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Guía de Laboratorios Código FLA-23 V.

01
Fundamentos de Microbiología de alimentos
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PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA

MANUAL DE PRACTICAS DE
LABORATORIO

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
PROGRAMA DE NUTRICIÓN Y DIETÉTICA

UNIVERSIDAD DE PAMPLONA.
2015
Guía de Laboratorios Código FLA-23 V. 01
Fundamentos de Microbiología de alimentos
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PRACTICA 1.
MUESTREO, DILUCIONES Y RECUENTO MICROBIANO

INTRODUCCION

Muestreo: Es la operación que consiste en separar un determinado número de muestras


de un lote con el fin de obtener resultados analíticos confiables.

Número de Muestras: Para que el muestreo tenga utilidad estadística, se debe realizar
sobre un número apreciable de unidades de un lote. El número de muestras esta en
relación con la precisión que se desee obtener de los resultados.

El número de muestras es el igual a la raíz cuadrada del número total de unidades que
conforman el lote, o tomando el 1 %, del total cuando este es grande y el 10%, cuando el
lote es pequeño. Cuando los productos se controlan con regularidad, es suficiente
analizar de 5 a 10 muestras de cada lote.

Parámetros a tener en cuenta en un programa de Muestreo:

- Inspección
- Tamaño del lote (N)
- Tamaño de la muestra(n)
- Muestra
- Toma de muestra
- Muestra defectuosa
- Riesgo del comprador
- Riesgo del vendedor
- Nivel de calidad Aceptable (NCA): Es el porcentaje máximo de unidades defectuosas
(número máximo de unidades defectuosas por cada 100), que se considera
satisfactorio o que se admite en un lote.

Condiciones para el muestreo:

Para obtener una muestra representativa se deben cumplir las siguientes condiciones:

- La persona responsable del muestreo debe conocer perfectamente su finalidad e


importancia, debe estar bien entrenada.
- En lo posible la muestra se tomara en sus envases originales.

RECUENTO EN PLACA DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS MÉTODO


Ministerio de Salud
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Para la correcta aplicación de esta norma, la preparación de la muestra es fundamental,


por lo tanto se requiere que la siembra se realice a partir de dos diluciones consecutivas y
por duplicado, además de inocular correctamente los volúmenes, 0.1ml, para superficie y
bajo ciertas circunstancias 1 ml, como cuando se sospecha baja carga microbiana y 1 ml
para análisis en profundidad.

RANGOS PARA EL RECUENTO:

Bacterias: Después del periodo especificado de incubación, se cuentan las unidades


formadoras de colonias presentes en las cajas que contengan entre 30 a 300 ufc; los
análisis que aplican a dicho rango son: Aerobios mesófilos, Coliformes, Bacterias
termófilas y en general para el análisis de microorganismos donde no se observan
reacciones enzimáticos ni de crecimiento sobre la superficie del Agar.

Bacterias (patógenos o identificación enzimático posterior al recuento): Para el recuento


de estos últimos microorganismos se emplea el rango 20 a 200 ufc, como para el análisis
de S. aureus, B. cereus.

Mohos y Levaduras: Para el recuento de mohos y levaduras y levaduras osmófilas se


debe utilizar el rango comprendido entre 10 y 100 ufc.

RECUENTO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS:

Caso General:

Se calcula el promedio de colonias para cada una de las diluciones a examinar,


multiplicando el resultado por el inverso de la dilución respectiva, a partir del recuento de
dos diluciones consecutivas. A continuación se divide el resultado obtenido en la mayor
dilución por el obtenido en la menor dilución (dividir la menos concentrada por la más
concentrada).

Si el cociente de esta división es mayor a 2, se reporta el resultado obtenido en la


dilución más concentrada, pero, si el cociente es menor o igual a 2, se reporta la
media aritmética de los recuentos de las dos diluciones utilizadas para el cálculo.

El resultado obtenido se redondea a dos cifras significativas. Para esto, si la última cifra
es inferior a 5, la cifra anterior no se modifica, pero, si la última cifra es mayor o igual a 5,
la cifra anterior se incrementa en una unidad y se prosigue así hasta obtener las dos cifras
significativas.

Los resultados se expresan en ufc/g o ml, de producto, según la naturaleza del mismo y
expresado como un número entre 10 y 99 (dos cifras significativas enteras), multiplicado
por 10x donde x es la potencia apropiada de 10.

Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos, para un agua embotellada, se


obtuvieron los siguientes resultados:
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Primera dilución retenida 10-2 168 y 215 ufc


Segunda dilución retenida 10-3 35 y 45 ufc

N = 168+215/2 x100

N = 19150

N= 35+45/2 x 1000

N= 40000

N= 40000/19150 = 2.087 >2

Como el cociente es mayor a dos, se reporta el resultado de la menor dilución, 10-2:19150


ufc/ml. Al redondear la cifra a dos enteros, como se especificó anteriormente, se obtiene
19000, que expresado con dos cifras significativas es 19 x 103 ufc/ml.

Casos especiales:

CASO 1: Cuando el número de ufc se encuentra por debajo del rango mínimo en ambas
cajas de una o de las dos diluciones consecutivas, se informará de la siguiente manera:
Se descarta el recuento obtenido en la mayor dilución y se calcula la media aritmética de

las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilución, multiplicándose por el
inverso de la dilución, e informando el resultado así:

Conteo Estimado de ufc/g o ml, expresado con las dos cifras significativas enteras.

CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las dos cajas correspondientes a la primera dilución


no presentan crecimiento, se reporta como negativo y se informa el resultado como sigue,
utilizando para el reporte el factor de dilución más concentrado.

Conteo Estimado < 1 x 10x ufc /g o ml, según corresponda

CASO 3: Crecimiento abundante; si las dos cajas correspondientes a la primera dilución


presentan crecimiento mayor de 300, 200 o 100, según sea el análisis, se divide la caja en
4,6, u 8 cuadrantes, se cuenta el número de colonias presentes en un cuadrante y se
multiplica por el total de cuadrantes hechos en la caja. Se realiza el mismo procedimiento
con la otra caja correspondiente a la misma dilución y posterior a ello se saca la media
aritmética de cada dilución, multiplicando por el inverso de la dilución respectiva. Se
continúa el recuento como en el caso general, pero se informa el resultado como conteo
estimado de ufc/g o ml, (es decir, dividir el resultado de la mayor dilución por el de las
menores y ver si el resultado es menor o igual o mayor a 2 y proseguir como los casos
generales.

Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos en una muestra de jugo se


obtuvieron los siguientes resultados, para una leche pasteurizada:
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Primera dilución retenida 10-2: > 300 ufc en las dos cajas
Segunda dilución retenida 10-3> 300 ufc en las dos cajas
Al dividir las cajas de 10-2 en 4, se contó en un solo cuadrante 180 y 150 colonias
respectivamente. Y al dividir las cajas de 10-3 en 4, se contó en un solo cuadrante 100 y
120 colonias respectivamente.

10-2(caja 1) ((180 X 4) X 100)) 10-2(caja 2) ((150 X 4) X 100))


10-3(caia1) ((100 X 4 ) X1000)) 10-3(caia2) ((120 X 4) X1000))

10-2 = 720+600 X 100/2 = 66000

10-3 = 400+480 X1000 12 = 440000

440000/66000= 6,66 > 2

Como el cociente es > a 2, se reporta el resultado de la menor dilución 10'10-


2
:66000ufc/ml. Al redondear la cifra a dos enteros, como se especificó anteriormente, se
obtiene 66000, que expresado con dos cifras significativas es igual al Conteo Estimado de
66 X 103 ufc/ml.

NOTA: Cuando el conteo de colonias exceda de 200 en 1/8 de la caja, se reportará como
Conteo Estimado > 1600 ufc/g o ml, multiplicado por el inverso de la mayor dilución.

PROCEDIMIENTO

El trabajo de las muestras debe iniciarse lo antes posible después de su recolección, si no


se puede, se debe mantener en refrigeración sin exceder las 24 horas. Si la muestra está
congelada, descongelarla en el envase original.

En muestras líquidas la dilución 10-1 se prepara midiendo 11 ml o 10 ml de la muestra en


un frasco de dilución que contenga 99 ml o 90 ml de diluyente, sosteniendo la pipeta en
un ángulo de 45 grados sobre la parte interior del cuello del frasco.

Para muestras sólidas pesar 11 g o 10 g del total del alimento, en un frasco de dilución
que contenga 99 ml o 90 ml de diluyente, tratando de coger de la superficie e interior del
alimento (no debe olvidar que este procedimiento se debe hacer en condiciones de
esterilidad). Guardar una contramuestra para eventuales verificaciones, en condiciones de
refrigeración, congelación o medio ambiento de acuerdo con las características de
almacenamiento del producto.

Agitar el frasco vigorosamente, dejar en reposo de 2 a 5 minutos.

- Transferir un mililitro de la dilución 10-1 a un tubo que contenga 9 ml de diluyente para


obtener la dilución 10-2 homogenizar cuidadosamente la dilución, y transferir un mililitro
a otro tubo que contenga 9 ml del diluyente para obtener la dilución 10-3. Repetir estos
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- pasos hasta obtener el número de diluciones deseadas, cada dilución sucesiva


disminuirá 10 veces la concentración.
- Siembre en profundidad y por duplicado, Inoculando 1 ml de la(s) diluciones
seleccionadas encajas De Petri estériles.
- Vierta el Agar SPC fundido y mantenido a 45° C.(15 a 20 ml)
- Mezcle inmediatamente las cajas con el medio, moviendo estas a la derecha,
izquierda, arriba y abajo, mínimo 5 veces.
- Deje solidificar, e incube las cajas invertidas a 37° C ± 2° C.
- Pasadas 24 horas de incubación, revise las cajas y realice el recuento de colonias
visibles, incube nuevamente y revise a las 48 horas, realice el recuento.
- Criterio de selección: Cuando se va a realizar el recuento, debe seleccionar las
diluciones para bacterias mesófilas aerobias, en el rango de 30 a 300 colonias.
- Para el recuento de mohos y levaduras, inocule 0.1 ml, de la dilución correspondiente
sobre la superficie de una caja de Agar OGY, deje absorber e incube invertidas las
cajas a 25° C por 3 a 5 días.
- Seleccione las cajas que estén entre 15 y 150 colonias, cuente las colonias que
presenten las características de hongos y levaduras, informe el resultado de mohos y
levaduras por g o ml.
- Con los datos obtenidos en los dos casos, proceda a realizar los cálculos por los
métodos de ICONTEC y Ministerio de Salud.
- Reporte los resultados correctamente.
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PRACTICA 2.
RECUENTO DE BACTERIAS MESÓFILAS AEROBIAS, MOHOS Y LEVADURAS

INTRODUCCION

Los aerobios mesófilos, los mohos y las levaduras constituyen un grupo de interés en la
microbiología de los alimentos puesto que tienen múltiples usos, uno de ellos es el de
constituir grupos indicadores de población que se asocian directamente a la calidad o
estado del alimento, su exposición su manipulación y almacenamiento, la mayoría de los
alimentos industrializados (excepto, los productos fermentados), deben ser considerados
como inadecuados para el consumo, cuando contienen un gran número de estos
microorganismos, aun cuando la mayoría no sean conocidos como patógenos y no hayan
alterado de forma inapreciable las características organolépticas del alimento.

Las bacterias mesófilas aerobias son un grupo heterogéneo de bacterias capaces de


crecer entre 15 y 45 °C, con un rango óptimo de 35 °C, en la industria de alimentos es
considerado como el grupo indicador más grande que existe. En productos terminados es
utilizado como indicador de vida útil. Para su recuento se utilizan medios de cultivo que
no tengan inhibidores para permitir el crecimiento de los microorganismos. Este recuento
no se hace en productos enlatados ni fermentados, ya que por la naturaleza de estos
alimentos, el recuento no sería representativo.

Recuentos altos en alimentos estables indican materias primas contaminadas o


tratamiento no satisfactorio, en productos perecederos, pueden indicar condiciones
inadecuadas de tiempo y temperatura durante su almacenamiento. La presencia de un
número elevado de bacterias aerobias mesófilas que crecen bien a temperatura corporal o
próxima a ella, significa que puede haberse dado condiciones favorables a la
multiplicación de microorganismos patógenos de origen humano o animal. En alimentos
deshidratados y en los congelados, siempre se obtienen recuentos de bacterias viables
más bajos. Así un recuento en placa no puede reflejar la calidad microbiológica de la
materia prima, antes de los procesos o tratamientos correspondientes, y por ello, es
necesario llevar un examen microscópico directo para comprobar si efectivamente, en un
principio existían o no abundantes microorganismos.

Los recuentos de bacterias mesófilas son de poco valor a la hora de predecir la vida útil
de un alimento conservado en refrigeración, ya que muchos microorganismos mesófilos
no crecen a temperaturas por debajo de los 5 °C. Los recuentos elevados de bacterias
mesófilas en productos crudos o no tratados, a menudo están constituidos por microflora
normal o pueden indicar alteraciones incipientes del alimento y no un peligro potencial
para la salud del consumidor.

Por otra parte, la contaminación fúngica de un alimento tiene mucha importancia, no tan
sólo por su acción deteriorante, que pudre y malogra materias primas y productos
manufacturados, sino también por la capacidad de algunos hongos para sintetizar gran
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variedad de micotoxinas, para provocar infecciones y, incluso, para provocar reacciones


alérgicas en personas hipersensibles a los antígenos fúngicos. Por estos motivos, para
conocer la calidad microbiológica de un producto, es pertinente realizar un recuento de
hongos y levaduras.

Los mohos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente,


pudiéndose encontrar como biota normal de un alimento, o como contaminantes en los
equipos. Ciertas especies son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo
también pueden ser causantes de la descomposición de los mismos. Debido a su
crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los
alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden
ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja
temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento
a la irradiación.

PROCEDIMIENTO

- Prepare las diluciones 10-1,10-2 y 10-3 en agua de peptona al 0.1 % a partir de las
muestras de alimentos.
- Prepare cuatro cajas de Petri estériles por dilución y divídalas de la siguiente manera:
dos para análisis de aerobios mesófilos y dos para análisis de mohos y levaduras.
- Adicionar 1 ml de cada dilución del alimento en las cajas seleccionadas.
- Adicione 20 ml de Agar Plate Count (debe estar a una temperatura de
aproximadamente 45ºC) a las primeras dos cajas seleccionadas para los aerobios
mesófilos de cada dilución.
- Mezcle inmediatamente las cajas con el medio, de acuerdo con los movimientos de las
agujas del reloj, mínimo 5 veces.
- Adicione 20 ml de Agar Patata dextrosa o Extracto de malta (debe estar a una
temperatura de aproximadamente 45ºC) a las segunda serie de dos cajas
seleccionadas para los mohos y levaduras de cada dilución.
- Mezcle inmediatamente las cajas con el medio, de acuerdo con los movimientos de las
agujas del reloj, mínimo 5 veces.
- Deje solidificar e Incube a 35 °C durante 48 horas para los aerobios mesofilos y a
25°C durante 72 horas para mohos y levaduras
- Retire los materiales de la incubadora una vez cumplidos sus periodos y realice el
recuento en cada caso.
- Cuando se va a realizar el recuento seleccione las cajas de las diluciones para
bacterias mesófilas aerobias, que contengan entre 30 a 300 colonias y 15 a 150 para
mohos y levaduras.
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PRÁCTICA 3.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Staphylococcus aureus COAGULASA
POSITIVO

INTRODUCCIÓN.
Los cocos Gram positivos y en especial Staphylococcus aureus son los
microorganismos más aislados de cualquier muestra clínica con excepción de las
enterobacterias, la segunda causa de infecciones intrahospitalarias (nosocomiales) y una
de las causas más comunes de intoxicación alimentaria. Según la novena edición del
Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática Staphylococcus spp se ubica dentro de
su propia familia Staphylococcaceae. El género Staphylococcus se compone
actualmente de 33 especies, de las cuales 17 pueden asociarse al hombre, de estas
Staphylococcus aureus es una especie potencialmente patógena que al desarrollarse
en un alimento puede producir una “toxina” que es la causa de la intoxicación.

GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.
Los estafilococos son ubicuos y se encuentran generalmente en la piel y las mucosas
nasales del hombre y otros animales. S. aureus puede distinguirse de Micrococcus por
su capacidad facultativa, resistente a la lisozima, sensible a la lisostafina y porque su
pared contiene ácidos teicoicos. S. aureus es un coco Gram positivo no esporulado,
inmóvil de 0,8 a 1 micra de diámetro, que se divide en varios planos formando
agrupaciones en forma de racimos en medios sólidos y pares, individuales o cadenas
cortas en medios líquidos, que prefieren las condiciones aeróbicas más que las
anaerobicas. Poseen una enzima _ – lactamasa lo que les confiere la resistencia a los
antibióticos como la penicilina y algunos de sus derivados. En el laboratorio las colonias
crecen lisas, convexas, resplandecientes y de borde entero, presentan pigmento que
puede ser variable de naranja a amarillo y de allí su denominación de coco dorado
(aureus). El crecimiento sobre medios de cultivo es abundante, y en caldo de cultivo se
manifiesta por la turbidez del caldo que más adelante se aclara observándose en el fondo
del tubo un sedimento fino suspendido o una película que forma un anillo en la superficie
del líquido.

La presencia de S. aureus en los alimentos puede provenir de la piel, la garganta, la nariz


de los manipuladores de alimentos que actúan como portadores sanos, los materiales y
equipos sucios, materias primas de origen animal contaminadas, y en general por una
falta adecuada de higiene. Una alta concentración de S. aureus en un alimento es un
buen indicativo de que la manipulación, el control sanitario y la temperatura de
almacenamiento no han sido los correctos. El consumo de alimentos principalmente
lácteos, pasteles rellenos de crema, productos de carnes de res o aves y pescados.

JUSTIFICACIÓN DEL ANÁLISIS.


El crecimiento de S. aureus en alimentos representa un peligro público potencial ya que
muchas cepas de este microorganismo producen enterotoxinas que causan intoxicaciones
al ser ingeridas. Aproximadamente la mitad de las cepas de Staphylococcus aureus
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generan alguna de las seis enterotoxinas serológicamente distinguibles (A, B, C1, C2, D y
E). Las intoxicaciones causadas por Staphylococcus aureus pueden constituir un alto
porcentaje del total de los procesos de intoxicación alimentaria. Igualmente se reconoce
que del 15 a 20% de los S. aureus aislados de los humanos son enterotoxigénicos, esto
explica el porqué de la importancia de los manipuladores de alimentos en la transmisión
del microorganismo.

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
Las características bioquímicas empleadas para identificar S. aureus se resumen en la
tabla 3.

PROCEDIMIENTO.

AISLAMIENTO Y RECUENTO EN PLACA:


Esta técnica es utilizada cuando se sospecha que el alimento a analizar contiene una gran
población de este microorganismo (>a 100 UFC/ gr o ml).

Preparar diluciones de 10-1, 10-2, y 10-3 .a partir de queso campesino de hoja.


Sembrar por duplicado 0.1 ml de las diluciones de 10-1, y 10-2 en superficie de agar
Baird Parker.
Con la ayuda de varillas de hockey extender sobre toda la superficie hasta quedar
seca.
Incubar las placas a 35ºC +/- 2ºC por 24 a 48 horas.
Pasado este tiempo seleccionar las placas que presentan entre 15 – 300 colonias
aisladas y contar las colonias:
En agar salado Manitol aparecen de color amarillo cremosas con viraje del medio de
rojo a amarillo.
En agar Baird Parker colonias típicas: redondas negras y brillantes, con bordes
reducidos blancos y lisos, convexas y que aparezcan rodeadas de zonas claras que
contrastan con el medio opaco: zona de precipitado.
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En medio de Vogel Jhonson son de color negro rodeadas de un halo amarillo por la
fermentación del Manitol produciendo acidez en el medio la cual hace virar el
indicador.
Marcar la posición de estas colonias e incubar las placas por 18 horas adicionales.
Contar todas las colonias que presenten el aspecto mencionado y que se han
desarrollado durante las 18 horas adicionales de incubación.
Tomar un mínimo de 3 colonias típicas y realizar la prueba de coagulasa.

La presencia de la enzima coagulasa así como la DNA-asa son indicadores primarios de


cepas de S. aureus productoras de enterotoxinas. Por esto se debe realizar esta
confirmación en los alimentos para determinar la presencia de dichas cepas toxigénicas y
de la cuantía existente de la misma.

A) PRUEBA DE COAGULASA.
La coagulasa es una enzima proteica similar a la protrombina, capaz de transformar el
fíbrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coagulo visible en un sistema
analítico adecuado, esta prueba es útil para identificar S. aureus coagulasa positivo de
otros estafilococos coagulasa negativo. Esta enzima se puede encontrar en forma "libre" y
la mal llamada “coagulasa ligada" o “Clumping factor”, cada una de las cuales poseen
diferentes propiedades que requieren el uso de diferentes técnicas para ser demostradas.

Coagulasa fija es una enzima que debería denominársele factor de agregación, está
unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las células
suspendidas en el plasma (que contiene fíbrinógeno) provocan su aglutinación, indicada
por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos.

Prueba en portaobjetos: Para esta prueba se coloca una gota de agua destilada estéril
en un portaobjetos y con ayuda de un asa se transfiere y homogeneiza una o dos colonias
sospechosas del microorganismo, paso seguido se adiciona una gota de plasma
reconstituido junto a la gota del microorganismo, se mezcla bien y se empieza a inclinar el
portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formación inmediata de un precipitado
granular o de grumos blancos. Una reacción positiva se detecta usualmente en 15 a 20
segundos por la aparición del precipitado granular la prueba se considera negativa si no
se observa aglutinación al cabo de 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos
los cultivos negativos o positivos tardíos deben ser verificados mediante la prueba en
tubos.
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PRÁCTICA 4.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES
(Clostridium perfringens).

INTRODUCCIÓN
Las especies de Clostridium perfringens hacen parte de los bacilos anaerobios
esporulados. Pertenece a la familia de las Bacillaceae, caracterizado por su morfología en
forma de bastón con tamaño promedio de 0.9 a 1.3 por 3 a 9 micras, con esporas ovales,
subterminales no deformantes y resistentes al calor. También son microorganismos
encapsulados cuando se encuentran en las heridas, inmóviles y clasificados como
anaerobios estrictos, aunque pueden crecer en presencia de niveles bajos de oxígeno.
Presenta temperatura óptima de crecimiento de 45°C desarrollándose hasta unos 15°C.
Se encuentran distribuidos en toda la naturaleza y en el tracto intestinal de humanos, y
animales como el ganado vacuno y porcino, todos sanos.

GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.
Cl. perfringens es un bacilo Gram positivo esporulado que forma parte de la biota
anaeróbica normal del ser humano. Las cepas de Cl. perfringens se clasifican en cinco
tipos (A-E) dependiendo de la clase de toxina que producen. Estas toxinas deben
diferenciarse de las enterotoxinas secretadas por las cepas de Cl. perfringens tipo A
causantes de intoxicación alimentaria. Las cepas enterotoxigénicas se consideran como
causantes de diferentes procesos diarréicos asociados al consumo de alimentos
contaminados (diarrea clásica), a ciertos casos de diarrea postantibiótica y a cuadros de
diarréicos esporádicos (comunitarios y nosocomiales) no asociados con ningún brote
alimentario. Para que se origine el crecimiento y desarrollo de Cl. perfringens en el tubo
digestivo humano es preciso la ingesta previa de una elevada concentración de
microorganismos; en general se calcula que la dosis infectiva está situada entre 106 - 108
UFC/g.

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
Las características bioquímicas empleadas para identificar Cl. perfringens se resumen en
la tabla 7.

PROCEDIMIENTO.

RECUENTO EN PLACA PROFUNDA:


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Esta técnica es utilizada cuando se sospecha que el alimento a analizar contiene una gran
población de este microorganismo (>a 100 UFC/ gr o ml).

· Preparar diluciones de 10-1, 10-2, y 10-3 .a partir de la muestra.


· Sembrar por duplicado 1 ml de las diluciones de 10-1, y 10-2 en el fondo de una caja
de Petri.
· Adicionar de 15 a 20 ml de medio fundido y mantenido a 55ºC (Agar SPS, OPSP, Agar
Selectivo para Clostridium perfringens) y rotar en forma conveniente.
· Incubar las placas a 43 °C +/- 2 °C por 24 a 48 +/2 horas en anaerobiosis.
· Pasado este tiempo seleccionar las placas que presentan entre 15 – 300 colonias
aisladas negras de 1 a 3 mm de diámetro (pueden ser planas, algo rizoides y
elevadas en el centro)
· Realizar confirmación.

CONFIRMACIÓN DE LAS COLONIAS PARA Clostridium perfringens.

· Tomar como mínimo 3 colonias negras a ensayar, e inocular en caldo Tioglicolato por 4
horas a 46°C en baño de María, o toda la noche a 35 – 37º°C.

· Hacer extensiones y teñirlas por el método de Gram y coloración de esporas, C.


perfringens es Gram Positivo con morfología bastones grandes con los extremos
redondeados, con esporas subterminales deformantes. La observación de esporas es
difícil de lograr, para ello se recomienda sembrar un tubo inclinado con Agar carne cocida
e incubarlo de forma anaerobia durante 5 a 7 días a 30°C.

Una vez comprobada la morfología, se procede a sembrar tubos con caldo nitrato, Agar
gelatina, Agar SIM, Agar sangre, y las bioquímicas a disposición.

Los medios se incuban en anaerobiosis a 43ºC +/- 2ºC por 18-24 horas.

Realizar la prueba de catalasa adicionando a una colonia o una emulsión de la colonia
peróxido de hidrógeno al 3%.
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PRÁCTICA 5.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Bacillus cereus.

INTRODUCCION
Desde mediados de 1970 B. cereus se ha reconocido de manera creciente como Una
causa significativa de intoxicación alimentaria, por ejemplo, en países como Estados
Unidos el 1% de todas las epidemias alimentarias son causadas por este microorganismo,
los datos de otros países aún son poco escasos. Bacillus cereus es un microorganismo
esporulado que una vez ha invadido un alimento por intermedio de estas estructuras y
encuentra las condiciones óptimas, las esporas empiezan a germinar dando lugar a la
proliferación y multiplicación de este microorganismo y por lo tanto la producción de una o
las dos toxinas implicadas en las ETA.
Bacillus cereus causa intoxicaciones alimentarias a través de la ingesta de alimentos
contaminados. En general se admite que, debido a la levedad del cuadro y a que la
detección microbiológica de esta bacteria no se realiza rutinariamente en pacientes
diarreicos, la incidencia real puede ser superior a la estimada.

GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.
El género Bacillus está constituido por unas 34 especies que pertenecen a la familia
Bacillaceae según la 8va Edición del Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Este
grupo se caracteriza por su gran heterogeneidad entre sus especies no solo a nivel
constitutivo de G-C en el DNA sino por su diversidad metabólica, requerimientos
nutricionales y estructura de sus paredes. El género incluye especies psicrófilas,
mesófilas y termófilas, alcalófilas, neutrófilas y acidófilas, aerobias estrictas hasta
facultativas. Casi todas las especies actualmente conocidas secretan una variedad de
enzimas hidrolíticas extracelulares (solubles) que degradad polisacáridos, ácidos
nucléicos, lípidos. Son productores de antibióticos como bacitracina, polimixina, tirocidina,
gramicidina circulina, esta producción de antibióticos está relacionado con la
esporulación, la liberación de estos metabolitos empieza cuando la esporulación
comienza cerca de la fase estacionaria de crecimiento.

Bacillus cereus se caracteriza por presentar morfología bacilar (bacilos grandes); Gram
positivos de aproximadamente 3 a 5 micras de largo por 1 a 1,2 micras de ancho y
formadores de esporas. Se pueden agrupar en cadenas, pares o encontrarse aislados, así
como contener glóbulos intracelulares que no se tiñen fácilmente, con movilidad variable,
y pueden desarrollarse fácilmente en agar glucosa.

Las características de sus esporas pueden ser cilíndricas u ovaladas con ubicación
central y no deformante, son menos resistentes que las de Clostridium perfringens ya
que se destruyen a 100ºC en 5 a 30 minutos. B. cereus es anaerobio facultativo y puede
crecer entre los 5ºC – 10ºC y 48ºC – 55ºC, aunque presentan temperaturas óptimas de
30ºC a 35ºC, aproximadamente el 80% de las cepas de B. cereus producen durante su
esporulación sustancias con actividad antibiótica y elaboran durante la fase logarítmica
una toxina termoresistente y durante la germinación de sus esporas otra termolábil que
originan dos síndromes o patologías distintas relacionadas con alimentos, el síndrome
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emético y el síndrome diarreico respectivamente.

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
Las características bioquímicas empleadas para identificar B. cereus se resumen
en la tabla 1.

PROCEDIMIENTO.

RECUENTO EN PLACA SUPERFICIAL


Esta técnica se utiliza cuando se sospecha que el alimento contiene más de 10
UFC de Bacillus cereus por gramo de muestra. Para realizar esta técnica se emplean
cajas de Petri con el medio a emplear ya servido.

- Preparar una serie de diluciones decimales de una muestra problema.


- A partir de la serie de diluciones decimales y por duplicado se deposita 0.1 ml de
cada una sobre la superficie bien seca de Agar Mossel o Agar selectivo para
Bacillus cereus.
- Diseminar él inoculo con ayuda del asa de vidrio y dejar reposar 15 minutos o
hasta secar.
- Incubar a 30ºC +/-1ºC por 24 a 48 horas.
- Hacer el recuento de colonias típicas así:

En agar Mossel (Rosado) las colonias típicas son de color rosado cremosas rodeadas de
un halo de precipitación blanco denso y una gama de tono rojo violeta al fondo.

En agar selectivo para Bacillus cereus (verde azulado) las colonias típicas aparecen de
color azul crenadas con halo denso al rededor (lecitinasa +).

Sembrar por estría de tres a cinco colonias típicas sobre agar nutritivo para hacer la
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confirmación bioquímica, se incuba a 30ºC +/-1ºC máximo por 24 horas.

CONFIRMACIÓN BIOQUÍMICA

Partiendo del crecimiento obtenido en agar nutritivo se realizan las siguientes pruebas:

- Coloración de Gram y coloración de esporas.


- Con asa recta sembrar en tubos con agar BHI por punción y cubrir con parafina
estéril Incubar a 30ºC +/- 1ºC durante 7 días observando cada día crecimiento
sobre la línea de punción.
- Sembrar un tubo con caldo glucosa tamponado (sin fosfato) e incubar a 30ºC +/-
1ºC durante 24 a 48 horas. En este tubo detectar la formación de Acetil-Metil
Carbinol (prueba de Voges Proskauer) adicionando 0.6 ml de a-naftol al 5% y 0.2
ml de KOH al 40%.
- Sembrar por suspensión caldo nitrato, caldo glucosa, caldo xilosa, caldo
arabinosa, e incubar a 30ºC +/- 1ºC por 24 a 48 horas, y revelar.
- Sembrar sobre superficie de agar almidón, agar CASO, agar SIM, Agar TSI y en
agar gelatina e incubar a 30ºC +/-1ºC por 24 a 48 horas.
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PRÁCTICA 6.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Salmonella spp

INTRODUCCIÓN.
La salmonelosis es el nombre genérico empleado para designar las infecciones humanas
y animales originadas por diferentes miembros de Salmonella spp. Actualmente en
Colombia los casos reportados como enfermedades (intoxicaciones o infecciones)
transmitidas por alimentos (ETA) indican que los principales microorganismos patógenos
causantes de estas pertenecen a Staphylococcus aureus y Salmonella pullorum y
Salmonella gallinarum; es decir, los colombianos estamos más expuestos a estas
intoxicaciones mas que por cualquier otro agente causal, pero este hecho no indica que
se descuide la vigilancia y control epidemiológico de los otros agentes causantes de
ETAS. El mismo hecho contrasta en el ámbito mundial donde las salmonelosis
(Salmonella enteritidis) son las enfermedades transmitidas por alimentos que más
predominan, por lo menos en la teoria. Se admite generalmente que la salmonelosis es
una infección alimentaria, pruebas más recientes sugieren que algunas salmonelas
aisladas de alimentos producen enterotoxinas bajo condiciones de laboratorio, esto ha
creado algún tipo de controversia sobre si la salmonelosis se puede clasificar como
intoxicación o infección. Esta duda será resuelta cuando se demuestre claramente si las
enterotoxinas juegan un papel importante en la enfermedad y si se producen en los
alimentos ya sea antes de ingerirse o después de esto.

GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.

Salmonella spp.
Las Salmonelas son bacilos cortos Gram negativos, móviles y no esporulados, 0xidasa
negativos no fermentadores de lactosa pero sí de glucosa con producción
o no de gas y productoras de ácido sulfhídrico, anaerobios facultativos, ampliamente
distribuidos en diferentes ambientes. Su temperatura óptima está alrededor de los 37°C y
se destruyen a temperaturas mayores de 60°C por 5 minutos mínimo, no crecen por
debajo de 5°C. Producen principalmente cuadros gastrointestinales, fundamentalmente
asociados a infecciones alimentarias con una alta incidencia en los países desarrollados.

La dosis infectante de las salmonelas oscila entre 105 y 109 ufc/ gr o ml, aunque se han
descrito casos de infecciones por concentraciones de 10². Las salmonelas son
consideradas bacterias invasivas, pero solamente superan las barreras mucosa y linfática,
invadiendo el torrente sanguíneo, las productoras de fiebre tifoidea y excepcionalmente
algún otro serotipo ocasionando una septicemia y en los casos más extremos el paciente
puede entrar en shock.

PROCEDIMIENTO. (Para demostrar ausencia o presencia).

1. Enriquecimiento no selectivo:
· Pesar 25 gramos de la muestra y homogenizarlos con 225 ml de agua peptonada
tamponada.
· lncubar el homogenizado a 35ºC +/- 2ºC por 18 a 24 horas.
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2. Enriquecimiento selectivo:
· Pipetear 1 ml del homogenizado a un tubo que contiene 10 ml de Caldo Rappaport-
Vasiliadis.
· Pipetear 1 ml del homogenizado a un tubo que contiene 10 ml de Caldo Tetrationate.
· Pipetear 1 ml del homogenizado a un tubo que contiene 10 ml de Caldo Selenito de
cisteína.
· lncubar a 43ºC +/- 0,5ºC por 24 horas.

3. Siembra en medios selectivos y diferenciales:


· A partir de cada uno de los tubos sembrar por rejilla en cajas que contienen medios
selectivos. Sembrar una caja de cada medio por cada tubo de caldo selectivo.
· lncubar todas las placas a 35ºC +/- 2ºC por 24 horas.
· hacer lecturas correspondientes.
· Las colonias de Salmonella spp crecen de la siguiente forma y color: colonias entre 2
y 4 mm de diámetro aunque algunas especies crecen con diámetro aproximado de 1
mm. En los medios que incorporen una fuente de azufre e hierro las colonias de
Salmonella spp. crecen con tonos negruscos que puede extenderse en parte o
totalmente en el medio de cultivo.

4. Confirmación bioquímica:
· Tomar de cada uno de los medios selectivos tres colonias típicas de Salmonella spp y
sembrar por punción y estría sobre la superficie de tubos que contienen agar TSI,
LIA, SIM y Citrato.
· Sembrar por suspención los caldos de RM-VP.
· Incubar a 35ºC +/- 2ºC por 24 - 48 horas.
· Leer las pruebas bioquímicas así:
¨ TSI: Salmonella fermenta la glucosa con o sin producción de H2S y gas. No fermenta
la lactosa. Es decir, parte inferior del tubo amarillo y la parte inclinada roja.
Salmonella spp = K/A + H2S.
¨ LIA: Salmonella spp cambia todo el medio del tubo a un color púrpura más intenso
con o sin producción de gas y H2S. Salmonella spp = LIA +
¨ SIM: Salmonella spp. no hidroliza el triptófano y por lo tanto no produce indol, ácido
pirúvico y amoníaco. En este medio se puede observar Motilidad y producción de
H2S. Salmonella spp = indol - y motilidad +
¨ Citrato de Simmons: Salmonella spp utiliza el citrato de Sodio como fuente única de
carbono, por lo tanto el medio vira de verde a un color azul.
¨ RM-VP: Salmonella spp se caracteriza por ser RM positivo y VP negativo, es decir,
utiliza la vía de fermentación ácido mixta durante la fermentación de la glucosa y no
la vía del 2,3-butanodiol.
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PRÁCTICA 7.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Vibrio cholerae y Vibrio Parahaemolyticus,

INTRODUCCIÓN.
La familia Vibrionaceae está constituido por un conjunto de bacilos Gram negativos
curvados no entéricos, fermentadores, aerobios y anaerobios facultativos, móviles (por
flagelos polares) y oxidasa positivos que forman parte del medio ambiente hídrico,
preferentemente marino. Este agrupamiento se originó por la búsqueda de una forma
conveniente para diferenciar estos microorganismos de las Enterobacteriaceae y no
implicaba necesariamente una relación taxonómica entre las especies que incluía. El
principal modulador de su presencia en estos ecosistemas lo constituye la temperatura y
el grado de salinidad. A esta familia pertenecen según el Manual de Bergey’s los géneros
Vibrio spp (27 especies), Photobacterium spp (3 especies), Aeromonas spp (4 especies) y
Plesiomonas spp (1 especie). Sin embargo, en los últimos años debido a la revolución
filogenética y análisis de

En el género Vibrio se han identificado alrededor de unas 35 especies distintas, de las


cuales unas doce pueden ser consideradas como patógenas humanas. Las especies
patógenas humanas pueden clasificarse en halofílicas o no halofílicas según requieran la
presencia de ciertas concentraciones de cloruro sódico para su crecimiento óptimo
(mínimo 1 %).
Este género está colocado junto a las bacterias entéricas en el Manual de Bergey’s por las
características anteriormente mencionadas y por el hecho de que algunas especies de
Vibrios habitan en el tracto intestinal de algunos animales acuáticos y cuando afectan al
hombre se alojan igualmente en el tracto gastrointestinal. Otras características de este
género es que poseen un metabolismo fermentativo y la mayor parte de las especies de
este grupo son móviles por flagelos polares más que perítricos.

GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.
Los miembros del género Vibrio spp están constituidos por bacilos Gram negativos
curvados, generalmente no entéricos, fermentadores, aerobios y anaerobios facultativos,
móviles (por flagelos polares) y oxidasa positivos que forman parte del medio ambiente
hídrico, preferentemente marino.
La especie de mayor interés del género Vibrio para la ciencia médica es sin duda V.
cholerae. Esta especie se ha dividido en dos grupos de acuerdo a la glutinación o no con
el antisuero anti O1. Las cepas que no se aglutinan con este antisuero se denominan V.
cholerae no O1 (si se determina bioquímicamente la especie) o se las designa con una
variedad de nombres de otras especies de vibriones, como V. parahaemolyticus, V.
mimicus, etc.

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.

Las características bioquímicas de Vibrio cholerae y Vibrio parahaemolyticus se


resumen a continuación.
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TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN.
El tratamiento de la diarrea coleriforme consiste fundamentalmente en la reposición de las
pérdidas hidroelectrolíticas; la adición de antibióticos parece incrementar la tasa de
curaciones, acortar el tiempo de eliminación de los microorganismos, disminuir el volumen
líquido perdido y mejorar la evolución clínica de los pacientes. En general las cepas de V.
cholerae se muestran sensibles a ampicilina, tetraciclinas, cloranfenicol y aminoglicósidos,
aunque en ciertas zonas de Asia predominan las cepas multirresistentes frente a estos
antimicrobianos y cotrimoxazol. En estos casos el empleo de las fluoroquinolonas en los
adultos o el ácido nalidíxico en los niños podrían ser altemativas terapéuticas válidas. Las
diarreas causadas por otros Vibrios son generalmente autolimitadas y no precisan de
tratamiento antibiótico.

Algunas medidas preventivas para disminuir el riesgo de proliferación y posterior


intoxicación alimentaria causada por este microorganismo son:

¨ Utilizar temperaturas de refrigeración y congelación para prevenir su multiplicación.


¨ Lavar con agua corriente potable todos los productos marinos para reducir así en parte
su número. Estos microorganismos se pueden lisar en agua destilada.
¨ La práctica más segura es cocinar y/o calentar los alimentos a temperaturas superiores
de 60ºC por 15 minutos.

Una de las causas de la diseminación del cólera por O1 y O139 es por portadores que
contraen estas enfermedades durante sus viajes a zonas endémicas y lo trasmiten luego
en las deposiciones en sus países de origen. Por ello se recomienda a los viajeros evitar:

¨ Consumir agua cruda (sin hervir o procesar) ni hielo fabricado con esa agua;

¨ Alimentos y bebidas expendidos en la vía pública por vendedores ambulantes;

¨ Pescados y mariscos crudos o semicocidos, incluido el cebiche, y Vegetales crudos. Las


ensaladas de frutos de mar frías pueden ser particularmente riesgosas.
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PROCEDIMIENTO. TÉCNICA DE RECUENTO EN PLACA SUPERFICIAL (Método


presencia – ausencia):

Presuntiva:

- Pesar y Mezclar 25 g de la muestra con 225 ml de agua peptonada alcalina estéril


suplementada con 3% de NaCl respectivamente.

- Inocular por triplicado 10 ml de la dilución anterior en tubos que contienen 10 ml de


caldo Glucosa doble concentración con 3% de NaCI.

- Incubar toda la noche a 35ºC +/- 2ºC.

- Sembrar en superficie de Agar TCBS 0.1 ml y homogenizar con varilla de Hockey


(dilución 10-2).

- Incubar 18 a 20 horas a 35ºC +/- 2ºC.

Interpretación
Las colonias de Vibrio parahaemolyticus en Agar TCBS son redondeadas, con un
diámetro aproximado de 2 a 3 mm y de color verde, azul o verde azulado.

Las colonias de Vibrio cholerae son amarillas. Las colonias de Vibrio alginolyticus y
otros Vibrios son más grandes y de tonos amarillos.

Las colonias de otros géneros como Coliformes, Proteus spp, Enterococos son más
pequeñas y translúcidas

Prueba Confirmativa.
Las colonias sospechosas se confirman mediante pruebas bioquímicas sembrando en
medios: TSI, SIM (motilidad), RM-VP. LIA.

· Incubar a 35ºC +/- 2ºC por 24 horas y realizar la debida interpretación.

· Realizar igualmente la prueba de oxidasa, crecimiento en diferentes concentraciones de


sal (O, 3, 6, 8 y 10%) en caldo triptosa de soja o tripticasa de soja e Incubar a 35ºC +/-
2ºC por 24 -48 horas.

· Realizar prueba para crecimiento en baño de María a 42ºC, y realizar coloración de


Gram sembrando en caldo glucosa al 3% e incubando por 24 horas.

RESULTADOS.
En la actualidad las normas sanitarias Colombianas sobre alimentos exige un resultado
negativo de V. parahaemolyticus como de V. cholerae en 25 gramos de producto, por lo
tanto este procedimiento está basado para arrojar estos resultados.
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PRÁCTICA 8.
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Listeria monocytogenes.

INTRODUCCIÓN.
L monocytogenes es un importante agente causal de septicemias y meningitis
principalmente entre los niños, ancianos y personas inmunocomprometidas por drogas o
enfermedades. Sin embargo, también ocurren casos de Listeriosis en niños y adultos
aparentemente sanos. Especialmente importantes son las infecciones durante el
embarazo, ya que pueden provocar abortos o muerte prematura del feto.

GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.
El género Listeria incluye bacilos cortos Gram positivos, con los extremos redondeados.
Algunas células pueden ser curvadas. Se disponen aislados, en cortas cadenas o
formando una V, L, T (antiguamente se incluían dentro de las corinebacterias). En cultivos
viejos pueden formar filamentos de 6-20 mm de longitud o más y una reacción de Gram
variable. A 20ºC – 25ºC son móviles por unos pocos flagelos perítricos, pero a 37ºC
pierden la movilidad. No son esporulados ni capsulares. Son aerobios y anaerobios
facultativos. Crecen entre 1ºC y 45ºC. Temperatura óptima, 30ºC a 37ºC.
No resisten un calentamiento a 60°C durante 30 minutos. Crecen entre pH 6 y 9.

La Listeriosis humana es una infección muy extendida por todo el mundo, habiendo
aumentado recientemente el número de casos declarados. Así, la incidencia de la
infección humana en Inglaterra se estima en el orden de 1 caso por cada 30.000
habitantes, y 1 caso de Listeriosis perinatal por cada 20.000 nacimientos. Estos datos son
similares en otros países del Norte de Europa y en EE.UU.; pero la incidencia en Francia
es cuatro veces más alta. En conjunto, los porcentajes de mortalidad son del 46% de los
casos estudiados, lo que indica que la Listeriosis, aunque es una infección de incidencia
relativamente baja, su alta mortalidad la convierte en una seria infección. La Listeriosis
también es importante en veterinaria. En diversos países ha habido un incremento
progresivo en el número de casos declarados de Listeriosis en el ganado, generalmente
asociados a cambios en las prácticas agrícolas como en la pobre calidad del forraje o
piensos utilizados y también la utilización de excrementos animales como fertilizantes de
la tierra. Muy pocas veces se ha demostrado que exista una transmisión directa de
Listeriosis de los animales al hombre, en cambio, la transmisión indirecta, a través de los
alimentos sí que es un vinculo muy importante.

El hombre puede adquirir la Listeriosis de diversas formas:


· Por contacto directo con animales enfermos (así la adquieren los veterinarios,
empleados de mataderos, etc.).
· Por Ingestión de alimentos (carne, leche, huevos de animales).
· Por vía respiratoria al inhalar polvo contaminado.
· Transmisión persona a persona (bastante rara)

La capacidad de L. monocytogenes de crecer a temperaturas de refrigeración y su


tolerancia a la sal y al nitrito sódico hace que esta bacteria pueda contaminar los
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alimentos refrigerados. Puede sobrevivir en la superficie de las carnes y durante la


preparación y almacenamiento de la leche en polvo. También puede permanecer viable
durante los procesos de fabricación y maduración del requesón y queso Cheddar, y puede
crecer en el queso Camembert. No crece a pH inferior a 5.5, y es relativamente intolerante
a los ácidos. Con respecto a su capacidad o no de sobrevivir a la temperatura de
pasteurización de la leche existe bastante controversia, pero parece ser que no es
excesivamente termorresistente.

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
Las características bioquímicas empleadas para identificar L. monocytogenes se
resumen en la tabla 1.
Todas las cepas toleran una presión osmótica alta, crecen en presencia de: 10% NaCI,
40% bilis. 0.025% acetato de talio, 3.75% de tíocianato potásico, 0.01 % de Cloruro de
2,3,5-trifeniltetrazolio, resisten la desecación, congelación, refrigeración, y se coloca en
duda su termorresistencia. No crecen en presencia de un 0.02% de ázida sódica.

PROCEDIMIENTO.
Técnica de aislamiento de la FDA modificado:

- Mezclar 11g o 25 gr de alimento con 99 ml o 225 ml de caldo selectivo de


enriquecimiento con acriflavina, ácido nalidíxico y cicloheximida respectivamente.

- Incubar a 30ºC durante 24 a 48 horas.

- Añadir 1 ml de caldo de enriquecimiento a 9 ml de KOH al 0.5%. Mezclar en vortex


e inmediatamente subcultivar en placas con agar modificado de Mc Bride o
Palcam.

- Incubar a 35ºC durante 48 horas.

- Examinar las colonias mediante la técnica de Henry con iluminación oblicua.


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- Realizar los test bioquímicos de las colonias sospechosas.


Las colonias de L. monocytogenes crecidas sobre agar Palcam son pequeñas, de borde
nítido, ligeramente abombadas, con superficie lisa, de color gris – azul con centro negro
rodeadas por una zona de color oscura a negra que destacan sobre un fondo rojo cereza.
La totalidad del medio puede cambiar a un color oscuro.

Partiendo del crecimiento obtenido en agar Palcam (Oxford o Mc Bride), se realizan las
siguientes pruebas:
Los resultados de las pruebas bioquímicas son:
· hemólisis de Agar Sangre de Caballo (+).
· Reducción de Nitratos (-).
· Test de CAMP con Staphylococcus aureus (+).
· Test de CAMP con Rodococcus eaqui (-).
· Producción de ácidos a partir de Manosa y Xilosa (-).
· Producción de ácidos a partir de glucosa, Ramnosa y Metil Manosido (+).
· Catalasa +
· Oxidasa –
· Indol –
· Citratos –
· H2S –

RESULTADOS.
En la actualidad las normas sanitarias Colombianas sobre alimentos exige un resultado
negativo de L. monocytogenes en 25 gramos de producto, por lo tanto este procedimiento
está basado en ese resultado.
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PRACTICA 9.
ANALISIS DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES.

INTRODUCCIÓN.

El grupo de los Coliformes incluye todas las bacterias de forma bacilar, aerobia y
anaerobia facultativa, oxidasa negativa y Gram negativas, no formadoras de esporas que
fermentan la lactosa con formación de gas en 48 horas a temperatura de 35ºC. El grupo
de los Coliformes contienen especies individuales que habitan en el intestino y otras no
intestinales que están en el suelo, agua y cereales. Los microorganismos Coliformes son
los más reconocidos indicadores de contaminación fecal y se constituyen en una de las
herramientas de trabajo más utilizadas en el área de microbiología de alimentos.

GENERALIDADES Y FISIOLOGÍA.

Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo, móvil por flagelos perítricos, algunos
forman microcápsulas otros macrocápsulas, no esporulados (asporógenos) con tamaño
promedio de 2 a 3 micras. Aero/anaerobio facultativo, mesófilos; posen 170 antígenos
somáticos (Ag O), 100 Ag H y 50 Ag K. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae y se
agrupan en la tribu Escherichiae. La clasificación serológica se basa en los antígenos H y
O. La clasificación en grupos se basa en los síndromes clínicos por 6 mecanismos
diferentes y causan enteritis o gastroenteritis. El grupo de los Coliformes está formado
por especies de E. coli, Citrobacter spp, Enterobacter spp, Klebsiella spp, y Serratia
spp. Los medios de cultivo utilizados para su detección contienen lactosa y al fermentarla
producen ácido y gas y estos criterios son usados para su clasificación Dentro del grupo
de los Coliformes se habla de Coliformes totales y Coliformes fecales. Los primeros hacen
relación a los Coliformes diferentes de E. coli que pueden vivir en el suelo y en gran
diversidad de hábitats, por consiguiente los Coliformes no siempre indican contaminación
de origen fecal por contacto directo con este material; sin embargo los Coliformes totales
son indicadores útiles de procesos y saneamiento inadecuado. Su presencia en un
número alto en un alimento procesado indica que la probabilidad de crecimiento de
bacterias patógenas como Salmonella spp, Shigella spp, S. aureus, etc., es alta.

La presencia de Coliformes fecales (E. coli) en alimentos es el indicador preferido de


contaminación de origen fecal. Su hábitat natural es la parte baja del intestino de animales
y vertebrados. E. coli es la bacteria que identifica el grupo de los Coliformes y por esta
razón para su identificación se utilizan las reacciones del IMViC (Indol, Rojo de metilo,
Voges Proskauer y Citratos). Una forma de detectar Coliformes fecales sin necesidad de
recurrir a la prueba anterior es cultivando el microorganismo a temperaturas un poco
mayores que las usuales. La temperatura empleada es de 44°C +/- 0.5°C y se considera
como Coliforme fecal aquellas cepas capaces de crecer y fermentar la lactosa a estas
temperaturas

CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS.
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Las características bioquímicas empleadas para identificar E. coli se resumen en la tabla


1.

JUSTIFICACIÓN DEL ANÁLISIS.


Coliformes hacen parte de los microorganismos indicadores presentes o no en un
alimento y que cuando está en un número superior al límite establecido se considera que
el alimento fue expuesto a condiciones que pudieron introducir organismos patógenos
para el hombre y/o ayudar a la proliferación de especies patógenas o toxigénicas. En un
examen microbiológico se miden tanto la seguridad microbiológica como la calidad del
alimento. Otro aspecto es que la presencia de Coliformes totales no indica explícitamente
que la muestra se contaminó con materia procedente de origen fecal, pero si puede
indicar que el alimento probablemente puede desarrollar especies patógenas para el
hombre.

E. coli es el indicador preferido de contaminación fecal en un alimento, la detección de


este microorganismo puede dar lugar a graves problemas epidemiológicos ya que se
asocia a infecciones en casi todos los tejidos y órganos humanos, es decir, existen grupos
de E. coli altamente patógenas para el hombre y es preciso detectarlas. En otras
palabras, E. coli en un alimento se puede tomas como un microorganismo patógeno y
como un indicador de calidad.

PROCEDIMIENTO.

AISLAMIENTO EN MEDIO SÓLIDO (Recuento en Placa Superficial)

- Realice diluciones de la muestra 10-1, 10-2 y 10-3.


- Siembre 1ml de cada dilución en cajas de petri estériles (cuatro cajas por cada
dilución).
- Adicione de 15 a 20 ml de medio fundido y mantenido a 55ºC, homogenice e
incube a 35ºC +/- 2ºC y 44.5ºC por 24 a 48 horas para Coliformes totales y E. coli.
- Contar todas las cajas con colonias rojas entre 15 – 300 (o típicas de acuerdo al
medio empleado) y confirmarlas con coloración de Gram, oxidasa e Indol pasando
colonias típicas sobre Agar nutritivo, incubando nuevamente y luego pasar a tubos
con caldo triptófano o medio SIM, confirmación bioquímicamediante la prueba de
TSI, LIA e IMViC para E. coli.
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RESULTADOS.

· Calcular el número total de E. coli teniendo en cuenta el número total de colonias típicas
crecidas en cada una de las placas, el número de colonias examinadas y el número de
colonias positivas así:

Donde:
N: Número total de UFC de E. coli por gramo o mililitro de muestra.
Σa: Sumatoria del número de colonias típicas en cada caja retenida.
V: Volumen de muestra inoculada.
n1: Número de cajas retenidas en la primera dilución.
N2: Número de cajas retenidas en la segunda dilución.
d: Factor de dilución de la primera dilución retenida.

Donde:
b: Número de colonias identificadas como positivas de acuerdo al criterio microbiológico.
A: Número de colonias examinadas
C: Número total de colonias contadas en cada una de las cajas retenidas.
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PRACTICA 10.
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE EQUIPOS, SUPERFICIES, AMBIENTES Y
MANIPULADORES

INTRODUCCIÓN.
Para garantizar la calidad sanitaria de los productos alimenticios que se procesan en las
fábricas de alimentos, estas deben tener implementados procedimientos adecuados de
limpieza y desinfección, así como, adecuados y suficientes agentes detergentes y
desinfectantes, que permitan mantener a la fábrica libre de focos de contaminación, y
prevenir riesgos que puedan afectar la salud del consumidor.

Limpieza: Es el proceso de remoción de mugre (contaminantes) y prevención de la


acumulación de restos de alimentos que pueden descomponer o soportar el crecimiento
de organismos que causen deterioro al alimento o enfermedades al consumidor.

La limpieza se debe aplicar a todas las áreas de la planta, detectando puntos de control
critico, con énfasis en especial en las superficies de contacto con alimentos.

Desinfección: Es la destrucción de microorganismos, presentes en una superficie. No


siempre incluye sus formas de resistencia

Saneamiento: Reducción de las formas vegetativas de os microorganismos patógenos o


perjudiciales para el alimento, hasta niveles seguros que permitan garantizar la inocuidad
del alimento durante toda su vida útil.

ORIGEN DE LA CONTAMINACIÓN EN LAS INDUSTRIA DE ALIMENTOS

En la industria de alimentos se considera que la contaminación procede de:

1. La materia de contacto con los alimentos


2. El aire
3. El personal

Desinfección de superficies:

Antes de cualquier operación de desinfección, es necesario definir cual es el problema


que se va a tratar para poder fijar tos parámetros de tos procesos de desinfección, lo cual

incluye: la concentración del producto activo, la temperatura, el tiempo de contacto, la


acción mecánica (cepillado, circulación, pulveración, remojo entre otras formas). Cada
empresa debe fijar sus parámetros de desinfección, así como de limpieza. Adaptando un
modelo de limpieza y desinfección acorde a las necesidades de la planta de producción.

El aire:
La contaminación del ambiente procede de restos de alimentos, en el suelo o sobre las
superficies, favoreciendo el desarrollo de microorganismos, de la manipulación de
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embalajes de cartón contaminados en su mayoría con esporas de mohos, de la


contaminación generada por el personal, de las corrientes de aire y de las instalaciones
de aire acondicionado que se encuentran en mal estado. Esta contaminación se puede
reducir mediante el uso de radiaciones ultravioleta, filtración, uso de aerosoles,
pulverizaciones o nebulizaciones que no precipiten rápidamente y que sean seguras para
el personal y el alimento.

El personal:

Los operarios que trabajan en las industrias de alimentos, pueden transmitir


microorganismos a los alimentos a través del cabello, la barba, la cavidad nasofaringea, la
ropa, las manos y el calzado; en cada caso se produce una contaminación por diferentes
microorganismos y de diferente procedencia. Las labores de desinfección enfocadas al
personal son limitadas a: desinfección de las manos, con alcoholes o mezclas de ellos y a
la desinfección de uniformes, particularmente las botas, petos, delantales, batas, con
productos alcalinos o clorados.

MÉTODOS PARA EL CONTROL DE LA DESINFECCIÓN EN LA INDUSTRIA


ALIMENTARIA

Utilización de hisopos: La toma de muestras con hisopos se emplea mucho, sobre todo
para el control de material en las salas de despiece, quesería, moldes, bandejas, válvulas,
palas de agitadores y en general de superficies que entren en contacto con el alimento o
donde se sospeche sea una fuente de microorganismos y donde el método sea factible de
aplicación.

Métodos de enjuague: Utilizados para el control de circuitos, tanques, botellas, el


inconveniente radica, en que en los sistemas cerrados no se logra establecer cual es el
punto de contaminación, si es que el problema persiste en algún equipo.

Métodos de vaciado: Se utilizan para el control de recipientes pequeños, requiriendo de


cierta experiencia para la distribución regular del medio, durante la operación de vaciado.

Métodos por impresión: Se adaptan bien a las superficies planas, los microorganismos
son extraídos por contacto directo con el medio de cultivo. De esta forma se puede
establecer la localización de los microorganismos en las superficies desinfectadas
(método de placa RODACb).

Control de aire con placas de medio de cultivo: El control se lleva a cabo exponiendo la
superficie del medio de cultivo a la atmósfera seleccionada por un tiempo determinado
(sedimentación).

Sistemas colectores de aire: Estos equipos toman un volumen de aire determinado en una
unidad de tiempo determinada, proyectando el aire captado sobre la superficie de una
placa de petri con un medio definido. Es una técnica significativa de la contaminación
ambiental.
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PROCEDIMIENTO

 Toma de muestras de superficies. Seleccione del lugar a trabajar un área de 100


cm2 y realice un hisopado, guiándose por las pautas dadas en la fundamentación
teórica de la guía. Utilice los medios de cultivo apropiados para el análisis a realizar
(conteo total de bacterias, mohos y levaduras, coliformes totales, E. coli y otros grupos
de microorganismos).

Para la misma determinación, realice los métodos de enjuague con caldo nutritivo y
técnica RODAC con los medios adecuados. Incube todos los análisis por el tiempo y
temperatura adecuados.

 Toma de muestras de aire. Seleccione del lugar de trabajo, un área, en la cual debe
exponer la superficie de una caja de agar plate Count para conteo total de bacterias y

de Ogy para recuento de mohos y levaduras (por sedimentación de


microorganismos). Exponga las cajas durante máximo 15 minutos al ambiente y
ciérrelas. Proceda a incubar por el tiempo y temperatura adecuados.

 Toma de muestras a manipuladores. Con los hisopos previamente humedecidos


con el caldo TAT, realice un frotis por las manos de los operarios, siguiendo las
indicaciones dadas en la fundamentación teórica de la guía. Con estos, proceda a
realizar los análisis de grupos de microorganismos que se desea detectar (Coliformes
totales, E. coli, etc...). Con algunos de los hisopos con el frotis de las manos, realice
directamente una siembra masiva sobre la superficie de la placa de petri con el medio
apropiado para el análisis.

 Reporte correctamente los resultados. Pasado el tiempo de incubación de todos los


análisis realizados a las superficies, operarios y aire, proceda a realizar los conteos y
reporte los resultados correctamente, guiándose por los criterios mencionados en los
cuadros de la fundamentación teórica o en el anexo C. Los resultados deben en su
totalidad estar tabulados.

NOTA: siempre tenga la precaución de marcar previamente los tubos, cajas y demás
pruebas con la fecha, lugar, análisis, hora, temperaturas de incubación y demás
información necesaria para el correcto desarrollo de las pruebas.
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BIBLIOGRAFÍA

- Albarracin, F. Y.; Herrera, F. C. Texto de Laboratorio de Microbiología de


Alimentos.1995
- Alaert, C. , Escola. M. Métodos de Análisis Microbiológicos de Alimentos .Madrid:
Editorial Díaz de Santos. 2002.
- Doyle, M. P. Beuchat, LR. Microbiología de Alimentos. Fundamentos y Fronteras.
Zaragoza: Editorial Acribia, 2001.
- Pascual, M.R. Microbiología Alimentaría: Metodología Analítica para Alimentos y
Bebidas. Segunda Edición. Editorial Díaz de Santos. 2000
- Forsythe, S.J., Hayos, P.R. Higiene de los Alimentos, Microbiología y HACCP.
Segunda Edición. Zaragoza: Editorial Acribia 2002.
- Rojas, A. Recopilación Guías de Microbiología de Alimentos. Universidad de
Pamplona. 2003.
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ANEXOS

Algunos criterios microbiológicos para ambientes en plantas procesadoras de


alimentos.
NORMAS MICROBIOLÓGICAS
ANÁLISIS DE RUTINA ANÁLISIS ESPECIALES Y/O ESPORÁDICOS
PRODUCTO NORMA AEROBIOS MOHOS Y S. aureus Bacillus Salmonella
COLIFORMES E. coli E..C.S.R. OTROS
MESÓFILOS LEVADURAS cereus spp
Planta ambientes EMP. PRIVADA 100 -- -- 30 -- -- -- -- --
Planta agua EMP. PRIVADA 100 0 -- -- -- -- -- -- --
Planta manos EMP. PRIVADA -- 100 -- -- -- -- -- -- --
Plantas manos (agua) EMP. PRIVADA -- 50 -- -- -- -- -- -- --
Planta superficies preproceso EMP. PRIVADA 100 <10 -- -- -- -- -- -- --
Planta superficies proceso EMP. PRIVADA 500 <10 -- -- -- -- -- -- --

Criterios microbiológicos para algunas bebidas refrescantes


NORMAS MICROBIOLÓGICAS
ANÁLISIS DE RUTINA ANÁLISIS ESPECIALES Y/O ESPORÁDICOS
PRODUCTO NORMA AEROBIOS MOHOS Y S. aureus Salmonella
COLIFORMES E. coli E..C.S.R. OTROS
MESÓFILOS LEVADURAS COAG(+) sp
Bebida dietética a base de jugo de MS. Res.
<3 <3 100 – 200 -- <10 -- --
frutas 11488/84
MS. Res.
Bebida dietética carbonatada <3 <3 <10 -- <10 -- --
11488/84
MS. Res.
Bebida hidratante energética <3 <3 <10 -- <10 -- --
02229/94
MS. Res.
Bebida hidratante energética en polvo <3 <3 <10 -- <10 -- --
02229/94
Néctares y refrescos de > 30 días de MS. Res.
100 – 300 <3 <3 10 – 100 -- <10 -- --
duración 07992/91
Néctares y refrescos de 30 días máx. MS. Res.
1000 – 3000 9 – 29 <3 100 – 200 -- <10 -- --
de duración 07992/91
Refrescos INS <30000 11 <3 <300 -- <10 -- --
v.
Gaseosas INS 100 <3 <3 <10 -- <10 --
cholerae”O”
MS. Res.
Jugo de tomate 100 – 300 3 <3 20 – 50 -- <10 -- --
15789/84
MS. Res.
Jugos y pulpas y pasterizados 1000 – 3000 <3 <3 100 – 200 -- <10 -- --
07992/91
MS. Res.
Jugos y pulpas Ultra pasterizados 100 – 300 <3 <3 <10 -- <10 -- --
07992/91
Jugos-pulpas concentrados MS. Res.
20000/50000 9 -29 <3 1000 - 3000 -- <10 -- --
congelados no pasterizados 07992/91
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Criterios microbiológicos para algunos productos lacteos.


NORMAS MICROBIOLÓGICAS
ANÁLISIS DE RUTINA ANÁLISIS ESPECIALES Y/O ESPORÁDICOS
PRODUCTO NORMA AEROBIOS MOHOS Y S. aureus Bacillus Salmonella
COLIFORMES E. coli E..C.S.R. OTROS
MESÓFILOS LEVADURAS COAG(+) cereus sp
MS. Res.
Leche con sabores pasteurizada 50000 – 10000 11 – 40 <3 -- -- -- -- -- --
02310/86
MS. Res.
Leche condensada 10000 – 30000 <3 <3 200 – 500 100 – 200 -- -- -- --
02310/86
MS. Dec. 100 –
Leche en polvo 10000 – 30000 <3 <3 200 – 1000 < 100 – 200 100 – 1000 0 --
2437/83 1000
MS. Dec.
Leche pasteurizada 50000 – 100000 11 – 93 <3 -- -- -- -- -- --
2437/83
MS. Dec. Ea/an
Leche UHT envasada e higienizada 20000 – 30000 < 10 – 23 <3 -- -- -- -- --
476/98 < 10 - 20
MS. Dec. Ea/an
Leche UHT larga vida y mediana 100 – 200 < 3 – 11 <3 -- -- -- -- --
476/98 < 10 - 20
MS. Res.
Queso fresco -- * <3 100 – 500 1000 – 3000 -- -- 0 --
01804/89
MS. Res. 100 –
Queso fundido 30000 – 50000 20 – 93 <3 100 – 200 100 – 200 100 – 500 0 --
01804/89 500
MS. Res.
Queso semimadurado. Madurado -- -- <3 -- 500 – 1000 -- -- 0 --
01804/89
MS. Res.
Yogurt / kumis -- 20 – 93 <3 200 – 500 -- -- -- -- --
02310/83
MS. Res. 100 –
Postre de leche pasteurizado 5000 – 10000 20 – 50 <3 200 – 500 100 – 200 100 – 1000 0 --
02310/89 1000
MS. Res.
Crema de leche pasteurizada -- 75 – 150 <3 100 – 200 100 – 200 -- -- 0 --
02310/86
MS. Res.
Mantequilla -- 75 – 150 <3 500 – 1000 100 – 200 -- -- 0 --
02310/86
MS. Res.
Arequipe 500 – 2000 11 – 40 <3 10 – 100 100 – 200 -- -- -- --
02310/86
MS. Res. 100000 –
Helados (con leche) 93 – 150 <3 -- 100 – 200 -- -- 0 --
01804/84 150000

Criterios microbiológicos para algunos productos cárnicos y derivados.


NORMAS MICROBIOLÓGICAS
ANÁLISIS DE RUTINA ANÁLISIS ESPECIALES Y/O ESPORÁDICOS
PRODUCTO NORMA AEROBIOS MOHOS Y S. aureus Bacillus Salmonella
COLIFORMES E. coli E..C.S.R. OTROS
MESÓFILOS LEVADURAS cereus spp
200000 –
Cárnicos cocidos o ecaldados NTC 1325 120 – 1100 <3 -- <100 100 – 1000 -- 0 --
300000
120 – 100 –
Cárnicos crudos NTC 1325 -- -- -- 100 – 1000 -- 0 --
1100 1000
Listeria
100 –
Cárnico crudo – pollo NTC 36442 -- -- -- 100 – 500 100 – 1000 -- 0 monocytigene
1100
s0
Listeria
Cárnicos crudos madurados NTC 1325 -- < 3 – 93 <3 -- <100 10 – 100 -- 0 monocytigene
s0
120 – 100 –
Pollo – carne cruda adobada INS -- * -- 100 – 1000 -- 0 --
1100 1000