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INFORME PRACTICA 3

Proteínas: Extracción, cuantificación y análisis de las proteínas de la leche.

PROTEINAS EN UNA MUESTRA DE LECHE ENTERA


Angela Zaramaa; Meliza Lopezb

a
Facultad de Ingeniería; Programa de Ingeniería Química; Laboratorio de Bioquímica
b Facultad de Ingeniería; Programa de Ingeniería Química; Laboratorio de Bioquímica

INTRODUCCIÓN: el medio ambiente entre otros (ABUL, K.A,


LICHTMAN, HA, POBER, SJ; 2018).
La leche de vaca es un alimento de primera
necesidad, que además tiene una gran
demanda debido a su alto valor nutricional
que se refleja en sus componentes, es
considerada un alimento primordial en la
dieta de niños, ancianos, enfermos, y en
general de todos. Los mamíferos dependen
fundamentalmente de la leche en sus
primeros períodos de vida y el hombre la ha Tabla 1. Composición general de la leche en
aprovechado para su alimentación, dos diferentes especies (por cada100 gr)
empleándola directamente y utilizando Proteínas: La proteína contenida en la leche
diversos procedimientos para la obtención es del 3,5% (variando desde el 2.9% al 3.9%).
de productos como el queso, yogurt y Esta “proteína láctea” es una mezcla de
mantequilla, entre otros. Su industrialización numerosas fracciones proteicas diferentes y
se ha desarrollado exponencialmente, de pesos moleculares distintos. Las proteínas
innovando cada día para obtener nuevos se clasifican en dos grandes grupos: caseínas
productos beneficiosos para la alimentación. (80%) y proteínas séricas (20%). (UNAM;
Composición nutricional: Básicamente, La 2014)
leche posee diversas sustancias, presentes http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero
en diferentes estados, suspensión o /Alimentosricosenproteinas_8076.pdf
emulsión, algunas bien definidas como: agua
grasa, proteína, lactosa, vitaminas, La caseína es la proteína que mas abunda en
minerales; a las cuales se les denomina la leche, y es la más característica de la leche
extracto seco o sólidos totales (LERCHE, puesto que no se encuentra en otros
Martín;1969). Otros componentes como Los alimentos. Existen tres tipos de caseínas (α, β
sólidos totales varían por múltiples factores y Kapa caseína), También de encuentra la
como lo son: la raza, el tipo de alimentación, albúmina y la globulina. La caseína tiene un
alto valor biológico, debido a su contenido pipeta graduada
1 Etanol al 70%
de aminoácidos esenciales que se separan de de 1.0 ml
la parte acuosa. (LERCHE, Martín;1969).
pipeta graduada
1
El principal objetivo del presente informe es de 10.0 ml
determinar no solo el punto isoeléctrico de la
caseína, sino también la concentración de Embudo de vidrio
1
proteínas en nuestra muestra de leche mediano
entera utilizando espectrofotometría. 1 Termómetro

Papel de filtro
MATERIALES Y METODOLOGÍA:

● Soluciones buffer pH 4.0 y 7.0 para calibrar


el potenciómetro
● Potenciómetro
● Espectrofotómetro
● Leche de vaca líquida comercial
● Cámara de electroforesis
● Fuente de poder
● Reactivo de Biuret
● Patrón de albúmina de huevo 5 mg/ml
● Un juego de micropipetas
MATERIAL
REACTIVOS
CANTIDAD TIPO

Vaso de
10 precipitado de 25 Agua destilada
ml

Vaso de
Acetato sódico 0.1
2 precipitado de 50
N
ml

vaso de
Ácido acético 0.01
1 precipitado de
N
250ml

10 tubos de ensayo Ácido acético 0.1 N

1 Probeta de 50ml Ácido acético 1.0 N

Matraz aforado
1 NaOH 1N
de 50 ml

pipeta graduada
1 Éter etílico
de 5.0 ml
Sesion 1: Aislamiento de Caseína

Se calentó en un vaso de precipitados 70 Acetato Ácido Ácido pH


sódico acético acético resultante
ml de agua destilada a 38°C, Tubo
0,1N 0,1N 0,01N aproximado
posteriormente se añadió 50 ml de leche (ml) (ml) (ml)
entera (marca). Se le agregó gota a gota 1 0,5 9,5 - 3,2
acido acético 1N, hasta que la leche se 2 1,0 9,0 - 3,6
cortó. 3 1,5 8,5 - 3,8
4 2,0 8,0 - 4,0
Se llevó a la centrifugadora a 5000 rpm, 5 3,0 7,0 - 4,2
pasados 2min se guardó el sobrante como 6 4,0 6,0 - 4,5
Solución A. El precipitado se lavó con 7 6,0 4,0 - 4,7
20ml de Etanol. Este se centrifugó 8 8,0 2,0 - 5,1
nuevamente en las mismas condiciones y 9 6,0 - 4,0 5,5
el sobrante se marcó como Solución B. 10 8,0 - 2,0 6,1
Luego se adicionó 10mL de éter etílico, Tabla 1: Volúmenes a utilizados de
el cual se centrifugó a las mismas cada uno de los reactivos para
condiciones y se Desechó sobrenadante. determinación del pI
Se midieron los pH de los vasos, los cuales
Finalmente quedó un precipitado blanco debían cubrieron un rango aproximado de
de compacto, el cual correspondía a la entre 3,0 y 6,5.
caseína, esta se puso en una Placa de Petri
Se Añadió 1mL de la solución de caseína a
y se puso en el horno a secar.
cada tubo, Y se Agitó suavemente,
Preparación de solución de caseína esperaramos 3 minutos, y medimos la
absorbancia de cada muestra.
Se agregaron 249,35 mg de caseína en un
vaso de precipitado de 50mL. Se agregaron SESION 2 Cuantificación de proteínas de la
20mL de agua destilada y 5mL de NaOH 1N, y leche
se agitó hasta disolver por completo la Se Prepararon las siguientes reacciones en
caseína. 10 tubos de ensayo:
Posteriormente se agregó a un matraz
aforado de 50mL, y se adicionó 5mL de ácido
acético 1N y se completó con agua destilada Al
E
lo faltante para 50mL. Como resultado b Bi
xt
tuvimos una La solución clara y limpia. Esta u Le u
Ag ra
m ch re
se marcó como solución C. Tu ua ct
in e t
bo (m o
Determinación del punto Isoeléctrico de la a (m (
l) (
caseína ( l) m
m
m l)
Se colocó en 10 tubos de ensayo los l)
l)
siguientes volúmenes de los reactivos: B 1,8 - - - 1,2
1 1,6 0,2 - - 1,2
2 1,4 0,4 - - 1,2
3 1,2 0,6 - - 1,2 ejercida por el gel de corrida de manera que
4 1,0 0,8 - - 1,2 aquellas proteínas retardadas pudieron
5 0,8 1,0 - - 1,2 alcanzar al resto y todas iniciaron la
Leche 1,79 - 0,01 - 1,2 separación desde el mismo punto,
Sln A - - - 1,8 1,2 mejorando así la calidad de la corrida. El gel
Sln B - - - 1,8 1,2 de apilamiento se preparó con una
Sln C - - - 1,8 1,2 concentración de acrilamida 4%, mientras
Tabla 2: Volúmenes a utilizados de que el gel de separación o gel de corrida se
cada una de las soluciones en la preparó según el rango óptimo de
cuantificación de proteínas resolución:

Luego se Agitó y se puso en la oscuridad


15min para que se desarrollara el color en la Gel de corrida
oscuridad. Se midió la absorbancia a 595 nm.
Este fue ensamblado por el Profesor, quien
también Preparó el gel de corrida. El
volumen del gel de corrida se calcularsó por
Electroforesis de las proteínas de la leche el grosor del gel, así:
Geles de corrida y apilamiento

Este procedimiento fue realizado por el


Solución Volumen
Profesor Jorge Cortázar. En este se
Agua destilada 3,4mL
prepararon 2 geles, el de corrida, donde se Acrilamida-bisacrilamida
separaron las proteína, el de apilamiento o 3.4mL
30%
concentrado, que como su nombre lo indica, Tris/HCl 1.5 M pH 8.8 2.5mL
concentró la mezcla. SDS 10% 100µL
Persulfato de amonio 10% 150µL
TEMED 10µL
El gel de corrida que separó las muestras Tabla 3: Volúmenes a utilizados de los
tuvo mayor concentración de Acrilamida reactivos para la preparación del gel de
(10%) y pH más básico (8.3.El gel de corrida
apilamiento tenía una baja concentración de
acrilamida (4%) en tampón ligeramente Se Vertió cuidadosamente la solución de
ácido (Tris/HCl 1M pH 6.8. acrilamida con una pipeta Pasteur en el
contenedor representado por 2 vidrios
sujetos al cassette y distanciados por unos
Una vez preparado y polimerizado el gel de separadores. Se dejó 1,5 cm de distancia
corrida, se preparó, en la parte superior de entre la solución de acrilamida y el vidrio
este el gel de apilamiento. Bajo la acción del frontal.
campo eléctrico, la mezcla proteica, colocada
sobre el gel de apilamiento, comenzó a
migrar hacia el polo positivo. Luego se añadió agua destilada para evitar
Cuando las proteínas atravesaron el gel de que el borde del gel polimérico de manera
apilamiento, se encontró con la resistencia
irregular. Se Esperó 15min para una ● Leche 2µL
polimerización total del gel. Colorín 18µL
● Solución A 10µL
Colorín 10µL
Gel de apilamiento ● Solución B 10µL
Colorín 10µL
Luego de polimerizado el gel de corrida, se
● Solución D 10µL
descargó el agua de la superficie del mismo y
Colorín 10µL
se prepararó 4ml del gel de apilamiento (4%)
● Estándar peso molecular 5 µL
según se muestra a continuación:

Solución Volumen
Estas muestras fueron Sometidas a
Agua destilada 6,1 mL
calentamiento (100°C) por 5 minutos en un
Acrilamida-bisacrilamida
1,3mL baño de agua, luego se sembró 20µL de las
30%
Tris/HCl 1M pH 6.8 2,5 mL muestra en los pocillos de los geles de la
SDS 10% 100µL electroforesis. Incluido un estándar de peso
Persulfato de amonio 10% 50µL molecular en uno de los pocillos (5µL).
TEMED 10µL
Tabla 4: Volúmenes a utilizados de los
reactivos para la preparación del gel de Se Sometieron las muestras a electroforesis
apilamiento aplicando una corriente de 30 mA.

Se puso el contenido del gel de apilamiento


sobre el gel de corrida polimerizado y se Finalizada la corrida se extrajeron los vidrios
colocar el peine para que no se formaran del cassette cuidadosamente y se separaron
burbujas. Esperamos unos 10min hasta que de manera tal que el gel quedó posado sobre
polimerizó la acrilamida. uno de los vidrios. Se Sumergió el gel en una
solución colorante por 3 horas. Transcurrido
el tiempo, se sumergió el gel en una solución
decolorante por 5 minutos para eliminar las
Colocación de las muestras
asociaciones inespecíficas del gel al
Cuando el gel de apilamiento polimerizó, se colorante. Se Observó las bandas proteicas y
colocó el cassette en el tanque de se midió la distancia recorrida por cada
electroforesis con 500mL del tapón de banda para determinar su PM y definir que
corrida en el cual se encontraban los posible banda corresponde a que posible
electrodos sumergidos. Se Quitó proteína.
cuidadosamente el peine para que quedaran
libres los pocillos del gel. Se colocaron
cuidadosamente las muestras con una
micropipeta.

Muestras: RESULTADOS:
punto isoeléctrico:
a partir de la gráfica se puede observar
Ph ABSORBANCIA que el punto isoeléctrico experimental es
de 4,74 valor que corresponde al pico más
alto de la gráfica 1. este punto es aquel en
3,44 0,018 el que precipitan las proteínas debido al
equilibrio de cargas positivas y negativas
3,71 0,053 en el que se encuentran. en promedio el
PI teórico de la caseína es de 4.6 por su
composición de a, b k- caseína los cuales
3,82 0,135
contienen PI diferentes, por lo cual se
corrobora que el punto isoeléctrico
4,01 0,158 experimental haado se encuentra en un
rango cercano al reportado en literatura.
4,22 0,191

4,4 0,239 concentración absorbancia

4,74 0,266 0,33 0,078

5,15 0,037 0,66 0,125

5,37 0,024 1 0,169

5,5 0,018 1,33 0,197

Tabla N 1 Ph Slc vs absorbancia de Slc. 1,66 0,228

Gráfica 1. punto isoeléctrico


experimental caseína (Ph Slc vs
absorbancia de Slc ).
Gráfica 2. absorbancia 540 nm vs resultado que difiere del reportado 2,7 %
concentración mg/ml (curva de (Jenness J. 1980). factor que se le puede
calibración). atribuir a una falta de secado mayor o en si
mismo a un grado de tratamiento de la leche
distinto(Ministerio de agricultura de peru,2009).
a partir de la ecuación de la recta
presentada en la gráfica 2 se obtiene el Electroforesis
valor de concentración de las siguientes
muestras:
peso log peso distancia
MUESTRA ABSORB CONCENTRACI molecular molecular Kda recorrida
ANCIA ÓN Kda (cm)

leche 0,279 2,053013152


175 2,243038049 0,6

solución A 0,342 2,609801016


13 2,113943352 1

solución B 1,813 15,61035575


95 1,977723605 1,6

solución C 1,496 12,80874062


70 1,84509804 2,1

Tabla N 3 Absorbancia y 62 1,792391689 2,7


concentración de muestras
desconocidas 51 1,707570176 3,4
DETERMINACIÓN DE CONTENIDO
DE CASEÍNA EN LA LECHE: 42 1,62324929 4,4

la leche de vaca tiene una densidad media


29 1,462397998 5,6
de 1,032 g/ml por lo cual:

(50 ml)/1*(1,032 g)/ml= 51,6 g leche 22 1,342422681 6,8

14 1,146128036 7,5
51,6 g leche

no obstante considerando que a caseína Tabla N 4 Datos de peso molecular en


representa cerca del 82,5 % de las función de la distancia marcador de
proteínas presentes la composición de peso.Protein markers instruction manual
caseína es igual a : (s.f)
peso 25 14 18,4
molecular
KDa

al comparar este peso molecular con el


obtenido experimentalmente se observa
que hay una desviación respecto a los
reales. sin embargo, teniendo en cuenta su
similitud puede afirmarse que en la
muestra de leche hay presencia de caseína
y lactoalbúminas, las lacto globulinas no
pudieron determinarse en la muestra se
gráfica 3. distancia recorrida (cm) Vs atribuye a un error del experimentador
logaritmo del peso molecular (KDa) pues no pudo observar la banda que
debería ir entre la banda 1 y 2 medidas.
de lo cual se obtiene la ecuación así pues, para analizar la presencia de
log(y)=-0,4405x + 2,2286 dicha proteína debería usarse un marcador
apartir de ella se pueden calcular los de peso como Opti- protein express
pesos moleculares correspondientes a las marker G494 pues con dicho el
siguientes manchas de corrida experimentador podrá notar la banda
cercana a los 18 KDa con mayor
facilidad.

CUESTIONARIO:
Tabla N 5 desplazamientos obtenidos
electroforesis 1. ¿Qué sucedería si se representa la
transmitancia para la determinación
banda 1 leche : del punto isoeléctrico de la caseína?
pm= 10^(-0,4405(1,9) + 2,2286)
teniendo en cuenta que la absorbancia
pm =24.64 KDa
obedece a la siguiente ecuación
banda 2 leche :
𝐴 = − l𝐴𝐴 (𝐴), calculamos los valores de
pm= 10^(-0,4405(2,4) + 2,2286)
la transmitancia, los resultados de
pm=14.2 KDa
muestran en la siguiente gráfica.
banda 3 leche:
pm= 10^(-0,4405(3,3) + 2,2286)
pm=6 KDa

las proteínas presentes en la leche se


clasifican en las siguientes:

Proteína Caseína Lacto Lacto


albúminas globulinas
La concentración de la solucion de
El punto isoeléctrico de la caseína con la caseína la obtuvimos a partir de los datos
absorbancia será pues su valor máximo de la gráfica 2, con las concentraciones
con un pH alrededor de 4,74, como se para las soluciones de leche, A, B y C. En
observa en la gráfica. Al mismo pH se promedio la concentración de caseína en
encuentra el valor mínimo de la leche es de 16,5409 unidades.
transmitancia, lo que quiere decir que
coincidirá con el punto isoeléctrico 5. Que es el lactosuero? Que proteínas
determinado anteriormente. contiene?

El lactosuero es el líquido que se obtiene


durante la coagulación de la leche durante
2. ¿Por qué las proteínas tienen el proceso de elaboración del queso y la
solubilidad mínima en el pI? caseína.

La solubilidad de una proteína es mínima Su color es amarillo verdoso, de aspecto


en su punto isoeléctrico, ya que su carga turbio y sabor un poco dulce.
neta es cero y desaparece cualquier fuerza
de repulsión electrostática que pudiera Su composición es, en su mayoría, agua,
dificultar la formación de agregados. así como una pequeña cantidad de
proteínas y grasas.
http://www.ehu.eus/biomoleculas/prote
inas/desnaturalizacion.htm El lactosuero es rico en vitaminas A, B y
C, y minerales como el hierro, el potasio,
3. ¿Cuál es el peso aproximado de las
el magnesio, el calcio o el fósforo. Es
proteínas de la caseína?
importante destacar que contiene lactosa.
En la leche de vaca, la caseínas
Contiene dos clases de proteína:
representan alrededor del 80% del total de
proteínas, es decir, de 25 a 28 gramos por – Caseína: 80 %.
litro de leche. En la leche humana la
presencia de proteínas del lactosuero es – Proteína de suero: 20 %.
mucho mayor, de tal forma que las
http://sialaleche.org/sabes-para-que-se-
caseínas son solamente del orden de la
utiliza-la-proteina-de-suero-de-leche/
mitad de las proteínas totales, entre 5 y 8
gramos por litro. https://mejorconsalud.com/proteina-de-
suero-de-leche/
http://milksci.unizar.es/bioquimica/tem
as/proteins/caseina.html 6. Que diferencias hay entre los
resultados y análisis de proteínas
4. ¿Cuál es la concentración de la utilizando el método de
solución de caseína? espectrofotometría o electroforesis?
Grafica 2 la diferencia radica en que por
espectrofotometría se puede cuantificar la
cantidad de caseína en la solución,
mientras que por el método de
electroforesis se puede cuantificar la
cantidad de proteínas en dicha sustancia
(leche)teniendo en cuenta el recorrido que
tuvo con lo que posteriormente al haber
utilizado un marcador de peso se haya el
peso molecular .

CONCLUSIONES:

- se encontró un punto isoeléctrico


experimental de 4,74 valor
cercano al reportado en literatura
4,6
- el grado de tratamiento de la leche
puede afectar su composición de
proteínas
- el uso de otros marcadores de
peso en los cuales haya un rf de
corrida diferente con respecto al
peso molecular puede facilitar al
experimentador realizar la toma de
datos.
- Se puede llevar a cabo un
aislamiento de la caseína de la
leche usando la poca solubilidad
que tiene cuando de le lleva hasta
el punto isoeléctrico y con el uso
de la centrifugadora aprovechado
su fácil sedimentación.
- REFERENCIAS

Ministerio de agricultura de perú.


Cambios organolépticos y nutricionales
producidos por los tratamientos térmicos
de refinamiento durante el procesamiento
de la leche, pero 2009.

applied biological materials InC. Protein


markers instruction manual (s.f)