UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA

FACULTAD DE INGENIERÍA
Departamento de Ingeniería Química

LABORATORIO BIOLOGIA PARA INGENIEROS

Nombres
Maria Paula Rozo Charris 1152471286
Juliana Atehortúa Muñoz 1152468424
Mateo Jiménez Figueroa 1152453145

Título de la Práctica
ACTIVIDAD CATALÌTICA DE LA A-AMILASA Y VARIABLES QUE LA AFECTAN

Objetivos Alcanzados (10%)

● Analizar como se ve afectada la actividad catalítica por la variación de la

temperatura y el pH.
● Medir la actividad enzimática para hacer una estimación de que tan activa es la
enzima.

Resultados (modelos de cálculo y resultados gráficos o tablas) (20%)

Para el desarrollo correcto de la práctica fue necesario hacer unas pequeñas

modificaciones a la guía de laboratorio.
Para la evaluación del cambio del pH sobre la actividad de la enzima amilasa se siguió el
proceso que se muestra en el siguiente cuadro en un orden de izquierda a derecha.

# DE SOLUCIÒN CALENTAMIENT ENZIMA AGUA CALENTAMIENTO NaOH

TUBO ADICIONADA O ADICIONADA ADICIONADA 20min 2M
2500µ 5min

1 pH=3,5 90ºC 5000µ NO 90ºC 5000µ

2 pH=6,3 90ºC 5000µ NO 90ºC 5000µ

3 pH=9 90ºC 5000µ NO 90ºC 5000µ

4 pH=3,5 90ºC NO 5000µ 90ºC NO

5 pH=6,3 90ºC NO 5000µ 90ºC NO

6 pH=9 90ºC NO 5000µ 90ºC NO

Tabla 1.
.
A continuación, se aplicó el protocolo DNS para lo cual se hizo necesario hacer diluciones
a los tres primeros tubos de ensayo, para cumplir la ley de Beer. La siguiente tabla
muestra las diluciones realizadas

# DE TUBO CANTIDAD TOMADA DE LA CANTIDAD ADICIONADA CANTIDAD

SOLUCIÒN DEL DE AGUA ADICIONADA DE DNS
RESPECTIVO TUBO

1’ 100µL 900µL 1000µL

2’ 100µL 900µL 1000µL

3’ 100µL 900µL 1000µL

A los tubos 4, 5 y 6 se les adicionó la misma cantidad de DNS. Finalmente, todos los tubos
se llevan a calentamiento por 5 minutos a 90ºC, pasado este tiempo se someten a un
baño de hielo por 5 minutos.

Imagen 1. Tubos de ensayo al baño de hielo.

Posteriormente se lee su absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de onda de

540nm. Los resultados arrojados por el equipo se muestran en la siguiente tabla:

# DE TUBO ABSORBANCIA CONCENTRACIÒN (g/L)

BLANCO 0,074 0

1’ 2,96 2,846

2’ 0,475 1,095

3’ 1,950 4,67

4 0,255 0,113

5 0,375 0,171

6 0,493 0,228
En la práctica de manejo de materiales y equipos tenemos la curva de absorbancia versus
concentración de glucosa, que se realiza a partir de una solución madre de glucosa:

La curva de calibración se presenta a continuación:

Se utiliza la ecuación de la recta y =2,064x + 0,022 para encontrar la concentración de

glucosa presente en los 6 tubos de ensayos utilizando la absorbancia medida para cada
uno. Se debe tener en cuenta que la concentración de los tubos 1,2 y 3 deben
multiplicarse por el respectivo factor de dilución.

2,96 − 0,022 1000 𝑔

∗ = 1,5816 𝑑𝑒 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
2,064 900 𝐿

0,475 − 0,022 1000 𝑔

∗ = 0,2438 𝑑𝑒 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
2,064 900 𝐿

1,950 − 0,022 1000 𝑔

∗ = 1,0378 𝑑𝑒 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
2,064 900 𝐿

0,255 − 0,022 𝑔
= 0,113 𝑑𝑒 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
2,064 𝐿
 0,375 − 0,022 𝑔
= 0,171 𝑑𝑒 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
2,064 𝐿

0,493 − 0,022 𝑔
= 0,228 𝑑𝑒 𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
2,064 𝐿

Las concentraciones halladas anteriormente nos servirán para encontrar la actividad

enzimática correspondiente para cada tubo, pero es necesario convertir esta
concentración en µM/L de glucosa. Sabemos que la glucosa tiene un peso de
180,156g/mol, hacemos una conversión sencilla para registrar la concentración de
glucosa en µM/L.

1,5816𝑔 1𝑚𝑜𝑙 1µ𝑀 µ𝑀

∗ ∗ = 8779,058 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
𝐿 180,156𝑔 1𝑥10 − 6𝑚𝑜𝑙 𝐿

0,2438𝑔 1𝑚𝑜𝑙 1µ𝑀 µ𝑀

∗ ∗ = 1353,27 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
𝐿 180,156𝑔 1𝑥10 − 6𝑚𝑜𝑙 𝐿

1,0378𝑔 1𝑚𝑜𝑙 1µ𝑀 µ𝑀

∗ ∗ = 5760,56 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎
𝐿 180,156𝑔 1𝑥10 − 6𝑚𝑜𝑙 𝐿

A partir de estas concentraciones en µM/L hallamos la actividad enzimática, utilizando la

fórmula:

Para hallar la cantidad de enzima es importante tener en cuenta el factor de dilución que
corresponde a:

µ𝑀 µ𝑀
8779,058 𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 292,63 𝐿
𝐴𝐸 = =
20𝑚𝑖𝑛 ∗ (0,5 ∗ 3)𝑚𝑙 𝑚𝑖𝑛 ∗ 𝑚𝑙

µ𝑀 µ𝑀
1353,27 𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 45,109 𝐿
𝐴𝐸 = =
20𝑚𝑖𝑛 ∗ (0,5 ∗ 3)𝑚𝑙 𝑚𝑖𝑛 ∗ 𝑚𝑙

µ𝑀 µ𝑀
5760,56 𝐿 𝑑𝑒 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 192,018 𝐿
𝐴𝐸 = =
20𝑚𝑖𝑛 ∗ (0,5 ∗ 3)𝑚𝑙 𝑚𝑖𝑛 ∗ 𝑚𝑙
Procedimiento llevado a cabo con Lugol.

Paralelo al procedimiento descrito anteriormente, se realizó la prueba con Lugol en los

tubos de ensayo iniciales (presentados en la tabla 1). A cada uno se les añadió 30 µL de
Lugol (disolución de yodo molecular I2 y yoduro potásico KI en agua destilada). Los
cambios en la coloración fueron percibidos drásticamente en los primeros tres tubos.

Imagen 2. Tubos 1, 2, 3 Imagen 3. Tubos 4, 5, 6

Análisis de Resultados (30%)

Las enzimas al ser proteínas, poseen niveles de estructura primaria, secundaria, y

terciaria, algunas además tienen estructura cuaternaria. La actividad catalítica de las
enzimas es altamente dependiente de la estructura tridimensional que tenga la cadena
peptídica.
En esta práctica el sustrato utilizado es el almidón y la enzima adicionada es la alfa
amilasa, la cual una vez es adicionada a la solución de almidón se encarga de romper los
enlaces peptídicos entre la cadena de este para formar unidades libres de glucosa. Una
representación de esta reacción es la siguiente:

Como puede observarse a partir de la reacción el producto formado por el almidón y la

alfa amilasa es glucosa, por lo tanto, la actividad enzimática debe medirse en función de
la concentración de esta. Para hacer un análisis de la actividad catalítica de la alfa amilasa
se estudia como se ve afectada la enzima por un cambio de pH y un cambio de
temperatura.

Si hablamos en términos de pH y sabemos que las enzimas son proteínas, un cambio

muy fuerte en el pH puede llegar a desnaturalizar la proteína y afectar los diferentes
niveles de su estructura, además de su solubilidad, actividad biológica, enzimática y
catalítica.

El pH óptimo o intervalo de pH de cada enzima es diferente y cuando varía, la

conformación de la enzima se altera, produciéndose un cambio en el estado de ionización
de grupos del sitio activo y llegando a no ser funcional. Esto es debido a que la
conformación de una proteína depende también, de las atracciones y repulsiones entre
los aminoácidos cargados negativamente y los cargados positivamente. Además, algunas
cadenas laterales de aminoácidos pueden actuar como ácidos o bases débiles que
desarrollan funciones críticas en el sitio activo del enzima.
Las enzimas pueden tener dos tipos de curvas:
- La primera curva posible de la actividad enzimática es en pico. Esto significa que la
enzima necesita un control riguroso del pH del medio en el que se encuentra. El 100% de
su actividad se encuentra en un pequeño intervalo en torno a un pH determinado.
-La segunda posibilidad es que la enzima mantenga una actividad superior al 75%
alrededor del pH óptimo.
En este caso en particular el pH óptimo en el cual la enzima realiza la máxima actividad
enzimática es 6,3, al pH de 9 la enzima se encuentra desnaturalizada y de esta manera
tanto su actividad enzimática como catalítica son bajas, mientras que a un pH=3,5 la
actividad enzimática es mayor y se puede tener una buena actividad catalítica pero no en
igual medida que en el pH óptimo.

Por otro lado, el Lugol es una disolución que se utiliza como indicador en la prueba del
yodo y sirve para identificar polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas
dextrinas, formando un complejo de inclusión termolábil que se caracteriza por presentar
distintos colores según las ramificaciones que presente la molécula de polisacárido.
En esta prueba se notó cambio de color en los tubos 1, 2 y 3, debido a que estos eran
quienes contenían la enzima comercial (Termamyl 120L). Esta reacción es el resultado
de la formación de cadenas de poliyoduro a partir de la reacción del almidón con el yodo
presente en la solución de un reactivo llamado Lugol. La amilosa, el componente del
almidón de cadena lineal, forma hélices donde se juntan las moléculas de yodo, formando
un color azul oscuro a negro.

Conclusiones (20%)

Según los resultados obtenidos puede concluirse que tanto el pH y la temperatura afectan
la actividad enzimática, incluso llegando a desnaturalizar la proteína y haciendo que la
enzima pierda sus propiedades catalíticas.

En la actividad catalítica de la alfa amilasa con el almidón, se rompen los enlaces

peptídicos de este último, para dar lugar a la formación de glucosa libre, que mediante el
método del DNS puede ser cuantificada. A partir de la concentración de glucosa pudo
hallarse la actividad enzimática de la alfa amilasa para las diferentes condiciones de pH.

Gracias a los cálculos y al análisis realizado pudo establecerse que los valores óptimos
para que se dé la mayor actividad enzimática son un pH= 6,3 debido a que en este punto
la enzima también posee la mayor actividad catalítica.

Se pudo concluir que tanto el pH como la temperatura afectan la actividad enzimática. Por
ejemplo, a pH muy ácido o muy básico se desnaturaliza la proteína, reduciéndose así su
actividad enzimática y catalítica. En última instancia, la velocidad de la reacción o catálisis
varía de acuerdo a la concentración del sustrato, pues al aumentar la concentración de
sustrato, la actividad enzimática aumenta, hasta alcanzar la velocidad máxima, punto
donde la enzima se satura.

Referencias

 Anónimo (2011). Capítulo I. Las enzimas. Recuperado de:

https://addi.ehu.es/bitstream/handle/10810/14292/4-
%20Cap%C3%ADtulo%20I.%20Las%20enzimas.pdf?sequence=4

 http://libroelectronico.uaa.mx/capitulo-6-enzimas/efecto-del-ph-y-la-temperat.html

 https://www.blogdebiologia.com/factores-que-afectan-la-actividad-
enzimatica.html