UNIVERSIDAD NACIONAL DE CORDOBA

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

ESCUELA DE TECNOLOGIA MÉDICA

CATEDRA DE BACTERIOLOGIA Y VIROLOGIA

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

AÑO 2018

AUTORA: Profesora Asistente: TL Lic. OYOLA, ELSA MÓNICA

CÁTEDRA DE BACTERIOLOGÍA Y VIROLOGÍA

Fundamentación
La presente Guía de estudio corresponde a la asignatura Bacteriología y Virología
del Primer Cuatrimestre de tercer Año de la Carrera de Técnico de Laboratorio Clínico e
Histopatología que se cursa en la Escuela de Tecnología Médica de la Facultad de
Ciencias Médicas. U.N.C.
Las actividades prácticas son el complemento básico de las clases teórico
prácticas dictadas por el Profesor Hugo Moretto para el estudio de la Bacteriología y la
Virología.
Durante el desarrollo de las actividades prácticas, el alumno, con los
conocimientos teóricos previos necesarios, adquirirá destrezas y prácticas en el manejo
de las distintas muestras biológicas, aplicará las normas de bioseguridad y logrará la
identificación de los agentes causantes de la infección bacteriana.
También se introducirá al alumno en las técnicas específicas para la
identificación de distintos virus causantes de enfermedades en el hombre a través de
cultivos celulares, siembra en huevos embrionados o en animales de experimentación.
Se recomienda al alumno, ampliar conocimientos con la consulta del material
bibliográfico específico que se encuentra al final de la presente Guía.

Objetivos:
 Reconocer la estructura bacteriana a través de sus características de tinción.
 Realizar las técnicas específicas de recolección, conservación, aislamiento e
identificación bacteriana.
 Practicar las técnicas de coloraciones, siembra y las pruebas de susceptibilidad a
los antimicrobianos.
 Adiestrarse en el manejo, funcionamiento y conservación del material utilizado.
 Conocer las técnicas específicas para evidenciar la presencia de virus en las
muestras biológicas.
 Emplear la terminología propia de esta asignatura en forma correcta y fluida.
 Habituarse en la aplicación de Normas de Bioseguridad que evitan la exposición
a agentes infecciosos.
 Comprender la función del técnico de laboratorio dentro del equipo de Salud.

Propuesta metodológica:
La presente Guía propone las actividades a realizar por los alumnos en cada
Trabajo Práctico.
Los mismos están a cargo de la Profesora Asistente TL Elsa Oyola, acompañada
por Profesionales Adscriptos: TL Marcos Moretto y TL Adriana Quattrini y por
alumnos agregados a la Cátedra.
Los TP son semanales, de 90 minutos de duración y se llevan a cabo en el laboratorio de
Microbiología de la Escuela de Tecnología Médica.
Son de asistencia obligatoria (100%)
Es obligación de los alumnos, estudiar los contenidos de cada trabajo práctico, ya que
serán evaluados antes de realizar la parte práctica, debiendo aprobar el 80 % de las
evaluaciones para quedar en condición de alumnos regulares.
En caso de obtener menos de 4 puntos en las evaluaciones, deben retirarse sin
posibilidad de realizar el TP.

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La evaluación es acumulativa, de manera tal que el alumno debe conocer contenidos
dados en TP anteriores.
Los alumnos que hayan sido aplazados dos veces quedan en condición de libre.
Los alumnos que trabajan deben presentar el correspondiente certificado de trabajo
donde especifique el horario que cumplen el primer día de clase con el fin de organizar
los horarios de trabajos prácticos.
Deben asistir al laboratorio con guardapolvo o chaquetilla, libreta de trabajos prácticos,
libreta de notas, lápiz y lapicera.
Cualquier negligencia repetida o un solo descuido grave son razones para excluir al
alumno y no admitirlo a los T.P. de esta asignatura.
El alumno deberá reponer el material que le ha sido asignado en caso de romperlo.
Está prohibido llevarse material asignado a los alumnos fuera del área del laboratorio.
Es necesario que los alumnos apliquen, en toda práctica de laboratorio, las normas de
bioseguridad.

Recursos:
La asignatura Bacteriología y Virología es dictada por el Profesor Titular TL
Hugo Moretto, una Profesora Asistente TL Elsa Oyola, Profesionales Adscriptos TL
Marcos Elias Moretto y TL Adriana Quattrini.
Dentro de los recursos materiales, el laboratorio de Microbiología dispone de
mesadas con piletas, mecheros, autoclave, estufas de cultivo y de esterilización,
microscopios, centrífuga, heladera, balanza digital, reactivos, medios de cultivo,
colorantes, elementos de vidrio y de plástico, etc.
Los recursos didácticos son diapositivas y preparados coloreados de bacterias,
muestras para realizar exámenes en fresco, para colorear y/o para realizar reacciones
serológicas.
Estos elementos de laboratorio permiten al alumno aprender su correcta
manipulación, desarrollar habilidades y ensayar su desempeño como futuro profesional.

Evaluación:
Antes de comenzar el Trabajo Práctico, el alumno será evaluado utilizando
diferentes metodologías (oral, escrito, preguntas a desarrollar, de respuesta corta,
múltiple choice, etc.)
Durante el transcurso del primer cuatrimestre realizará un examen parcial y un
Examen Práctico Integrador para verificar el aprendizaje de todos los procesos
realizados. Los mismos serán escritos, orales o procedimentales.

CONDICIÓN DE ALUMNO:
REGULAR EN LOS TRABAJOS PRACTICOS:
El alumno que asistió al 100 % de los trabajos prácticos y aprobó el 80 % de los
mismos, el parcial y el examen práctico integrador con cuatro (4) puntos.

PROMOCIÓN DE TRABAJOS PRACTICOS:

El alumno que asistió al 100 % de los trabajos prácticos y aprobó el 80 % de los
mismos, el parcial y el examen práctico integrador con siete (7) puntos.

LIBRE:
El alumno que haya sido aplazado con menos de cuatro puntos por dos veces queda en
condición de libre.

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PROMOCION DE PARTE TEÓRICA:
Las clases teórico prácticas son obligatorias, debiendo asistir al 80 % de las mismas.
Los alumnos serán evaluados durante el desarrollo de las mismas y además, tendrán tres
evaluaciones una de cada módulo que deberán aprobar con ocho puntos para
promocionar la parte teórica.

RÉGIMEN DE INASISTENCIAS:
Los alumnos deben asistir al 100 % de los trabajos prácticos.
Las inasistencias a los trabajos prácticos o al examen parcial o integrador final solo se
justifican por enfermedad, debiendo presentar dentro de las 48 horas ante el profesor
correspondiente el certificado médico expedido por bienestar estudiantil o institución
pública.

EXAMEN FINAL TEORICO DE BACTERIOLOGIA Y VIROLOGIA

Alumnos con promoción de la parte teórica:
Son aquellos que asistieron y aprobaron el 80 % de los teóricos-prácticos de la
asignatura y aprobaron los tres módulos con ocho (8) puntos.
En el examen final se asentará el promedio de las notas obtenidas en los tres módulos.

Alumnos sin promoción de la parte teórica:

Son aquellos que no tienen el 80 % de asistencia a los teórico-prácticos de la asignatura
y no aprobaron los tres módulos con ocho (8) puntos. En el examen final deberán rendir
la asignatura y obtener como mínimo cuatro (4) puntos que corresponden al 60 % de las
preguntas respondidas correctamente, ya sean éstas orales o escritas.
El alumno regular en los trabajos prácticos deberá rendir un examen de Trabajos
Prácticos y aprobarlo antes de rendir el examen teórico.
El alumno con promoción en los TP deberá rendir el examen teórico, quedando por
sentado que ya tiene los conocimientos prácticos.

CRONOGRAMA DE TRABAJOS PRÁCTICOS OBLIGATORIOS

TRABAJO CONTENIDOS FECHA LUGAR

PRÁCTICO
Nº 1 Descontaminación. Lavado. Acondicionamiento Laboratorio
del material. Esterilización. Desinfección.
Normas de bioseguridad
Nº 2 Recolección, conservación y procesamiento de Laboratorio
muestras biológicas
Nº 3 Examen microscópico de los microorganismos Laboratorio

Nº 4 Medios de cultivo y técnicas de siembra Laboratorio

Nº 5 Identificación bacteriana Laboratorio
Nº 6 Antibiograma Laboratorio
Nº 7 Reacciones serológicas Laboratorio
N° 8 Inmunofluorescencia indirecta (IFI) Laboratorio

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EXAMEN Contenidos Fecha Lugar
Parcial Los trabajos prácticos realizados hasta esa fecha
Integrador Todos los Trabajos Prácticos de Bacteriología y
practico Virología

Nota: el orden de realización de los Trabajos Prácticos puede ser modificado para
que se correlacionen con los contenidos teóricos dictados por el Jefe de Cátedra.

Introducción:
Particularidades del laboratorio de bacteriología

En un laboratorio de bacteriología se procesan muestras biológicas

potencialmente patógenas que se cultivan en medios especiales para su recuperación,
aislamiento y posterior identificación del agente causante de la infección.
Por lo tanto, el alumno debe adiestrarse en la manipulación de los materiales y
aparatos que utilizará en la práctica, aplicando siempre las normas de bioseguridad.
Los materiales utilizados para el aislamiento e identificación bacteriana deberán
estar estériles.
Los elementos más característicos son: cápsulas de Petri, ansas de siembra, mechero de
Bunsen, balanza, medios de cultivo deshidratados, autoclave tipo Chamberland, estufa
de incubación o cultivo y estufa de esterilización u horno Pasteur.

CÁPSULAS DE PETRI ANSAS DE SIEMBRA MECHERO DE BUNSEN

BALANZA MEDIOS DE CULTIVO AUTOCLAVE

ESTUFA DE CULTIVO ESTUFA DE ESTERILIZACIÓN

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 TRABAJO PRÁCTICO Nº 1:

CONTENIDOS:
DESCONTAMINACIÓN. LAVADO. ACONDICIONAMIENTO DEL
MATERIAL. ESTERILIZACIÓN. DESINFECCIÓN. NORMAS DE
BIOSEGURIDAD

OBJETIVOS:
 Realizar las técnicas de descontaminación, lavado, desinfección y esterilización
en el laboratorio de Bacteriología.
 Adiestrarse en el acondicionamiento adecuado del material de vidrio.
 Conocer, diseñar y poner en práctica las normas y técnicas de bioseguridad en el
laboratorio.
 Comprender la importancia de utilizar material estéril para lograr el aislamiento
del agente causal a partir de una muestra biológica.

ACTIVIDADES A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

* Durante el TP los alumnos realizarán la descontaminación del material
reutilizable, el lavado, secado y acondicionamiento de los mismos.
* Se adiestrarán en el uso de la estufa de esterilización y la autoclave.

DESCONTAMINACIÓN DE MATERIALES REUTILIZABLES

A través de este proceso se eliminan los gérmenes patógenos y no patógenos del
material de vidrio, instrumentos, equipos, superficies y espacios de trabajo luego de su
uso.
Puede realizarse por procedimientos físicos o químicos.

Descontaminación física:
Calor húmedo, vapor a presión:

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Se colocan en la autoclave los materiales de vidrio contaminados (placas de Petri,
Erlenmeyer, tubos, etc.) y su contenido (muestras, medios de cultivo, etc.) en recipientes
metálicos cuya forma y capacidad se adapte al tipo de autoclave del que se disponga.
Se descontamina con calor húmedo (vapor a presión) durante 30 minutos a 1 atmosfera
de presión
Luego que baja la temperatura se desecha el contenido del material y se procede al
lavado del mismo.
.

Autoclave tipo Chamberland

Radiaciones ultravioletas:
Sólo se utilizan para reducir el número de microorganismos aerotransportados en
quirófanos, bioterios y laboratorios de manipulan materiales infecciosos.
Se utilizan lámparas Sterilamp que producen luz ultravioleta de 250-260 nm.

Descontaminación química:
Puede utilizarse: fenol al 5 %, hipoclorito de sodio al 1 %, formaldehido al 4 %.
 Las pipetas, luego de su uso, se sumergen en recipientes de vidrio de base
ancha que contienen una solución de hipoclorito de sodio al 1%.
 Los portaobjetos usados con muestras infectadas (orina, heces, etc.) se
sumergen en una solución desinfectante (hipoclorito de sodio al 1 % o fenol al 5
%) durante 30 minutos. Aquellos con residuos de aceite de inmersión se frotan en
papel absorbente para quitarles el aceite y luego se sumergen en recipientes con
detergente.
 Las jeringas descartables, luego de utilizarlas, se colocan en recipientes que
contienen solución de hipoclorito de sodio al 1 % durante 30 minutos para su
descontaminación y posterior tratamiento como residuo patógeno.
 Las agujas se desechan en recipientes resistentes a la punción y son tratados
de igual forma.

LAVADO
Luego de la descontaminación se realiza el lavado y enjuague de los materiales
reutilizables.
El lavado puede hacerse con lavadoras automáticas o manualmente.

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Los materiales de vidrio descontaminados, se lavan, se enjuagan en forma exhaustiva
con agua potable y luego con agua destilada.
Para ello se deben usar guantes resistentes, delantal impermeable, protectores oculares y
barbijos impermeables deberá tener mucho cuidado de no salpicar el ambiente físico u
otras personas.
En el lavado se utilizan agentes neutros de limpieza, cepillos de cerdas blandas y agua a
temperatura entre 40-50°C.
Las pipetas se lavan con lavapipetas automático que utiliza el principio del sifón, se
enjuagan primero con agua corriente y luego con agua destilada, y posteriormente se
secan.

Los portaobjetos usados se enjuagan con agua corriente luego de su descontaminación.

Se lavan con jabón líquido, cepillo y agua caliente, se enjuagan, se colocan el alcohol 70
% por media hora y se secan con paño suave que no desprenda pelusa.
Los portaobjetos nuevos se lavan con agua caliente, se colocan en alcohol isopropílico o
etílico de 70 % durante media hora, se secan con paño suave.

SECADO
El material limpio se seca en un soporte adecuado inclinado o vertical, colocando el
material boca abajo, o bien se utiliza una estufa de secado. En este último caso el
material debe ser introducido en la estufa sin tapones ni llaves.

ACONDICIONAMIENTO DE MATERIALES DE VIDRIO PARA SU

ESTERILIZACIÓN:
El acondicionamiento consiste en proteger el material limpio y seco envolviéndolo con
papel sulfito. Esto evita que se contamine luego de su esterilización y hasta su
utilización.
Los paquetes con materiales acondicionados deben indicar: contenido, método y fecha
de esterilización y operador.
Acondicionamiento de placas de Petri:
Se envuelven individualmente, cortando papel sulfito de tamaño adecuado para la caja
que se desee envolver.
Se coloca la caja en el centro del papel con la tapa hacia arriba.
Los bordes de los costados se unen al centro cubriendo la caja que se envuelve.

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En la parte superior se unen los bordes de ambos lados y esta unión se dobla a la mitad.
Se hace un segundo doblez, quedando recargado éste sobre la caja.
Al papel se le presiona a los costados quedando al relieve el volumen de la caja envuelta
en el papel, se doblan las puntas del papel de cada una de las esquinas al centro.
Se le da vuelta al material, quedando el doblez hacia abajo.

Acondicionamiento de tubos, matraces o Erlenmeyer:

Se elaboran tapones de algodón (torundas o muñecas) para proteger la boca de los
mismos.
Para ello, se corta una tira de algodón, de largo adecuado a las necesidades ( ya sea para
los tubos de ensayo o de hemolisis o para el matraz de 500 ml)
Se enrolla el algodón sobre sí mismo apoyándose en la mesada, de manera que quede
firme y se coloca sobre el centro de un cuadrado de gasa y se juntan las esquinas
envolviendo el rollo de algodón.
Luego se introduce en la boca del recipiente y se comprueba que pueda destaparse
varias veces y que no esté flojo.
Una vez tapadas las bocas de los tubos, se envuelven con papel sulfito formando
paquetes atados con hilo de algodón con la cantidad que se utilice (4, 6, 10) y se rotula

Acondicionamiento de pipetas:
Se corta una tira de papel sulfito de aproximadamente 5 cm de ancho y 50 cm de largo.
Se dobla el extremo inferior aproximadamente 2 cm.
Se coloca la pipeta con la punta a la mitad del doblez anterior y con un ángulo de
aproximadamente 25º de inclinación con respecto a la posición del papel sulfito
Envolver la pipeta en forma de espiral procurando que el papel no quede flojo o se
rompa.
Retorcer la parte superior y colocar con lápiz la graduación de la pipeta.
Colocar en portapipetas con la tapa abierta.

ESTERILIZACIÓN
Es el proceso de destrucción o eliminación completa de toda forma de vida existente en
el interior o en la superficie de cualquier material, por medio del calor, radiaciones,
filtración, etc.
Por lo tanto, la esterilización es un término absoluto e incluye la destrucción de las
esporas y formas vegetativas, los virus, etc.; no admite la presencia de agentes
biológicos.

METODOS
La esterilización se puede realizar según diferentes métodos:

Físicos: 1. Calor
2. Radiaciones
3. Frio: gas plasma

Mecánicos: Filtración

Químicos: Óxido de etileno, glutaraldehido, formaldehido

ESTERILIZACION POR CALOR:

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 Fuego directo.
a. calor seco
Aire caliente

Vapor de agua fluente

b. calor húmedo a presión
Tindalización

a. ESTERILIZACION POR CALOR SECO:

Produce desnaturalización proteica, desorganización de membranas u oxidación
irreversible de sus componentes celulares.

Fuego directo:
Se usa para esterilizar ansas (alambre al rojo vivo) o para
flamear las bocas de frascos u otros recipientes.

Aire caliente:
Las estufas de esterilización u hornos Pasteur constan de una doble cámara, el aire
caliente, generado por una resistencia eléctrica circula por el espacio principal y entre
ambas cámaras. La temperatura de esterilización en estufa es de 170º C durante una
hora.
Se esteriliza todo material que no se altere a la temperatura de trabajo como placas de
Petri y tubos de vidrio acondicionados, pipetas dentro de pipeteros, iinstrumental
quirúrgico cromado, materiales de vidrio, aluminio o porcelana, aceites, parafina,
sustancias grasas, vaselina, polvos (talco)
Los materiales acondicionados deben disponerse de tal manera que el aire caliente
circule por todas sus partes.

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Ventajas:
 No es corrosivo para metales e instrumentos.
 Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias
viscosas no volátiles.
Desventajas:
 Requiere mayor tiempo y temperatura de esterilización que el calor húmedo,
debido a su menor poder de penetración.

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HUMEDO:

El calor húmedo el cual destruye a los microorganismos por desnaturalización de las
proteínas.
La esterilización por vapor de agua puede ser por vapor fluente y por vapor a presión y
en ambos casos se utiliza la autoclave.

Descripción de la autoclave:
Es un dispositivo sellado que permite la entrada
de vapor de agua bajo presión.
Consta de una caldera, cilindro de cobre o
bronce, con un fondo cóncavo sobre el cual se
coloca una rejilla donde se apoyan los
materiales a esterilizar, evitando que entren en
contacto con el agua que contiene el fondo.
La tapa de bronce se ajusta con seis clavijas de
bronce que se cierran en cruz y cierra
herméticamente la caldera y en ella hay un manómetro, una espita y una válvula de
seguridad.
Espita: permite la salida del aire y del vapor. Si se deja abierta, la temperatura del
interior de la autoclave no excede los 100º C, se utiliza para esterilizar a vapor fluente.
Válvula de seguridad: mantiene la presión constante dejando escapar el vapor cuando
ésta se eleva demasiado, evitando así que ocurra una explosión.
Manómetro: indica la presión en la esterilización por vapor a presión.
Fuente de calor: pueden ser dispositivos eléctricos o quemadores de gas ubicados en la
parte inferior de la caldera.
Ventajas:
Rápido calentamiento y penetración.
Destruye bacterias y esporas en corto tiempo.
No deja residuos tóxicos.
Hay poco deterioro del material expuesto.
Económico.

Desventajas:
No permite esterilizar geles.
Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.

Procedimiento para la esterilización por vapor a presión:

Llenar con agua el fondo de la autoclave (hasta la rejilla).

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Introducir los materiales a esterilizar dentro de canastas u ollas sobre la rejilla.
Colocar los controles de esterilización.
Cerrar la tapa, atornillar las clavijas de la tapa.
Abrir la espita.
Iniciar el calentamiento de la autoclave.
Cerrar la espita cuando comienza a salir un chorro de vapor uniforme y continuo. Esto
indicará que ha salido todo el aire del interior, se ha PURGADO LA AUTOCLAVE.
Bajar la intensidad de la fuente de calor.
Observar el manómetro hasta que llegue a 1 atmósfera (15 libras), que corresponde a
una temperatura de 121º C.
En ese momento comenzar a contar el tiempo: 20 minutos, para esterilizar medios de
cultivo y 30 minutos para descontaminación de materiales.
Apagar la fuente de calor.
Cuando baje la temperatura, abrir la espita para igualar las presiones dentro y fuera de la
autoclave.
Cuando cese el silbido, aflojar las clavijas y abrir la autoclave.

Algunas normas a tener en cuenta:

Colocar recipientes de capacidades similares para esterilizar medios de cultivo.
Los frascos con cierre hermético deben colocarse en la autoclave sin cerrarlos
totalmente para facilitar la entrada del vapor durante el proceso. Luego de la
esterilización se cierran totalmente.
No incluir dentro del mismo paquete material con diferentes tiempos de esterilización.
Tiempos de esterilización en autoclave:
Guantes de goma 15 minutos
Sondas látex 15 minutos
Agua en frascos 20 minutos
Equipo de transfusión 30 minutos
Paquetes de maternidad 30 minutos
Ropa 30 minutos
Torundas 30 minutos
Paquete quirúrgico 45 minutos
Instrumental de acero inoxidable 45 minutos

Esterilización por vapor fluente

Se colocan los materiales a esterilizar en la autoclave con la espita abierta. Esto impide
que se produzca presión y que la temperatura supere los 100ºC.
Se utiliza para esterilizar medios de cultivo que contienen leche y muy azucarados, para
evitar su caramelización.

TYNDALIZACION:
Consiste en calentamientos discontinuos que permiten la esterilización de sustancias que
se alteran a altas temperaturas, como sueros, extractos globulares, etc.
Se puede utilizar el autoclave de Chamberland, dejando abierta la válvula de escape o
espita (vapor fluente) durante 30 minutos.

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Hay sustancias que requieren ser calentadas a temperaturas inferiores (56º u 80º) para
evitar su descomposición.
Después de los calentamientos, se deja el material a 37 º C durante 24 horas.
La operación se repite durante 3 o 4 días consecutivos.
En este intervalo, no se debe abrir el recipiente de tyndalización.
La discontinuidad de reposo y calor permite a las esporas formar nuevas formas
vegetativas que son destruidas en el tercer o cuarto calentamiento.

ESTERILIZACION POR RADIACIONES:

Las radiaciones no ionizantes como la luz ultravioleta, puede ser empleada en el control
de áreas cerradas como depósitos, camiones de transporte de ropa hospitalaria, etc.
RADIACIONES GAMMA ():
Son radiaciones ionizantes para esterilizar productos o materiales termolábiles como
materiales plásticos, antibióticos, vacunas, alimentos, jeringas y agujas, sondas, etc.

ESTERILIZACION POR FILTRACION

Esteriliza líquidos termosensibles como soluciones concentradas de azúcares, de urea,
vitaminas, factores de crecimiento, enzimáticas o gases.
Los poros del filtro retienen los microorganismos (pero no los virus y los micoplasmas)
y permiten el paso de un líquido o un gas cuando se produce un vacío. Tradicionalmente
se usan filtros de nitrocelulosa desechables con tamaño de poro de 0,45 o de 0,22
micras.

ESTERILIZACION POR OXIDO DE ETILENO (OE):

El óxido de etileno es bactericida, esporicida, viricida con gran poder de penetración,
efectivo a bajas temperaturas y penetra sustancias porosas. Por ser explosivo e
inflamable, se mezcla con CO2.
Esteriliza todo material termosensible como el descartable (goma, plástico, papel)
metal, prótesis, implantes, madera, lana, piel, equipos electrónicos, productos
farmacéuticos.
Dichos materiales se acondicionan con embalajes de polietileno, nylon, celofán, etc.

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Las cámaras esterilizan con OE al 5-10%, con dióxido de carbono y humedad (40-80
%) controlada y a 30-60ºC durante 1 a 5 horas, seguido de aireación en dicha cámara.
Luego de la esterilización los materiales se airean durante 6 horas.
El personal encargado de la debe llevar equipo de protección: bata, guantes, gorro,
gafas, mascarilla.
Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y además cancerígeno.

ESTERILIZACIÓN EN FRÍO CON GLUTARALDEHIDO:

La solución comercial es al 2%, acuosa y a pH ácido, se activa alcalinizándolo con
bicarbonato de Na (pH 7,5 a 8,5) Destruye formas bacterianas en 2 minutos,
micobacterias, hongos e inactiva virus en 30 minutos y elimina esporas de Clostridium
y Bacillus en 3 horas.
Se utiliza en la desinfección de superficies y de equipos médicos (como
hemodializadores, endoscopios) que luego se enjuagan, se airean y se colocan en
recipientes estériles.
Es irritante, no es corrosivo para metales, no daña los lentes, el caucho o el plástico.
Es efectivo en presencia de agua dura y materia orgánica, el calor acelera su acción.

ESTERILIZACIÓN CON FORMALDEHÍDO:

Las pastillas de paraformaldehido expuestas al calor de 60ºC producen gas
formaldehido usado como desinfectante ambiental de salas altamente contaminadas que
una vez tratadas deben airearse.
Las Estufas de Formol o formalina esterilizan materiales de látex, goma, plásticos, etc.
Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs.

ESTERILIZACIÓN EN FRÍO: ESTERILIZACIÓN POR GAS-PLASMA DE

PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
La difusión del peróxido de hidrógeno en fase plasma (estado entre líquido y gas) a
menos de 60ºC tiene acción biocida. El peróxido de hidrógeno no deja ningún residuo
tóxico. Se convierte en agua y oxígeno al final del proceso. El material no precisa
aireación. El ciclo de esterilización dura entre 54 y 75 minutos.
Esteriliza material termosensible e instrumental de superficies lisas por aplicación de
fuerza eléctrica a un gas circulante. No puede esterilizarse instrumental articulado, ni
material con cabo ciego. El material con lúmenes de longitud superior a 31 cm y
diámetros inferiores a 6 mm requiere el uso de un adaptador que no está aprobado por la
FDA, ya que para activar los adaptadores es necesaria una acción manual que no puede
ser detectada ni validada.

Limitaciones: no se pueden esterilizar objetos que contengan celulosa, algodón,

líquidos, humedad, madera o instrumental con lúmenes largos y estrechos.
Es muy costoso.

CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN
Son dispositivos de distinta naturaleza que sirven como indicadores de que se ha llevado
a cabo el proceso de esterilización. Los hay de tres tipos: físicos, químicos y biológicos.
En todos los casos los resultados obtenidos de controles químicos y biológicos se deben
registrar.

Controles químicos:

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La mayoría son cintas adhesivas que se adhieren al material a esterilizar y que están
impregnadas con una sustancia química que cambia de color a la temperatura de
esterilización
Ej.: una mezcla de ácido benzoico y verde brillante funde al llegar a 121ºC y tomará
color verde oscuro.
La desventaja de los puntos de fusión es que, aunque se logra la temperatura, el tiempo
de exposición no se conoce.
Se debe incorporar un indicador químico cada vez que se esterilice.

Controles biológicos:
Consisten en determinados microorganismos con una tolerancia conocida al método que
se está empleando.
Los indicadores biológicos para el proceso de esterilización por calor húmedo son
soportes de papel conteniendo endosporas de Geobacillus stearothermophilus, ATCC
N° 7953 (ex Bacillus stearothermophilus) Se incluyen en el ciclo de esterilización y
una vez concluido éste se inoculan en el medio de cultivo adecuado y se incuban a 56°C
durante no menos de 7 días.
Los indicadores biológicos para la esterilización por calor seco son soportes de papel
conteniendo endosporas de Bacillus atrophaeus, ATCC N°9372 (ex Bacillus subtilis var
niger), Se incluyen en el ciclo de esterilización y una vez concluido éste se inociulan en
el medio de cultivo adecuado y se incuban a 37°C durante no menos de 7 días.
Para controlar la esterilización por Óxido de etileno, también se utilizan endosporas de
Bacillus atrophaeus (ex Bacillus subtilis var niger) y para la esterilización por
radiaciones ionizantes, endosporas de Bacillus pumilus ATCC N° 27142.
Se recomienda el uso de controles biológicos por lo menos una vez a la semana para
verificar el buen funcionamiento del autoclave. En caso de que se sospeche de alguna
falla se debe colocar un indicador biológico en cada carga de esterilización.

Controles físicos:
Son los manómetros y los termómetros
los cuales permiten constatar las condiciones físicas dentro de la cámara de
esterilización.
También existen los termógrafos los cuales, además de registrar la temperatura
alcanzada en el proceso, permiten conocer durante cuánto tiempo ésta se mantuvo.

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termómetros termógrafo manómetro

DESINFECCIÓN
Procedimiento que permite eliminar, inactivar o inhibir a un gran número de formas
vegetativas patógenas de los materiales o en el ambiente, por técnicas físicas o
químicas. No implica la eliminación total de los microorganismos, ya que las esporas
pueden sobrevivir.

Desinfectante:
Agente químico o físico que logra un efecto bacteriostático, generalmente sin acción
sobre las formas resistentes bacterianas, que se utiliza en objetos inanimados o
ambientes.
Son de amplio espectro, tóxicos, corrosivos e irritantes por eso se usan en soluciones
diluidas.Son solubles en el agua y en las grasas. De baja tensión superficial. Estable,
compatible con otras sustancias químicas.

Factores que influyen en la desinfección:

Tiempo:
En un primer momento se destruye mayor cantidad de bacterias y luego disminuye
gradualmente. Las bacterias que están en fase de crecimiento son las más susceptibles y
por lo tanto mueren antes que las células maduras.
Temperatura:
El calor actúa como catalizador, acelerando la muerte de las bacterias.
Un aumento de 10 grados supone duplicar la tasa de muerte para algunos desinfectantes.
Materia orgánica:
La presencia de sustancias orgánicas extrañas disminuye su eficacia al disminuir su
concentración.
Concentración del desinfectante:
A mayor concentración de desinfectante, mayor acción germicida.
Pero, no porque doblemos la concentración del desinfectante reduciremos a la mitad el
tiempo necesario para destruir los microorganismos. El uso de altas concentraciones
está condicionado a la acción nociva o tóxica del desinfectante. Además, existe un
límite mínimo de concentración útil, por debajo del cual la eficacia del desinfectante es
nula e, inversamente, puede estimular el crecimiento de bacterias.
pH:
Influye tanto en los microorganismos como en la acción de los desinfectantes ya que
estos últimos suelen ser más eficaces cuando no ionizan. Las bacterias aumentan su
sensibilidad al desinfectante cuando están a un pH desfavorable.
Microorganismos:
Se elige el desinfectante adecuado según los microorganismos presentes (características
tintoriales, presencia de cápsulas o esporas), la fase de cultivo, la carga inicial, etc.
Por ej., el bacilo tuberculoso resiste los hipocloritos mejor que otras bacterias.

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DESINFECTANTES QUIMICOS
ALCOHOLES:
Son antisépticos seguros, actúan en un minuto sobre formas vegetativas, micobacterias,
hongos y algunos virus, pero no eliminan esporas ni penetran materiales ricos en
proteínas.
Los alcoholes etílico e isopropílico, al 70 % son usados como antisépticos.
La adición de emolientes en gel al alcohol aumenta la actividad bactericida, evita el
rápido secado.
Se utilizan para el lavado quirúrgico de las manos y para el lavado seco de manos del
personal de salud.
Otros usos: El alcohol etílico al 70 % se usa para descontaminar mesadas y exterior de
recipientes de muestras; dejándolo actuar durante 2 minutos.
El alcohol isopropílico se utiliza para desinfectar equipos de laboratorio (lectores de
ELISA, termómetros, tapas de medicamentos, áreas de preparación de medicamentos e
instrumentos utilizados en ultrasonido).
Precauciones: es volátil e inflamable, almacenar en lugar fresco y herméticamente
cerrado.

FENOLES:
Son eficaces contra las Micobacterias y hongos e inactivos contra esporos y virus.
Son activos ante materia orgánica, se inactivan por la goma, madera y plásticos.
Se utilizan para descontaminar desechos y desinfección de superficies a una
concentración de 5%. Las soluciones deben prepararse diariamente.
Son corrosivos y de uso restringido por su baja biodegradabilidad.

AGENTES OXIDANTES:
Compuestos de Cloro:
De espectro amplio, bajo precio, rápida acción, no dejan residuos venenosos, pero son
corrosivos, se inactivan con materia orgánica. El compuesto activo que se libera es el
ácido hipocloroso.
El hipoclorito de sodio al 0,5 % es eficaz contra las bacterias vegetativas (incluso
mycobacterias) esporos y hongos.
Se usan en desinfección de superficies, en la lavandería, para tratamiento de agua y de
algunos desechos.
No deben emplearse en partes metálicas de centrífugas y otros aparatos.
Las soluciones diluidas deben sustituirse después de 24 horas.
La inhalación de los gases de cloro es irritante para el tracto respiratorio, pueden
producir tos, disnea, edema pulmonar y neumonitis química.

Compuestos de Yodo:
Utilizados en antisepsia de piel, membranas mucosas, el lavado de manos antiséptico y
quirúrgico.
La iodopovidona (IP) al 7,5% se utiliza para el lavado de manos.
Son bactericidas, micobactericidas y virucidas, pero requieren un contacto prolongado
para matar ciertos hongos y esporas bacterianas. No tienen efecto residual y su acción
disminuye en presencia de materia orgánica como la sangre o esputo.
Puede producir irritación de la piel y alergias en personas sensibles. No se deben utilizar
en mujeres embarazadas, que estén lactando, ni en recién nacidos, por los riesgos que
presentan su acción probable sobre la glándula tiroides.
Se deben conservar en frascos opacos y al abrigo de la luz.

17
Peróxido de Hidrogeno:
Es bactericida, virucida, funguicida pero poco efectivo frente a esporas.
Usado al 3% es estable y efectivo en la desinfección de superficies inanimadas, de
elementos de ventiladores, de lentes de contacto, etc. Causan irritación local si no se
enjuaga adecuadamente. Corroe metales y plástico.

AGENTES ALQUILANTES
Formaldehido
Se utiliza al 37 % en Parasitología como conservante de materia fecal y en Histología
como fijador y conservador de piezas frescas de tejidos para estudio microscópico.
Destruye los microorganismos, incluso las esporas. Se une a las toxinas bacterianas
(por ej. toxina diftérica), destruyendo su toxicidad pero no sus propiedades antigénicas.
Muchas vacunas bacterianas y rickéttsicas se preparan tratándolas con formol.
Actualmente fue reemplazado por el glutaraldehido.
El uso industrial y hospitalario está limitado por la producción de gases, el olor
picante y su potencial carcinogénico Se utiliza al 10% para preservar preparaciones
anatómicas y biopsias. No se debe permanecer por más de 8 horas de trabajo diarias en
un ambiente con una concentración de 0,75 ppm.

DETERGENTES Y JABONES:
Los detergentes se pueden clasificar en:
1) Detergentes iónicos: a) catiónicos: potentes desinfectantes contra bacterias Gram-
positivas y Gram-negativas a concentraciones muy bajas, en materiales no orgánicos.
Son compuestos de amonio cuaternario que se usan como alguicidas en piscinas.
Por su baja toxicidad, se emplean como antisépticos de la piel.
b) aniónicos: jabones activos a pH ácido, efectivos sobre bacterias
Gram-positivas.
Combinados con ácidos, son potentes desinfectantes sanitarios y de rápida acción (30
segundos).
Los detergentes no iónicos rara vez tienen actividad antimicrobiana.

ALCALIS:
El NaOH es bactericida. Se utiliza al 2 o al 4 % para homogeneizar esputos.
La soda cáustica diluida se utiliza para la limpieza de utensilios y concentrada, para
desinfección.

ACIDO ACETICO:
Al 1 % se utiliza como antiséptico, sobre todo en quemaduras.
Los ácidos y álcalis fuertes tienen considerable actividad antimicrobiana. Después de un
tiempo de contacto adecuado, todas las superficies que han sido desinfectadas deberán
someterse a un enjuague final con agua.

TRABAJO PRÁCTICO Nº 2: RECOLECCIÓN, CONSERVACIÓN Y

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS.
CONTENIDOS:
Importancia de una buena toma de muestra. Objetivos de una buena toma de muestra.

18
Normas generales de recolección de muestras. Procesamiento de las muestras.
Materiales utilizados en la recolección de muestras. Recolección de muestras de sitios
anatómicos y órganos específicos

OBJETIVOS:
• Capacitarse en dar las indicaciones al paciente que debe recolectar la muestra por sí
mismo en forma clara y también por escrito para asegurar una correcta recolección.
• Manejar los términos adecuados para expresarse de manera correcta en el
desempeño de sus funciones.
• Adiestrarse en la toma de muestras y conservación de las mismas para poder hacer
cultivos de los microorganismos presentes en las mismas.
• Vislumbrar el contacto paciente- técnico que permiten sensibilizar al alumno en la
parte importancia asistencial del ejercicio de su profesión.
• Tomar conciencia de la necesidad de la aplicación de las normas de bioseguridad
que permiten el cuidado y protección del personal de salud y la preservación de la
muestra.(VER ANEXO III)

ACTIVIDADES A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

Los alumnos recibirán indicaciones escritas para realizar distintos estudios
bacteriológicos y deberán conocer cómo se toma cada muestra, quién es el responsable
de la toma, cómo se conserva y cómo se procesa la misma.
Además se adiestrarán en dar las indicaciones al paciente en el caso que deba tomar la
muestra en su domicilio.
En todo momento se aplicarán las normas de bioseguridad correspondientes.

Introducción:
Cuando se recibe o se toma una muestra para estudios bacteriológicos se debe tener en
cuenta que no hay un solo método de diagnóstico debido a las diferencias biológicas de
los microorganismos.
La muestra debe ser representativa del sitio donde se localiza la lesión o infección,
recolectada en recipiente estéril, en cantidad suficiente, en el momento adecuado,
evitando su contaminación con la flora normal y aplicando normas de bioseguridad para
preservar la muestra y evitar contaminaciones.
Las etapas del diagnóstico bacteriológico son:
 Toma o recepción de la muestra
 Envío al laboratorio
 Recepción de la muestra
 Conservación
 Procesamiento
 Informe
 Interpretación de resultados

INDICACIONES AL PACIENTE Y RECEPCIÓN DE MUESTRAS:

Todo el personal del laboratorio debe conocer y dar la correcta explicación al paciente
de cómo debe recolectar la muestra y mantenerla viable hasta la llegada al laboratorio.
El pedido de estudios debe tener fecha, tipo de muestra, forma de obtención, datos
completos del paciente, edad, procedencia (consultorio externo o internado en UTI,
quemados, Neonatología, Sala común) y los medicamentos administrados.

19
Son importantes los datos proporcionados en la historia clínica sobre los antecedentes
epidemiológicos y diagnóstico presuntivo. En caso de no tener acceso a la historia
clínica realizar una pequeña anamnesis al paciente sobre dichos antecedentes.
Al recibir la muestra se interroga al paciente acerca de cómo fue recolectada, a qué hora
y como la conservó hasta su llegada al laboratorio.
Las muestras SE REMITIRAN INMEDIATAMENTE para su procesamiento.
Se rechazan las muestras sin rotular o con datos discordantes a los del pedido,
derramadas, enviadas sin el medio de transporte correspondiente o incorrectamente
conservadas.

NORMAS GENERALES DE RECOLECCION DE MUESTRAS

Las muestras clínicas deben ser:
1. Del sitio real de infección evitando la contaminación de tejidos o de secreciones
adyacentes.
2. Obtenidas en el momento óptimo, en lo posible, antes de la administración de
antibióticos. En caso contrario, con 48 horas de suspendido o terminado el
mismo. (excepto en el caso de orinas: NO menos de 5 días). Si no se pueden
suspender: tomar la muestra justo antes de la siguiente dosis, es decir, en el
valle de la posología.
3. Recolectadas en recipientes estériles rotulados, adecuados al material que se
procesará, en suficiente cantidad para permitir la realización de los métodos de
diagnóstico necesarios.
4. Remitidas al laboratorio de inmediato para su procesamiento.
5. Manipuladas siguiendo las normas de higiene y de bioseguridad adecuadas.
6. Rechazadas si están derramadas, en recipientes inadecuados o no conservadas
adecuadamente. (orinas con más de 2 horas de emisión no refrigeradas).

OBJETIVOS DE UNA BUENA TOMA DE MUESTRA

 Aislar e identificar al agente presente en la muestra
 Determinar la sensibilidad de dicho agente frente a los antimicrobianos.

CONSERVACION DE MUESTRAS
A TEMPERATURA AMBIENTE:
- Muestras en medio de transporte semisólidos.
- L.C.R.
- Sangre.
EN ESTUFA DE CULTIVO:
- Muestras en medio de transporte líquido.
- L.C.R. sembrado en Agar Chocolate
- Sangre inoculada en frascos de hemocultivo.
EN HELADERA (4°C):
- Orinas
- Catéteres colocados en contenedores con solución fisiológica.
- Coprocultivos en medio de transporte semisólido, sí el lapso de conservación supera
las 6 horas.
- Muestras para estudio de Micobacterias (esputos)
- Muestras para estudios Virológicos.
- Líquidos de punción extraídos en dos tubos, con y sin anticoagulante
Stuart: para exudados faríngeos, conjuntivales, nasales y de
Heridas.

20
Medios de transporte Cary Blair: para muestras fecales que contienen Salmonellas,
Shigelas, Vibrio cholerae

PROCESAMIENTO GENERAL DE LAS MUESTRAS

 Examen microscópico directo

 Siembra- inoculación
 Aislamiento. Obtención de cultivo puro.
 Identificación: morfológica, tintorial, bioquímica, inmunológica.
 Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos.
 Comunicación de los resultados.

El examen microscópico directo consiste en observar la muestra en fresco o coloreada.

La observación de bacterias por microscopia óptica y de virus por microscopía
electrónica ayuda al diagnóstico.
Luego se siembran las muestras en medios de cultivo para lograr el desarrollo “in vitro”
de la bacteria causante de la infección.
Cuando se logra el aislamiento y se obtiene un cultivo puro, se realizan las pruebas
bioquímicas o inmunológicas que permiten su identificación, es decir, el Género y la
especie del agente causal.
Luego se realizan las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos para determinar
el antibiótico más efectivo para implementar un tratamiento
Los virus causantes de la enfermedad infecciosa se aíslan en cultivos celulares, huevos
embrionados o en animales de experimentación.
Los métodos indirectos incluyen la detección de anticuerpos específicos (aglutinación,
inmunofluorescencia, RIE, ELISA), de ácidos nucleicos por técnicas de hibridación con
sondas marcadas o PCR.
Finalmente, se elabora el informe con los resultados obtenidos que será interpretado por
el médico tratante.
En cada paso del diagnóstico microbiológico deben seguirse las pautas para el control
de calidad necesario para asegurar la certeza de los resultados obtenidos.

A continuación, se presentan las distintas técnicas de recolección de muestras para

estudios microbiológicos:

PEDIDO DE HEMOCULTIVO O CULTIVO DE SANGRE:

Esta técnica consiste en inocular la muestra de sangre en un caldo inmediatamente
después de obtenida para lograr, luego de la incubación, el desarrollo de los
microorganismos presentes en la sangre del paciente.

Materiales necesarios para la extracción:

 Frascos de hemocultivo (*)
 Algodón, tintura de yodo, alcohol 70º.
 Jeringa y aguja estériles.
 Guantes de cirugía de látex.

21
 Actualmente se dispone de frascos de hemocultivo con caldo de cultivo y
un adaptador con aguja que permite extraer directamente la sangre e
introducirla en el medio, evitando la posible contaminación de las muestras.

(*)Frasco aerobio tapón azul. Frasco pediátrico tapón amarillo,

Frasco anaerobio tapón rojo. inóculo 1 a 4 cc.
Inóculo 5 a 10 cc. Adultos

El frasco de hemocultivo contiene:

- caldo tripteína soya o cerebro-corazón o Brucella
- Polianetolsulfonato de sodio (PSD) (anticoagulante)
- tensión de CO2 para anaerobios.

Condiciones generales de recolección:

 Recolectar 3 muestras dentro de 24 hs. con intervalos de 30 minutos entre cada una
de ellas, siempre de distintos puntos de punción.
 Recoger la muestra una hora antes del pico febril, si se puede predecir o cuando
comienza.
 En caso de sepsis resistentes al tratamiento como la endocarditis, cualquier momento
es adecuado para tomar la muestra.
 Realizar las extracciones antes de la administración de antibióticos. Si no puede
evitarse, hacerlo antes de la siguiente dosis. (Valle o menor concentración plasmática de
antimicrobiano)
 Rotular cada muestra según las pautas establecidas, indicando el número de la misma
y la hora de extracción.
 Nunca extraer hemocultivos a través de catéteres intravenosos permanentes de más
de 48 horas de colocación.
 En frascos para sistemas automatizados inocular 5-10 cc de sangre para adultos y 1-4
cc para niños.

Elección del tipo de frasco (aeróbico, anaerobio, etc.) según la situación clínica:
Adultos y adolescentes:
 Septicemia, meningitis, osteomielitis, artritis, neumonía: tomar 2 muestras, una
aerobia y otra anaerobia.
• Endocarditis bacteriana subaguda: tomar 3 muestras aerobias en 24 hs. Repetir si son
negativas luego de 24 hs de incubación.
• Endocarditis bacteriana aguda: tomar 3 muestras en el lapso de 1-2 horas, sobre todo,
antes de implementar la terapéutica.
• Bacteriemia de origen desconocido (paciente medicado con ATB): tomar entre 4-6
cultivos en 48 horas. (incluir frascos anaeróbicos)

22
Pacientes pediátricos y recién nacidos:
• Tomar 3 muestras en forma simultánea para poder realizar diagnóstico de
bacteriemia. (frascos aeróbicos)

TECNICA DE RECOLECCION:
 Lavado de manos con antisépticos.
 Elección del sitio de punción.
 Colocarse guantes estériles.
 Ligar el antebrazo por encima del pliegue del codo y palpar la vena elegida.
 Realizar la antisepsia de la piel con alcohol 70° durante 1 minuto, seguida por
aplicación de solución de iodo povidona, en forma concéntrica al sitio de punción.
 Dejar actuar 30"-60", luego remover con alcohol 70° para evitar la irritación local.
 Luego de realizado este procedimiento, no volver a palpar la vena a punzar.
 Desinfectar el tapón de goma del frasco con alcohol iodado.
 Punzar la vena y extraer la cantidad necesaria de sangre
 Cambiar la aguja y punzar el tapón desinfectado de hemocultivo e inocular la
sangre en los frascos SIN INTRODUCIR AIRE en ellos. (Invertir los frascos al
realizar esta operación)
 Agitar suavemente, sin formar espuma para homogeneizar la muestra, evitando
que la sangre coagule.
 Enviar las muestras INMEDIATAMENTE al Laboratorio. Fuera del horario de
recepción: colocar en estufa de incubación a 35°C o en Bact alert en caso de contar
con equipos automatizados (Laboratorio de Guardia).

Procesamiento:
a) Incubar los frascos de hemocultivo a 35 – 37°C hasta por 7 días.
b) Examinarlos visualmente y con luz transmitida después de 12 y 24 horas de
incubación.
La turbidez o lisis de los glóbulos rojos indican crecimiento bacteriano; entonces
se realizará una coloración Gram y un subcultivo.
En los medios bifásicos como Ruiz Castañeda, se puede observar turbidez en la
fase líquida y colonias en la fase sólida.
c) Para realizar los subcultivos ciegos, desinfectar la superficie de la tapa
del frasco con alcohol de 70%.
Extraer a través del tapón del frasco con una aguja y jeringa, inóculo para
realizar la siembra en agar sangre y en agar Mac Conkey.
Incubar las placas de Agar Sangre y agar Mac Conkey a 35 - 37° C por 24 horas.
Si no hay crecimiento a las 24 horas seguir incubando hasta por 48 horas.
Si no hubiera desarrollo bacteriano, repetir el procedimiento al 5° y 7° día.
d) Para realizar una coloración de Gram, extraer una gota de inóculo de la misma
manera que se extrajo para hacer los subcultivos, realizar un frotis y colorear con
Gram.
e) Observar forma y características tintoriales.
f) Realizar las pruebas de identificación y el antibiograma del microorganismo
desarrollado.
g) Entregar el informe de laboratorio.

SISTEMAS AUTOMATICOS DE LECTURA.

23
Estos sistemas aumentan la sensibilidad y la rapidez en la detección del crecimiento
bacteriano y se basan en la detección del CO 2 que se produce en el crecimiento
bacteriano por diferentes métodos, radiométricos, fluorimétricos, espectrometría de
infrarrojos, cambios del pH, etc.
Los frascos inoculados con la muestra deben ser rápidamente introducidos en el equipo,
que lee cada 10 minutos la concentración de CO 2. En las muestras positivas el
incremento en el CO2 activa una alarma visual y sonora. Las muestras negativas al cabo
de 5 días son detectadas, pero en todos los casos hay que confirmarlas por medio de
frotis, teñido al Gram y por subcultivo en agar sangre y agar chocolate.

PEDIDO DE UROCULTIVO
La técnica de UROCULTIVO consiste en cultivar la muestra de orina recolectada para
lograr, luego de la incubación, el desarrollo de los microorganismos presentes.
Para evitar la contaminación con gérmenes que normalmente colonizan la porción
anterior de la uretra, se debe recolectar el “chorro medio” previa higiene de la zona.
En el examen microscópico del sedimento urinario, la infección puede estar
evidenciada por presencia de bacterias y leucocitos.
Material necesario para urocultivo por micción voluntaria:
Envase de plástico estéril, de boca ancha, hermético con tapón de rosca, de 50 cc.

Las muestras de orina pueden recogerse de 3 formas:

Por micción voluntaria.
Por sonda uretral.
Por aspiración suprapúbica.

Indicaciones para la recolección por micción voluntaria:

Preferentemente se dará al paciente las instrucciones por escrito y en forma oral para
una correcta recolección de la muestra:
 Se recoge la primera orina de la mañana o con una retención de 3 horas como
mínimo.

24
 Si se está recibiendo medicación antibiótica, recolectar la orina antes de la toma de
antibióticos.
 Antes de la recolección, el paciente lavará los genitales externos, zona perineal e
inguinal, meato uretral con agua y jabón. Enjuagar con agua tibia previamente
hervida y secar con gasa estéril.
 En el caso de la mujer, debe separar los labios y colocar dentro de la vagina un
tapón de gasa estéril antes de orinar para evitar la contaminación con flujo vaginal.
 En el caso de los hombres y niños con control de esfínteres, deben retraer el
prepucio.
 En todos los casos, desechar el primer chorro de orina (30 ml) y recoger el “chorro
medio” en un recipiente estéril.
 Tapar inmediatamente, rotular y enviar al laboratorio lo antes posible.
 En niños mayores la orina se recoge igual que en los adultos bajo supervisión del
profesional.
En niños pequeños, neonatos, prematuros, lactantes se utiliza una bolsa colectora de
orina estéril con anillo adhesivo que se coloca después de lavar los genitales. Si no se
consigue orina en 20-30 minutos, se despega la bolsa o se ensucia, hay que sustituirla
por otra.

Transporte y conservación
La muestra para urocultivo debe llegar lo antes posible al laboratorio.
Lo correcto es procesarla inmediatamente.
Se conserva en el laboratorio en heladera (4 ºC) no más de 24 horas.

Procesamiento:
1. Examen físico y microscopico.
2. Siembra y aislamiento en medios de cultivo adecuados
3. Recuento de colonias.
4. Identificación
5. Antibiograma.
6. Entrega de resultados.

1. Examen físico: consiste en tomar densidad y pH,

Examen microscópico: Se centrifugan 10 ml de orina durante 10 minutos a 2000
r.p.m. Descartar el sobrenadante en un recipiente con hipoclorito de sodio al 10 % o
fenol, dejando caer la orina por gravedad hasta que salga todo el líquido.
Examen en fresco: Se coloca una gota de sedimento entre porta y cubreobjeto y se
observa al microscopio con objetivo de 10 X y de 40 X.
Examen de frotis teñidos: Con otra gota de sedimento se realiza un frotis para
coloración de Gram. Esto permite obtener información morfológica que nos
orienta acerca de los pasos a seguir.
Escherichia coli y Proteus son bacilos gramnegativos. Staphylococcus son cocos
grampositivos agrupados en racimos. Enterococcus son cocos gran positivos
agrupados en cadenas cortas.
En el sedimento se investigan los siguientes indicadores de infección urinaria:
bacterias, leucocitos, hematíes, hongos.
El sedimento urinario normal contiene 1-2 leucocitos/campo 400 X en el hombre y
2-4 leucocitos/campo 400 X en mujeres y niños. Existe piuria cuando la cifra es
superior e indica infección urinaria.

25
 Materiales y equipos necesarios para la siembra:
a) Ansa calibrada de platino o descartable de 0.001ml, 0.01 ml
b) Estufa de 35 – 37° C
c) Mechero Bunsen
d) Guantes de látex
e) Contenedor de material contaminado
f) Pinza estéril
i) Placas con medios de cultivo:
1- medios para determinación cualitativa: -EMB, AMS, Sabouraud-cloranfenicol
2-medios para determinación cuantitativa: agar CLDE, agar sangre y agar
chocolate. Medio CPS 3 (se usa actualmente para aislamiento y recuento de
Escherichia coli, Proteus y Enterococcus)

2- Siembra:
Con un ansa calibrada, tomar una muestra de orina y sembrar en placas con agar
CLDE en condiciones aeróbicas y en placas con agar sangre o agar chocolate con
atmósfera de 5-7% de CO2.
Incubar a 37ºC durante 24 horas (48 horas para agar sangre o chocolate).
Cultivo positivo: aparecen numerosas colonias idénticas en los medios de cultivo
inoculados.

3- Recuento de colonias: si se utilizó una ansa de 0.01 ml, se cuenta el número de

colonias desarrolladas y se lo multiplica por 100 para determinar el número de
colonias presentes por mililitro de orina.
Nº colonias x 100 = Nº colonias/ml = ufc/ml
La unidad formadora de colonia (ufc) supone que un microorganismo dará lugar a
una colonia en la placa de Petri.
Generalmente el desarrollo de dos o más tipos de colonias (en pacientes sin sonda
vesical) indica que la muestra se ha contaminado por recolección incorrecta o
demora en la siembra.
4.5. Se realizan las pruebas complementarias para lograr la identificación del
microorganismo sospechado y su correspondiente antibiograma.

6. Se entrega el informe de laboratorio.

MUESTRAS PROCEDENTES DEL APARATO RESPIRATORIO

Las muestras pueden proceder del tracto respiratorio superior (faríngea, nasal) y del
inferior (esputo, secreción y aspirado traqueal y bronquial)
Para el diagnóstico de faringitis aguda, observar la zona para localizar áreas de
inflamación con exudados, con membranas o con úlceras. En su defecto realizar un
hisopado enérgico de amígdalas, área tonsilar y faringe posterior.
Si se visualizan áreas con pseudomembranas: realizar coloración de Gram para
descartar asociación fuso espirilar. (Angina de Vincent).
Si se desea realizar estudios de portación de Staphylococcus aureus y de gérmenes
oportunistas en neutropénicos (por ejemplo por aparición de brotes en Unidades de
internación), tomar muestras de secreciones faríngeas y de zona palatina.
Eventualmente, enviar a su vez cultivo de fosas nasales.

26
Hisopado faríngeo:
 El paciente debe estar sentado con la cabeza en hiperextensión y recibir la zona,
muy buena iluminación.
 Se instruye al paciente para que inspire profundamente. Se utiliza una luz que
enfoque la cavidad bucal, un hisopo estéril y un tubo estéril.
 Se baja la lengua con suavidad con un depresor lingual para evitar el contacto del
hisopo con la lengua y la mucosa bucal.
 Se debe hacer que el paciente diga “ahhhh” para levantar la úvula y reducir el reflejo
de arcada.
 Suave pero firme pasar el hisopo por la pared posterior de la faringe.
 Retirar el hisopo con las mismas precauciones usadas para introducirlo.
 Colocar el hisopo dentro del tubo estéril con tapa a rosca y llevar al laboratorio para
ser cultivado lo antes posible (tiempo máximo de conservación: 4 horas). Se toma
otra muestra con otro hisopo para hacer frotis para realizar coloración de GRAM.
 Si se sospecha un posible caso de difteria, se coloca el hisopo en medio de cultivo
de Loeffler y se envía a un laboratorio de referencia. En caso de sospecha de
meningitis, el hisopo se coloca en un tubo estéril con medio de transporte
(Transgrow o Stuart).
 Si se trata de infección por Streptococcus pneumoniae, se siembra en agar sangre.

Hisopado faríngeo Toma de muestra nasal

Secreción nasal:
Esta muestra sólo se toma, en caso de brotes, para estudio de portación de
Staphylococcus aureus y de Streptococcus B hemolítico.
Procedimiento:
Insertar el hisopo 1 cm en las narinas.
Rotarlo firmemente sobre las membranas y dejarlo 10 – 15 segundos.
Colocarlo en medio de transporte semisólido
Remitirlo inmediatamente al Laboratorio.
Conservar a temperatura ambiente hasta su procesamiento.
Si hubiera lesiones en las narinas: tomar muestra de los bordes activos de la lesión.
NUNCA utilizar hisopados nasales para diagnóstico de sinusitis. La muestra válida es la
Punción-Aspiración del seno nasal infectado. Para la investigación de Bordetella
pertussis: se recomienda la obtención de exudado nasofaríngeo.

Oído:
Se realiza si el médico lo solicita.
Técnica: Con un hisopo embebido en solución fisiológica o agua destilada, limpiar el
oído externo por fuera y descartarlo, y con otro seco y estéril rotar en el fondo del OE
extrayendo el material.

27
Sembrar en agar-sangre y Mac Conkey y realizar un frotis para colorear con Gram.

VIAS RESPIRATORIAS BAJAS:

Las muestras son: esputo, aspirado traqueal, lavado bronquial, broncoalveolar (BAL) y
gástrico

Esputo
Es difícil obtener muestras apropiadas de esputo debido a la contaminación con las
secreciones orales.
La muestra se obtiene por la mañana y en ayunas, previo enjuague con solución de
bicarbonato.
Recolectar el esputo producto de una expectoración profunda dentro del frasco,
presionando el borde de este debajo del labio inferior para impedir la contaminación del
exterior del recipiente.
El recipiente es de plástico, estéril, de boca ancha, con cierre hermético y 50 a 125 ml.
Si se buscan bacilos ácido-alcohol-resistentes (BAAR) el recipiente puede no ser estéril.
Rotular el frasco y remitirlo al Laboratorio inmediatamente.
El esputo de una persona infectada suele contener: moco denso con burbujas, hilos de
fibrina, pus, sangre, etc.
La presencia de abundantes células epiteliales escamosas sugiere contaminación con
saliva.

Lavado Gástrico
Se realiza en niños pequeños y en pacientes incapaces de expectorar, buscando el esputo
deglutido. El paciente debe tener 8 horas de ayuno.
Se aspira el contenido del estómago con una jeringa de lavado y se envía la muestra con
la mayor brevedad posible.

MUESTRAS OCULARES
Indicaciones al paciente:
 Suspender la colocación de todo tipo de colirios y ungüentos conjuntivales 48-
72 horas antes de la toma de la muestra, excepto gotas para glaucoma.
 Concurrir con la cara limpia sin maquillaje e higienizarse con agua tibia para
eliminar las costras adheridas al ojo.

Toma de muestra conjuntival:

 Lavarse las manos y colocarse guantes estériles
 Tomar muestra de ambos ojos con hisopos secos (si hay secreción) o húmedos
en caldo –tripticasa-soya o BHI (si no hay secreción). Se usan dos hisopos por
cada ojo, uno para cultivo y otro para coloración.
 Pasar el hisopo sobre la conjuntiva inferior, 2 ó 3 veces en la misma dirección (y
no hacia delante y atrás), desde el ángulo interno, evitando tocar el mismo, hacia
el otro extremo absorbiendo el material sin frotar. No tocar el borde del
párpado.
 Sembrar directamente en los medios de cultivos correspondientes y hacer los
frotis para las coloraciones.
 Si no pueden ser sembrados en forma directa, colocarlos en medio de transporte
Cary –Blair y remitir al Laboratorio junto a dos frotis preparados en el momento
de la toma de muestra para coloración de Gram y de Giemsa.

28
MUESTRAS DE MATERIA FECAL PARA COPROCULTIVO
Toma de muestra y conservación
El paciente debe recoger la materia fecal de una deposición espontánea en un frasco
estéril de boca ancha.
En niños que usan pañales las muestras deben ser tomadas preferentemente de las
nalgas y no del pañal seleccionando las partes mucosas, purulentas y/o sanguinolentas y
colocarlas en frasco estéril.
Se lleva la muestra al laboratorio antes de la hora de ser emitida, caso contrario solicitar
medio de transporte antes de tomar la muestra.
La muestra debe procesarse inmediatamente (dentro de las dos horas de emitida)

MUESTRA PARA EXAMEN COPROPARASITOLÓGICO

Técnica de recolección de Deschiens:
Esta muestra de materia fecal es recolectada por el paciente y en el laboratorio se le
deben dar las instrucciones orales y escritas para asegurar una correcta recolección.
Se informará al paciente que debe adquirir un equipo para examen parasicológico y que
dicho equipo sea el adecuado según el pedido médico: si el pedido es de
coproparasitológico e hisopado anal debe verificar que ambos recipientes tengan líquido
y que el equipo contenga los 5 hisopos.
El paciente debe recolectar durante 6 días una pequeña porción de materia fecal
(½ cucharadita) de cada deposición y colocarla en el frasco con la leyenda Solución de
formaldehído; si también se solicita hisopado anal el paciente debe pasar por zona peri
anal un hisopo distinto cada mañana al despertar y colocarlo en el recipiente con la
leyenda Solución fisiológica.
NOTA: El paciente no debe ingerir los laxantes que puede contener el equipo ya que
actualmente está desaconsejado.

Procesamiento de las muestras:

Se realiza la concentración por centrifugación o método de Teleman.
Para ello, se filtra la muestra de materia fecal
a través de gasa en un tubo de centrífuga con tapa a rosca hermética( aproximadamente
hasta la mitad del tubo)
Se agrega luego solución de formol al 5% y éter sulfúrico (debe hacerse con el mechero
apagado por ser explosivo) hasta aprox., 1cm. del borde del tubo, se tapa y se invierte
varias veces.
Se centrifuga 10 minutos a 2000 rpm.

En caso de los hisopados anales se trasvasa 10 ml de la solución fisiológica donde están

los hisopos a un tubo de centrífuga con tapa a rosca y se centrifuga.
Se descartan los sobrenadantes de ambos tubos centrifugados y se realiza en un
portaobjeto una emulsión del sedimento de la materia fecal en Lugol y en el otro
extremo se deposita una gota del sedimento de la S.F. que contenía los hisopos, se
coloca sobre cada uno un cubreobjeto y se observa al microscopio en 100x y 400x.
En otro portaobjeto se deposita una gota del sedimento de la materia fecal, se deja secar,
se fija y colorea con Kinyoun.

TRABAJO PRÁCTICO Nº 3: EXAMEN MICROSCOPICO DE LOS

MICROORGANISMOS

CONTENIDOS:

29
Técnicas de examen directo de muestras sin teñir. Técnicas de examen directo de
muestras teñidas. Preparación, secado, fijación y coloración de frotis.
Coloración de Gram, de Ziehl-Neelsen. Fundamentos y técnicas.
Otras coloraciones: Kolowsky, Azul de Metileno, Leifson, Moeller, Giemsa, Wayson.
Composición y preparación de colorantes y reactivos (ver Anexo I)

OBJETIVOS:
• Adiestrarse en las técnicas de examen de fresco de muestras.
• Realizar coloraciones diferenciales para observar al microscopio los
microorganismos de la muestra.
• Comprender el fundamento de las técnicas para apreciar el porqué de cada paso.

ACTIVIDADES A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

- Realizarán un examen en fresco de muestras y observarán al microscopio.
- En todo momento se aplicarán las normas de bioseguridad correspondientes.
- Prepararán los colorantes y reactivos utilizados en las técnicas de coloración.
- Realizarán coloraciones diferenciales para observar al microscopio la morfología y las
características tintoriales de los microorganismos presentes en las muestras.

EXAMEN MICROSCÓPICO DE MUESTRAS:

Permite detectar la presencia de bacterias, su morfología, sus características tintoriales,
para elegir los medios de cultivo más adecuados que permitan el aislamiento e
identificación del microorganismo causante de la infección.
La observación microscópica de los microorganismos puede ser:
a) Examen en fresco o directo
b) Examen de frotis coloreados.
El examen en fresco o directo consiste en observar el material sin ningún artificio de
fijación o de coloración; simplemente colocando una gota de material entre porta y
cubreobjeto y observando al microscopio con objetivos a seco.
Se puede observar la movilidad bacteriana y microorganismos como levaduras,
protozoos o algas microscópicas.
El examen de frotis coloreados permite observar con mayor claridad la morfología del
microorganismo y clasificarlo según sus características tintoriales en Grampositivos.
Gramnegativos, Bacilos ácido-alcohol-resistentes (BAAR)
Los frotis coloreados a partir de colonias desarrolladas en medios sólidos permiten
determinar el grado de pureza del cultivo. También el grado de deformidad de las
bacterias en esos medios, su supervivencia, etc.

Materiales utilizados:
Portaobjetos: Medidas estándar de 76 x 26 mm x 1 mm de espesor.
Cubreobjetos: Los de 22 x 22 mm y 0,1 ó 0,2 mm de espesor son los más usados.
Colorantes: evidencian la morfología, estructuras y características tintoriales de los
microorganismos.
Pueden ser: naturales o sintéticos, según sean extraídos de plantas o animales o de
anilinas.
Naturales: Hematoxilina, extraída del palo de campeche, que por oxidación proporciona
Hemateína, muy usada en Histología como colorante nuclear.
Sintéticos:
1. básicos, colorean núcleos y otras estructuras celulares ácidas, por ej. Cristal
violeta, azul de metileno

30
 2. ácidos, que colorean citoplasmas y componentes celulares cargados
positivamente como grupos aminos de las proteínas, por ej. Eosinas, ácido
pícrico.
3. neutros, que tiñen las partes básicas de una célula de un color y las partes
ácidas de otro; por ej. Eosinato de azul de metileno.
4. indiferentes, generalmente insolubles en agua y solubles en alcohol tiñen
aquellas estructuras o sustancias que los disuelven más fácilmente que el
líquido en que están preparados. Un ejemplo es el colorante sudan, un
colorante de lípidos.
Los colorantes ácidos se utilizan como colorantes de contraste.
Los neutros e indiferentes, para coloraciones especiales.
Para reforzar la acción de los colorantes básicos, se les añade un mordiente.
Algunas técnicas requieren también de un agente de diferenciación (alcohol, ácidos
diluidos, etc.)

TÉCNICAS DE EXAMEN DIRECTO DE MUESTRAS SIN TEÑIR:

A) ORDINARIO O DIRECTO
EXAMEN EN FRESCO B) CON TINTA CHINA
C) CON MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO

A) Examen en fresco ordinario o directo:

Colocar una gota de material entre porta y cubreobjeto y observar con objetivo a
seco. Si es denso se emulsiona con una gota de solución fisiológica.

B) Examen en fresco con tinta china

Colocar una gota de material sobre el portaobjeto, una gota de tinta china, mezclar y
cubrir con cubreobjeto. Observar al microscopio con objetivos a seco la presencia de
cápsulas.

C) Examen en fresco con microscopio de campo oscuro

Se usa un microscopio modificado en su condensador para observar en fresco muestras
que contienen por ejemplo Treponema pallidum.
El campo visual se observa detrás de la muestra como un fondo oscuro sobre el cual
aparecen pequeñas partículas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el
objetivo.
Es la única técnica de examen en fresco donde se observa el material con objetivo de
inmersión.

31
TÉCNICAS DE EXAMEN DIRECTO DE MUESTRAS TEÑIDAS:
Procedimiento general de coloración:
1. Preparación del frotis
2. Secado del frotis
3. Fijación del frotis:
a) Física: por calor
b) Química: alcohol flameado o en frío

4. Coloración:
a) simple: Azul de Metileno
GRAM
ZIEHL NEELSEN
Otras coloraciones especiales:
-KOLOWSKY para Brucellas
b) diferenciales -AZUL DE METILENO para Corynebacterium diphtheriae
-LEIFSON para cilios y/o flagelos
-MOELLER para esporas
-GIEMSA Trypanosma y Plasmodium
-WAYSON para Yersinias

1. Preparación de frotis:
De un inóculo líquido: Tomar inóculo de un tubo con ansa estéril, colocar en el centro
del portaobjeto. Secar al pie del mechero. Fijar.

32
1-Preparación del frotis 2- Secado 3- Fijación por calor

De un cultivo en medio sólido:

Colocar una gota de agua destilada en el portaobjeto con el ansa estéril.
Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del
cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla
con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante
extendida para facilitar su secado. Esterilizar el ansa.
Secar al pie del mechero. Fijar.

2. Secado de los frotis:

Los frotis se secan al pie del mechero o en estufa a 37ºC.

3. Fijación de los frotis:

Cuando los frotis están secos, se fijan para lograr la adherencia del material al
portaobjeto, manteniendo la morfología bacteriana por coagulación rápida de sus
proteínas.

Existen varias formas de realizar la fijación: a) Física: por calor

b) Química: alcohol flameado o en frío

a) Se pasa tres a cinco veces sobre la llama del mechero el portaobjeto con el frotis
hacia arriba, debe notarse caliente pero no debe quemar cuando se coloca en la
parte posterior de la mano.

b) Alcohol flameado: Colocar sobre el frotis seco unas gotas de alcohol metílico y
escurrir y flamear.
c) Alcohol en frío: Colocar sobre el frotis seco unas gotas de alcohol y dejar secar

33
4. Coloración de los frotis:

a) COLORACIÓN SIMPLE:
Se puede utilizar fucsina o un colorante azul (de metileno, de toluidina, etc.)
Técnica:
 Cubrir los frotis fijados con Azul de metileno durante 1 minuto.
 Lavar con agua corriente.
 Escurrir y dejar secar en la gradilla.
 Observar al microscopio las distintas formas de las bacterias, teñidas de color azul.

b) COLORACIONES DIFERENCIALES

1) COLORACION DE GRAM
Es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio
bacteriológico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado.
Permite observar no solo la morfología bacteriana sino la diferenciación entre
microorganismos Gram positivos y Gram negativos según sus características tintoriales.

Fundamento:
Para que esta reacción ocurra es necesario que las bacterias que se van a colorear
tengan su pared íntegra, para esto se deben utilizar cultivos jóvenes.
La pared de la célula bacteriana sirve para dar forma al organismo y para prevenir la
lisis osmótica. Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tienen diferencias
estructurales en sus paredes de ahí que se tiñan de manera distinta. El peptidoglicano les
confiere rigidez a las bacterias y permite el paso de las soluciones para la tinción.
La pared de las bacterias Gram-positivas es gruesa, constituida por varias capas
interconectadas de peptidoglicano (80-90%) y de ácido teicoico. La pared de las
bacterias Gram-negativas es más delgada, sólo de peptidoglicano (10-20%) y rodeada

34
por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y
lipoproteínas. Al ser más delgada la pared celular de las Gram-negativas, el alcohol
acetona provoca la apertura de los poros en la lámina de peptidoglicano, liberando el
complejo cristal-violeta-yodo. Luego de decolorarse se tiñen con el segundo colorante
(fucsina o safranina).

Es importante destacar la intervención del yodo como mordiente de esta coloración ya

que forma un precipitado con el colorante cristal violeta que tiñe ambos tipos
bacterianos.
La decoloración con alcohol acetona permite la diferenciación del Gram.
Las bacterias Gramnegativas se decoloran y quedan libres para tomar la coloración de
contraste.

Técnica;
 Realizar un frotis, secarlo y fijarlo por calor.
 Cubrir con solución de Cristal Violeta durante 1 minuto.
 Enjuagar con agua corriente (nunca sobre el material).
 Cubrir con solución de Lugol durante 1 minuto.
 Lavar con agua corriente.
 Bañar completamente el frotis con solución de alcohol-acetona no más de 20
segundos.
 Enjuagar con agua corriente.
 Cubrir con Fucsina 1 minuto como colorante de contraste.
 Enjuagar con agua corriente, escurrir y secar en la gradilla.
 Observar al microscopio con objetivo de 100 X y aceite de inmersión.
Resultados: bacterias grampositivas: de color azul-violáceo
bacterias gramnegativas: de color rosado

2) COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN
Fundamento:
La pared de las micobacterias posee un elevado contenido en lípidos (50–60%) que le
confieren un carácter hidrofóbico y está constituida por el complejo macromolecular
formado por ácidos micólicos–arabinogalactano–peptidoglucano (mAGP).
Se utiliza fucsina fenicada en caliente, ya que el calor actúa como mordiente para
ayudar al colorante a penetrar en la bacteria. El fenol, que forma parte del colorante, es
soluble en los lípidos que componen la mayor parte del citoplasma de las bacterias
BAAR. También es soluble en alcohol y en agua (más en los lípidos que en el agua).
La mezcla decolorante (alcohol- ácido clorihídrico al 3 %) no podrá decolorar los
BAAR debido a la resistencia de la pared a su penetración permaneciendo rojos
mientras que las demás bacterias se verán azules.

35
Las bacterias ácido-alcohol resistentes son del Género Mycobacterium, (Mycobacterium
tuberculosis y Mycobacterium leprae). También del Género Actinomyces.

Técnica:
1- Realizar un frotis, secar y fijar a la llama.
2- Cubrir con colorante primario, solución de fucsina fenicada (solución acuosa de
fucsina 1 % y fenol 5 %).
3- Calentar el preparado pasando un hisopo de algodón embebido en alcohol y
encendido por debajo del preparado hasta lograr la emisión de vapores, realizando
pasajes discontinuos, evitando la ebullición del colorante. Por consiguiente, no debe
mantenerse el hisopo debajo del preparado sino colocarlo en los momentos en que cese
la emisión de vapores.
4- Escurrir
5- Lave suavemente el colorante con agua corriente fría hasta que toda la tinción libre
quede lavada. Retire el exceso de agua.
5- Decolorar con alcohol- ácido clorhídrico diluido al 3 %. (30 ml de HCl 1N + 970 ml
de alcohol etílico) Esta operación puede repetirse hasta que sobre el extendido se
observe un color rosado.
6- Lavar, escurrir
7- Colorear con colorante de contraste, Azul de metileno durante 1 minuto.
8- Lavar con agua, dejar secar a Tº ambiente o en estufa a 37ºC y observar con objetivo
de inmersión de 100 X.

TRABAJO PRÁCTICO Nº 4: MEDIOS DE CULTIVO Y TÉCNICAS DE

SIEMBRA

CONTENIDOS
Medio de cultivo. Utilización. Condiciones. Clasificación. Preparación. Esterilización.
Principales medios de cultivo utilizados en bacteriología.
Siembra. Inóculos. Métodos de siembra en medio líquido, sólido y semisólido. Cultivo
de cepas. Interpretación de los cultivos primarios. Características macroscópicas de las
colonias.

OBJETIVOS
• Comprender la importancia de trabajar en condiciones de esterilidad para que pueda
aislarse el agente causal.
• Adquirir destreza en la correcta preparación, acondicionamiento, esterilización y
fraccionamiento de los medios de cultivo.
• Reconocer la necesidad de evitar la contaminación tanto de los medios de cultivo
como de los demás elementos utilizados en el laboratorio de microbiología.
• Adiestrarse en el manejo del material y conocer los métodos de siembra.
• Adquirir destreza y habilidad manual para la siembra de microorganismos con el fin
de obtener cultivos puros.
• Explicar los diferentes tipos de siembras que pueden realizarse para aislar el
microorganismo a partir de una muestra.

ACTIVIDADES A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

Los alumnos prepararán medios de cultivo sólidos, líquidos y semisólidos, los
esterilizarán, los fraccionarán en placas, en tubos, según corresponda y realizarán
distintas técnicas de siembra en placas de Petri y en tubos con caldo y picos de flauta.

36
MEDIO DE CULTIVO
Es aquel que contiene los elementos necesarios para el crecimiento y multiplicación del
microorganismo que se va a cultivar. Presenta en su composición una serie de
nutrientes, siendo además necesarias ciertas condiciones físicas que permitan el
desarrollo “in vitro” del microorganismo sembrado.
Dichas condiciones son: temperatura, grado de humedad, pH y presión de oxígenos
adecuados.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de
cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al
enfriarse a 4°C. No es nutritivo para las bacterias ni es atacado por ellas al crecer en el
medio con agar.
Entre los materiales de enriquecimiento de los medios de cultivo figuran los hidratos de
carbono, suero, sangre completa, bilis, etc.
Los medios de cultivo se utilizan para inocular las muestras.
Luego de la incubación, se obtienen colonias aisladas que permiten la identificación d el
microorganismo causante de la infección a través del estudio de las características de las
colonias y del estudio del metabolismo bacteriano.
Finalmente, en los medios de cultivo se realizan los antibiogramas que determinan la
susceptibilidad del agente causante de la infección a los antimicrobianos.
También los medios de cultivo permiten la conservación de cepas en el laboratorio.

CONDICIONES QUE DEBE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO

a) Composición de nutrientes adecuada a las necesidades del microorganismo:
Son nutrientes a base de extractos de carne y Peptona con fuentes de carbono, nitrógeno,
azufre, fósforo, sales inorgánicas, cofactores y coenzimas. También pueden ser
necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio,
manganeso, sodio o potasio y ciertas vitaminas y factores de crecimiento.
Algunas bacterias requieren medios enriquecidos con suero, sangre, líquido ascítico, etc.
Los hidratos de Carbono no solo aportan nutrientes al medio sino que permiten la
identificación del microorganismo en base a su metabolismo (oxidativo, fermentativo)
El agregado de colorantes a los medios sirve para indicar el pH y los cambios de color
detectan la formación de ácido, por ejemplo. También se utilizan como inhibidores
selectivos del crecimiento de bacterias.
Por ejemplo: el Rojo Fenol se usa como indicador, es rojo en pH básico y amarillo en
pH ácido.
El Violeta de Genciana se usa como inhibidor, impide el crecimiento de la mayoría de
las bacterias Gram-positivas.
b) Consistencia adecuada del medio
Pueden ser sólidos, líquidos o semisólidos según el objetivo de la siembra.
c) Condiciones físico-químicas apropiadas dentro de la estufa:
Temperatura óptima, alrededor de los 37ºC
Grado de humedad, para evitar la desecación de los medios inoculados
pH, la mayoría de los patógenos se desarrolla a pH 7.
Presencia o ausencia de oxigeno según sea aerobio, anaerobio estricto o facultativo,
microaerófilos.
La mayoría crece mejor en la oscuridad excepto los microorganismos fotosintéticos.

CLASIFICACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

* Según su consistencia:

37
 a) Medios sólidos.
b) Medios líquidos o caldos.
c) Medios semisólidos.
* Según su uso o utilización:
1- Enriquecidos
a) Medios para aislamiento: 2- Selectivos
3- Diferenciales
b) Medios primarios.
c) Medios para identificación.
d) Medios para mantenimiento de cepas o transporte.

* Según su composición:
a) Medios naturales.
b) Medios artificiales:
b.1) Medios sintéticos.
b.2) Medios complejos.

* Según su presentación :
a) Medios deshidratados o liofilizados.
b) Medios preparados

MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU CONSISTENCIA:

Los medios sólidos contienen una proporción en agar por encima del 15‰ (15 gr x
litro).
Permiten el aislamiento, purificación y visualización del crecimiento en colonias de las
bacterias y la realización de antibiogramas.
Los medios líquidos o caldos no contienen agar, contienen agua, sales minerales,
fuente de carbono, vitaminas, etc.
Se utilizan para realizar pruebas bioquímicas, para identificar bacterias, para preparar
inóculos, etc.
Los medios semisólidos contienen menos de 5% de agar y se utilizan para pruebas
bioquímicas (como Oxidación- Fermentación, movilidad, etc.)

Medio sólido caldo medio semisólido

MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU UTILIZACIÓN

a) MEDIOS PARA AISLAMIENTO
1) enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina,
u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (por ejemplo, Agar
Sangre)

38
2) selectivos: contienen sustancias químicas que inhiben algún tipo bacteriano y
permiten el crecimiento de otros facilitando así su aislamiento.
3) diferenciales contienen compuestos químicos que, tras la inoculación e incubación
producen un cambio característico en el aspecto del crecimiento bacteriano y/o en el
medio que los rodea lo cual permite su diferenciación.
b) MEDIOS PRIMARIOS: Son los que permiten obtener colonias aisladas.
c) MEDIOS DE IDENTIFICACIÓN. Sirven para el estudio del metabolismo
bacteriano. Contienen hidratos de carbono, peptona, urea, etc.
d) MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS O DE TRANSPORTE.
Son aquellos que mantienen la viabilidad del microorganismo, evitando su
desecación.

MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU COMPOSICIÓN

Los medios naturales existen como tales en la naturaleza, por ejemplo, agua, suero,
papa, huevos, leche, sangre, tierra o los cultivos celulares o animales de
experimentación
Los medios artificiales, pueden ser sintéticos o complejos. Los sintéticos de
composición conocida exactamente, los complejos no.

MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU PRESENTACIÓN

Los medios deshidratados se preparan en el laboratorio adicionando la cantidad de
agua correspondiente y luego se esterilizan en autoclave.
Los medios preparados se adquieren ya fraccionados, listos para usar.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Los materiales usados deben estar perfectamente limpios.
En general, la preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la
cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada, en dos etapas, siguiendo las
instrucciones del fabricante y luego esterilizarlo.

Agar-nutritivo:
Se prepara incorporando 15 gr/l de agar en polvo al caldo nutritivo, se esteriliza a 121°
C 20 minutos, se filtra, se toma el pH (pH 7,2 a 7,4), se fracciona en tubos y en placas
(6-7 ml para tubos en pico de flauta y 20 ml para placas)

Agar-sangre: Se funde el agar nutritivo estéril que contiene el tubo a baño maría y
luego se enfría a 45-50°C y se le incorpora el 5 al 10 % de sangre (humana, de carnero o
conejo desfibrinada, oxalatada o citratada) con todas las precauciones de asepsia. Se
mezcla haciendo rotar el tubo entre las manos y luego se vuelca su contenido en una
cápsula de Petri, uniformando bien por medio de un ligero
movimiento de rotación sobre la mesa de trabajo. En caso de
formarse burbujas de aire, éstas se pueden eliminar arrimando a las
mismas un ansa estéril y caliente. También se pueden fraccionar
tubos en “pico de flauta”.
El medio tiene un color rojo uniforme.

Utilización: Es un medio enriquecido y diferencial para el carácter

hemolítico. El agregado de 5 % de sangre de cordero favorece el
crecimiento de los Streptococcus y permite distinguir el tipo de hemólisis que se
presentan para su identificación.

39
Streptococcus pneumoniae es alfa hemolítico.
Staphylococcus aureus: Crece en este medio y es beta hemolítico.

Agar-chocolate:
Se prepara de la misma manera que el agar sangre pero luego de agregar la sangre, se
calienta a baño María hasta que adquiere color marrón (75ºC), se uniforma bien entre
las manos y se fraccionan en las placas o en los tubos en “pico de flauta”.

FRACCIONAMIENTO DE MEDIOS DE CULTIVO

Los medios sólidos estériles fundidos se fraccionan en placas de Petri o en tubos “pico
de flauta” (agar inclinado)
Los caldos estériles se fraccionan en tubos y sirven para pruebas bioquímicas, o para
realizar un inóculo.
Los medios semisólidos se fraccionan en tubos y se utilizan en ciertas pruebas
bioquímicas como, por ej. Pruebas de movilidad, de oxidación-fermentación.

ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados según las
condiciones que señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco
(entre 15-25 ºC), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben
almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.
Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o decoloren.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar
entre 2-8ºC, a menos que el medio requiera alguna condición diferente. Se deben
mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratación. Cuando se usa
tapón de algodón se debe colocar por encima una envoltura de papel

ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO

Una vez preparados, los medios de cultivo se esterilizan por calor húmedo (vapor
fluente o a presión) o por filtración.
Vapor fluente: para esterilizar medios de cultivo con leche y/o ciertos hidratos de
carbono que se descomponen a temperaturas superiores a 100° C. durante 30 minutos.
Vapor a presión: el más usado para esterilizar medios de cultivo. Presión: 1 atmósfera
(121ºC) Tiempo 20 minutos.
Filtración: para esterilizar por ej. caldo nutritivo glucosado.

PRINCIPALES MEDIOS UTILIZADOS EN BACTERIOLOGIA

* Medio Chapman o Agar Manitol Salado
Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de especies del género
Staphylococcus.
Es selectivo porque contiene cloruro sódico a concentración alta que impide el
crecimiento de otros gérmenes.
Es diferencial porque sólo Staphylococcus aureus fermenta el manitol, hecho que
se pone de manifiesto al virar el rojo fenol (indicador de pH) en medio ácido de
rojo a amarillo.
Lectura: luego de la incubación se observan colonias de Staphylococcus aureus grandes
y de color amarillo dorado por fermentación del manitol.

40
Las colonias de Stapphylococcus no aureus son pequeñas y no fermentan el manitol,
observándose de color rojizo o purpúreo.

* Medio de Thayer y Martin

Es un medio selectivo para el aislamiento de gonococos y meningococos.
Contiene agar hemoglobina, con la adición de 4 antibióticos: vancomicina, nistatina,
colistín.y trimetoprima sulfa
Lectura: los gonococos crecerán luego de la incubación dando pequeñas colonias
grises. Las colonias de los meningococos aparecerán entre las 16 y 24 horas de
incubación, siendo opacas blanquecinas a veces con aspecto mucoso.

* Medio Cled (CLDE)

Es un medio selectivo porque sólo permite el desarrollo de bacterias que producen
infecciones urinarias. Es diferencial porque distingue las colonias fermentadoras de
lactosa (amarillas) de las colonias Lactosa(-) que son grises.
Permite el desarrollo de bacilos GRAM negativos, estafilococos y enterococos y frena
las ondas expansivas de los Proteus.
Su nombre proviene de las siglas: Cistina. Lactosa, Deficiente en Electrolitos
S. aureus: cultivo positivo. Colonias amarillas Gram positivas. Lactosa +
E. coli: Cultivo positivo. Colonias amarillas Gram negativo Lactosa +
P. aeruginosa: Cultivo positivo. Colonias incoloras Gram negativo Lactosa –

* Medio de EMB
Es un medio SELECTIVO Y DIFERENCIAL. En su composición tiene los colorantes
eosina y Azul de metileno, que inhiben el crecimiento de las bacterias Gram positivos.
A su vez es DIFERENCIAL ya que los lactosa positivos dan colonias de color rojas o
rosas o verde metálico (al producir ácido a partir de la lactosa precipitan los colorantes
encima de la colonia) mientras que los lactosa negativos dan colonias grises.
S. aureus: cultivo negativo
E. coli: Cultivo positivo. Colonias verde metálico( sólo este microorganismo)
P. aeruginosa: Cultivo positivo. Colonias incoloras Lactosa

* Medio Mac Conckey

Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento e identificación de
enterobacterias. Se usa para el recuento de colonias coliformes en aguas, alimentos, etc.
Es selectivo porque contiene sales biliares y cristal violeta que inhiben a los
microorganismos Gram positivos.
Es diferencial porque distingue las colonias fermentadoras de lactosa de las que no la
fermentan.
Lectura: Las colonias de Escherichia coli son rojas o rosadas por fermentación de la
lactosa. Las colonias de Enterobacter aerogenes son rosadas y mucosas. Las colonias
de Salmonella, Shigella y Pseudomonas son incoloras porque no fermentadoras de
lactosa.

* Medio agar S-S

Es un medio diferencial y selectivo para el aislamiento de Salmonella y Shigella.
Lectura: luego de la incubación, las colonias que fermentan la lactosa como los
coliformes (enterobacterias lactosa positivo) son rojas o rosadas. Las colonias que no
fermentan la lactosa y no producen SH2 son incoloras (típico de Shigella). Las colonias

41
que producen SH2 producen un precipitado negro en sus colonias (típico de
Salmonella).

* Medio Sabouraud
Es un medio para el aislamiento e identificación de hongos (micelios y levaduras).
Lectura: luego de la incubación a 28ºC, se observan colonias muy diferentes según el
tipo de hongo: cremosas si son levaduras y mohosas sin son micelios

 Medio Mueller Hinton

Es un medio recomendado por la OMS para realizar pruebas de sensibilidad
antimicrobiana mediante el método de difusión en disco. La composición del medio
Mueller Hinton permite el crecimiento de las bacterias no exigentes.
Este medio muestra buena reproducibilidad, contiene bajo nivel de inhibidores de
sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina y es adecuado para el desarrollo de la mayoría
de las bacterias patógenas. (Enterobacterias, bacilos Gram-negativos no fermentadores,
estafilococos y enterococos).
El agar Mueller Hinton suplementado con 5% sangre de cordero, permite el crecimiento
de bacterias como neumococo y otros estreptococos, garantizando unas mínimas
interferencias entre los componentes del medio y el resultado de la prueba.

AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE BACTERIAS AEROBIAS

Es esencial en Bacteriología la obtención de cultivos puros para realizar la
identificación bacteriana. Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de
microorganismo. Para poder obtenerlo es necesario recurrir a las técnicas conocidas
como aislamiento.

SIEMBRA O INOCULACIÓN
Es el paso de una porción representativa de la muestra problema a un medio de cultivo,
ya sea líquido o sólido
Es colocar la bacteria presente en la muestra en un medio de cultivo para su desarrollo
“in vitro”.
Para ello, se toma una pequeña porción de cultivo o muestra denominada inóculo y se
transfiere al medio con precauciones especiales de asepsia para evitar la contaminación
con otros microorganismos ajenos al inóculo.
La siembra debe realizarse en una cabina de bioseguridad o cerca del mechero Bunsen

OBJETIVOS DE LA SIEMBRA:
 Aislar distintas cepas de una muestra.
 Realizar repiques o resiembras.
 Conservar cepas renovando sus nutrientes.
 Incrementar la cantidad de microorganismos de la muestra.
 Obtener un cultivo puro para perpetuar la especie, para identificar la especie
bacteriana según sus propiedades culturales o bioquímicas
.
RESIEMBRA O REPIQUE
Es el paso del inóculo obtenido de una colonia aislada en un medio de cultivo a otro.

42
Procedimiento general:
− Cerrar bien puertas y ventanas, sin brusquedad y sin hablar.
− Colocar cerca del mechero la gradilla con el tubo que contiene el inóculo, las placas o
los tubos donde se va a sembrar, el ansa y todo el material necesario.
− Trabajar a una distancia no mayor de 15 cm. de la llama de un mechero (área
aséptica)
_Luego de esterilizar el ansa, se enfría cerca del mechero antes de tomar el inóculo.

Técnicas de siembra en medio sólido.

Siembra por agotamiento

En estría:
 Se toma inóculo con el ansa estéril y se deposita en uno de los extremos
superiores de la placa.
 A partir de aquí realizar movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa
SIN tomar nuevo inóculo y SIN levantar el ansa hasta concluir la siembra de toda
la placa.

En estría múltiple
 Se toma inóculo con el ansa estéril y se deposita en uno de los extremos
superiores de la placa.
 Extender de un extremo a otro de ésta, sólo en la parte superior.
 Flamear el ansa y girar la placa repitiendo el proceso anterior desde la
última porción de la estría anterior.
 Flamear el ansa sin tomar muestra y seguir repitiendo la operación hasta
un total de 4 ó 5 veces, teniendo en cuenta que el último tramo se efectuará hacia el
interior de la placa.

43
Técnica de los cuatro cuadrantes
Dividir la placa con un rotulador en 4 cuadrantes iguales.
Tomar inóculo con el ansa estéril y depositarlo en el extremo superior de uno de los
cuadrantes realizando movimientos en zig-zag como muestra la figura.
Repetir la misma operación sin flamear en los demás cuadrantes en sentido horario.

Siembra en Agar Inclinado (“pico de flauta”):

1. Esterilizar el ansa y enfriarla cerca del mechero.
2. Sostener con la mano izquierda el tubo con inóculo.
3. Retirar el tapón del tubo con el dedo meñique de la mano derecha y mantenerla
ahí (no colocar sobre la mesada, para evitar contaminación)
4. Flamear la boca del tubo.
5. Introducir el ansa estéril y tomar inóculo. Cuando destape el tubo, mantenerlo
inclinado para evitar el ingreso de los microorganismos ambientales.
6. Flamear nuevamente la boca del tubo y colocar el tapón.

44
 7. Realizar estrías sobre la superficie del “pico de flauta” para siembra en
superficie.

7. Realizar con el ansa de punta recta una siembra en profundidad y al sacar el ansa
realizar estrías en la superficie del “pico de flauta”
Se utiliza para la prueba de fermentación de hidratos de Carbono (KIA, TSI)

Siembra en Agar semisólido:

Seguir los pasos del 1 al 6
7. Con el ansa recta inocular en línea recta por el centro y hasta la mitad del agar.
Se utiliza para realizar la prueba de la movilidad, de oxidación fermentación de Hugh-
Leiffson.

Siembra en Caldo:
Seguir los pasos anteriores del 1 a 6
7. Tomar el tubo que contiene el caldo con la mano izquierda, y con el meñique de
la derecha retirar el tapón, flamear la boca del tubo.
8. Introducir el ansa en el caldo y dar movimientos de rotación.
9. Retirar el ansa, flamear y tapar el tubo.
10. Esterilizar el ansa.

45
CULTIVO Y MANTENIMIENTO DE CEPAS
Luego de la siembra del inóculo se debe mantener el cultivo en condiciones adecuadas
(temperatura, esterilidad, cantidad suficiente de Oxigeno y Dióxido de Carbono):
Para ello:
 Evitar la apertura de los medios de cultivo, sobre todo, en el período de
incubación. Se abrirán sólo cuando sea estrictamente necesario.
 Controlar la temperatura de las estufas de cultivo, ya que cualquier variación de
éstas impedirá el crecimiento de la siembra.
 Verificar las condiciones adecuadas de oxígeno y/o dióxido de carbono, según
los casos.
 Rotular adecuadamente los medios, el día y hora en que se efectuó la siembra
para evitar errores y garantizar un análisis fiable.
 Para el mantenimiento de cepas una vez desarrollado se coloca en heladera a
4°C y se repican cada 15 días.
 También se pueden conservar cepas en tubos con medios sólidos sembrados por
picadura y cerrados en forma hermética para evitar su desecación.
 Los cultivos se mantienen a temperatura ambiente o en refrigeración (4ºC) y en
esas condiciones las muestras pueden sobrevivir más de un año sin que sea
necesario repicar el cultivo.

INTERPRETACIÓN DE LOS CULTIVOS PRIMARIOS

Luego de la incubación, la bacteria forma poblaciones visibles llamadas colonias sobre
el medio de cultivo.
Realizar una coloración de Gram de las colonias sospechosas.
Examinar las características macroscópicas de cada tipo de colonia inclinando las placas
en varias direcciones, bajo luz directa brillante, usando lupa o microscopio de disección
para detectar colonias pequeñas.
Observar si hay cambios en el medio que rodea a las colonias y que reflejan la actividad
metabólica específica de las bacterias recuperadas.
Las placas de agar sangre se examinan con luz brillante por detrás para detectar las
reacciones de hemólisis.
Algunos olores producidos por la acción de ciertas bacterias en los medios de cultivos
sólidos y líquidos ayudan a su identificación tentativa.

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LAS COLONIAS EN MEDIOS

SÓLIDOS

46
Hemólisis en agar sangre
Alfa: clarificación parcial de la sangre alrededor de las colonias con un cambio de color
al verde del medio; contorno de los eritrocitos intactos.
Beta: zona de clarificación completa de la sangre alrededor de las colonias debido a la
lisis total de los eritrocitos
Gamma: sin lisis o cambio de color de los eritrocitos.
Producción de pigmentos en medio sólido
Pigmentos solubles en agua que producen un cambio de color en el medio: Piocianina,
pigmentos fluorescentes y pigmentos confinados a las colonias que no difunden en el
medio.

Tipos de hemólisis Pigmentos

TRABAJO PRÁCTICO Nº 5: IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

CONTENIDOS:
Reacciones bioquímicas de uso más frecuentes en un laboratorio de bacteriología para la
identificación de especies del Género Staphylococcus y Enterobacterias.
Este Trabajo Práctico se complementa con las clases teóricas, por lo que el alumno debe
asistir al mismo con los conocimientos previos adquiridos en las mismas.

OBJETIVOS:
- Conocer las características de los cocos Grampositivos y de los bacilos gramnegativos
y su clasificación para comprender los mecanismos de acción que provoca efectos
patológicos en el hombre.
- Adiestrarse en la aplicación de técnicas de identificación de los mismos.
- Aplicar normas de bioseguridad para evitar su diseminación fuera del laboratorio y la
contaminación del lugar de trabajo como así también evitar accidentes en el laboratorio.

ACTIVIDADES A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

Los alumnos realizarán la observación microscópica de distintas muestras que presentan
cocos Grampositivos y bacilos gramnegativos.

47
Observarán las características de las colonias desarrolladas en los medios de cultivo
sólidos.
Realizarán la inoculación, incubación, lectura y revelado de las distintas reacciones
bioquímicas para la identificación de Staphylococcus aureus y de enterobacterias
debiendo conocer los fundamentos de cada técnica realizada.

PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS:

 Catalasa.
 Coagulasa.
 Fermentación del manitol.
 DNAsa.

 Prueba de la catalasa:
La catalasa es una enzima que se encuentra en la mayoría de los microorganismos
aerobios y anaerobios facultativos que contienen citocromo.
La catalasa cataliza la siguiente reacción;

2 H2O2 2 H2O+O2 (gas)

El peróxido de hidrógeno es un producto final de la degradación aeróbica oxidativa de
los hidratos de carbono.
La catalasa actúa sobre el peróxido de hidrógeno descomponiéndolo en agua y oxígeno
(gas). Si se acumulase peróxido de hidrógeno en los microorganismos les provocaría la
muerte, por ello es fundamental la presencia de esta enzima.
Prueba en portaobjeto:
 En un portaobjeto se coloca una gota de suspensión del microorganismo
en solución fisiológica.
 Encima de la gota, añadir una gota de peróxido de hidrógeno al 3 %.
 Esta prueba también puede realizarse vertiendo una gota de peróxido de
hidrógeno sobre una colonia aislada en una placa de agar.
 Resultados:
CATALASA (+): formación de burbujas de oxígeno inmediatamente.
Micrococcus
Staphylococcus

CATALASA (-): no aparecen burbujas.

Streptococcus

Método del tubo de hemólisis o Khan:

A una suspensión del M.O. realizada en un tubo de Khan se agrega 1-2 gotas de
H2O2 al 3%.
Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).

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Precauciones:
Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la
precaución de no tocar al agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del
medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.

 Prueba de la coagulasa:
Esta enzima producida por Staphylococcus aureus es capaz de coagular el plasma y
mediante esta prueba se diferencian S aureus de otras especies
Técnica:
Se pueden emplear dos métodos: sobre portaobjeto y en tubos; aunque la prueba
en portaobjeto no es recomendable. Consiste en emulsionar con plasma humano
sobre un portaobjeto, una gota de suspensión bacteriana en caldo tripto soya. Si
entre los 5 y 15 segundos se observa espesamiento o coagulación macroscópica, es
prueba positiva.
La prueba en tubo consiste en colocar en un tubo de hemólisis estéril, 0,5 ml a 1
ml de suspensión del microorganismo en caldo tripto-soya.
 Mezclar con igual volumen de plasma humano.
Incubar a 37ºC y observar a intervalos regulares si hay formación de un ligero
coagulo, espesamiento del líquido o solidificación total; cualquiera de estos
resultados se consideran PRUEBA POSITIVA.
Todas las pruebas negativas se dejan en estufa de cultivo 24 horas y luego se
observan nuevamente.( puede haber reabsorción del coagulo)
 Resultados: COAGULASA (+): Staphylococcus aureus
COAGULASA (-): otras especies de Staphylococcus.

Para diferenciar Staphylococcus epidermidis de Staphylococcus saprophyticus se

realiza la prueba de la Novobiocina: S. epidermidis: Sensible.
S. saprophyticus: Resistente o parcial R.

 Prueba de fermentación del manitol:

Se utiliza el medio de Chapman o Agar Manitol Salado, que contiene manitol y cloruro
de sodio a una concentración del 7,5 %, fraccionado en tubos de hemólisis en pico de
flauta y sembrados por puntura.

49
Luego de la inoculación de los tubos, se incuban a 37ºC durante 24 horas.
Resultados:
 Staphylococcus aureus: desarrollo de abundantes colonias amarillas,
viraje a color amarillo del medio.
 Otras especies de Staphylococcus dan colonias blancas que contrastan
con el color rojo del medio.

 Prueba de la DNAsa:
Los Staphylococcus aureus poseen esta enzima (nucleasa) que actúa sobre los sustratos
que contengan DNA, produciendo la despolimerización de sus moléculas. Esto se revela
con ácido clorhídrico 1 N en unos minutos.
Técnica:
1. Se realiza una suspensión en solución fisiológica estéril.
2.Sembrar, a partir de un cultivo joven y puro, una línea por c/ cepa a investigar en
una placa de Petri chica
3. Incubar a 37ºC durante 24 horas.
4. Añadir con cuidado una solución de ClH 1 N. sobre el cultivo
5. Dejar en reposo 3-5 minutos.
Resultados: Positivo; se observa un halo claro alrededor del crecimiento bacteriano,
quedando opaco o lechoso el resto de la placa. Negativo: no se ve zona clara, toda la
placa está opaca

MICROCOCO TEST
FROTIS COLOREADO CON GRAM: COCOS GRAMPOSITIVOS.
CATALASA

(+) (-)
Familia Micrococcaceae: Familia Streptococcaceae
 Micrococos
 Estafilococos
 Planococos
KLIGLER (KIA)

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Desarrollo y cambio a color amarillo en todo desarrollo solo en superficie
el medio: con o sin cambio de color:
Micrococcus roseus: rojo.
Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus: rojo
epidermidis o saprophyticus Micrococcus varians amarillo

Staphylococcus aureus

COAGULASA FERMENTACION DEL MANITOL DNAsa

(-) (+) colonias amarillas (+)

S. epidermidis
S. saprophyticus (-) colonias blancas (-)

NOVOBIOCINA

RESISTENTE SENSIBLE

S. saprophyticus S, epidermidis

REACCIONES BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE

ENTEROBACTERIAS

IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS
Se prepara una suspensión en agua peptonada con la enterobacteria a identificar.
Se inocula la siguiente batería bioquímica y se incuba 24 horas a 37°C.
Se reserva el resto de la suspensión en caso de requerir pruebas adicionales.

PRUEBAS BIOQUIMICAS:
 TSI Fermentación de hidratos de carbono -Producción de SH2 y gas
 Ureasa
 Utilización de Citrato
 SIM Producción de Indol –Movilidad
 Desaminasas: fenilalanina
 Decarboxilasas

PRUEBAS ADICIONALES:
 Voges-Proskauer
 Rojo de metilo.
 ONPG( se realiza si la lactosa dio negativa)

Fermentación de hidratos de carbono:

Fermentación es la utilización de carbohidratos en forma anaerobia.
Se puede utilizar el medio TSI (three Sugar Iron) o el medio Kligler (agar-hierro o KIA)
que solo se diferencian en que el TSI tiene un tercer hidrato de carbono que es la
sacarosa, mientras que el agar hierro de Kligler contiene solo glucosa y lactosa.

51
Estos medios permiten realizar 3 pruebas a la vez:
1. Utilización de azúcares: glucosa, lactosa (TSI).
2. Producción de gas.
3. Producción de ácido sulfhídrico.
Cuando la bacteria fermenta los azúcares, el medio se acidifica por la formación de
ácidos orgánicos. Esto hace virar el indicador de pH (rojo fenol) del medio al amarillo.
El medio TSI (o Kligler) se fracciona en tubos en pico de flauta y se siembra en
profundidad y en superficie. Luego se incuban a 37ºC durante 24 horas y se observan:
 Si hay cambio a color amarillo en la zona profunda del tubo, significa que ha
fermentado la glucosa, ya que este azúcar solo fermenta en anaerobiosis.
 Todas las enterobacterias atacan la glucosa, es decir que si la bacteria en estudio no
fermentó este azúcar, NO ES UNA ENTEROBACTERIA.
 Si hay cambio o color amarillo de la superficie del pico de flauta, significa que ha
fermentado la lactosa, ya que este azúcar solo se fermenta en aerobiosis.
 Para verificar la producción de gas se observa si aparecen burbujas, agrietamiento o
desplazamiento del medio del fondo del tubo, debido a la formación de hidrógeno y
de anhídrido carbónico.
 La producción de ácido sulfhídrico se manifiesta por el ennegrecimiento de la capa
profunda del medio, o bien por un anillo negro cerca de la parte superior de la capa
profunda.

 Producción de ureasa:
Esta prueba se realiza para detectar la presencia de la enzima ureasa en la
enterobacteria.
Dicha enzima, desdobla la urea en dióxido de carbono, amoníaco y agua, formando
carbonato amónico, alcalinizando el medio.
Se utiliza el medio urea de Christensen fraccionado en tubos en pico de flauta,
sembrados por estrías en superficie e incubado 24 horas a 37ºC.
Resultados:
Ureasa positiva: viraje del indicador rojo fenol a color rosado rojizo por
alcalinización del medio.
Ureasa negativa: el medio no cambia de color, continuando amarillo
pálido.

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  Utilización del citrato:
Se utiliza el medio Citrato de Simmons que contiene citrato de sodio como fuente de
carbono y fosfato de amonio como fuente de nitrógeno; con azul de bromo timol como
indicador de pH.
Esta prueba se realiza para investigar si la bacteria en estudio es capaz de utilizar el
citrato del medio como única fuente de carbono.
Al tomar el citrato del medio, se forma amoníaco, lo que produce la alcalinización del
medio. Esto se manifiesta por el viraje del indicador a color azul (originariamente es de
color verde).
Técnica:
1. Sembrar el medio de citrato de Simmons fraccionado en un tubo “pico de flauta”,
realizando estrías en su superficie.
2. Incubar 48-72 horas a 37ºC.
3. Resultados:
Citrato positivo: color azul intenso en todo el medio y crecimiento.
Citrato negativo: el medio continúa de color verde y no hay crecimiento

 Prueba de Indol:
El Indol es el resultado del ataque bacteriano a las proteínas, es un catabolito del
triptófano.
Luego de la siembra e incubación, se evidencia la presencia de Indol con el reactivo de
Ehrlich o el de Kovacs.

Técnica:
1. Se utiliza un tubo vertical con medio SIM que contiene triptófano, pero no debe
contener glucosa porque su fermentación eleva la acidez del medio e inhibe la
acción de la triptofanasa.
2. Inocular la cepa con ansa puntiforme por punción profunda hasta 1,5 cm.

53
 3. Incubar a 37ºC durante 24 horas.
4. Añadir 1 ml de éter etílico, agitar bien y dejar en reposo para que el éter suba a
la superficie del medio.
5. Agregar por las paredes del tubo, 5 gotas de reactivo de Ehrlich.
6. También puede usarse el reactivo de Kovacs, que no necesita el agregado previo
de éter.
7. Resultados: Indol positivo: anillo de color rojo cereza en la intersección de
los dos líquidos.
Indol negativo: el medio toma el color del reactivo añadido.

 Prueba de movilidad:
Se utiliza un tubo vertical con medio semisólido SIM, que permite investigar movilidad
y producción de Indol en el mismo tubo.
Técnica:
1. Inocular la cepa con ansa puntiforme por punción profunda hasta 1,5 cm. Es
importante que la siembra se realice en línea recta.
2. Incubar a 37ºC durante 24 horas.
3. Resultados:
Movilidad positiva: turbidez que parte de la zona inoculada y
trata de invadir todo el medio.
Movilidad negativa: solo se ve desarrollo a lo largo de la punción.

 Prueba de fenilalanina desaminasa:

Se basa en la capacidad que tienen algunas bacterias de desaminar la fenilalanina,
produciendo ácido fenil pirúvico.
Para ello, deben tener la enzima fenilalanina desaminasa.
El Genero Proteus da positiva esta prueba.
Técnica:
1. Sembrar con ansa puntiforme por estría la superficie del pico de flauta del medio e
incubar a 37ºC durante 24 horas.
2. Agregar 4-5 gotas del reactivo (solución ácida de cloruro férrico al 10 %) sobre la
superficie sembrada.
3. Resultados:
P. positiva: Coloración verdosa por formación de ácido fenil pirúvico.
P. negativa: No se produce cambio de color.

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  Descarboxilación de aminoácidos:
Las descarboxilasas son enzimas que actúan sobre el grupo carboxilo de los
aminoácidos (lisina, ornitina, arginina) para formar aminas con desprendimiento de
dióxido de carbono. Este proceso se realiza en anaerobiosis y permite detectar las
bacterias que poseen estas enzimas mediante la alcalinización del medio.
Se utiliza para esta prueba el caldo de Moeller que contiene glucosa.
Técnica:
1. Se preparan 4 tubos con caldo de Moeller para cada bacteria en estudio:
Tubo 1: control (solo con caldo, de color rojo púrpura)
Tubo 2: con L-lisina al 1 %
Tubo 3: con L-ornitina al 1 %.
Tubo 4: con L-arginina al 1 %.
2. Inocular los 4 tubos con el germen en estudio proveniente de un cultivo joven y
puro.
3. Sellar con 2-3 ml de vaselina estéril para producir anaerobiosis.
4. Incubar a 37ºC durante 24 horas.
5. Resultados:
Tubo control Tubo con aminoácido
Prueba (+) Amarillo rojo púrpura
Prueba (-) Amarillo Amarillo

 Prueba de Voges Proskauer (VP):

Se basa en la capacidad de un microorganismo de producir, en presencia de oxígeno
atmosférico y álcali, un compuesto llamado diacetilo que generará un compuesto
coloreado al añadirle los reactivos apropiados.
Glucosa ácido pirúvico acetoína 2,3 butanodiol
(acetil metil (si se reduce)
carbinol) diacetilo
(si se oxida)

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Por reducción, la acetoína forma 2,3 butanodiol y por oxidación, diacetilo.
Técnica:
1. Sembrar en agua peptonada el germen en estudio e incubar 24 horas a 37ºC.
2. Transferir 1-2 ml del caldo sembrado a un tubo de hemólisis y agregar:
 0,5 ml de solución de alfa naftol y
 0,5 ml de solución de hidróxido de potasio (KOH) al 40 %, respetando el
orden.
3. Agitar e inclinar el tubo casi horizontalmente para favorecer la oxidación de la
acetoína.
4. Reposar 10-15 minutos y observar.
5. Resultados:
V. Proskauer positivo: antes de una hora aparece en la superficie del medio color rojo.
V. Proskauer negativa: superficie del medio color amarilla.

 Prueba de rojo de metilo (RM):

Se utiliza para identificar bacterias que producen ácidos fuertes a partir de la glucosa.
Técnica:
1. Se inocula agua peptonada con la bacteria en estudio y se incuba 48 a 72 horas.
2. Añadir a este cultivo unas gotas de indicador rojo de metilo.
3. Resultado:
Prueba positiva: Superficie del medio de color rojo intenso debido al viraje del
indicador por descenso del pH a menos de 4,4 por la producción de ácidos estables.
Prueba negativa: Color amarillo en la superficie del medio.

 O.N.P.G:
Investiga la capacidad de los microorganismos para fermentar la lactosa.
Para ello, dichas bacterias deben poseer 2 enzimas específicas: lactosa permeasa, que
permite la penetración de la lactosa a la bacteria; y la beta-galactosidasa, que desdobla
la lactosa en glucosa y galactosa.
Para detectar la presencia de esta enzima en el microorganismo en estudio, se remplaza
la glucosa por el reactivo O.N.P.G. (orto-nitrofenil-D-Galactopiranósido) que es
incoloro pero por acción de la enzima Beta-galactosidasa, se hidroliza en galactosa y
orto-nitrofenil (de color amarillo).
Técnica:
 Realizar una suspensión del microorganismo en Solución Fisiológica. (0.5ml)
 Agregar un disco del reactivo.

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 Incubar 60 minutos.
 Agregar una gota del revelador.
Resultados: ONPG positivo: amarillo (en la mayoría de los microorganismos en 1 hora)
ONPG. negativo: incoloro.

TRABAJO PRÁCTICO Nº6: ANTIBIOGRAMA

CONTENIDOS:
Antibióticos. Clasificación de los antibióticos según su acción sobre la bacteria.
Elección del agente antimicrobiano. Estandarización de un inóculo. Clasificación de los
antibiogramas

OBJETIVOS:
- Conocer el modo de acción de los antibióticos y adiestrarse en la realización de
antibiogramas.
- Determinar la concentración inhibitoria mínima necesaria para inhibir el
microorganismo.
- Comprender la importancia de la realización del antibiograma para la terapéutica que
implementará el médico.

ACTIVIDADES A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

Los alumnos realizarán antibiogramas por la técnica de difusión en medio sólido y el
informe de las lecturas de antibiogramas utilizando la tabla.

ANTIBIÓTICOS
Sustancias químicamente definidas que inhiben o destruyen bacterias ya que actúan
sobre una etapa de su metabolismo (biosíntesis de la pared, membrana plasmática,
síntesis proteica, ácidos nucleicos)

MODO DE ACCIÓN DE LOS ANTIBIÓTICOS

Los que interfieren sobre la biosíntesis de la pared bacteriana son: Penicilinas,
cefalosporinas y derivados betalactámicos.
Sobre los ácidos nucleicos actúan los aminoglicósidos.
Sobre la síntesis proteica: lincosamidas, cloranfenicol, macrólidos y similares
tetraciclinas.
Sobre el metabolismo: quimioterápicos.

57
ANTIBIOGRAMAS
Investigan la acción de distintos agentes antibióticos frente a un microorganismo en
estudio.
Se realiza antes del tratamiento de una enfermedad microbiana con el fin de implantar la
terapia más efectiva.

FUNDAMENTO:
Se somete un determinado número de microorganismos procedentes de un inóculo a la
acción de distintos antimicrobianos. Luego de la incubación, se observa si se produce o
no el crecimiento del germen alrededor del disco.

CLASIFICACION DE LOS ANTIBIOGRAMAS:

por difusión en medio sólido
Antibiograma
por dilución en medio líquido

Los antibiogramas se realizan en aerobiosis o en anaerobiosis, según en microorganismo

en estudio.
El medio recomendado por la OMS para antibiogramas aerobios es el Mueller-Hinton
en caldo o en agar según la técnica utilizada.
Streptococcus pneumoniae requiere de medio Mueller Hinton con el agregado de 5 %
de sangre. Para realizar antibiograma a Haemophilus influenzae se requiere del medio
HTM (Haemophilus Test Medium)
La atmósfera de incubación para anaerobios debe estar compuesta por: 5 % de CO 2, 10
% de Hidrógeno y 85 % de Nitrógeno.
Incubar utilizando campanas de anaerobiosis, sistema Gas-Pack u otro durante 24-72
horas a 35ºC.

Selección del antimicrobiano

Se elige según sean bacterias Grampositivas, Gramnegativas, según el sitio de la
infección (infecciones urinarias) o según la muestra obtenida (coprocultivo, urocultivo)

Conservación:
Los discos de antibióticos se conservan la heladera a 4°C, evitando la humedad.
Antes de su uso, verificar la fecha de vencimiento.

Preparación del patrón de turbidez:

Se prepara con 0,5 ml de solución de cloruro de bario 0,048 M y 99,5 ml de solución de
ácido sulfúrico 0,18 M. La reacción de ambas soluciones forma un precipitado blanco
de sulfato de bario.
Distribuir en tubos sellados 4 a 6 ml del patrón, manteniéndolos a temperatura ambiente
y al abrigo de la luz.
La turbidez aceptada corresponde a 0,5 de la escala de Mc Farland (1,5 X 108 UFC/ml)

Preparación del inóculo:

Para obtener un inóculo, se suspende directamente en 5 ml de caldo Mueller-Hinton 4 o
5 colonias procedentes de un cultivo joven y puro, homogeneizar y ajustar la turbidez
con la del patrón.

58
ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN EN MEDIO SÓLIDO
Permite medir la actividad inhibitoria en forma cualitativa (Indica bacteriostasis)
Se realiza para bacterias aeróbicas de crecimiento rápido y poco exigentes.
Se utiliza el medio de cultivo Mueller Hinton fraccionado en placas de Petri con un
espesor de 4mm.

PROCEDIMIENTO GENERAL A SEGUIR:

1.- Preparar el inóculo.
2.- Sembrarlo dentro de los 15 minutos de estandarizado el mismo.
Para ello, impregnar con inóculo un hisopo estéril, cubrir la superficie del agar Mueller
Hinton en tres direcciones y, por último, por la periferia del agar para conseguir una
siembra uniforme.
3.- Dejar 3 a 5 minutos al pie del mechero antes de depositar los discos de antibióticos.
4.- Colocar los discos de antibióticos seleccionados con los dispensadores automáticos o
manualmente en forma aséptica utilizando una pinza flameada. Presionar el disco de
antibiótico ligeramente sobre la superficie del medio. Recordar que no deben colocarse
más de 6 monodiscos por placa de 100 mm.
5.- Dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
6.- Incubar a 35-37ºC de 18 a 24 horas colocando la placa invertida en la estufa de
cultivo con el ambiente apropiado para la bacteria que se desea desarrollar (con o sin
CO2 ) Importante! No apilar más de 3 placas en la estufa de cultivo.
7.- Realizar la lectura de las placas observando la presencia de halos de inhibición de
desarrollo bacteriano.
Nota: En los medios suplementados, con sangre, se mide el diámetro de inhibición de
crecimiento no el de la zona de hemólisis.
Para medir los halos se utiliza una regla graduada en mm y se observa sobre un fondo
negro y con luz reflejada.
La lectura se hace por la parte posterior de la placa (base del agar)
Si los medios contienen sangre se leen por la parte superior.
8.- Comparar con la tabla e informar los resultados obtenidos: SENSIBLE,
INTERMEDIO O RESISTENTE.
Los resultados se darán en siglas: (S) SENSIBLE, (I) INTERMEDIO O (R)
RESISTENTE.
 S: cuando la infección causada por el microorganismo responde al tratamiento con
el antimicrobiano a las dosis terapéuticas recomendadas.
 I: cuando el germen presenta sensibilidad disminuida a un antibiótico que puede ser
utilizado con éxito para el tratamiento de la infección en dosis más altas, por ser
poco tóxico o porque se concentra en el foco de infección. Por ejemplo los
antibióticos betalactámicos o quinolonas en la orina.
 R: cuando el tratamiento con esos antimicrobianos no es efectivo cualquiera sea la
dosis y la localización de la infección.

59
ANTIBIOGRAMA POR DILUCIÓN EN MEDIO LÍQUIDO:
Fundamento:
Permite medir la actividad inhibitoria en forma cuantitativa.
Determina la CIM, es decir la Concentración Inhibitoria Mínima, la concentración de
antibiótico que el médico debe lograr en el sitio de infección.
En otras palabras, la CIM es la mínima concentración de antibiótico que puede producir
bacteriostasis de la bacteria que causa la infección.
Se realiza cuando se prueban nuevos antibióticos, en infecciones severas o falla del
tratamiento, por falta de una metodología más sencilla.

POR DILUCIÓN EN MEDIO LÍQUIDO

La adaptación a microplatos con pocillos utilizando distintas concentraciones de
antibióticos permite testar un gran número de antibióticos de forma sencilla, rápida y
económica.

Se coloca en cada pocillo medio de crecimiento con una concentración de antibiótico

decreciente a la mitad. Se valora la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)
visualmente.

Dilución en tubos:
Para ello se requieren de diluciones seriadas al doble del agente antimicrobiano en
estudio.
El medio utilizado es caldo Mueller Hinton o caldo tripticasa soya.
Se siembra la suspensión bacteriana en el caldo, se incuba 24 horas y se puede
determinar la CIM
Técnica:
1. Se colocan diez tubos estériles y con tapa a rosca en una gradilla al pie del mechero.
2. Agregar a cada tubo 1 ml de inóculo (suspensión bacteriana, obtenida de un cultivo
puro, en caldo Mueller-Hinton).
3. Al primer y al segundo tubo agregar 1 ml de antibiótico en la mayor concentración
de la gama utilizada
4. Homogeneizar el tubo 2 y extraer 1 ml. Comenzar a hacer diluciones seriadas al
doble hasta el tubo 9 (el ml que se extrae del tubo 9 se descarta).

60
5. El tubo 10, por lo tanto, no contiene antibiótico.
6. Incubar los 10 tubos en estufa a 37ºC durante 18-24 hs.
7. Interpretación de los resultados:
 Tubo 1: límpido (TESTIGO DEL ANTIBIÓTICO)
 Tubo 10: turbio (TESTIGO BACTERIANO)
 Determinar la CIM observando el resto de los tubos (corresponde al tubo anterior al
primer tubo que dió turbidez).
 Ej. El tubo 2 tiene una concentración de 128 mg/ml, los siguientes tendrán 64, 32,
16, 8, 4, 2, etc.; si dió turbidez a partir del tubo 7, la CIM está en el tubo 6 y será de
8 mg/ml.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Testigo Testigo
ATB bacteriano

TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: REACCIONES SEROLOGICAS

CONTENIDOS:
Reacciones serológicas para el diagnóstico presuntivo de sífilis. Reacción de
Huddleson para el diagnóstico serológico de brucelosis.
Los contenidos teóricos serán desarrollados por el Jefe de Cátedra TL Hugo Moretto
antes de la realización del Trabajo Práctico y deben ser estudiados.

OBJETIVOS:
- Comprender los mecanismos de defensa del organismo para apreciar la importancia de
la prevención.
- Aplicar las normas de bioseguridad correspondientes.
- Conocer las reacciones inmunológicas para adiestrarse en su realización.

ACTIVIDADES A REALIZAR POR LOS ALUMNOS:

Los alumnos realizarán distintas reacciones serológicas de aglutinación, diluciones
seriadas para las técnicas cuantitativas y lectura de resultados.
En todo momento se aplicarán las normas de bioseguridad correspondientes.

REACCIONES SEROLÓGICAS
Se realizan con el fin de determinar si la sangre del paciente contiene anticuerpos
contra diversas enfermedades infecciosas.

61
MUESTRAS:
En general, se utiliza suero, no descartando las muestras hemolizadas o lipémicas, en
casa de ser reactivo se solicita nueva muestra.
El suero se obtiene extrayendo 10 ml de sangre venosa.
Dicha sangre se coloca en un tubo de centrífuga y se tapa. Se deja que la sangre coagule
a temperatura ambiente.
Luego de 30 minutos a dos horas, se centrífuga a alta velocidad durante 10 minutos.
Luego de la centrifugación, se aspira el suero sobrenadante con una pipeta automática y
tips.
El suero se coloca en un tubo, pudiendo conservarlo en la heladera a 2º C durante 48
horas y en el congelador a –2º C o temperaturas inferiores por lo menos durante un mes.

REACCIÓN SEROLÓGICA PARA EL DIAGNÓSTICO PRESUNTIVO DE

SÍFILIS: V.D.R.L.
La reacción V.D.R.L. (Venereal Disease Research Laboratory) es de alta sensibilidad y
especificidad dentro de las reacciones serológicas no treponémicas que se usan para el
diagnóstico de sífilis, mediante una reacción de FLOCULACIÓN (disoluciones
coloidales precipitadas en forma de copos: microaglutinación).
No se utiliza como antígeno Treponema pallidum (por eso es una reacción no
treponémica) sino una suspensión alcohólica de cardiolipina, colesterol y lecitina.
Cuando los sueros son reactivos se deben cuantificar.

Muestras: suero fresco sin inactivar o plasma, L.C.R.

Reacción cualitativa:
Se realiza en placas de vidrio para serología:
0,025 ml 0,025 ml 0,025 ml
Suero problema suero control (+) suero control (-)
Suspensión 1 gota 1 gota 1 gota
antigénica
Se rota a 180 r.p.m. durante 4 minutos en rotador mecánico y se observan los círculos
de reacción en el microscopio óptico con objetivo a seco de 10 X

Resultados: reactivo (*), débil reactivo (*) o no reactivo.

(*) cuantificar.

REACTIVO: FLOCULACION
Antígenos en forma de agujas y cristales se aglutinan en forma de grumos regulares sin
partículas libres sobre un fondo claro.
NO REACTIVO: suspensión homogénea con partículas libres.
Reacción cuantitativa:
En caso de dar reactivo, se debe titular o cuantificar realizando diluciones seriadas de la
muestra en solución fisiológica (1:2; 1:4; 1:8, 1: 16 y 1:32).
TITULO: corresponde a la última dilución que haya dado REACTIVA.
Se informa la inversa de la última dilución que muestra floculación franca. (Ej: si 1:8 es
la última dilución que dió reactiva, el título es: 8 Dils)
La reacción VDRL da reactiva en los casos de sífilis a las 3 semanas de aparecido el
chancro primario; es decir, a las 6 semanas de haber sido infectado con Treponema
pallidum.

62
Puede haber reacciones positivas falsas cuando el paciente presenta otras enfermedades
como lepra, mononucleosis infecciosa, hepatitis infecciosa, neumonía, lupus
eritematoso, periartritis nodosa, etc.

REACCIÓN DE HUDDLESON PARA EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE

BRUCELOSIS:
La brucelosis es una enfermedad producida por microorganismos del Género Brucella.
Cuando un microorganismo invade al huésped éste reacciona produciendo anticuerpos
(aglutininas). Estos anticuerpos presentes reaccionan con la suspensión antigénica de
Brucella abortus, produciendo aglutinación macroscópica.
Títulos significativos de 1:160 o mayores es una evidencia presuntiva de brucelosis.
Títulos de 1:80 o más se hacen diluciones seriadas obteniendo una curva de
aglutinación.
Enfermos en fase aguda: títulos de 1:320 o mayores.
Reacciones cruzadas: cólera, influenza.
Reacción cualitativa:
Se realiza en placas de vidrio para serología:
0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml
suero(*) problema suero control (+) suero control (-)
Suspensión 1 gota 1 gota 1 gota
antigénica
Mezclar con varilla de vidrio o madera
Balancear con movimientos circulares entre 1 a 3 minutos
Observar sobre fuente luminosa la presencia o no de aglutinación.
En caso de haber aglutinación, realizar la reacción cuantitativa

Reacción cuantitativa
Realizar diluciones del suero que dio aglutinación con solución fisiológica

Suero problema 0,08 ml 0,04 ml 0,02 ml 0,01 ml

Suspensión 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota
antigénica
Diluciones 1:20 1:40 1:80 1:160
Mezclar con varilla de vidrio o madera, empezando por la mayor dilución,
Balancear con movimientos circulares entre 1 a 3 minutos
Observar sobre fuente luminosa la presencia o no de aglutinación.
Informar la última dilución que dió aglutinación.

TRABAJO PRACTICO Nº 7 TECNICA DE ELISA

Autor: TL Marcos Elias Moretto
Profesional Adscripto a la Cátedra de Bacteriología y Virología

63
La técnica de ELISA ( Enzimo inmunoensayo en fase Solida) detecta Antígeno ( Ag)
como también Anticuerpos (Ac) según la configuración de la misma : para detectar un
Ac se utilizan moléculas con 2 componentes acoplados a un Ag que se encuentra
pegado en el fondo del Wells ( pocillo).
Esta técnica es sensible para cada Ac y Ag, esto quiere decir que NO es especifica por
lo tanto puede dar falsos (+) y falsos (-) ya que en el sistema inmune circulan grandes
cantidades de IgG (inmunoglobulinas IgG) que pueden interferir con la técnica.

MATERIALES

Kid comercios de ELISA (Chagas Lisado).

Pipetas automatizadas.
Muestras de suero.
Pisetas.
Placas para ELISA.
Tips
Estufa de 37ºC
Lector de placas de ELISA

OBJETIVOS

1 - Comprender la importancia de trabajar con muestras seropositivas

64
2 - Adquirir destreza necesaria para realizar correctamente la técnica

3 - Conocer y comprender cada uno de los pasos de la técnica

4 - Interpretar los resultados obtenidos en el proceso de dicha técnica

TIPOS DE ELISA MÁS FRECUENTES

ELISA DIRECTO : es la técnica básica : se coloca la muestra de suero problema en un

pocillo, en frente de una muestra igual pero con el virus a estudiar (control positivo) y la
otra donde no está el virus( control negativo). Se aplica el Ac con la enzima en los 3
pasillos y se compara con la muestra a estudiar en los restantes.

ELISA INDIRECTO : similar al DIRECTO, pero en este caso se añade primero un Ac

sin enzima y después uno con la enzima, de esta manera la señal que emite la enzima es
mucho más potente y la prueba es más sensible.

ELISA SANDWICH : en este caso los pasillos primero se añade el Ac y después el Ag

quedan ya adheridos en el fondo. Después se añade el Ac con la enzima, esta es la
forma más eficaz de la prueba.

ELISPOT : se trata de un ELISA que permite conocer de forma cuantitativa el Ag

incluso identificar el número correcto de células donde se encuentra.

PASOS DE LA TECNICA DE ELISA (CHAGAS LISADO)

1º - Elegir la cantidad de pasillos (Wells) a utilizar.

2º - Colocar en cada pasillo (Wells) 100 µl de diluyente de muestra y 20 µl de muestra y

de los controles, se los tapa con un adhesivo para que no se evaporen.

3º - Incubar en estufa a 37ºC durante 30 minutos.

4º - Retirar de la estufa y realizar 3 lavados con PBS Tween

5º - SECAR

6º - Colocar 100 µl de conjugado en cada pocillo (Wells) previamente preparado

(dilución 1/10)

7º - Incubar en estufa a 37º durante 30 minutos.

8º - Retirar de la estufa y realizar 3 lavados con PBS Twenn.

9º - SECAR

10º - Colocar 100 µl de cromógeno e inmediatamente después colocar la placa en un

lugar al abrigo de la luz de 15 - 20 minutos.

11º - Retirar la placa y colocar en cada pocillo 100 µl de STOPPER paso siguiente leer
en Lector de Placas e interpretar las lecturas correspondientes.

65
 REACTIVOS

Diluyente de Muestra (Buffer Salino con Tensioactivo )

STOPPER (Ácido Sulfúrico 2N )

Cromógeno (Revelador , solución de Tetrametilbencidina y Peroxido de Hidrogeno )

Controles Positivos (+) Negativo (-)

Conjugado Concentrado

Diluyente de Conjugado

TRABAJO PRACTICO Nº 8 INMUNO FLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

Es una técnica especifica ya que detecta solamente el material pegado en la impronta

pero resulta más cara con relación a otros métodos de detección de Ac (HAI e ELISA);
consta de doble capa en donde se aplica el Ac sin marcar directamente sobre el tejido o
material pegado en vidrio de la impronta para posteriormente visualizar la unión Ag –
Ac en microscopio de campo oscuro las Inmunoglobulinas IgG o IgM marcadas con
fluorocromógeno. Esta técnica requiere personal diestro en la observación e
interpretación de las mismas.
MATERIALES

IMPRONTAS.
IgG e IgM marcada con fluorocromo
Camara humeda
PBS Tween
Estufa de 37ºC
Tubos de plásticos
Tips
Pipetas automáticas
Muestras de suero.

OBJETIVOS

1 - Saber realizar las diluciones correspondientes de los sueros problemas

66
2 - Adquirir la destreza necesaria para poder sembrar las improntas

3 - Realizar las diluciones de las IgG o IgM marcadas

4 - Saber observar e interpretar lo observado en el microscopio de campo oscuro

PASOS DE LA TECNICA DE INMUNOFLUORECENCIA INDIRECTA (IFI)

1º - IgG: se realiza una dilución previa 100 µl de PBS Twenn y 10 µl de la muestra

(1/10)

IgM: se realiza una dilución previa 40 µl de Absorbente de IgG y 10 µl de muestra

(1/5) y se la deja reposar durante 30 minutos luego se centrifuga 3 - 4 minutos a 10.000
rpm

2º - Se colocan las improntas a utilizar dentro de una cámara húmeda, se siembra sobre
la impronta con el cuidado de no tocar el tejido con la pipeta y se las deja durante 30
minutos.

3º - Se realizan 3 lavados de 3 minutos con PBS Twenn.

4º - Se secan las improntas en la estufa a 37ºC entre 15 - 20 minutos.

5º - Se preparan previamente tanto la IgG o la IgM marcada según corresponda:

IgG: 400 ml de PBS y 12 µl de IgG marcada

IgM: 400 ml de PBS y 6 µl de IgM marcada

6º - Se retiran las improntas de la estufa y se las colocan nuevamente en la cámara

húmeda y se le agrega IgG o IgM según corresponda durante 30 minutos.

7º - Se las retira de la cámara humedad se les realiza 3 lavados de 3 minutos con PBS.

8º - Se secan las improntas en la estufa a 37ºC

9º- Se las retira de la estufa se les coloca liquido de montaje y un cubre objetos sobre las
mismas y se observa al microscopio de fondo oscuro.

ANEXO I: PREPARACION DE SOLUCIONES Y COLORANTES

PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE HIPOCLORITO DE SODIO

Para preparar una solución al 1% (1 gr/100 ml):

67
Si se parte de una solución que contenga 80 gr/l de Cloro activo, se necesitan 1.250 ml
de lavandina concentrada y c.s.p. 10 litros de agua potable.
Para las superficies muy contaminadas como materiales de laboratorio, la solución se
prepara con 3% y se deja actuar sobre el material durante 30-60 minutos.
Las soluciones se deben preparar diariamente y no se usan más de 24 horas después de
su preparación porque se agota en su principio activo.
La dilución de hipoclorito de sodio en agua genera ácido hipocloroso con un máximo de
actividad a pH 6-7.
La solución concentrada debe almacenarse en recipientes plásticos opacos a la luz y a
una temperatura no mayor de 20-25ºC y por menos de 30 días.
La relación entre el volumen del descontaminante y la superficie a tratar no debe ser
mayor que 1,5 litros por metro cuadrado de superficie

COMPOSICION Y PREPARACION DE COLORANTES Y REACTIVOS

COLORACION DE GRAM:
A. CRISTAL VIOLETA
Cristal Violeta 2g
Etanol al 95% 20 ml.
Disolver y completar con Agua destilada c.s.p. 1000 ml
Guardar 24 horas antes de usar. Filtrar.

B. LUGOL
Yodo 1g
Yoduro potásico 2g
Agua destilada 300 ml
Pulverizar el yodo y el yoduro con un mortero. Añadir agua de a poco y mover
hasta su disolución. Mezclar en un frasco de vidrio oscuro con el resto del agua
destilada.

C. SOLUCIÓN DECOLORANTE: ALCOHOL-ACETONA

Alcohol al 95 % y acetona en partes iguales.

D. SAFRANINA
Solución madre: Solución de trabajo:
Safranina O 2,5 g Solución madre 10ml
Etanol al 95% c.s.p. 100ml Agua destilada 90 ml

COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN:
A. FUCSINA DE ZIEHL:
Solución A:
Solución saturada de fucsina básica
Fucsina básica 3g
Etanol al 95 % 100 ml
Solución B:
Solución de fenol acuosa
Fenol 10 g
Agua destilada c.s.p. 200 ml
Mezclar 10 ml de solución A y 90 ml de solución B
Atención: esta solución es corrosiva y tóxica.

68
 B. DECOLORANTE ALCOHOL-ÁCIDO
Ácido clorhídrico concentrado 3 ml
Etanol al 95 % 97 ml.

C- COLORANTE DE CONTRASTE: AZUL DE METILENO

Azul de metileno 0,3 g
Agua destilada 100ml

Medio de transporte de Stuart

Cloruro de sodio………………….. 3 g
Cloruro de potasio………………... 0,2 g
Fosfato disódico………………….. 1,25 g
Fosfato monopotásico…………….. 0,2 g
Tioglicolato de sodio………….. …..1 g
Cloruro de calcio al 1% en agua 10 g
Cloruro de magnesio al 1% en agua 10 g
Agar 4 g
Agua destilada q.s. 1 litro
pH = 7,3
Medio de transporte Cary-Blair
Tioglicolato sódico ....................................... 1,5 g
Fosfato disódico de hidrógeno ......................... 1,1 g
Cloruro de Sodio ................................................ 5,0 g
Agar ................................................. ................... 5,0 g
pH 8,4 ± 0,2
Suspender los12,6 g del polvo en 991 ml de agua destilada. Reposar 5 minutos y
mezclar hasta uniformar. Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto hasta
disolver. Enfriar a 50°C y agregar 9 ml de una solución de CaCl 2 al 1% preparada
recientemente. Ajustar el pH, fraccionar y esterilizar 15 minutos a vapor fluente

Conservación de reactivos:
Peróxido de hidrógeno 3%
• Conservar el frasco de peróxido en frasco color caramelo y evitar exponerlo
innecesariamente a la luz. De preferencia mantenerlo refrigerado.
• Periódicamente el peróxido de hidrógeno debe ser controlado con cultivos positivos y
negativos conocidos, antes de su uso.

Plasma de conejo deshidratado

• Guardar las ampollas, bien cerradas y refrigeradas para mantener su estabilidad. Es
recomendable no conservar el plasma reconstituido pasado el día de su uso, pero cuando
sea necesario es preferible congelarlo (-20° C) durante algunos días pero siempre se
tienen que hacer pruebas de control de calidad antes de su empleo

ANEXO II GLOSARIO:
ABSCESO:
Acumulación de pus en una cavidad del cuerpo debido a un proceso infeccioso por
destrucción de tejidos orgánicos.

69
ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENCIA
Es la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración de la
fucsina básica (rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol y el calor.
AISLAMIENTO PRIMARIO:
Desarrollo inicial de microorganismos a partir de una muestra clínica.
ANTIBIOTICO:
Son substancias que interfieren en forma específica en el crecimiento y la supervivencia
de los microorganismos. Debido a esta especificidad, los antibióticos tienen un espectro
de acción limitado; esto es, en general son activos frente a ciertos microorganismos e
inactivos frente a otros, lo que permite usarlos como agentes selectivos.
ANTIBIOGRAMAS
Son también llamadas pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos.
Investigan la acción de distintos agentes antibióticos frente a un microorganismo en
estudio.
Se realiza antes del tratamiento de una enfermedad microbiana con el fin de implantar la
terapia más efectiva.
ANTISEPSIA
Procedimiento que pretende, mediante el empleo de sustancias químicas, la disminución
de microorganismos (acción biocida) o impedir su proliferación (acción biostática). A
diferencia de los desinfectantes, su baja toxicidad relativa permite que se puedan aplicar
sobre la piel y las mucosas.
ANTISÉPTICO:
Son compuestos químicos que actúan en forma inespecífica sobre los grupos de
microorganismos, su acción es más general, no suelen ser demasiado tóxicos y pueden
aplicarse sobre tejidos vivos.
ASEPSIA
Consiste en la ausencia de microorganismos en el material inerte, objeto o área.
BACTERIAS ACIDO ALCOHOL RESISTENTES
Son bacterias que no pueden ser clasificados según la tinción de Gram, sólo se tiñen con
algunas tinciones concentradas combinadas con calor. Además, resisten la decoloración
con alcohol-ácido, de ahí su nombre ácido-alcohol resistentes.
La alta concentración de ácido micólico en la pared celular de bacterias del Género
Mycobacterium, permite la retención de la fucsina en caliente en la coloración de Ziehl
Neelsen.
BACTERIAS COLIFORMES:
Designa a un grupo de especies bacterianas que tienen ciertas características
bioquímicas en común e importancia relevante como indicadores de contaminación de
aguas y de alimentos.
Coliforme significa con forma de coli, debido a que la bacteria principal del grupo es
Escherichia coli.
En agar Mac Conkey dan colonias de color ladrillo rodeadas de una zona de bilis
precipitada.
BACTERIAS GRAM POSITIVAS:
Son aquellas bacterias que se tiñen de azul violeta en la tinción de Gram.
Esta característica está íntimamente ligada a la estructura de la pared celular por lo que
refleja un tipo natural de organización bacteriana.
BACTERIAS GRAM NEGATIVAS:
Son aquellas bacterias que se tiñen de rosado o amarillo en la tinción de Gram, según si
se usó Fucsina o Safranina como colorante de contraste. Esta característica está

70
íntimamente ligada a la estructura de la pared celular por lo que refleja un tipo natural
de organización bacteriana.
BACTERIEMIA:
Entrada accidental del germen en el torrente sanguíneo que generalmente no produce
manifestaciones clínicas de importancia.
Ej. Extracción de una muela. Es un procedimiento que introduce una cantidad notable
de bacterias en el torrente sanguíneo, pero estas son incapaces de replicarse en la sangre
de la mayoría de gente.
BACTERIOCINA:
Es una toxina proteica sintetizada por una bacteria con el fin de inhibir el crecimiento
de bacterias similares o de cepas cercanas. Aunque existe controversia al respecto,
muchas veces son consideradas como antibióticos de corto espectro. Son muy diversas
estructural, fisiológica y ecológicamente
CAPSULA:
Cubierta mucosa que rodea una o varias bacterias de composición variable según la
especie bacteriana.
De alto valor antigénico, protege contra la fagocitosis, es un factor de virulencia pasiva
pero no es indispensable para la vida del germen ya que puede vivir y reproducirse sin
ella. Ej. Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis.
CEPA BACTERIANA
Cultivo puro de bacterias formada por los descendientes de un solo aislamiento.
COLONIA
Crecimiento visible de microorganismos, generalmente en medios sólidos, originado
por la multiplicación de un solo organismo. Todos son la progenie de una única bacteria
preexistente.
DESINFECCIÓN
Es un proceso físico o químico que mata o inactiva microorganismos patógenos como
bacterias, virus y protozoos que se encuentran en objetos inertes.
DESCONTAMINACION:
Inactivación de gérmenes mediante el uso de agentes físicos y/o químicos para
protección del operador.
ESPORAS:
Es una célula reproductora producida por ciertos hongos, plantas (musgos, helechos) y
algunas bacterias.
Ciertas bacterias solo producen endoesporas como mecanismo de defensa cuando esta
en condiciones ambientales adversas.
Una endoespora consta de: Núcleo (parte central que contiene dipicolinato de Ca para
resistencia); Membrana de la endoespora; Corteza (formada por peptidoglicano); Capa
Cortical (la cual contiene proteínas con enlace disulfuro, que permite resistir a elevadas
temperaturas); Exosporio (estructura más externa, formada por glicoproteínas.
Son muy resistentes a las altas temperaturas, a la humedad y a otras condiciones
desfavorables. Las bacterias Clostridium forman esporas que causan gangrena gaseosa y
colitis asociada con antibióticos.
ESTERILIZACION:
Destrucción de todo tipo de microorganismo en un objeto, área específica o sustancia.
Es un método de control del crecimiento microbiano a través del cual se eliminan todas
las formas de vida microscópicas, incluidos los virus y los organismos esporulados.
EXANTEMAS:
Erupción de la piel de color rojo.
FISTULA:

71
Conducto anormal entre órganos, vasos o tubos, ulcerado y estrecho que se abre en la
piel o en la membrana de las mucosas.
Puede ser el resultado de estrés, heridas, cirugía, infecciones, inflamaciones, o de origen
congénito.
FLEMON:
Inflamación del tejido conjuntivo que conduce a un absceso o ulceración.
FOLICULITIS:
Inflamación de los folículos pilosos, provocada generalmente por una infección de
estafilococos.
FORÚNCULO:
Es una inflamación de un folículo piloso que se extiende al tejido circundante y se
asocia con la muerte del tejido (necrosis) y la formación de secreción purulenta. La
formación de pus en el centro de la infección es parecida a la de un absceso.
HEMOGLOBINA:
Pigmento rojo de los hematíes (eritrocitos, glóbulos rojos) formado por un grupo
prostético y una proteína: la globina.
HEMORREA:
Hemorragia no provocada directamente, espontanea.
HEMOPTISIS:
Vomito de sangre proveniente de los pulmones.
HOMEOSTASIS:
Tendencia de los seres vivos a presentar una constancia de condiciones ambientales en
su medio interno.
IATROGENICA:
Alteración del estado del paciente producida por el médico.
IMPETIGO:
Infección por bacterias del grupo A del estreptococo beta-hemolítico y el
Staphylococcus aureus que afecta las capas superficiales de la epidermis.
Tiene 3 formas clínicas: impétigo contagioso, la forma común y el impétigo bulloso. Se
trasmite por contacto directo y es muy contagioso.
INCUBACION
Mantenimiento de cultivos bacterianos en condiciones ambientales favorables para su
desarrollo y multiplicación.
INFECCION:
Penetración y desarrollo de microorganismos patógenos en los tejidos de un huésped
ocasionándole efectos nocivos.
INFESTACION:
Infección producida por agentes mas estructurados que las bacterias como por ejemplo
los metazoos (piojos, artrópodos,)o los helmintos.
INGUINAL:
Zona de la ingle donde converge cada una de las extremidades inferiores con el tronco.
INOCULO
Alícuota de una muestra que es transferida a un medio de cultivo.

LAVADO:
Remoción de la materia orgánica de cualquier superficie mediante la acción mecánica
del agua y del detergente.
MICROBIOSTASIS, FUNGOSTASIA O BACTERIOSTASIS
Es una condición por la que el crecimiento o la multiplicación de los microorganismos
están inhibidos, lo que no quiere decir que sean destruidos. Si el agente microbiostático

72
es eliminado, el crecimiento microbiano puede resurgir. De igual definición pero de
aplicación a la correspondiente categoría de microorganismos son los fungistáticos y los
bacteriostáticos.
MICROBIOCIDA, FUNGICIDA O BACTERICIDA
Es el agente que destruye las formas viables de los microorganismos. De igual
significado pero con ámbito más restringido son los términos fungicida y bactericida.
PEPTONAS:
Productos de electrolisis enzimática de la carne. Se usa como fuente de Nitrógeno en
todos los medios de cultivo.
PUSTULA:
Lesión cutánea formada por una vesícula llana de pus que forma una prominencia sobre
la superficie de la piel.
RESIEMBRA O REPIQUE
Es el paso del inóculo obtenido de una colonia aislada en un medio de cultivo a otro
medio para su conservación viable
SAPROFITO:
Microbios que viven normalmente en el organismo a expensas de las materias en
putrefacción y que pueden dar lugar a enfermedades, son potencialmente patógenos.
SEPTICEMIA:
Infección generalizada que se manifiesta con fiebre, escalofríos, etc. debido a la
presencia y crecimiento de microorganismos en la sangre.
SEPSIS:
Infección que cursa con síndrome de respuesta inflamatoria sistémica debido a la
presencia de gérmenes patógenos en cualquier tejido o fluido del organismo y no
exclusiva ni necesariamente en la sangre.
SIEMBRA O INOCULACIÓN
Es el paso de una porción representativa de la muestra problema a un medio de cultivo,
ya sea líquido o sólido.

ANEXO III: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

NORMAS DE BIOSEGURIDAD
Son normas universales preventivas aplicadas para mantener, controlar y reducir
factores de riesgo laborales procedentes de agentes biológicos, físicos o químicos.
Su objetivo es lograr actitudes y conductas que prevengan impactos nocivos y que
aseguren que las prácticas profesionales no atenten contra la salud y la seguridad de las
personas y del medio ambiente.
El laboratorio de la Cátedra de Bacteriología y Virología es NIVEL I: laboratorio de
enseñanza. Trabaja con Bacillus subtilis, hepatitis canina, Escherichia coli, algunos
cultivos de células y bacterias no patógenas.

NORMAS PARA LA REALIZACION DE CADA TRABAJO PRÁCTICO

 El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado.
 Cerrar las puertas y ventanas para mantener la adecuada contención biológica.
 En caso de presentar cortes, raspaduras u otras lastimaduras en la piel, cubrir la
herida de manera conveniente antes de iniciar la práctica.
 Evitar realizar actividades prácticas en el laboratorio con accesorios que podrían
ser fuente de contaminación como por ejemplo joyas (anillos y pulseras).

73
  Usar calzado cerrado.
 Reportar al docente a cargo, en caso de producirse un accidente.
 Usar ropa y elementos de seguridad (ej. guardapolvo, guantes, máscara, etc.).
 Usar guantes para manipular muestras o cultivos potencialmente patógenos y
desecharlos antes de salir del laboratorio.
 Es necesario recogerse el pelo largo, llevar las uñas cortas y no usar anillos ni
pulseras. El calzado debe cubrir totalmente los pies.
 Ordenar, limpiar y desinfectar las mesadas antes y después de cada técnica
realizada con una solución germicida (hipoclorito de sodio 0,5 %, fenol al 5 % o
alcohol 70º)
 Descontaminar todo el material de vidrio reutilizable contaminado antes de ser
lavado.
 Asistir al trabajo práctico con guardapolvo, quitárselo antes de salir, lavarse
cuidadosamente las manos con agua y jabón y desinfectarlas.
 Disponer de un desinfectante listo para ser usado en caso de salpicaduras o
derrames para realizar una descontaminación de emergencia.
 Utilizar el desinfectante adecuado según el material manipulado.
 Está prohibido comer, beber, fumar o maquillarse en el laboratorio, así como el
almacenamiento de comida o bebida.
 No tocarse la cara ni el cabello con las manos enguantadas con que está
manipulando material potencialmente patógeno.
 Seguir las normas específicas para el transporte de muestras biológicas.
 Evitar el contacto de la piel con materiales potencialmente infecciosos.
 Lavarse las manos frecuentemente antes, durante y después de las actividades
prácticas con un jabón antiséptico y secarse con papel.
 Considerar que todo material que se manipula es potencialmente patógeno.
 Rotular todo el material infectivo para prevenir confusiones.
 Realizar la práctica con cuidado, sin apresurarse para evitar salpicaduras o
contaminaciones.
 Depositar los residuos y muestras peligrosas en contenedores cerrados,
resistentes e impermeables siguiendo las normas específicas para cada tipo de
residuo.
 No colocar en la zona de trabajo material de escritorio ni libros para evitar su
contaminación.
 Evitar hablar mientras se realizan las técnicas bacteriológicas a fin de evitar la
contaminación de los cultivos.
 Esterilizar siempre el ansa antes y después de su uso.
 No colocar los tapones sobre la mesada para evitar contaminaciones.
 Utilizar gradillas para colocar los tubos que contengan medios de cultivo o algún
tipo de muestra.
 Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear con el fin de
evitar accidentes.
 Ante alguna duda, consultar con el docente a cargo.
 Descontaminar el material contaminado reutilizable, ya sea en la autoclave o en
recipientes con hipoclorito de sodio al 1 %.
 Antes de salir del laboratorio, quitarse el guardapolvo y colocarlo en una bolsa.
Al llegar a su casa realice la descontaminación con hipoclorito de sodio al 5 %.

74
  El piso del laboratorio no debe barrerse ni encerarse, solo se desinfecta con
solución de hipoclorito de sodio al 1 %.
 Apagar celulares al ingresar al trabajo práctico.
 Nunca pipetear con la boca, utilizar peras plásticas o pipetas automáticas.
 Tapar los tubos que se introduzcan en la centrifuga, se detenerla manualmente ni
destaparla antes de que cese de girar.

OBJETOS CORTOPUNZANTES:
 Nunca se debe volver a encapuchar las agujas y éstas no deben ser torcidas ni
separadas de la jeringa con la mano.
 Evitar tapar, enfundar, doblar o quebrar agujas, bisturíes u otros elementos
punzocortantes una vez utilizados. Estos elementos deben ser desechados en
contenedores especiales diseñados para este propósito que contienen solución
descontaminante (hipoclorito de sodio al 1 %).
 Las jeringas usadas deben ser descontaminadas en recipientes con solución de
hipoclorito al 1 %.

Antes de retirarse del laboratorio:

 Cerrar las llaves de agua y gas.
 Apagar las luces.
 Desconectar los equipos.
 Desenchufar, limpiar los objetivos de los microscopios y protegerlos con fundas.
 Ordenar y desinfectar las mesadas de trabajo.
 Guardar los reactivos utilizados en su correspondiente lugar.

MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA

Derrame de material biológico sobre el cuerpo:
1. Remover la ropa inmediatamente.
2. Lavar vigorosamente el área expuesta con agua y jabón por un minuto.
3. Reportar el incidente al profesor.
4. Buscar atención médica si es necesario.

Salpicaduras en los ojos con materiales peligrosos:

1. Lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del párpado con
abundante agua durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para asegurar
efectivamente el lavado, comenzando por los párpados. No frotar nunca.
2. Reportar el incidente al profesor.
3. Buscar atención médica inmediatamente.

Cortes menores y heridas por pinchazo:

1. Lavar vigorosamente la herida con agua y jabón por varios minutos.
2. Aplicar un antiséptico adecuado
3. Reportar el incidente al profesor.
4. Buscar atención médica si es necesario.

En el caso de derrames por roturas:

1. Reportar el incidente al profesor.
2. Colocarse guantes y cubrir con papel absorbente el área del derrame.

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 3. Verter una solución de hipoclorito de sodio (desinfectante) y dejar actuar 10
minutos.
4. Retirar el material absorbente junto al material roto y colocarlos en un recipiente
para residuos contaminados o bolsa de desechos, la cual debe descontaminarse
junto con los guantes utilizados.
5. Limpiar y desinfectar nuevamente el área empleando nuevas toallas de papel y
desinfectante.
6. Lavarse las manos con abundante agua y jabón.

En el caso de quemaduras pequeñas:

1. Las quemaduras pequeñas consideradas de primer grado producidas por material
caliente se tratan lavando la zona con chorro de agua fría o colocándola en un
recipiente de agua y hielo durante 10-15 minutos.
2. Se puede aplicar compresa y crema para aliviar el ardor y la tirantez de la piel.
3. Buscar atención medica en caso de quemaduras mas graves y no aplicar pomada
grasa y espesa, solo colocar gasa gruesa para aislar la quemadura del aire.

En el caso de ingestión de cualquier reactivo:

1. Reportar el incidente al profesor.
2. Cualquiera sea el producto ingerido se debe dar un litro de agua para que así la
concentración del toxico sea menor.
3. Suministrar antídotos universales tales como claras de huevo en un litro de agua,
creando una película protectora de la mucosa gástrica.

Técnica de lavado de manos

1) Subirse las mangas hasta el codo.
2) Mojarse las manos con agua corriente.
3) Aplicar 3 a 5 ml de jabón líquido.
4) Friccionar las manos durante 10 o 15 segundos.
5) Enjuagar con agua corriente.
6) Secar con toalla de papel.
7) Cerrar la llave con la toalla.

Clasificación de los agentes biológicos por grupos de riesgo

El RD 664/97 clasifica los agentes biológicos en cuatro grupos en función del riesgo de
infección:
Grupo 1. Aquél que resulta poco probable que cause una enfermedad en el hombre.
Grupo 2. Aquél que puede causar una enfermedad en el hombre y puede suponer un
peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la colectividad y
existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.
Grupo 3. Aquél que puede causar una enfermedad grave en el hombre y presenta un
serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la colectividad y
existiendo frente a él generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.
Grupo 4. Aquél que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio
peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la
colectividad y sin que exista generalmente frente a él profilaxis o tratamiento eficaz.

Clasificación de SPAULDING de los materiales:

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 1. Críticos. Requieren esterilización porque tienen contacto con sistema
vascular u otras áreas estériles el cuerpo. Ej.: instrumental quirúrgico, agujas,
catéteres, prótesis o implantes.
2. Semicríticos. Requieren de preferencia esterilización, pero se puede
hacer desinfección porque tienen contacto con mucosas. Ej.: endoscopios, equipo
para terapia respiratoria y catéteres urinarios.
3. No críticos. Requieren de desinfección porque tienen contacto con la piel
intacta del paciente. Ej.: estetoscopios, electrodos cardíacos, manguitos de
esfigmomanómetros, etc.

ELIMINACIÓN DE LOS RESIDUOS PATÓGENOS

Los sobrenadantes de los cultivos, sangre, líquidos orgánicos, secreciones, etc.,
se colocan en un recipiente con solución de hipoclorito de sodio al 1 %. Luego de la
descontaminación se eliminan por los desagües con agua abundante.
Otros laboratorios los descontaminan en la autoclave durante 30 minutos sobre
todo aquellos procedentes de las áreas de micobacteriología o virología.
Los residuos sólidos se descontaminan en la autoclave durante 30 minutos.
Otros laboratorios los transfieren a empresas autorizadas, en recipientes rígidos.

ANEXO IV: BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA

 Microbiología y Parasitología Humana, Romero Cabello, Raúl. Editorial Médica
Panamericana, Tercera Edición. Año 2007.
 Microbiología, Bacteriología y Virología, Salvatierra.Sexta Edición, 2000.
 Zoonosis de enfermedades transmisibles comunes al hombre y animales. Dr.
Pedro N. Acha y Dr. Boris Szyfres. OPS. Año 1998.
 Microbiología. Raquel Granados Pérez. Maria Carmen Villaverde Peris.
Editorial Paraninfo. Edición 1997.
 Gradwohl Métodos y Diagnósticos del Laboratorio Clínico, Alex C.Sonnenwirth
y Leonard Jarett. Editorial Médica Panamericana, Octava Edición. Año 1983
 Manual de técnicas básicas para un laboratorio de Salud. Publicación científica
Nº 439 Organización Panamericana de la Salud. 1983
 Manual de Bioseguridad para Técnicos de Laboratorio. Acta bioquímica Clínica
Latinoamericana, Suplemento Nº 2, 1992
 MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA Cátedra de Microbiología
Ambiental I Departamento de Ciencias del Ambiente Área Saneamiento -
Orientación Tratamientos Autores: MANACORDA, Ana María CUADROS,
Daniela Patricia Universidad Nacional del Comahue - Escuela Superior de Salud
y Ambiente Buenos Aires 1400- Neuquén Capital 1ª Edición: 2005.
 Revista del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias
versión impresa ISSN 0187-7585.

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FOTOS DEL TRABAJO PRACTICO DE ENTEROBACTERIAS

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