolsa interior (bag-in-box) y pueden
contaminar el zumo que contienen dichos envases, incluso en condiciones de refrigeración.
 VI. MATERIALES Y MÉTODOS

Existen diversos métodos para cuantificar el número de microorganismos presentes en

muestras líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas se encuentran los procedimientos basados
en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo
Sintéticos sólidos o líquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de
Colonias (UFC) (López L. y C. Torres, 2006).

En el medio de cultivo Mac Conkey, la peptona es la fuente de aminoácidos y de otros

factores de crecimiento, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable,

La bilis de buey estimula el crecimiento de las bacterias coliformes e inhibe a gran parte de
la flora Gram positiva, y el púrpura de bromocresol es el indicador de pH. Los coliformes,
son microorganismos que fermentan la lactosa, con producción de ácido y gas. Al acidificar
el medio, se produce un viraje del indicador de pH, del color púrpura al amarillo (López L.
y C. Torres, 2006).

6.1. Descripción del Sitio

Las condiciones de venta en la calle, la salud y la higiene personal de los vendedores, la

contaminación microbiológica del agua empleada, acarrean muchos problemas de higiene y

de salud, la calidad nutritiva y sanitaria de los alimentos y de las comidas preparadas y

vendidas en la calle es baja.

La muestra de jugo de naranja a analizar, fue conseguida por venta ambulatoria, ubicada

frente a la Universidad Nacional del Santa (paralelo a la Av. Universitaria), en donde el paso

de vehículos automovilísticos, personas y animales es constante.

El espacio en donde se vende el jugo de naranja no cuenta con la salubridad del caso, ya que

al tratarse de alimentos, debería contar con los cuidados sanitarios, es una venta al aire libre,

expuesto al sol, al polvo y demás contaminantes presentes en el ambiente.

 Descripción del Ensayo

Obtenidas las 5 muestras de jugo de naranja, se procedió a medir el pH con la ayuda de

un pH metro y los Grados Brix mediante un refractómetro, a partir de los Grados Brix
se calculó la concentración de azúcar.

De cada muestra de jugo de naranja obtenida se tomó 1 ml y se lo diluyó en un tubo de

ensayo con 9 ml de agua fisiológica, obteniendo una solución a 10−1 (solución madre),
de esta manera se logró conseguir 5 soluciones madre respectivas de las muestras.
De cada solución madre se extrajo 1 ml y se hizo la dilución en otro tubo de ensayo con
9 ml de agua fisiológica, resultando una solución de 10−2.
En este procedimiento se realizó hasta obtener una disolución de 10−6 para cada
muestra.
De cada uno de los tubos de ensayo con las soluciones a diferentes concentraciones se
procedió a realizar la siembra en cajas Petri con MacConkey Agar.
Este medio es óptimo para el análisis de bacterias Gram negativas ya que las peptonas
aportan los nutrientes para la proliferación bacteriana, la mezcla de sales billares y el
cristal violeta son los ingredientes selectivos que inhiben el desarrollo de la flora Gram
positiva, mientras tanto la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, el cual produce
una disminución en el pH alrededor de la colonia, esto produce el viraje de color que es
el indicador de pH, la absorción en las colonias y la precipitación de las sales billares.
Los microorganismos no fermentador es de la lactosa producen colonias incoloras nos
informa (Aryal, 2015).

Tabla N°01: Composición Química del Medio Mac Conkey Agar. (Aryal, 2015)

FÓRMULA CANTIDAD

Peptona de carne 1.5 g

Peptona de gelatina 17.0 g

Tripteína 1.5 g

Lactosa 10.0 g

Mezcla de sales biliares N◦3 1.5 g

Cloruro de sodio 5.0 g

 Rojo Neutro 0.03 g

Cristal violeta 0.001 g

Agar 13.5 g

Agua purificada 1000 ml

pH final: 7.1 ± 0.2

La siembra se realizó en cámara de flujo laminar vertical, con técnica de siembra

estriada o por arrastre, en la cual se tomó una pequeña cantidad del inóculo para
estriar el primer cuadrante de la placa con un movimiento hacia adelante y hacia atrás.

Se quemó el asa bacteriológica en el mechero y se enfrío tocando o introduciendo en

una parte de la placa de agar que no haya sido inoculada. Colocándola en un borde del
área que se acabó de estriar y se estrió a partir de allí en el segundo cuadrante de la
placa.

Nuevamente se flameo y enfrió el asa y se extendió desde la zona estriada de la segunda

área en el tercer cuadrante. Se quemó el asa, se enfrió y se estrió desde el borde del
tercer cuadrante hacia el cuarto cuadrante de la placa.

Se colocó en una incubadora Memmert de 35 a 37◦C y se realizó la cuantificación las 8

primeras horas cada dos horas y después cada 24 horas durante 3 días y se anotaron los
resultados. La población microbiana se determinó por conteo directo de las colonias en
las cajas Petri, siguiendo las reglas generales de la cuantificación bacteriana por el
método de conteo directo (Camacho, 2009).

Las variables microbianas se reportaron en términos de Unidades Formadoras de

Colonias por mililitro (UFC/ml).
VII. PROCEDIMIENTO

a) Materiales

 Jugo de naranja
 Agua peptonada
 Aceite de inmersión
 Solución salina
 Pipeta esterilizada
 Placas petri
 Agar nutritivo
 Mechero
 Tubos de ensayo
 colorantes

b) Equipos

 Microscopio
 Incubadora
 Cocina eléctrica
 Balanza analítica

c) Métodos
 Para la realización del análisis realizamos la compra de jugo de naranja en un puesto
frente a la Universidad de la Santa.

Imágenes 1: Compra del jugo de naranja

 Lo primero a realizar fue verter 1ml de jugo de naranja en el agua peptonada, con la
ayuda con una pipeta previamente esterilizada, teniendo en cuenta una zona aséptica de
20 cm cerca del mechero, agitamos la solución para tener una mezcla homogénea.

Imágenes 2: Adición del jugo de naranja en el agua peptonada

 Posteriormente añadimos 10 ml de la mezcla obtenido en el paso anterior e un tubo de

ensayo realizando la técnica de disolución bacteriana, que consiste en trabajar con
diluciones decimales. Obteniendo una preparación de 10 ml de la dilución 1/10 de la
muestra, para ello, se añade 1 ml de muestra a 9 ml de diluyente; es decir de cada 10 ml
de esta dilución 1/10, 1 ml corresponde a la muestra. Para el segundo tubo la dilución
1/100, o expresado de otro modo la dilución 10−2, realizando así preparaciones de
diluciones sucesivas, como se muestra en la siguiente imagen :

Imagen 3: Disolución Bacteriana

Fuente: Hawking, S. W. (1998)

 Una vez realizada este paso diluimos el agar nutritivo en una cocina eléctrica, ya que
estaba en estado sólido.
 Teniendo en cuenta que para cada análisis tenemos que someter la boca del matraz con
la disolución y los tubos de ensayo a calor suave.
 Con ayuda de una pipeta, utilizándola como sorbete para succionar y dejar caer la muestra al
tubo de ensayo, se logra de esta manera combinar homogéneamente la disolución.
 Se vertió 1ml de cada disolución a diferentes concentraciones (10-2 y 10-3) (en 2 placas PETRI,
como se aprecia en la imagen 4.

Imagen 4: Realización de la disolución de naranja

en los tubos de ensayo con solución salina

 En vista que el agar nutritivo estaba sólido y no se podía trabajar con ello, se llevó a una cocina
eléctrica, para calentar y llevarlo a un estado líquido (imagen 6).

Imagen 5

Imagen 5: Calentamiento del agar

 Teniendo el agar líquido, esperamos que enfriara a temperatura ambiente ya que al someter
nuestra muestra a la elevada temperatura en la que se encontraba el agar líquido, ocasionaríamos
la inactivación de los microorganismos a estudiar, éste al estar frio se vertió en cantidades
iguales a cada placa PETRI, con las diluciones, quedando la muestra como en la imagen 7.

Imagen 6: Vertido del agar en las Imagen 7

disoluciones (muestra de naranja).

 Llevamos las placas PETRI a la incubadora con una temperatura de 37°C por 24 horas,
colocándolas siempre en posición invertida lo que evitará que el agua de condensación se
deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención de colonias aisladas.

Imagen 8: Incubadora a 37o C

 Comprobamos los resultados de los agares que dejamos la semana pasada en la estufa para
comprobar si crecieron colonias bacterianas para lo cual utilizaremos una técnica ya conocida
por nosotros en el curso la coloración Gram.

 Para realizar la coloración tendremos primero que trabajar con el mechero y la asa
bacteriológica, trabajando siempre a no más de 20 cm, esto nos dará la seguridad de que la
 muestra que posteriormente observamos en el microscopio no esté propensa a sufrir una
contaminación cruzada para lo cual siempre es bueno pasar por el fuego rápidamente tanto la
asa bacteriológica y también la lámina porta-objetos.

Imagen 9: Asa Bacteriológica y mechero se está desinfectando el asa

 Procederemos a sacar una muestra del agar donde se observa a simple viste una colonia
relativamente grande de hongos para lo cual ya estaba diferenciado y no había necesidad de
identificarlo, procedimos a sacar de otros agentes que eran hasta ese entonces desconocidos
teniendo mucho cuidado de sacarlo y ponerlo de manera cercana al mechero.
 Una vez que tengamos ya nuestra muestra procederemos a trabajar con los colorantes para
determinar si es una Gram Positiva o una Gram Negativa

Tabla N° 02: Procedimiento para colorear la muestra

Colorantes Tiempo

Cristal Violeta Dejamos 1 minuto reposar

Lugol Dejamos 1 minuto reposar

Alcohol – Acetona Dejamos 1 minuto reposar

Safranina Dejamos 1 minuto reposar

TOTAL DE COLORANTES Dejamos 4 minutos reposar

Coloración Gram

 Se realizó los siguientes pasos :

Fijación de la muestra

Añadir

Cristal Violeta por 1

min., luego lavamos

Añadir
Lugol por 1 min.,
lavamos con agua

Añadir
Descolorizar con alcohol
de acetona, por 1 min
luego lo lavamos

Añadir

Safranina por 1 min.,

lavamos con agua

Imagen 10: Adición de Cristal Violeta en el porta - objetos

 Imagen 11: Adición del Lugol en el porta - objetos

Imagen 12: Adición de alcohol acetona en el porta - objetos

Imagen 13: Adición de la safranina en el porta - objetos

Imagen 14: Secado de muestra

 Posterior al tiempo de reposo que no debe ser menor de 4 minutos puesto que es necesario que
esta repose para posibilitar una clara observación en el microscopio óptico, se utilizó el objetivo
100x en donde es necesario el uso del aceite de inmersión para identificar con claridad cuál era
el tipo de microorganismo existente en el jugo de naranja.

Imagen 15: Adición del aceite de inmersión

en la muestra
Imagen 16: Microscopio Óptico

 Agar Sangre (por agotamiento)

Se divide la placa Petri, con el medio, en 4 cuadrantes, logrando así sembrar los diferentes
microorganismos ya obtenidos en el cultivo anterior en cada espacio para su diferenciación.

Imagen 17: División del medio (agar sangre) en 4 cuadrantes.

 Se llevan los cultivos, siempre ubicados boca abajo, a la incubadora por 24 horas
a 37°C.

Imagen 18: Incubadora

 Seguimos con la Tinción Gram

Comprobamos los resultados de los agares que dejamos la semana pasada en la
estufa para comprobar si crecieron colonias bacterianas en nuestro agar Sangre para
lo cual utilizaremos una técnica ya conocida por nosotros en el curso la famosa
coloración Gram

Imagen 19 y 20: Observación de agentes microbianos en el agar rojo posterior

a dejarlo en la incubadora durante una semana
  Para realizar la coloración tendremos primero que trabajar con el mechero y la asa
bacteriológica puesto que dentro del rango de no separarlo más de 20 cm esto nos dará
la seguridad de que la muestra que posteriormente observamos en el microscopio no
esté propensa a sufrir una contaminación cruzada para lo cual siempre es bueno pasar
por el fuego rápidamente tanto la asa bacteriológica y también la lámina portaobjetos

Imagen 21 y 22: Preparación de placas para ponerles el agar se descontamina con el

mechero además también se descontamina el medio de crecimiento de las bacterias llamado
solución salina

 Procederemos a sacar cuatro muestras del agar sangre para ello utilizaremos dos placas
donde pondremos las muestras que obtuvimos para lo cual identificamos cuatro puntos
críticos una de color amarillo otra mucosa blanca otra con posiblemente hongos y un
grano esto lo pasaremos a comprobar con la tinción gram para identificar que
microorganismos habitan en ese agar.

 Una vez que tengamos ya nuestra muestra procederemos a trabajar con los colorantes
para determinar si es una Gram Positiva o una Gram Negativa

Tabla N° 03: Procedimiento para colorear la muestra

Colorantes Tiempo

Cristal Violeta Dejamos 1 minuto reposar

Lugol Dejamos 1 minuto reposar

Alcohol – Acetona Dejamos 1 minuto reposar

 Safranina Dejamos 1 minuto reposar

TOTAL DE COLORANTES Dejamos minutos reposar

 Posterior a esto luego de agregar todos los colorantes procedemos a dejar secar las placas
durante un tiempo corto al ambiente para posteriormente pasarla por el mechero para
desinfectar la muestra y dejarla totalmente seca.

Coloración Gram
 Se realizó los siguientes pasos :

Fijación de la muestra

Añadir
Cristal Violeta por 1
min., luego lavamos
Añadir

Lugol por 1 min.,

lavamos con agua

Añadir

Descolorizar con
alcohol de acetona,
por 1 min lo lavamos

Añadir

Safranina por 1 min.,

lavamos con agua

Imagen 23: Adición de Cristal Violeta en el porta - objetos

 Imagen 24: Adición del Lugol en el porta - objetos

Imagen 25: Adición de Alcohol – Acetona en el porta - objetos

 Imagen 26: Adición de Safranina en el porta - objetos

Imagen 27: Dejar reposar las muestras porta - objetos

Imagen 28: Agregar aceite de inmersión para poder observar en el microscopio óptico en vista de
100 x (luego del secado de los porta objetos)
VIII. RESULTADOS

MEDIO DE CULTIVO: AGAR NUTRITIVO

 Crecimiento de colonias microbianas, cultivadas en un medio de agar nutritivo,

después de 48 horas.
 Las colonias a simple vista presentaron diferentes morfologías, medianas,
convexas, de color blanco, forma circular, bordes redondeados. (Imagen 30 )
 Macroscópicamente, se observó la presencia de un hongo, mostrado en la (Imagen
29).

Imagen 29: Visualización macroscópica Imagen 30: Formación de

de hongo en agar nutritivo colonias de levaduras.

 Observación en el microscopio de microorganismos cultivados en el agar nutritivo.

Imagen 31: Observación de levaduras de regular

tamaño en el microscopio óptico
CANTIDAD DE COLONIAS PRODUCIDAS EN AGAR NUTRITIVO.

-Fórmula para la obtención el número de unidades formadoras de colonias (UFC)

𝑼𝑭𝑪 (𝑵𝑶 𝒅𝒆 𝒄𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊𝒂𝒔 𝒑𝒐𝒓 𝒑𝒍𝒂𝒄𝒂) 𝒙 (𝒇𝒂𝒄𝒕𝒐𝒓 𝒅𝒆 𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊𝒐𝒏)

=
𝒎𝒍 𝒎𝒍 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 𝒔𝒆𝒎𝒃𝒓𝒂𝒅𝒂

*Factor de dilución: inversa de la dilución.

a) Con datos obtenidos en el laboratorio, con muestra de jugo de naranja, se contó un

aproximado de 150 colonias producidos bajo la dilución 10-2.

𝑼𝑭𝑪 𝟏𝟓𝟎 𝒙 𝟏𝟎𝟎

=
𝒎𝒍 𝟏𝒎𝒍
𝑼𝑭𝑪 𝟏𝟓𝟎𝟎𝟎
=
𝒎𝒍 𝒎𝒍

MEDIO DE CULTIVO: AGAR SANGRE.

Se observó crecimiento microbiológico, los cuales se asemejaron a mucosidades con tonalidad

blanquecina.

Imagen 31: Crecimiento microbiológico en agar sangre.

En el agar sangre lo que realizamos fue una coloración Gram para confirmar y a la vez también
a su vez identificar que bacterias están presentes en dicho agar para lo cual utilizaremos el
microscopio óptico que a su vez necesita previamente de una gota de aceite de inmersión en el
porta objetos.
Imagen 32, 33,34: Crecimiento de cocos en el agar sangre.

Imagen 35: Crecimiento de levaduras en el agar sangre

VIII. DISCUSIONES

 Una vez completado el período de incubación, observar el desarrollo de colonias y sus

características, especialmente el patrón de hemólisis La evaluación de los patrones
hemolíticos es válida solo para las condiciones de tiempo y temperatura de incubación
señaladas. Períodos de incubación prolongados o a mayores temperaturas alteran la
respuesta del medio de cultivo para este aspecto. (VALTEK S.A.-SANTIAGO
CHILE)

 Las muestras de jugo de naranja muestran contajes de aerobios mesófilos y de levaduras

que van entre 30% y 60% fuera de especificación microbiológica, sin crecimiento de
mohos ( Arroyo, 2009 ) en contraste con nuestros resultados del jugo de naranja en el
que se observó mohos esto puede ser explicado que venía directamente del jugo de
naranja o a su vez puede estar relacionado a las personas que manipulan la materia
prima en este caso el cítrico ( naranja )

 Tenemos que tener en cuenta la manera como se trabaja con la naranja esta materia
prima es lavada con agua reciclada, pasando directamente al extractor, en donde el agua
del lavado corre por la superficie de la fruta, inunda al equipo y llega hasta el recipiente
de almacenamiento del jugo el cual es también de procedencia desconocida y no parece
ser muy actual sino ya en estado medianamente usado.

 Arroyo (2009) comenta también que la mayoría de los vendedores ambulantes dispone
individualmente de los desechos que generan su actividad, no se observaron recipientes
apropiados para recolectar desechos sólidos adecuados en lugares accesibles.

 El pH del jugo de naranja puede ser un indicativo directo del tiempo de preparación, es
decir que mientras más tiempo esté almacenado se va a transformar en un pH más
básico. El pH también puede estar alterado por el estado de madurez de la fruta, el
tiempo y el modo de almacenamiento y las condiciones ambientales son fuentes directas
de la alteración del pH del jugo de naranja en palabras de (Bayona, 2009).

 La concentración de azúcar en las muestras no presentó una relación directa con la

proliferación de coliformes totales a pesar de ser una fuente de carbono, esto demuestra
 que las bacterias Gram negativas utilizan los nutrientes proporcionados por las peptonas
para su proliferación (Aryal, 2015).

 Recomendación

Por ende, en Perú, país en donde abunda el comercio ambulatorio, en especial la

venta de comidas, es necesaria la implementación de una Normativa Técnica que
especifique claramente los límites permisibles de microorganismos de este tipo de
bebidas frescas, dado que también se expende en ciertas zonas de la capital jugos de
toronja, piña, así como también de ensalada de frutas.

La normativa deberá enfatizar en la salud poblacional pero respetando y otorgando el

derecho a trabajar de los ciudadanos en este caso de los vendedores ambulantes.
IX. CONCLUSIONES

 Los hallazgos obtenidos en este estudio califican a la mayoría de puestos de venta

ambulatoria de alimentos con riesgo sanitario alto. Se requiere un mayor control por
parte de las autoridades correspondientes y una mayor información y capacitación a
vendedores y consumidores de este tipo de alimentos.
 Teniendo en cuenta los puntos críticos de control se puede mejorar la calidad de los
alimentos de venta ambulatoria, entre los más importantes se encontró, la disponibilidad
de agua de buena calidad sanitaria ya que es determinante para lograr alimentos de
calidad sanitaria idónea los puestos no tiene un sistema de abastecimiento de agua y
presentan un deficiente lavado del material reutilizable, es necesario un adecuado
hábito de higiene de los manipuladores, ellos no utilizan el equipo de protección
personal ni realizan un correcto lavado de manos ni desinfección del área de trabajo.
Para la correcta conservación de los alimentos preparados durante el tiempo que
transcurre hasta su venta se debe utilizar recipientes en los cuales no se encuentren
expuestos a la intemperie, pues se observó que las naranjas se encontraban al aire libre.
Estos puntos críticos fueron el factor determinante para explicar los altos niveles de
contaminación microbiana de los alimentos expedidos en los puestos de venta
ambulante estudiados.
 Según la “Norma Sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad
sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano” (2008),
en el apartado XV.1. (que hace referencia a los alimentos preparados sin tratamiento
térmico mencionando los jugos naturales, uno de los tantos alimentos descritos), en
donde nos da las cantidades límites de diferentes agentes microbianos que debe
contener los alimentos.
La muestra de jugo de naranja que fue analizada dio un UFC/ml de 15000, el cual se
encuentra dentro del intervalo límite de la cantidad aceptable en lo que respecta a
aerobios monofilos.
 La presencia de microorganismos patógenos como Escherichia coli, Staphylococcus
aureus y Salmonella no fue significativa en las muestras del jugo de naranja
 Se llegó a la conclusión que las condiciones higiénicas sanitarias de los puestos de venta
de jugo de frutas expendidos en los alrededor de la universidad Nacional del Santa
, está relacionadas significativamente con la carga microbiana de los jugos de frutas,
de tal forma que, a mayor deficiencia en las condiciones higiénicas menor la calidad
microbiológica de los jugos.
X. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

o Antillón, F. (1997). Higiene y salud en los servicios de alimentación pública:

manual para manipuladores de alimentos. San José: Editorial UCR.

o Aryal, S. (2015). MacConkey Agar-Composition. Microbiologyinfo, 12-15.

o Arroyo, A. (2009). Calidad Microbiológica de algunas Bebidas de Expendio

Ambulante. Universidad Centro occidental “Lisandro Alvarado”, 3-6

o Bayona, A. (2009). Evaluación Microbiológica de Alimentos Adquiridos en la Vía

Pública. Scielo, 10-12.

o Camacho, A. (2009). Técnicas para el Análisis Microbiológico de los Alimentos.

o Ciudad de México: UNAM. FAO. (2011). Alimentos de venta callejera: el camino a

seguir para una mejor seguridad alimentaria y nutrición. Publicaciones FAO, 12-30.

o FIAI. (23 de Noviembre de 2013). Agroindustria. Obtenido de El Zumo de Naranja

https://fiai-pe.blogspot.com/2013/11/el-zumo-de-
naranja.html?fbclid=IwAR0kccXwe0zsmPvbSkYrk9E8iFtF9h06DtLkWTB4MvE8
Ppdl_40YmiqMM6Y

o Pelayo, M. (24 de Julio de 2007). Consumer.es. Obtenido de Consumer.es:

http://www.consumer.es/seguridad-alimentaria/ciencia-y-
tecnología/2007/07/24/28327.php
o Pelayo, M. (15 de Abril de 2010). Consumer.es. Obtenido de Consumer.es:
http://www.consumer.es/seguridad-alimentaria/sociedad-y-
consumo/2010/04/15/192394.php

o Torres, L. L. (2006). Estudio Cuantitativo de Bacterias. Fondo Editorial de la

Universidad Nacional del Nordeste, 30-35.

o Willen, J. (2009). Microbiología de Prescott, Harley y Klein

XI. ANEXOS

Pipeta esterilizada y tubos de ensayos con solución salina

Agar nutritivo

Jugo de naranja

I
Agua Peptonada

Mechero

Placas Petri

II
 Aza de Kolle

Colorantes Aceite de inmersión

Microscopio Laminillas

III