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CULTIVO DE LINFOCITOS Y OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS

INTRODUCCIÓN
El cultivo de células animales permite la realización de diferentes actividades
docentes que tienen importancia en el ámbito de la biotecnología. Los diferentes
tipos celulares animales tienen dos opciones de crecimiento, en suspensión y
adheridas, el estudiante deberá conocer los dos sistemas. ¨Para ello deberá
realizar cultivos a corto plazo máximo una semana y realizar dos experiencias, la
primera la obtención de cromosomas y la segunda la criopreservación.
OBJETIVO GENERAL
Dar al estudiante las bases del cultivo de células en suspensión (linfocitos) y de
células adheridas (línea celular).
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtener cromosomas de un cultivo de linfocitos de sangre de diferentes
especies.de mamíferos.
Cultivar células adheridas, para establecer cambios morfológicos durante su
crecimiento.
Criopreservar células conservando las características morfológicas iniciales
MATERIALES
Jeringa de 2,5cc, frasco de cultivo ( Boterito), pipeta de 5ml , pipeta de 1 ml,
incubadora a 37oC, tubos cónicos de centrífuga, centrífuga, pipetas pasteur,
láminas portaobjetos, láminas cubreobjetos, aceite de Inmersión, microscopio de
luz (100X), heparina, medio de cultivo RPMI, suero fetal bovino, extracto de frijol,
solución hipotónica de KCL 0.075M, colchicina, metanol, ácido acético, colorante
de Giemsa
PROCEDIMIENTO
La muestra que será suministrada a los estudiantes, será tomada en forma estéril
de la vena yugular en una jeringa heparinizada (Liquemine, Roche). Estas
muestras han de ser identificadas.
La siembra debe hacerse en condiciones estériles y se sembrarán 10 gotas de
sangre en 5 ml de medio RPMI (Roswell Park memorial Institute) suplementado
con suero fetal bovino al 10% y 100ul de Fitohemaglutinina (50Ugrml). Se lleva el
cultivo a una incubadora de 37oC por 72 horas.
OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS
Se adiciona al cultivo 0,1 ml de Colcemid (5ugr/ml)y se deja en incubacón por 30
minutos, luego se centrifugan 10 minutos a 1800 rpm. Se descarta el
sobrenadante y se adicionan 8 ml de solución hipotónica y se homogeniza bien la
muestra y se incuba 10 minutos a 37oC , posteriormente se adiciona 1 ml de
Carnoy ( Metanol: Acido acético 3.1), se homogeniza y se centrífuga.1800 rpm x
10 minutos. All pellet se le adicionan 10 ml, se homogeniza y se deja por 30
minutos en refrigeración (5oC). Se centriufa por 10 minutos, el pellet se
resuspende en 5 ml de fijador y se vuelve a centrifugar, esta operación se repite
dos veces mas.
Al final el pellet se resuspende en 0,5 ml de Fijador , finalmente se colocan 2 o 3
gotas de fijador sobre la lámina, esta se deja secar.
Las láminas son coloreadas con colorante de Giemsa y se observan al
microscopio las metafases.
Seguimiento:
El cultivo debe revisarse a las 24 horas para evidenciasr signos de contaminación.
Las láminas una vez coloreadas deben revisarse para observar la presencia de
metafases y si es posible tomar fotograficas para analizarlas.
GLOSARIO
Medio de cultivo : Solución de aminoácidos, vitaminas y sales que es capaz de
soportar el desarrollo celular
Colchicina: Inhibidor de la despolimerización de los microtúbulos, necesario para
detener las células en metafase
Fitohemaglutinina: Mitógeno, utilizado para promover la división de los linfocitos en
el cultivo
Cultivo: Procedimiento mediante el c