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CULTIVO Y CRIOPRESERVACIÓN DE CELULAS ANIMALES

INTRODUCCIÓN
Dentro del proceso de aprendizaje el estudiante conocerá el comportamiento de
las células que crecen adheridas y sumado a esto realizara un ejercicio de crió
preservación de las mismas.
Las células que crecen dependientes de anclaje son aquellas que necesitan un
soporte sólido para su desarrollo in Vitro, usualmente son las células del cuerpo
que sirven de sostén, fibroblastos, tejido conectivo. Ellas crecen tomando formas
especificas que sirven para su identificación y caracterización.
La crió preservación nació hace aproximadamente 50 anos y puede definirse
como el procedimiento mediante el cual se conservan las células a temperaturas
inferiores 00C , esto se pudo dar gracias a dos desarrollos importantes, el primero
el descubrimiento de los crioprotectores y el desarrollo de sistemas de frió. Los
crioprotectores mas usados son el glicerol y el dimetil sulfoxido son moléculas
pequeñas, hasta 150 kd que entran a la célula desplazando el agua intracelular lo
que impide que a bajas temperaturas se formen cristales de hielo que rompen la
membrana. Posteriormente se realiza la curva de congelación que en ocasiones
es muy rápida, caso fibroblastos o lenta caso espermatozoides.
Se pueden congelar cualquier tipo de células, pero lo más importante es que al
descongelar se encuentre viabilidad y funcionalidad de las mismas, por eso
aunque se hable de congelación es igual o más importante la descongelación,
esta se hace transfiriendo las células a 370C por 5 minutos.
Para que la preservación de las células pueda hacerse por largo tiempo se
utilizan sistemas que producen o generan frió, en el primer caso la nevera de
hasta menos -800C, en el segundo gracias a someter a presión los gases estos se
licuan a temperaturas bajas, en el caso del nitrógeno -1960C y el helio -2100C.
Criopreservar es detener el tiempo, esto debe tenerse en cuenta, especialmente
cuando se congelan células germinales, espermatozoides y/o óvulos, pues no se
puede asegurar que la respuesta de la información genética a los efectos
medioambientales sea la misma que cuando fueron congeladas.
OBJETIVO GENERAL
Conocer el proceso de congelación y descongelación en un modelo de células
dependientes de anclaje.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Conocer los cambios morfológicos que ocurren en los cultivos de células
dependientes de anclaje.
Criopreservar células eucarioticas
Materiales
Células, pipetas de 5 ml, pipetas de 1ml, cajas de petri para cultivo, tubos cónicos
de centrífuga, crioviales, congelador de - 80 oC, microscopio, centrífuga, medio de
cultivo Ham F12, suero fetal bovino, solución de Tripsina, glycerol o Dimetil
sulfóxido, solución Salina Bufferada
Procedimiento
Las células son recuperadas cuando la población alcanza el máximo dentro del
frasco de cultivo, idealmente las céulas se han de cosechar cuando están en su
fase mayor de crecimiento (log phase). Las células se deben mantener a 37 oC,
con un ph entre 7.2 y 7.5, una osmolaridad de 220 mosm, alta humedad , con una
fase gaseosa en equilibrio (C02 con el bicarbonato del medio) y en lo posible
protegido de la luz.
CULTIVO Y CRIOPRESERVACION
A cada grupo se le entregara una suspensión de células, que deberá lavar , contar
(al menos mirar la microscopio cuantas tiene por campo) y determinar su
viabilidad. Ellos sembraran en cajas de petri de 30 mm con medio RPMI
suplementado con suero al 10%, algún grupo puede usar otro medio como Ham´s
F12 o Dulbecco. Allí las dejarán observando los cambios morfológicos hasta la
confluencia, una vez confluentes procederán a soltarlas y a criopreservarlas.
Tripsinización de células adherentes
Evalué la densidad celular de su cultivo (frasco, botella, etc), si tiene confluencia o
usted estima conveniente remover las células pase al paso No 2., remueva el
medio de cultivo (OPCIONAL: Lave una o dos veces con solución salina bufferada
(PBS) su cultivo con el fin de remover las proteínas, adicione 1 ml de Tripsina
0.25 % y déjelo por 10 minutos a 37oC. A los 5 minutos observe si las células se
están soltando. Cuando las células estén totalmente sueltas, adicione 5 ml de
medio sin suero fetal bovino, transfiera la suspensión celular a un tubo de ensayo
y centrifuge a 1800 rpm x 10 minutos.
Descarte el sobrenadante y resuspenda en 5 ml de medio con suero fetal bovino y
dependiendo de sus necesidades, determine la concentración y la viabilidad
Ajuste con medio de cultivo de acuerdo con sus necesidades, si simplemente va a
duplicar un cultivo existente añada 10 ml de medio con suero y siembre de a 5 ml
en una cada frasco
Criopreservación
A 4 ml de suspensión de células agregue 4 ml de suero fetal bovino y 1 ml de
glycerol, homogenize y transfiera a los crioviales. Una los crioviales y envuélvalos
en gasa. Llévelos a -80 oC, y déjelos allí mínimo 72 horas.
Descongelación
Tome un vial y llévelo al baño de maria a 37 oC espere a que el vial se descongele
totalmente, transfiera el contenido del vial a un tubo de centrífuga con medio de 5
ml de medio de cultivo, deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet en 5 ml de
medio con suero fetal bovino al 20%, siembre las células en las cajas de cultivo y
observe el crecimiento
SEGUIMIENTO
24 horas después de la siembra de debe verificar si hay o no contaminación.
Cada 24 horas se observa el cultivo para ver el crecimiento de las células y la
formación de monocapas
Verificación del crecimiento después de la descongelación.
GLOSARIO
Criopreservación: Procedimiento de almacenamiento celular mediante el cual
estas se conservan vivas a temperaturas inferiores a - 70 grados centígrados
Tripsinización: Procedimiento mediante el cual, se aplica una solución de tripsina a
células adheridas para que estas se suelten.
Vial: Recipiente pequeño, de un volumen no mayor a 2 ml usado para almacenar
células.
Pasaje: Procedimiento mediante el cual, una vez formada la monocapa de células
estas se sueltan y son sembradas en dos o mas nuevos frascos de cultivo.
BIBLIOGRAFÍA
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